KR101058583B1 - 뇌경색 진단용 다중 ｓｎｐ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ는 서열번호 1 내지 43으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

Description

뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 {Multiple SNP for diagnosis of ischemic stroke, and microarray and kit comprising the same}

본 발명은 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.

모든 생물의 게놈은 진화의 과정에서 자손의 서열에 변이체를 생기게 하는 자발적 돌연변이를 겪는다(Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831-854, 1986). 변이체는 자손 형태에 비하여 진화적으로 이익 또는 불이익을 주거나 중성적일 수 있다. 어떤 경우는 변이체가 치사적 불이익을 주어 자손에게 전달되지 않는 경우도 있다. 다른 경우에는, 종에게 진화학적인 이익을 주고, 결국에는 종의 대부분에 DNA가 삽입되어 효과적으로 선조 형태가 된다. 많은 경우 이 선조 형태 및 변이체는 살아남아 종집단 중에 공존하게 된다. 서열의 복수 형태의 공존에 의하여, 다형 (polymorphism)이 발생한다.

이러한 다형에는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), STR (short tandem repeats) 및 SNP(single nucleotide polymorphism) 등이 알려져 있 다. 이중 SNP는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP는 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 SNP가 발생할 수 있다. 이들 중 일부는 예컨대, 결함있는 스플라이싱의 결과로서 결함있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다.

SNP는 인간의 경우 약 1,000bp 마다 1회의 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 SNP가 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 SNP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다. 이렇게 찾아낸 SNP의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개하고, 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다.

그러나 이러한 SNP는 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 SNP가 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.

뇌경색(ischemic stroke)은 선진국의 경우 심장병과 암에 이어 사망을 일으키는 원인 중 3위를 차지하며 전체적인 유병율은 10만 명당 794명이다. 2000년 뇌경색 질환의 대표 질병인 중풍으로 사망한 한국인은 3만 3천여 명이며, 인구 10만 명당 73.2명으로 단일질환으로는 국내 사망 원인 1위일 뿐만 아니라, 중풍 환자의 약 70~80%는 운동마비, 언어장애, 치매와 같은 인지장애 등의 심각한 후유증을 남겨 삶의 질 저하와 사회경제적 비용소모가 크다.

종래 뇌경색을 비롯한 복잡한 질병을 진단 혹은 조기 예측하는데 가장 큰 문제점은, 이들 질환이 어느 정도 진행되어야 물리적인 방법을 사용하여 진단해 낼 수 있다는 것이다. 현재 뇌경색에 걸린 환자의 병인을 조사하기 위하여 혈액시험, CT 촬영, MRI 촬영, 도플러 울트라사운드, 동맥 X선 촬영법 등이 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 뇌경색의 병인을 현상적으로 파악하는 것들로서 근본적인 병인, 즉, 유전적 요인을 밝히기는 어렵다. 더구나 위의 방법들은 이미 뇌경색에 걸린 후에 측정하는 방법들로서 정상인이 뇌경색에 걸릴 가능성이 높은지를 예진할 수 있는 기능은 발휘하지 못한다. 뇌경색을 일단 겪게 되면 그 결과는 인체에 매우 치명적이어서 발병 후 진단보다는 발병 전에 발병 가능성을 미리 아는 것이 무엇보다도 중요하다.

따라서, 뇌경색을 진단 혹은 조기 예측하는데 사용되던 종래 기술의 상기 문제점들을 해결하기 위하여 유전자 돌연변이형 검사법이 제시되었고, 상기 유전자 돌연변이형 검사법에는 서던 블롯(southern blotting) 방법과 슬랩 겔 전기영동 (slab gel electrophoresis)법, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)법 등이 있다. 그러나, 상기 서던 블롯 방법은 처리시간이 많이 걸리고, 여러 준비과정을 거치는 번거로움과 많은 인력이 요구되며, 다량의 DNA가 요구된다는 문제점을 가지고 있으며, 상기 슬랩 겔 전기영동법 또한 처리시간이 오래 걸리고 감도가 떨 어지며 시료의 전처리 과정이 필요하다는 문제점이 있고, 상기 모세관 전기영동법은 처리시간은 비교적 짧으나 유전자 증폭과정이 필요하며 장치의 소형화가 어렵다는 문제점을 갖는다.

