JP2008545387A - 心血管疾患診断のための方法及び構成 - Google Patents
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Abstract
心血管疾患診断用の多重一塩基多型(multi−SNP)マーカー及び心血管疾患診断方法が提供される。また、ポリヌクレオチドセット、マイクロアレイ、マイクロアレイを含むキットが提供される。
Description
技術分野
関連する特許出願の相互参照
本出願は、韓国特許庁にそれぞれ2005年5月18日及び2006年2月24日に提出した韓国特許出願第10−2005−0041653号及び第10−2006−0018449号の利益を主張し、各々の開示は参照によってその全体が本明細書に採用される。
関連する特許出願の相互参照
本出願は、韓国特許庁にそれぞれ2005年5月18日及び2006年2月24日に提出した韓国特許出願第10−2005−0041653号及び第10−2006−0018449号の利益を主張し、各々の開示は参照によってその全体が本明細書に採用される。
本発明は、心血管疾患診断用の多重一塩基多型(多重SNP)マーカー、それを利用した心血管疾患の診断方法、並びに該方法を実施するためのポリヌクレオチドセット、マイクロアレイ及びキットに関する。
背景技術
あらゆる生物のゲノムは、連続する進化の過程で自発的突然変異を経てゆき、先祖の塩基配列に変異体を生じさせる(Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831−854, 1986)。先祖の核酸配列の変異体は、先祖形態に比べて進化にとって有利なこともまたは不利なこともあり、または中立的であることもある。変異体が致死的な不利益を与え、生物の次の世代に受け継がれない場合もある。別の場合では、種に進化の上の利益を与え、最終的に種のほとんどの個体にそのDNAが組み込まれて事実上先祖形態となる。多くの場合、先祖形態及び変異体は、存続し、種集団内に共存することになる。こうして、多様な配列形態が共存することにより、多型が発生する。
あらゆる生物のゲノムは、連続する進化の過程で自発的突然変異を経てゆき、先祖の塩基配列に変異体を生じさせる(Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831−854, 1986)。先祖の核酸配列の変異体は、先祖形態に比べて進化にとって有利なこともまたは不利なこともあり、または中立的であることもある。変異体が致死的な不利益を与え、生物の次の世代に受け継がれない場合もある。別の場合では、種に進化の上の利益を与え、最終的に種のほとんどの個体にそのDNAが組み込まれて事実上先祖形態となる。多くの場合、先祖形態及び変異体は、存続し、種集団内に共存することになる。こうして、多様な配列形態が共存することにより、多型が発生する。
多型にはいくつかの種類が知られており、制限断片長多型(RFLP)、縦列型反復配列(STR)及び一塩基多型(SNP)などが挙げられる。このうちの「SNP」は、同種個体間の核酸配列における一塩基の変異である。SNPが、遺伝子のうちの蛋白質のコーディング配列中に発生する場合、多型形態のいずれか一つによって非同義的なコドンへの変化が発生し、これにより欠陥があるかまたは変異した蛋白質が発現することもある。SNPが遺伝子のうち非コーディング配列中で発生する場合、多型形態の一つが、例えば、欠陥のあるmRNAのスプライシングの結果として、欠陥があるかまたは変異した蛋白質の発現を招くこともある。その他のSNPは表現型に何らの影響を及ぼさない。
人間のSNPは、1,000bpごとに一回の頻度で発生すると推定されている。それらSNPが疾病の存在または非存在のような表現型の発現を誘発する場合、そのSNPの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドは、その疾病を診断するためにプライマーまたはプローブとして使うことができる。そのSNPの対立遺伝子の一つから生成されるアミノ酸の配列に特異的に結合するモノクローナル抗体もまた、疾病の診断に使うことができる。現在、さまざまな研究機関で塩基配列及びSNPの機能に関する研究が行われている。同定された人間のSNPのヌクレオチド配列やその他実験結果はデータベース化され、容易にアクセスできるようになっている。
これまでに入手可能になった知見は、人間のゲノムまたはcDNA上に特定のSNPが存在するということを示しているものの、SNPの表現型への影響は明らかにしていなかった。ほとんどのSNPの機能は未だに見い出されていない。
心血管疾患は、世界の先進工業国での主要な死亡原因であり、韓国でも1970年代から主要死亡原因になっている。韓国統計庁によれば、2003年は、死亡者24万6千人のうち2万2千人(10万人当たりの死亡率9,087人、9.1%)が心臓疾患及び高血圧が原因となっており、癌及び脳血管疾患に次いで第三位の死亡原因となっている。
心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中及び血栓症を含む。
心血管疾患のうち重要と位置づけられる冠状動脈疾患は、通常動脈硬化によって心臓に血液を供給する冠状動脈がふさがったり、または狭くなって引き起こされる。動脈硬化により冠状動脈が完全にふさがることを心筋梗塞症、狭くなることを狭心症という。冠状動脈疾患の危険因子としては、脂質異常症(高コレステロール血症)、高血圧、喫煙、糖尿、遺伝、肥満、運動不足、ストレス及び女性の閉経などが周知である。この疾患の危険因子をより多く有する人ほどこの疾患の罹患の危険も増大する。他の多くの疾病と同様に、心血管疾患も遺伝的要因に影響を受ける。
技術的課題
従来、様々な心血管疾患及び関連疾患を診断、あるいは早期予測するのに最も大きな問題点は、それら疾患が進行した段階で初めて物理的な方法を使用して診断することができるという点である。現在、心血管疾患診断のために、心臓及び冠状動脈内部のX線及び超音波検査をすることができるが、これは、病気の進行した段階で診断が可能である。しかし、最近のさまざまな分子生物学的技術の発展とヒトゲノムに対する研究とが一次的に完了することにより、心血管疾患と直接または間接的に関連ある遺伝子あるいは遺伝的変異を検出することが可能になった。疾病の表現型あるいは身体的な特徴に依存した従来の診断法を用いる代わりに、遺伝的因子を用いた心血管疾患の早期診断が可能になった。
従来、様々な心血管疾患及び関連疾患を診断、あるいは早期予測するのに最も大きな問題点は、それら疾患が進行した段階で初めて物理的な方法を使用して診断することができるという点である。現在、心血管疾患診断のために、心臓及び冠状動脈内部のX線及び超音波検査をすることができるが、これは、病気の進行した段階で診断が可能である。しかし、最近のさまざまな分子生物学的技術の発展とヒトゲノムに対する研究とが一次的に完了することにより、心血管疾患と直接または間接的に関連ある遺伝子あるいは遺伝的変異を検出することが可能になった。疾病の表現型あるいは身体的な特徴に依存した従来の診断法を用いる代わりに、遺伝的因子を用いた心血管疾患の早期診断が可能になった。
技術的解決
本発明者らは、心血管疾患の発現及びその確率に関連する遺伝的因子を見つけるために研究した結果、心血管疾患を発病したすべての個体は特定SNPの同じ対立遺伝子を有しており、したがってこれらのSNPにより心血管疾患の発現、その確率及び遺伝的感受性を予測することが可能になることを見出した。
本発明者らは、心血管疾患の発現及びその確率に関連する遺伝的因子を見つけるために研究した結果、心血管疾患を発病したすべての個体は特定SNPの同じ対立遺伝子を有しており、したがってこれらのSNPにより心血管疾患の発現、その確率及び遺伝的感受性を予測することが可能になることを見出した。
本発明は、心血管疾患診断用の多重一塩基多型(多重SNP)マーカーを提供する。多重SNPマーカーは、多重の単一のSNPで構成される。本発明者らは、多重SNPマーカーを含むSNPセットにおける特定の遺伝子型パターンが心血管疾患のさらに高い発現またはその確率と関連があることを見い出した。
また、本発明は、多重SNPマーカーを含むSNPを有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはそのcDNAを含む心血管疾患診断用のマイクロアレイを提供する。
また、本発明は、前記マイクロアレイを含む心血管疾患診断用のキットを提供する。
また、本発明は、前記多重SNPマーカーを利用する心血管疾患を診断する方法を提供する。
本発明の一態様によれば、心血管疾患診断用の多重SNPマーカーにおける遺伝子型パターンを、ハイブリダイズすることによって決定する、ポリヌクレオチドセットが提供される。そのセットを構成する各ポリヌクレオチドは、(a)配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも10個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも10個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中一塩基多型(SNP)の塩基を含み、ここで、該SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、(b)核酸配列(a)の相補的配列を含む。
本発明は、心血管疾患診断用のSNPのためのポリヌクレオチドを提供し、それは、(a)配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも10個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも10個の塩基は前記選択されたヌクレオチド配列中一塩基多型(SNP)の塩基を含み、ここで、該SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、(b)核酸配列(a)の相補的配列を含む。
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチド配列の相補的ポリヌクレオチドが提供される。
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチド、前記ヌクレオチド配列の相補的ポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドの一つとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドの一つによってコードされるポリペプチドまたはそのcDNAを含む心血管疾患診断用のマイクロアレイが提供される。
本発明の他の態様によれば、前記マイクロアレイを含む心血管疾患診断用のキットが提供される。
本発明の他の態様によれば、被検体の一塩基多型(SNP)の遺伝子型を決定する過程を含む心血管疾患の診断方法が提供され、ここで、前記SNPは、表2中1から12番の多重SNPマーカーから選択された多重SNPマーカーを含むSNPのうちの一つであり、ここで、前記SNPは、配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択されたポリヌクレオチドにより同定され、ここで、前記SNPは、前記選択された配列中、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置する。
以下、本発明の上記の態様及び効果はその例示の実施形態を詳細に説明することにより、より明らかになる。
発明の詳細な説明
用語「a」及び「an」は、量の限定を示さず、むしろ参照された要素の少なくとも一つが存在するということを表す。用語「または」は「及び/または」を表す。用語「含む」、「有する」及び「含有する」は、制限のない用語と解釈されねばならない(すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」ことを意味する)。
用語「a」及び「an」は、量の限定を示さず、むしろ参照された要素の少なくとも一つが存在するということを表す。用語「または」は「及び/または」を表す。用語「含む」、「有する」及び「含有する」は、制限のない用語と解釈されねばならない(すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」ことを意味する)。
本明細書で特に指摘しない限り、数値範囲の記載は、単にその範囲内の各々別個の数値を個別に参照する簡単な方法として用いることを意図したものであり、各々個別の数値は、ここに個別に列記されたときのように、本明細書に組み入れられる。あらゆる範囲の終点は、その範囲に含まれ、独立的に結合できる。
本明細書で説明される全ての方法は、明細書に特に指摘されるか、または文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行うことができる。いずれか及び全ての実施例、または例示的用語(例えば、「のような」)の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特にクレームしない限り、本発明の範囲に限定を付するものではない。本明細書のいかなる記載も、ここで用いられた方法で発明の実施に不可欠なクレームされていない要素を指し示していると解釈してはならない。特に定義されない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で当業者により一般的に知られているものと同じ意味を有する。
本発明の一態様による心血管疾患診断用の多重SNPマーカーは、表1に記載された一つ以上のSNPを含む。SNPは、表1における配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択される参照ポリヌクレオチドにより核酸中で同定することができ、ここで、前記SNPは、配列番号4中76番目、配列番号8中85番目、配列番号9中51番目、配列番号10中35番目、配列番号19中85番目、並びに配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35中101番目のヌクレオチドに位置する。
国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)dbSNPデータベースのSNP登録番号は、各SNPのフランキングまたは参照配列、及びその参照配列内のSNP位置を表すものである。当業者ならば、前記dbSNPのrs登録番号を利用してSNPの位置及び基準配列を容易に同定することができる。NCBIのdbSNPに登録されているSNPのrs番号に対応する特定の参照配列は、長い間に変更されることがある。本発明の範囲が、対応するrs番号が変更されたとしても、その参照配列に及ぶということは当業者に自明なことである。