최근에는 유전자나 유전자 변이 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 혼성화(hybridization)를 이용하는 마이크로어레이나 진단칩을 이용하여 뇌경색 진단을 위한 검사시간의 단축, 검사정확도 증가, 대량검사 등의 개선을 시도하는 방법들이 연구되어 왔으며 (대한민국등록특허 제 10-0506185호, 제 10-0487911호, 제 10-0487912호, 제 10-0634467호), 한 번의 검사로 고혈압, 동맥경화증, 치매, 골다공증, 당뇨합병증 등을 동시에 진단하려는 검사 방법도(대한민국등록특허 제 10-0759520호) 연구되어 왔다.

그러나, 상기 진단방법들이 가지는 장점들에도 불구하고, 상기의 방법들은 종래에 뇌경색과 관련되어 있다고 보고되고 있는 유전자가 다양하지만, 직접적인 원인이 되고 있는 것으로 알려진 경우는 드문 상황에서, 종래에 뇌경색에 관련이 있다고 알려진 많은 유전자 중 한 두 개의 유전자의 발현량이나 유전자 내 변이를 검사하여 뇌경색의 진단이나 발병 가능성을 예측하고자 함으로써, 그 정확도를 기대하기가 어렵다고 할 것이다.

또한, 상기 뇌경색과 관련있는 유전자들의 연구가 대부분 외국인을 대상으로 수행된 것들로서 뇌경색의 경우와 같은 복합질병(complex disease)의 경우 인구 집단에 따라 기여하는 유전적 요인이 달라질 수 있으므로, 한국인에 있어서의 뇌경색의 진단을 위해서는 한국인 뇌경색 환자들을 대상으로 한 연구에서 도출된 유전적 지표를 사용하는 것이 정확한 진단을 위하여 필수적인 조치라 할 것이다.

상기 종래 기술들의 문제점을 고려할 때, 종래 기술의 장점을 유지하면서 뇌경색 진단 및 조기 예측의 정확도를 높이기 위해서는 잠재적으로 뇌경색과 관련된 가능한 많은 유전적 지표 또는 이들의 조합을 고려해야 하며, 사용될 유전적 지표가 한국인을 대상으로 연구되어야 하고, 연구가 유전체 전영역에 걸쳐 수행되어 가능한 많은 유전적 요인들이 지표로 사용되는 것이 효과적일 것이라고 기대할 수 있다.

본 발명자들은 한국인을 대상으로 뇌경색의 발병 및 그의 확률을 조기에 진단할 수 있는 SNP를 발굴하기 위하여 유전체 전체를 대상으로 연구를 수행하던 중, 뇌경색이 발병된 개체들의 경우 특정 SNP들을 동시에 갖고 있으며, 이러한 특정 SNP들을 이용하여 뇌경색의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트를 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 43으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 다중 ＳＮＰ의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 뇌경색 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 뇌경색 진단용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ는 서열번호 1 내지 43으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

서열번호 1 내지 43으로 표시되는 SNP 위치의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드들은 하기 표 1에 나타낸다.

SNP는 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다(약 1개/1kb).

또한, 상기 SNP의 dbSNP 등록번호는 상기 각 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 등록번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI의 dbSNP에 등록되어 있는 SNP의 rs 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

또한, 상기 서열번호 1 내지 43은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열 (polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 43으로 표시되는 SNP 위치의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 각 SNP의 특성은 하기 표 2에 나타낸다.

표 2에서 '밴드'는 각 단일 SNP가 위치하는 염색체 번호, 각 염색체 상의 동원체를 중심으로 한 단완(short arm;p) 부분 또는 장완(long arm;q) 부분 및 밴드 번호를 의미한다. 예를 들어, 서열번호 1에 포함되어 있는 SNP의 위치는 14q13.1이며, 이는 14번 염색체 상의 장완 부분(q)의 13.1 밴드 상에 존재함을 의미한다.

상기 '유전자'는 각 SNP를 포함하는 유전자를 의미한다.