表1で、「SNPを含むポリヌクレオチド」と表示された欄は、核酸中のSNPの同定のための参照ヌクレオチド配列についての配列同定番号を提供する。これらのヌクレオチド配列、配列番号1から35は、それぞれ多型部位を含む多型配列である。「多型配列」は、SNPが生じている多型部位を含むポリヌクレオチド配列である。多型部位に隣接する多型配列の全部または一部は、当業者により核酸中でSNPを同定するのに使うことができる。
配列番号1から35のヌクレオチド配列はまた、SNPの塩基配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチド配列は、DNAまたはRNAでもよい。
これらSNPのいくつかの特徴が表1に開示されている。
表1中、「多重SNPマーカー参与回数」は、特定のSNPを含む、表2中の多重SNPマーカーの個数を表すものである。
「バンド」は、そのSNPの染色体位置を示し、「p」は染色体の動原体から伸びている短腕であり、「q」は動原体から伸びている長腕であり、番号はバンド番号である。例えば、配列番号1に位置するSNPの「バンド」が17q23.3であるときには、このSNPは第17染色体上の長腕(q)かつ23.3領域のバンドに位置する。
「遺伝子」は、SNPを含む遺伝子であって周知のものを参照している。
「SNPの機能」は、遺伝子のSNPであって周知のものが果たす役割を示している。
本発明の一態様は、心血管疾患(CVD)診断用のポリヌクレオチドセットを提供する。このポリヌクレオチドセットは、ここで開示されたCVD診断のための多重SNPマーカーの遺伝子型パターンを決定するために使ことができる。各ポリヌクレオチドは、(a)配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも10個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも10個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中の一塩基多型(SNP)の塩基を含み、ここで、該SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは(b)核酸配列(a)の相補的配列を含む。
一実施形態では、そのセットは、前記多重SNPマーカーを含む少なくとも2個のSNPの遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、そのセットは、前記多重SNPマーケットを含むSNPのそれぞれの遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、前記セットは、表1のSNPそれぞれによる遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。
本発明の一実施形態において、多重SNPマーカーのSNPに関する核酸中での遺伝子型は、以下の表2に記載されたSNPの遺伝子型のうちの一つであってもよい。
本実施形態による多重SNPマーカーは、表1に列挙された単一のSNPを組み合わせた12個の多重SNPマーカーの一つであってもよい。組み合わせの中の各SNPが参照配列番号により表されているため、このSNPの組み合わせ及びそれらの遺伝子型は、表2に開示されている。表2の「多重SNPマーカー」は、選択された3個の単一のSNPの組み合わせを表している。「遺伝子型」は、本発明者らにより罹患した集団に特徴的であると決定された多重SNPマーカーの配列番号順に単一SNPの遺伝子型を表す。例えば、表2の1番において、「rs20568」の遺伝子型(配列番号2)、「rs209176」の遺伝子型(配列番号25)、及び「rs5050」の遺伝子型(配列番号3)は、それぞれCC、CC及びTGである。
本発明の別の実施形態において、心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中又は血栓症であってもよく、本発明の一実施形態では、心筋梗塞症である。
本発明の実施例では、心血管疾患の高い罹患率に符合する単一のSNPの組み合わせ、すなわち、多重SNPマーカーを探索するために、一連の選択過程を経た。
前記多重SNPマーカーの選択は、人間の男性の被検体を対象として行なった。男性の心血管疾患患者及び男性の健常者の血液からDNAを分離及び増幅した後、男性の心血管疾患患者に特に現れるが、男性の健常者には現れない特異的なSNPの組み合わせ、及びそれらの遺伝子型を同定した。
同定されたSNPの組み合わせ、及びそれらの遺伝子型を表2に表した。多重SNPマーカーの統計的特徴については、下記表3に記載されている。
表3の「番号」は、表2の多重SNPマーカーの番号に対応している。
「患者群の出現頻度」は、検査した全患者221人のうち前記多重SNPマーカーを有する患者数を表す。「健常群の出現頻度」は、検査した192人の健常者のうち、前記多重SNPマーカーを有する男性の数を表す。
「オッズ比」は、健常群における前記多重SNPマーカーを有する確率に対する、患者群における前記多重SNPマーカーを有する確率、の比率を表す。すなわち、オッズ比はad/bcであり、aは患者群の多重SNPマーカーの出現頻度を表し、cは健常群の多重SNPマーカーの出現頻度を表し、b=[(検査した総患者数)−a]及びd=[(総健常人数)−c」である。検査した患者及び健常人がそれぞれ221人及び192人なので、結局b=[221−a]であり、d=[192−c」である。
オッズ比が1を超える場合には、その多重SNPマーカーと患者群との間には相関性がある。オッズ比と共に相関性の程度も増加する。表3に表したように、本発明の一実施形態による、1番から12番までの多重SNPマーカーは、11.5と61.3との間の範囲のオッズ比を有する。これらの数値は、1よりはるかに大きい数値であるので、本発明の一実施形態による1番から12番までの多重SNPマーカーは、心血管疾患の発病と密接な相関性があると推定される。
「95%信頼区間」は、実際のオッズ比をその区間が含んでいる確率が95%であることを表し、下記の式を用いて得られる。信頼区間が1を含む場合、すなわち、信頼区間の下限が1より小さく上限が1を超えている場合には、その多重SNPマーカーと心血管疾患との間に相関性はないことを意味すると解釈される。
95%信頼区間=(下限,上限)
=(オッズ比×exp(−1.960),オッズ比×exp(1.960))
ここで、V=1/a+1/b+1/c+1/d)である。
=(オッズ比×exp(−1.960),オッズ比×exp(1.960))
ここで、V=1/a+1/b+1/c+1/d)である。
本発明の一実施形態による心血管疾患診断用の多重SNPマーカーは、多重SNPマーカーの一つを含んでいればよく、2以上の多重SNPマーカーを含んでもよく、例えば、1番から12番までの多重SNPマーカー全部を含んでいてもよい。
心血管疾患診断用の多重SNPマーカーに含まれる単一のSNPのポリヌクレオチドは、少なくとも10個のコンティグ塩基を含んでいてもよく、例えば10から100個のコンティグ塩基を含んでいてもよい。