상기 'SNP의 역할'은 상기 유전자 내에서 상기 각 단일 SNP가 수행하는 역할을 의미한다.

상기 '유의확률'은 각 SNP가 뇌혈관 질환에 연관되어 있지 않을 확률을 의미하며, 뇌혈관 환자군 집단과 정상인 집단간의 각 SNP의 유전형 분포가 균일하다는 귀무가설 하에서 실제 검사된 유전형 분포가 얻어질 확률을 카이제곱 검정으로 계산한 것이다. 즉, 유의확률이 낮을수록 그 SNP가 뇌혈관 질환에 깊이 연관되어 있음을 나타내어 준다. 예를 들어, 표 2에서 서열번호 1에 해당하는 SNP가 뇌혈관 질환에 연관되어 있지 않다는 가정 하에서, 실험적으로 얻어진 유전형 분포가 나타날 확률은 약 0.04%에 해당하며, 이것은 서열번호 1에 해당하는 SNP가 뇌혈관 질환에 깊이 연관되어 있음을 보여준다. 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 43에 해당하는 SNP들은 유의확률이 0.000002에서 0.008에 이르는 낮은 값으로, 상기의 SNP들이 뇌혈관 질환에 깊이 연관되어 있으며, 상기 SNP들의 유전형 정보를 이용하여 뇌혈관 질환의 진단과 예측에 효과적으로 활용할 수 있음을 기대할 수 있다.

상기 카이제곱 검정은 두 변수 사이의 연관성을 평가하기 위하여 교차분석에서 사용하는 통계적 검정으로, 두 변수가 연관성이 없다는 귀무가설 하에서, 표 3에 나타낸 특정 SNP의 집단별 유전형 빈도에 대한 교차 분할표로부터 수학식 1로 계산된 카이제곱 통계량은 자유도가 (분할표 컬럼수-1)×(분할표 줄수-1) 인 카이제곱 분포를 한다는 것을 이용하여 관측된 데이터가 나올 수 있는 유의확률을 계산하는 통계적 검정법이다.

본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 SNP에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 43으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP의 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 하기 표 4의 조합으로 선택되는 1 내지 30으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 SNP에 있어서, 상기 선택된 폴리뉴클레오티드들의 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기의 대립 유전자형은 각각 표 5에 나타낸 대립 유전자형이 바람직하다.

본 발명에 따른 다중 SNP는 상기 각 단일 SNP들을 조합한 30개의 다중 SNP에 특징이 있다. 상기 각 단일 SNP들의 조합 및 이들의 유전자형은 표 4 및 표 5에 기재되어 있는 바와 같다. 표 4 및 표 5에서, '다중 SNP' 컬럼은 선택된 3개의 단일 SNP의 조합을 나타내는 것이고, '유전자형' 컬럼은 동일한 순서의 각 단일 SNP의 SNP 위치에서의 유전자형을 나타낸다. 예를 들어, 표 5의 다중 SNP 1번에 있어서, rs976336의 유전자형은 AC이고, rs10492393의 유전자형은 GG이고, rs1327631의 유전자형은 GG이다.

본 발명에 있어서 뇌경색은 뇌혈전증 또는 뇌색전증일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 각 단일 SNP들로부터 뇌경색 발병과의 연관성이 매우 큰 단일 SNP들의 조합, 즉 다중 SNP를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳤다. 뇌경색 환자들 및 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, 상기 DNA 중 SNP 위치의 서열을 분석한 다음, 뇌경색 환자들에서만 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 SNP의 특정 조합 및 그들의 유전자형을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서 확인된 SNP 조합 및 그들의 유전자형은 각각 표 4 및 표 5에 나타내었으며, 각 다중 SNP의 특성에 관하여는 하기 표 6에 나타내었다.

표 6에서, '번호'는 다중 SNP의 번호를 나타내는 것으로, 표 4에 기재되어 있는 번호와 동일하다.

'환자군 출현 빈도' 및 '정상군 출현 빈도'는 각각 시험된 123명의 환자와 121명의 정상인 중 해당 다중 SNP를 갖는 것으로 판명된 환자 및 정상인의 수를 나타낸다.

상기 '오즈비(odds ratio)'는 정상군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률의 비율을 나타낸다. 즉, 오즈비는 ad/bc로서, 상기 식에서 a는 표 6에서 환자군의 출현 빈도를 나타내고, c는 표 6에서 정상군의 출현 빈도를 나타낸다. 그리고, b = [(총 환자군 수)-a]이고, d = [(총 정상군 수)-c]이다. 시험된 환자 및 정상군이 각각 123명 및 121명이므로 결국 b = [123-a]이고, d = [121-c]이다.

상기 오즈비가 1을 초과하는 경우 해당 다중 SNP가 환자군과 연관성이 있음을 나타낸다. 오즈비가 클수록 상기 연관성도 증가한다. 표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 다중 SNP 1 내지 30은 68.94 내지 92.8의 오즈비를 갖는다. 이 수치는 1보다 훨씬 큰 수치이므로, 본 발명에 따른 다중 SNP 1 내지 30은 뇌경색의 발병과 큰 연관성이 있음을 알 수 있다.

상기 '95% 신뢰구간'은 해당 오즈비가 존재할 확률이 95%인 구간을 나타내는 것으로, 하기 수학식 2로 계산된다. 신뢰구간이 1을 포함하는 경우, 즉 신뢰구간의 하계가 1 이하이고 상계가 1 이상인 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다.

상기 수학식 1에서, V = 1/a + 1/b + 1/c + 1/d 이다.

상기 '유의확률'은 각 다중 SNP의 유전형 분포가 뇌경색 환자군과 정상군 사이에서 차이가 없다는 귀무가설하에서 계산한, 각 다중 SNP의 유전형 빈도가 측정결과와 같이 얻어질 확률이며, '자유도'는 유의확률을 계산하기 위하여 사용된 카이제곱 분포의 자유도이다. 유의확률이 낮을수록, 측정에서 얻어진 다중 SNP의 유전형 빈도가 뇌경색 환자군과 정상군에서 다르게 나타남을 의미한다.

본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 SNP는 상기 다중 SNP 각각으로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 2 이상의 다중 SNP로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 다중 SNP 1 내지 30 전부로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 뇌경색 진단용 다중 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 10개 이상의 연속 염기인 것이 바람직하고, 10 내지 100개의 연속 염기인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 뇌경색 진단용 마이크로어레이는 서열번호 1 내지 43의 각 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 이들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 이용하여 프로브로 사용함으로써, 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스팟터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 진단용 마이크로어레이의 이용과 제작은 당업계에서는 보편화되어 제공되고 있으며, 본 발명의 서열과 같이 프로브 제작을 위한 용도가 밝혀진 변이 부위의 정보를 가진 당업자들은 용이하게 마이크로어레이의 제작과 연구적 사용이 가능할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 마이크로어레이를 포함하는 뇌경색 진단용 키트는 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법으로 제조될 수 있으며, 상기 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 설계할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 다중 SNP를 이용하면 뇌경색의 존재 또는 위험의 유무를 조기에 효과적으로 진단할 수 있다. 구체적으로, 피검체로부터 핵산 시료를 분리하고 서열번호 1 내지 43 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치 (각 서열의 101번째) 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하여 뇌경색을 진단할 수 있다.

상기 피검체로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법으 로 행할 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 피검체로부터 핵산을 얻는 방법은 PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다. 분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시 법에 의하여 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나 SNP 위치의 서열을 포함하는 프로브 또는 이에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 이로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 혼성화의 정도는 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 피검체로부터 분리한 핵산 시료를 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화시킨 후 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 뇌경색의 진단은 상기 서열번호 1 내지 43 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형이 표 5의 1 내지 30 중 하나 이상인 경우 상기 피검체를 뇌경색 질환에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 다중 SNP의 선별

본 실시예에서는 한국인 중 뇌경색 환자로 판명되어 치료 중인 환자군과 아직 뇌경색 증상이 없는 정상인의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, SNP 마이크로어레이를 이용하여 유전형 검사를 수행하였으며, 검사가 수행된 SNP들의 유전형 데이터로부터 3개의 SNP의 조합으로 이루어지는 조합 중에서 환자군에서 특이적으로 나타나는 조합을 통계적으로 분석하여 뇌경색의 발생확률을 진단할 수 있는 다중 SNP를 선별하였다.