本発明の他の態様による心血管疾患診断用の対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドとは、その対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。配列番号1から35の多型部位でのSNPの塩基を明確に区別するためには、ハイブリダイゼーションがなされる必要がある。ハイブリダイゼーションは、厳しい条件で行われ、例えば、1M以下の塩濃度及び25℃以上の温度下で行われる。例えば、5×SSPE(750mM NaCl、50mM リン酸ナトリウム、5mM EDTA、pH7.4)及び25〜30℃の条件が対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適する。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者により所望の用途に応じて変更してもよい。
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、もよい。ここで、プライマーとは、適当なバッファ中で適当な条件、例えば、4種の異なるヌクレオチド三リン酸、及び適切な温度下でのDNA、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合剤の存在下で、テンプレート指向DNA合成の開始点となりうる一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの長さは、使用目的によって変わることがあるが、通常15から30ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般的にテンプレートと安定してハイブリダイズするためには、より低い温度を必要とする。プライマー配列は、テンプレートと完全に相補的である必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするには十分に相補的でなければならない。プライマーは、その3’末端が配列番号1から35の多型部位と対応するように整列している。プライマーは、多型部位を含む標的DNAにハイブリダイズし、プライマーと完全な相同性を有する対立遺伝子の増幅を開始する。このプライマーは、反対側でハイブリダイズするもう一方のプライマーと対をなして使われる。増幅は2つのプライマーを用いて行われ、それは、特異的対立遺伝子が存在するということを意味する。本発明の一実施形態によれば、プライマーは、リガーゼ連鎖反応(LCR)で使われるポリヌクレオチド断片を含む。
本発明の一実施形態において、対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プローブであってもよい。プローブとは、ハイブリダイゼーションプローブを意味し、核酸の相補鎖に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブは、Nielsenら, Science 254, 1497−1500(1991)で発表されたペプチド核酸を含む。本発明の一実施形態によれば、プローブは、対立遺伝子特異的プローブである。多型部位は同種の2つの個体に由来する核酸断片中に位置する場合には、対立遺伝子特異的プローブは一個体に由来したDNA断片にはハイブリダイズするが、もう一方の個体に由来した断片にはハイブリダイズしない。この場合、ハイブリダイゼーションの条件は、異なる対立遺伝子についてのハイブリダイゼーションの強度の有意な差を示すことによって、一つの対立遺伝子だけがハイブリダイズするのに十分厳しいものであればよい。本発明の一実施形態によれば、プローブは、中央部位が多型部位であるように、例えば、15個のヌクレオチドからなるプローブの7番目の位置、または16個のヌクレオチドからなるプローブの8番目または9番目の位置、となるように配置される。このようにして、異なる対立遺伝子間のハイブリダイゼーションの違いが得られる。本発明の一実施形態によれば、プローブは、対立遺伝子を検出するための診断方法などに使うことができる。診断方法はサザンブロッティングであってもよく、サザンブロッティングによれば、プローブが予め結合したマイクロアレイを用いる方法を用いて、核酸のハイブリダイゼーションを利用して検出が行われる。
本発明の他の態様による心血管疾患診断用マイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド若しくはその相補的ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、またはそのcDNAを含む。
本発明の一実施形態によれば、マイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド若しくはその相補的ポリヌクレオチド、プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、またはそのcDNAを利用し、本分野の当業者に周知である従来の方法により製造されてもよい。
例えば、前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−L−リシン及びアルデヒドの活性基で被覆された基板上に固定されていてもよい。また、基板は、シリコンウェハー、ガラス、石英、金属又はプラスチックで構成されていてもよい。ポリヌクレオチドを基板上に固定化させる方法としては、圧電方式を利用したマイクロピペッティング法、ピン状のスポッターを利用した方法のいずれかを使用できる。
本発明の他の態様による心血管疾患診断用のキットは、マイクロアレイを含む。
前記キットは、被検体からSNPを含むDNAを分離し増幅するためのプライマーセットをさらに含んでいてもよい。適切なプライマーセットは、本発明の一実施形態による配列を参照し、当業者であれば容易に設計しうる。例えば、表4のプライマーセットを利用できる。
本発明の他の態様による心血管疾患の診断方法は、本発明の多重SNPマーカーを使用する。
前記診断方法は、被検体のSNPの遺伝子型を決定する段階を含み、ここで、SNPは、表2の多重SNPマーカーを含むSNPの一つである。SNPは、配列番号1から35のポリヌクレオチドによって同定することができ、ここで、該SNPは、参照ポリヌクレオチド中の、配列番号4の76番目、配列番号8の85番目、配列番号9の51番目、配列番号10の35番目、配列番号19の85番目、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目に位置する。この方法は、さらに各多重SNPマーカー内の各SNP、または各多重SNPマーカー内の各SNPの遺伝子型を決定する段階を含むことができる。また、この方法は、さらに被検体から試料を得る段階を含んでもよく、ここで、試料は核酸またはポリペプチドを含んでおり、またはさらに被検体から核酸を分離する段階を含むことができる。
DNA分離は、この分野の当業者に周知の方法を用いて行ってもよい。例えば、組織または細胞からDNAを直接に精製したり、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などを使用し、特定の領域を増幅し、これを分離したりすることができる。本明細書において、DNAとは、DNAだけではなく、mRNAから合成されるcDNAも参照する。被検体から核酸を得る段階は、例えば、PCR増幅の一つ、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace, Genomics 4, 560(1989); Landegren etc., Science 241, 1077(1988))、転写増幅(Kwoh etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989))及び自家維持配列複製(Guatelli etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990))及び核酸配列に基づく増幅(NASBA)が使われる。
分離されたDNAの配列決定は、この分野の当業者に周知の様々な方法によって行われ得る。例えば、核酸のヌクレオチドはジデオキシ法を用いて直接的に配列決定してよい。同様に、多型部位のヌクレオチドは、SNP部位の配列を含むプローブまたはそれに相補的なプローブをDNAとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの程度を調べることによって配列決定してもよい。ハイブリダイゼーションの程度は、検出可能な標識を標的DNAに標識し、ハイブリダイズした標的を特異的に検出する方法を用いるか、電気的信号検出方法を用いて測定できる。多型部位の遺伝子型を決定する段階は、被検体から分離した核酸試料を、本発明の実施形態によるSNPを含むポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドとハイブリダイズしたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる段階、及びハイブリダイゼーションの結果を検出する段階とを含むことができる。加えて、SNPの遺伝子型決定は、実施例の質量分析法、またはこの分野で周知の他の適切な方法いずれを利用して行ってもよい。
心血管疾患の診断方法は、SNPの遺伝子型が、選択された多重SNPマーカーのうちのSNPについて、表2に列挙された心血管疾患に関連のある遺伝子型に適合する場合、被検体を心血管疾患の発現及びその確率の高い、高危険群に属すると判定する段階をさらに含むことができる。加えて、その方法は、被検体に対して選択された多重SNPマーカーのうちの各SNPに対する遺伝子型を決定する段階、及び選択された多重SNPマーカーのうちの各SNPに対して決定された遺伝子型が、そのSNPについて表2に列挙された心血管疾患に関連のある遺伝子型に適合する場合、被検体は心血管疾患発現のより高い危険群に属すると判定する段階をさらに含むことができる。
有利な効果
本発明のSNPは、心血管疾患の診断及び治療のために使用できる。また、本発明のSNPを含むマイクロアレイ及びキットにより、心血管疾患を効果的に診断できる。また、本発明の心血管疾患と関連したSNP分析により、心血管疾患の存在または危険の有無を効果的に診断できる。
本発明のSNPは、心血管疾患の診断及び治療のために使用できる。また、本発明のSNPを含むマイクロアレイ及びキットにより、心血管疾患を効果的に診断できる。また、本発明の心血管疾患と関連したSNP分析により、心血管疾患の存在または危険の有無を効果的に診断できる。
最良の形態
本発明を以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
本発明を以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
多重SNPマーカーの選別
心血管疾患と診断され治療中である患者群と、心血管疾患症状のない健常者との血液からDNA試料を分離した。それから、特定SNPの対立遺伝子の出現頻度を分析した。患者群と健常者群双方は韓国人からなる。本実施例のSNPは、公開されたデータベース、NCBI dbSNP(NCBI dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)またはシーケノム社のウェブサイト(http://www.realsnp.com/)から選択した。選択されたSNP近傍の配列とハイブリダイズするプライマーを利用し、SNPを分析した。
多重SNPマーカーの選別
心血管疾患と診断され治療中である患者群と、心血管疾患症状のない健常者との血液からDNA試料を分離した。それから、特定SNPの対立遺伝子の出現頻度を分析した。患者群と健常者群双方は韓国人からなる。本実施例のSNPは、公開されたデータベース、NCBI dbSNP(NCBI dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)またはシーケノム社のウェブサイト(http://www.realsnp.com/)から選択した。選択されたSNP近傍の配列とハイブリダイズするプライマーを利用し、SNPを分析した。
1−1.DNA試料の調製
心血管疾患と診断され、治療中である221人の韓国人男性患者群の血液からDNAを抽出した。心筋梗塞症状のない韓国人男性192人の健常者群の血液からもDNAを抽出した。染色体DNA抽出は、公知の抽出法(A Laboratory Manual, p.392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)と市販のキット(Gentra system、D−50K)の説明書とを用いてなされた。UV測定(260/280nm)により、少なくとも1.7の純度を持つDNAだけを抽出したDNAから選別し、使用した。
心血管疾患と診断され、治療中である221人の韓国人男性患者群の血液からDNAを抽出した。心筋梗塞症状のない韓国人男性192人の健常者群の血液からもDNAを抽出した。染色体DNA抽出は、公知の抽出法(A Laboratory Manual, p.392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)と市販のキット(Gentra system、D−50K)の説明書とを用いてなされた。UV測定(260/280nm)により、少なくとも1.7の純度を持つDNAだけを抽出したDNAから選別し、使用した。
1−2.標的DNAの増幅
分析しようとする705個のSNPのうち、少なくとも1つを含む一定のDNA領域を有する標的DNAをPCRを利用して増幅した。PCRは、従来の方法で進め、その条件は、次の通りであった。まず、染色体DNAを2.5ng/mlになるまで希釈した。次に、次のPCR混合液を準備した。
分析しようとする705個のSNPのうち、少なくとも1つを含む一定のDNA領域を有する標的DNAをPCRを利用して増幅した。PCRは、従来の方法で進め、その条件は、次の通りであった。まず、染色体DNAを2.5ng/mlになるまで希釈した。次に、次のPCR混合液を準備した。
水(HPLC級) 2.24□
10×バッファ(15mM MgCl2、25mM MgCl2を含有)0.5□
dNTP混合液(GIBCO)(25mM/各)0.04□
Taq pol(HotStart)(5U/□)0.02□
フォワード/リバースプライマー混合液(1μM/各)0.02□
DNA1.00□
総体積5.00□
ここで、増幅反応によって、200以下のヌクレオチドを含む標的DNA断片を得るために、フォワード及びリバースプライマーは、公知の参照配列中の適正な位置に存在するSNPの上流と下流とから選択した。705個のプライマーセットのいくつかを表4に示す。