1. DNA 시료의 준비

뇌경색으로 판명되어 치료 중인 환자군(123명)과 아직 뇌경색 증상이 없는 정상인(121명)의 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. 염색체 DNA 추출은 공지의 추출 방법(Molecular cloning : A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Sping Harbor Press, 1989)과 상업용 키트(Gentra system, D-50K)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도 기준이 UV 측정비율(260/280nm)로 최소 1.7 이상 되는 것만을 선별하여 사용하였다.

2. SNP의 유전형(genotype) 분석

SNP의 유전자형 검사는 약 26만개의 프로브가 고정된 마이크로어레이 (Affymetrix, GeneChip Human Mapping 500K Array Set 중 Nsp chip과 GeneChip Fluidics Station 450 시스템)를 이용하여 수행하였다.

3. 다중 SNP의 선별

상기 2에서 분석한 123명의 뇌경색 환자와 121명의 정상인의 총 244명에 대하여 수행한 마이크로어레이를 이용한 유전형 검사결과를 기초로 하여, 뇌경색 환자에서 자주 발견되는 SNP의 조합, 즉 다중 SNP를 선별하였다.

먼저, 상기 마이크로어레이를 이용한 유전형 검사로부터 244명에 대한 262,217개의 SNP에 대한 유전형 데이터를 얻었다. 단일 SNP 마커를 사용하는 것보다 다중 SNP 마커를 사용하는 것이 표현형에 대한 판별력이 증가하므로 본 발명에서는 3개의 SNP가 조합된 다중 SNP 마커를 사용하고자 하였으며, 이 경우 262,217개의 SNP의 조합으로부터 얻어지는 3중 SNP 마커의 가짓수는 3x10¹⁵ 가지에 해당하므로 주어진 전산자원과 기간으로는 분석이 용이하지 않았다. 따라서, 본 발명에서는 일차적으로 단일 SNP에 대한 연관분석(association study)을 통하여 뇌경색과 통계적으로 유의하게 연관된 SNP들을 선별하여 SNP의 개수를 줄이고, 축소된 SNP 집단 내에서의 다중 SNP 마커 조합에 대하여 뇌경색과의 연관성을 심도있게 분석하는 2단계의 과정을 수행하였다. 일차로, 연관분석 프로그램인 plink(Shaun Purcell외, http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/)를 이용하여 뇌경색에 연관된 SNP들을 분석하였다. 전처리 단계에서 정상인을 대상으로 한 하디-와인버그 평형 검사(Hardy-Weinberg equilibrium test)에서 1,140개의 SNP가 제외되었고 (유의확률 <= 0.0001), 결측치를 10% 이상 포함하고 있는 6,540개의 SNP가 제외되었으며, maf(minor allele frequency)가 5% 미만인 74,757개의 SNP를 제외하여 총 175,520개의 SNP를 대상으로 연관분석을 수행하였다. 그 결과로부터 일차적으로 유의확률이 0.01 보다 작은 858개의 뇌경색 연관 SNP를 선별하였다. 선별된 뇌경색 연관 858개로부터 3개의 SNP 조합으로 얻어지는 다중 마커의 수는 1×10⁸ 가지이며, 이는 일반적인 전산자원과 처리기간을 이용하여 처리할 수 있는 양으로 판단되었다. 858개의 SNP로부터 3개씩의 SNP 조합으로 얻어지는 다중 SNP 마커에 대하여, 뇌경색 환자군과 정상군 사이의 유전형 데이터 빈도에 대한 오즈비와 그에 대한 95% 신뢰구간을 분석하여 다중 마커의 위험요인 정도를 평가하였으며, 카이제곱 검정을 통하여 그에 대한 통계적 유의성을 평가하였다.

- 오즈비 : 어느 한 유전자형을 갖거나 갖지 않는 환자 및 정상인의 수가 각각 하기 표 7과 같은 경우, 오즈비 = ad/bc (오즈비가 1을 초과하는 경우 상기 유전자형은 뇌경색에 위험 요인으로 작용함을 의미.)

	특정 다중 SNP 유전자형을 갖는 수	특정 다중 SNP 유전자형을 갖지 않는 수
환자군 빈도	a	b
정상군 빈도	c	d

상기에서 선별된 858개의 조합으로 얻어진 10⁸개의 다중 SNP에 대해 오즈비와 그에 대한 95% 신뢰구간을 계산하여 하계가 2.0 이상인 것을 선별하고, 카이제곱검정에 의한 유의확률이 10^-5보다 작은 30개의 다중 SNP 마커를 최종 선별하였다. 상기 30개의 다중 SNP는 표 4 내지 표 5에 나타내었다.

실시예 2 : 본 발명에 따른 다중 SNP가 고정된 마이크로어레이의 제작

상기 실시예 1에서 선별된 다중 SNP를 기판 상에 고정하여 마이크로어레이를 제작하였다. 즉, 표 1에 나타낸 각 서열번호로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 20개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들(각 SNP는 상기 20개 중 11번째에 위치 함)을 기판상에 고정하였다. 각 SNP 위치에 두 개의 대립형질이 존재하므로 각 서열마다 2개씩의 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하였다.

먼저, 상기 각 폴리뉴클레오티드의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem사)에 스팟팅하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2×SSC(saline-sodium citrate, pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액으로 2분간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH₄, PBS(pH 7.4) 300 mL, EtOH 100 mL)으로 15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 3 : 본 발명에 따른 마이크로어레이를 이용한 뇌경색 진단

상기 실시예 1 및 2에 설명되어 있는 방법을 이용하여 뇌경색 발병 또는 발병 가능성을 진단하고자 하는 대상의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, 형광 표지 시켰다. UniHyb 혼성화 용액(TeleChem 사) 하에서 상기 실시예 2에서 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분간 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000; GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어 (BioDiscover사)로 분석하여 상기 대상이 본 발명에 따른 다중 SNP 전부 또는 일부를 갖고 있는지를 확인하여, 뇌경색의 발병 가능성 및 뇌경색에 대한 감수성을 측정하였다.