10×バッファ(15mM MgCl2、25mM MgCl2を含有)0.5□
dNTP混合液(GIBCO)(25mM/各)0.04□
Taq pol(HotStart)(5U/□)0.02□
フォワード/リバースプライマー混合液(1μM/各)0.02□
DNA1.00□
総体積5.00□
ここで、増幅反応によって、200以下のヌクレオチドを含む標的DNA断片を得るために、フォワード及びリバースプライマーは、公知の参照配列中の適正な位置に存在するSNPの上流と下流とから選択した。705個のプライマーセットのいくつかを表4に示す。
PCRの熱循環は、95℃で15分間維持し、その後95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分を計45回繰り返し、72℃で3分間維持した後、4℃で保管した。
1−3.増幅された標的DNAのSNPの分析
標的DNA断片のSNP分析は、シーケノム社の均質的MassExtend(hME)法を利用して行った。hME法の原理は、次の通りである。まず、標的DNA断片のSNP直前までの塩基に相補的な、伸長用プライマーとも呼ばれるプライマーを準備した。次に、そのプライマーを標的DNA断片にハイブリダイズさせ、DNA重合反応を促進させた。このとき、被検体のSNP対立遺伝子の中の第一対立遺伝子塩基(例えば、A対立遺伝子)に相補的な塩基を加えた後、反応液に加えたのは、重合を終了させるための試薬(終止混合液、例えば、ddTTP)である。その結果、標的DNA断片が第1対立遺伝子(例えばA対立遺伝子)を含む場合には、添加された第一対立因子に相補的な塩基(例えば、T)だけを含む生成物が得られた。一方、標的DNA断片が第二対立遺伝子(例えば、G対立遺伝子)を含む場合には、第一対立遺伝子塩基(例えば、A)まで伸びた第二対立遺伝子に相補的な塩基(例えば、C)を有する生成物が得られた。標的DNAの中の対立遺伝子の種類を決定するため、プライマーから伸びた生成物の長さを質量分析を用いて決定した。具体的な実験条件は、次の通りであった。
標的DNA断片のSNP分析は、シーケノム社の均質的MassExtend(hME)法を利用して行った。hME法の原理は、次の通りである。まず、標的DNA断片のSNP直前までの塩基に相補的な、伸長用プライマーとも呼ばれるプライマーを準備した。次に、そのプライマーを標的DNA断片にハイブリダイズさせ、DNA重合反応を促進させた。このとき、被検体のSNP対立遺伝子の中の第一対立遺伝子塩基(例えば、A対立遺伝子)に相補的な塩基を加えた後、反応液に加えたのは、重合を終了させるための試薬(終止混合液、例えば、ddTTP)である。その結果、標的DNA断片が第1対立遺伝子(例えばA対立遺伝子)を含む場合には、添加された第一対立因子に相補的な塩基(例えば、T)だけを含む生成物が得られた。一方、標的DNA断片が第二対立遺伝子(例えば、G対立遺伝子)を含む場合には、第一対立遺伝子塩基(例えば、A)まで伸びた第二対立遺伝子に相補的な塩基(例えば、C)を有する生成物が得られた。標的DNAの中の対立遺伝子の種類を決定するため、プライマーから伸びた生成物の長さを質量分析を用いて決定した。具体的な実験条件は、次の通りであった。
まず、PCR生成物から、遊離dNTPを除去した。このために、純水1.53□、hMEバッファ0.17□、エビアルカリホスファターゼ(SAP)0.30□を1.5mlチューブに入れて混合し、SAP酵素溶液を準備した。このチューブを5,000rpmで10秒間遠心分離した。その後、PCR生成物をSAP溶液チューブに入れ、密封し、37℃で20分、85℃で5分間維持した後、4℃で保管した。
次に、前記標的DNA生成物をテンプレートとして均質的伸長反応を実施した。反応液は、次の通りであった。
水(ナノクラスの純水)1.728□
hME伸長混合液(2.25mM d/ddNTPsを含む10×バッファ)0.200□
伸長プライマー(各100μM)0.054□
サーモシークエナーゼ(32U/□)0.018□
総体積2.00□
反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離を行った。前記反応液の入ったチューブまたはプレートを密封し、94℃で2分間維持し、続いて94℃で5秒、52℃で5秒、72℃で5秒の条件で計40回反復した後、4℃で保管した。得られた均質的伸長反応生成物を樹脂(SpectroCLEAN、シーケノム社 #10053)で洗浄し、塩を除去した。均質的伸長反応に使われた延長プライマー705個のうちいくつかを表4に表した。
hME伸長混合液(2.25mM d/ddNTPsを含む10×バッファ)0.200□
伸長プライマー(各100μM)0.054□
サーモシークエナーゼ(32U/□)0.018□
総体積2.00□
反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離を行った。前記反応液の入ったチューブまたはプレートを密封し、94℃で2分間維持し、続いて94℃で5秒、52℃で5秒、72℃で5秒の条件で計40回反復した後、4℃で保管した。得られた均質的伸長反応生成物を樹脂(SpectroCLEAN、シーケノム社 #10053)で洗浄し、塩を除去した。均質的伸長反応に使われた延長プライマー705個のうちいくつかを表4に表した。
得られた伸長反応生成物について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)を用いて質量分析を行った。MALDI−TOFでは、分析しようとする物質がレーザービームを照射され、イオン化されたマトリックス(3−ヒドロキシピコリン酸)と共に真空中を検出器まで飛行する。検出器までの飛行時間を計算して質量を決定する。軽い物質は重い物質よりも短い時間で検出器に到達することができる。標的DNAのSNPのヌクレオチド配列は、質量の差と、既知のSNPの配列とに基づいてを決定できる。
診断数値を有すると判明した各SNPの可能な対立遺伝子を、表1に表示されたヌクレオチド配列に示す。各対立遺伝子は、個体においてホモ接合体またはヘテロ接合体の形態で存在しうる。メンデルの遺伝法則とハーディー−ワインバーグ(Hardy-Weinberg)法則とによれば、集団を構成する対立遺伝子の遺伝的な構成は、一定の頻度に維持される。与えられたSNPの対立遺伝子の頻度が、疾患群と健常群とで統計的に有意なレベルで異なっている場合には(すなわち、患者群対健常群により示されるような一般的集団についてハーディー-ワインバーグ平衡を介して予想される対立遺伝子頻度)、その変動は予測値を与え、従って、心血管疾患の診断に効果的に使うことができる。選択されたSNPは、一般的集団で同定され公開データベースで確認されるほど頻度が高いために、本発明の実施形態による705個の単一のSNPはいずれも、双方の集団において生じる。
1−4.多重SNPマーカーの選別
心血管疾患患者で頻繁に発見されるSNPの組み合わせ、すなわち多重SNPマーカーを、221人の男性心血管疾患患者と192人の男性健常者に対し、分析した705個のSNP配列に基づき、選別した。
心血管疾患患者で頻繁に発見されるSNPの組み合わせ、すなわち多重SNPマーカーを、221人の男性心血管疾患患者と192人の男性健常者に対し、分析した705個のSNP配列に基づき、選別した。