본 발명에 따른 다중 ＳＮＰ는 뇌경색 환자들에서만 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 SNP의 특정 조합 및 이들의 유전자형을 가지고 있으므로, 뇌경색의 존재 또는 위험의 유무를 조기에 효과적으로 진단할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 다중 ＳＮＰ는 한국인 집단을 대상으로 하여 수행된 유전형 데이터를 사용하여 발굴한 한국인 특이적 뇌경색 진단 지표이므로, 서양인을 대상으로 연구한 소수의 진단지표를 사용하는 경우에 비하여 한국인의 뇌경색의 조기 진단과 예측에 보다 정확하고 효과적일 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Multiple SNP for diagnosis of ischemic stroke, and microarray and kit comprising the same <130> P09-06646 <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 catggattta taatacccct ccaagtattt agatctataa actaattaat atgaacgtta 60 caaagggatg acacattttt aaatgtataa aagttgacca yatatgacag aatcctgcta 120 tactctaatg gctttaggct ttttgtcact aacatgactt cttatctcag atattgtgcc 180 tattgtgcct acagtccaaa a 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tctatcttca atcaatactt gccaggattt tatgtatatt cctacataag gccacttttc 60 tctccacata aaattaatag ctaggtatac tgcttgaaga mgtgtccact ggaaggataa 120 tctttatcca ttgtcttcca agactaccca tgttttgtgg tagccctcaa cacctgcttt 180 attaacatat tgacctgatt c 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cttgatttgg gggcatgttt aacaacacta ccactcaatg agttctgagc cattgttatg 60 gtatatacaa acaattataa attgtaagag cactgaacag waagataaca gtacaatata 120 ataacagtta cacaatcatt caggaatgtt ttcaggctac aaagtcaagt gtggttcatg 180 ggatactttt atttccaata t 201 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaccaacttg agtgttatcc atcaggtagg tgcagctgag ctcaggggaa acatgtgggt 60 agttctaagc caagccagcc tatctatcca gattccctta rggactaggt tctgcaggaa 120 agctgtggag atctgagaag gcacctttta agcatcaaca tttttatttt attttagtca 180 tttaagatgg caatcttttg t 201 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aataactgtg cccagcccct taacagcaga gctaaggagg gcgctttcct ctctgcagtc 60 tcagttcttt tccaccctcg gttgttacaa ttgtctacac rtggagaact aatagcattc 120 accaccccct ctcctccacc ccagacccca gcctccttct tctccacctc ctgacagcat 180 cagcccccat ccaacctgta a 201 <210> 6 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttcttaaaac attcaacatg ttaaaaatca tattcaaaat ctaagtacta ataatattct 60 agtattaagc atagattaaa ttttgattgt tgtaactatc ytttgtgaat attgagaaat 120 gatcacaata gcatttttgt tcatgtgttt aattattcat ggcattccat ttgaaggcca 180 acaatattag agtgtgaaaa c 201 <210> 7 <211> 201 <212> DNA <213> 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taagatctta tatctagaga tgtggagata taattttgct 180 gactagagct accatttggc c 201 <210> 21 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 caagtgaata attaagagtt aattttgtat atagtttact aaaaagctca taaataaatt 60 gtctttcact gtaaattaaa ctacatcatg ttgagaaata kcagagcaaa atttggtttt 120 atataactta tttaaaaaac tcaattaagc aacttgctat tacaaagcat gttgttgaaa 180 caccacaaga gttaaaaacc a 201 <210> 22 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gttccaagtc tttgctattg tgaatagtgc cacaataaac atacgtgtgc atgtgccttt 60 atagcagcat gatttgtaat cctttggtgt agagttcatc ygcctttcct ttgagattca 120 ttcgcttccc ttttctgtct gtgttttatg gagctaggaa ataattctcc tgactcctta 180 gcaaactaat ttcagctcta t 201 <210> 23 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 aggttggttc catgactttg ctcctgtgac tagtgctgca atcaaaatat gagtgcaggt 60 gtcttttttt atataatgat ttctttcctt ttgagtagat rctgagctgg atcaaatgat 120 ggttctattt ttagttctct gagaaatctc catactgttt tccatagagg ttaactgatt 180 tgcatcccca ccaaatttat t 201 <210> 24 <211> 201 <212> DNA <213> Homo 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Claims (11)

1. 하기 <표 4>의 다중 SNP 중 13번, 14번, 21번, 23번, 25번, 28번 및 29번의 다중 SNP로 구성되며, 상기 각 다중 SNP를 구성하는 SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드는 각 SNP 위치(각 서열의 101번째) 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.

   <표 4>

   
2. 제 1항에 있어서, 상기 다중 SNP는 상기 <표 4>의 다중 SNP 중 9번 및 12번의 다중 SNP가 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.
3. 제 2항에 있어서, 상기 다중 SNP는 상기 <표 4>의 다중 SNP 중 1번, 2번, 16번, 18번 및 19번의 다중 SNP가 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.
4. 제 3항에 있어서, 상기 다중 SNP는 상기 <표 4>의 다중 SNP 중 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 10번, 11번, 24번 및 30번의 다중 SNP가 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.
5. 제 4항에 있어서, 상기 다중 SNP는 상기 <표 4>의 다중 SNP 중 8번, 15번, 22번 및 27번의 다중 SNP가 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.
6. 제 5항에 있어서, 상기 다중 SNP는 상기 <표 4>의 다중 SNP 중 17번, 20번 및 26번의 다중 SNP가 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.
7. 제 1항의 다중 ＳＮＰ의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 뇌경색 진단용 마이크로어레이.
8. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정되는 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 마이크로어레이.
9. 제 8항에 있어서, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 마이크로어레이.
10. 제 7항의 마이크로어레이를 포함하는 뇌경색 진단용 키트.
11. 제 1항에 있어서, 상기 뇌경색은 뇌혈전증 또는 뇌색전증인 것을 특징으로 하는 뇌경색 진단용 다중 ＳＮＰ.