まず、705個のSNP配列のうち1〜3個を有し、かつ、あり得る多重SNPマーカーの数は、ほぼ7.3×109個あるということを見出した。
一次スクリーニングの後、遺伝子型の差が0.1×(全体患者の数、すなわち221)以上かつ遺伝子型比2以上を有する11,582,361個の多重SNPマーカーを選別した。
遺伝子型の比=(ある遺伝子型を有する患者の数)/(その遺伝子型を有する健常者の数)
遺伝子型の差=(ある遺伝子型を有する患者の数)−(その遺伝子型を有する健常者の数)
さらに、疾患群及び健常群で遺伝子型パターンの頻度の差についてp値が10−6以下である5,348個の多重SNPマーカーを選別した。フィッシャーの直接確率検定を用いて得られるp値は、さらに正確な統計的有意性を調べるのに使われる変数である。本発明の実施形態によれば、p値が10−6以下である場合には、その遺伝子型は危険因子または保護因子を示し、それにより、表現型と疾病の間には有意な関係があることが判明する。
遺伝子型の差=(ある遺伝子型を有する患者の数)−(その遺伝子型を有する健常者の数)
さらに、疾患群及び健常群で遺伝子型パターンの頻度の差についてp値が10−6以下である5,348個の多重SNPマーカーを選別した。フィッシャーの直接確率検定を用いて得られるp値は、さらに正確な統計的有意性を調べるのに使われる変数である。本発明の実施形態によれば、p値が10−6以下である場合には、その遺伝子型は危険因子または保護因子を示し、それにより、表現型と疾病の間には有意な関係があることが判明する。
二次スクリーニングでは、オッズ比、そのオッズ比の95%信頼区間及び99%信頼区間を用いた。オッズ比はad/bcで定義され、ここで、a、b、c及びdは表5で定義される。オッズ比が1を超える場合には、遺伝子型は心血管疾患に危険因子として働くことを意味する。
オッズ比の95%信頼区間=(オッズ比×exp(−1.960),オッズ比×exp(1.960)(ここで、V=1/a+1/b+1/c+1/d)
オッズ比の99%信頼区間=(オッズ比×exp(−2.576),オッズ比×exp(2.576)(ここで、V=1/a+1/b+1/c+1/d)
選別された5,348個の多重SNPマーカーのうち、2,826個の多重SNPマーカーは、95%信頼区間の下限が2.0以上である多重SNPマーカーによって選別されて、オッズ比が3.0以上である多重SNPマーカーを選別し、それから、オッズ比の99%信頼区間の下限が2.0以上である多重SNPマーカーを選別した。オッズ比、並びに、95%及び99%信頼区間の下限値が1.0を超えれば、結果は統計的に有意なものである。しかしながら、もっとも効果的なマーカーを選別するために、要求される基準値をそれぞれ2.0、3.0及び2.0とした。
オッズ比の99%信頼区間=(オッズ比×exp(−2.576),オッズ比×exp(2.576)(ここで、V=1/a+1/b+1/c+1/d)
選別された5,348個の多重SNPマーカーのうち、2,826個の多重SNPマーカーは、95%信頼区間の下限が2.0以上である多重SNPマーカーによって選別されて、オッズ比が3.0以上である多重SNPマーカーを選別し、それから、オッズ比の99%信頼区間の下限が2.0以上である多重SNPマーカーを選別した。オッズ比、並びに、95%及び99%信頼区間の下限値が1.0を超えれば、結果は統計的に有意なものである。しかしながら、もっとも効果的なマーカーを選別するために、要求される基準値をそれぞれ2.0、3.0及び2.0とした。
2,826個の多重SNPマーカーのうち、少数の単一のSNPから構成され、高いオッズ比、すなわち患者群に対しては高いカバー率、かつ、健常群に対しては低いカバー率を有する12個の多重SNPマーカーを、最適化方法であるグリーディー法(Cormen et al., “Introduction to Algorithms”, MIT Press, 2001)を用いて選別した。12個の多重SNPマーカーは、表2に示されている。
実施例2
SNP固定マイクロアレイの製作
選別した多重SNPマーカーの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを基板上に固定してマイクロアレイを製作した。すなわち、配列番号1から35の20個のコンティグヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、ここで、表1のヌクレオチド配列の20個のコンティグヌクレオチドの11番目に位置するSNPの塩基を含む各ポリヌクレオチドが基板に固定された。配列番号1から35において、SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、及び配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置する。各SNP配列に2つのポリヌクレオチドが基板に固定され、それは各SNPの2つの対立遺伝子それぞれに一つずつである。
SNP固定マイクロアレイの製作
選別した多重SNPマーカーの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを基板上に固定してマイクロアレイを製作した。すなわち、配列番号1から35の20個のコンティグヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、ここで、表1のヌクレオチド配列の20個のコンティグヌクレオチドの11番目に位置するSNPの塩基を含む各ポリヌクレオチドが基板に固定された。配列番号1から35において、SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、及び配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置する。各SNP配列に2つのポリヌクレオチドが基板に固定され、それは各SNPの2つの対立遺伝子それぞれに一つずつである。
まず、各ポリヌクレオチドの5’末端をアミン基で置換し、そのポリヌクレオチドをシリル化スライド(Telechem社)にスポッティングし、このとき、スポッティングバッファは2×SSC(pH7.0)を使用した。スポッティング後、乾燥器中で2分間スライドの温度を95℃に昇温させることによって結合を誘導した。結合していないポリヌクレオチドを、ブロッキング溶液(1.0g NaBH4、PBS(pH7.4)300mL、EtOH 100mL)で15分間、0.2%SDS溶液で1分間、三次蒸溜水で2分間洗浄することによって除去し、常温で乾燥させた。
実施例3
マイクロアレイを利用した心血管疾患診断
実施例1の1−1及び1−2で説明した方法を用いて、心血管疾患の発現またはその確率を診断するために、被検体の血液から標的DNAを分離し、蛍光物質で標識した。蛍光標識された標的DNAは、実施例2で製造されたマイクロアレイを用い、UniHybハイブリダイゼーション溶液(TeleChem社)でハイブリダイゼーションを42℃で4時間行った。スライドは2×SSCで室温、5分間の条件で二回洗浄した後、空気中で乾燥した。乾燥したスライドをScanArray 5000(GSI Lumonics社)でスキャンした。スキャン結果をQuantArray(GSI Lumonics社)とImaGeneソフトウェア(BioDiscover社)とで分析した。被検体が本発明の実施形態による多重SNPマーカー全部または一部を有しているか否かを確認することにより、心血管疾患の発病可能性及び心血管疾患に対する感受性を測定した。
マイクロアレイを利用した心血管疾患診断
実施例1の1−1及び1−2で説明した方法を用いて、心血管疾患の発現またはその確率を診断するために、被検体の血液から標的DNAを分離し、蛍光物質で標識した。蛍光標識された標的DNAは、実施例2で製造されたマイクロアレイを用い、UniHybハイブリダイゼーション溶液(TeleChem社)でハイブリダイゼーションを42℃で4時間行った。スライドは2×SSCで室温、5分間の条件で二回洗浄した後、空気中で乾燥した。乾燥したスライドをScanArray 5000(GSI Lumonics社)でスキャンした。スキャン結果をQuantArray(GSI Lumonics社)とImaGeneソフトウェア(BioDiscover社)とで分析した。被検体が本発明の実施形態による多重SNPマーカー全部または一部を有しているか否かを確認することにより、心血管疾患の発病可能性及び心血管疾患に対する感受性を測定した。
本発明を実施例を参照して特に明らかにし説明したが、当業者ならば、以下の請求の範囲で定義する本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに多様な変更を形式や細部において加えうるということを理解するであろう。ここで特に指摘しない限り、あるい文脈により明らかに矛盾しない限り、上記の要素のどのような組み合わせも、それらの可能な変更すべてにおいて、本発明に包含される。
Claims (18)
- 心血管疾患診断用のポリヌクレオチドセットであって、
該セットは表2中1から12番の多重SNPマーカーからなる群から選択された多重SNPマーカーにおいて、少なくとも2個の一塩基多型(SNPs)のそれぞれの遺伝子型に対応する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号1から35のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも10個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも10個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中SNPの塩基を含み、
ここで、該SNPは、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、
(b)核酸配列(a)の相補的配列を含むことを特徴とする、心血管疾患診断用のポリヌクレオチドセット。 - 前記セットが、前記選択された多重SNPマーカーにおいて、前記SNPのそれぞれの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチドセット。
- 前記セットが、表2の前記多重SNPマーカーそれぞれにおいて、前記SNPのそれぞれの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチドセット。
- 各ポリヌクレオチドは、前記選択されたヌクレオチド配列について、10から100個のコンティグ塩基を含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチドセット。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドセットとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドセット。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドセットまたは該ポリヌクレオチドセットの各ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、心血管疾患診断用のマイクロアレイ。
- 前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−L−リシン及びアルデヒドからなる群から選択された活性基で被覆された基板上に固定されることを特徴とする、請求項6に記載のマイクロアレイ。
- 前記基板は、シリコン、ガラス、石英、金属及びプラスチックからなる群から選択された材料で構成されることを特徴とする、請求項7に記載のマイクロアレイ。
- 請求項6に記載のマイクロアレイを含む、心血管疾患診断用のキット。
- 心血管疾患の診断方法であって、
被検体の一塩基多型(SNP)の遺伝子型を決定する過程を含み、
ここで、前記SNPは、表2中1から12番の多重SNPマーカーから選択された多重SNPマーカーを含むSNPのうちの一つであり、
ここで、前記SNPは、配列番号1から35から選択された配列により同定され、
ここで、前記SNPは、前記選択された配列中、配列番号4の76番目のヌクレオチド、配列番号8の85番目のヌクレオチド、配列番号9の51番目のヌクレオチド、配列番号10の35番目のヌクレオチド、配列番号19の85番目のヌクレオチド、または配列番号1から3、5から7、11から18及び20から35の101番目のヌクレオチドに位置することを特徴とする、心血管疾患の診断方法。 - 前記遺伝子型を決定する過程は、
前記被検体から核酸試料を得る段階と、
該核酸試料を前記SNPの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる段階と、
ハイブリダイゼーションの結果を検出する段階とを含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。 - 前記SNPに対する、前記決定された遺伝子型が、前記選択された多重SNPマーカー中のSNPに対する、表2に列挙された心血管疾患に関連した遺伝子型と適合する場合に、前記被検体は、心血管疾患の罹患の危険が高いと判定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記選択された多重SNPマーカー中の各SNPの遺伝子型が、前記被検体に対して決定されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記選択された多重SNPマーカー中の各SNPに対する、前記決定された遺伝子型が、前記SNPに対する表2に列挙された心血管疾患に関連した遺伝子型と適合する場合に、前記被検体は心血管疾患の罹患の危険が高いと判定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記被検体は、人間の男性であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中及び血栓症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記心血管疾患は、心筋梗塞症であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 表2に列挙された前記多重SNPマーカーの各々において、各SNPの遺伝子型を決定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
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