KR101523769B1

KR101523769B1 - 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 snp 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101523769B1
Application number: KR1020130137929A
Authority: KR
Inventors: 김영주; 방옥선; 김대수; 박근향; 유병태; 차민호
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국 한의학 연구원
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2015-05-27
Also published as: KR20150055496A

Abstract

본 발명은 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 SNP(Single Nucleotide Polymorphism), 이를 포함하는 마이크로어레이, 및 이를 이용한 허혈성 뇌졸중 진단용 키트에 관한 것으로서, 서열번호 1 내지 서열번호 9의 다중 SNP 마커가 허혈성 뇌졸중 환자들에서만 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 SNP의 특정 조합 및 이들의 유전자형을 가지고 있으므로, 상기 SNP를 허혈성 뇌졸중 진단용 마커 및 이의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

허혈성 뇌졸중 진단용 다중 SNP 및 이의 용도{Multiple SNPs for diagnosis of ischemic stroke and use thereof}

본 발명은 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 SNP(Single Nucleotide Polymorphism), 이를 포함하는 마이크로어레이, 및 이를 이용한 허혈성 뇌졸중 진단용 키트에 관한 것이다.

모든 생물의 게놈은 진화의 과정에서 자손의 서열에 변이체를 생기게 하는 자발적 돌연변이를 겪는다(Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831-854, 1986). 변이체는 자손 형태에 비하여 진화적으로 이익 또는 불이익을 주거나 중성적일 수 있다. 어떤 경우는 변이체가 치사적 불이익을 주어 자손에게 전달되지 않는 경우도 있다. 다른 경우에는, 종에게 진화학적인 이익을 주고, 결국에는 종의 대부분에 DNA가 삽입되어 효과적으로 선조 형태가 된다. 많은 경우 이 선조 형태 및 변이체는 살아남아 종집단 중에 공존하게 된다. 서열의 복수 형태의 공존에 의하여, 다형 (polymorphism)이 발생한다. 이러한 다형에는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), STR (short tandem repeats) 및 SNP(single nucleotide polymorphism) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP는 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 SNP가 발생할 수 있다. 이들 중 일부는 예컨대, 결함있는 스플라이싱의 결과로서 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다.

SNP는 인간의 경우 약 1,000bp 마다 1회의 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 SNP가 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 SNP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다. 이렇게 찾아낸 SNP의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개하고, 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다. 그러나 이러한 SNP는 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 SNP가 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.

뇌졸중은 뇌혈관 질환으로서, 심장 질환 및 암과 함께 3가지 주요한 사망 원인이며, 빈발수가 점진적으로 증가됨에 따라 평균 수명 전망 및 인구의 나이를 연장에 영향을 주는 가장 일반적인 질환 중 하나이다. 고혈압, 고지방혈증, 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증은 뇌혈성 뇌졸중에 대한 다양한 중요한 위험인자들로 알려져 있다. 이들은 유전적 인자들에 의해 부분적으로 결정되며 허혈성 뇌졸중의 유전적 연구에서 고려될 수 있는 것이다. 거의 드문, 뇌졸중의 단일기원으로 유전된 형태를 유발하는 많은 유전적 결함을 최근에 동정하였다(Kuhlenbamer G, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2006 Apr;77(4):521-4.). 뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하므로 허혈성 뇌졸중이 심각한 질환이라고 할 수 있다. 최근 신경계는 비면역성 기관(immune privileged organ)이라는 기존의 학설과는 달리 다발성 경화증(multiple sclerosis), 외상, 알쯔하이머 질환(Alzheimer's disease), 뇌허혈(cerebral ischemia) 및 각종 뇌손상 등의 신경 질환시에 중추신경계 내에서도 염증반응이 나타나며 이는 신경퇴행을 야기하는 주요 원인 중의 하나임이 보고되고 있다.

Phosphodiesterase 4D, PDE4D 유전자는 deCODE Genetics, LTD에 의해 허혈성 뇌졸중에 관여되어 있음이 최초로 보고된 신규한 유전자이다(Gretarsdottir et al., 2002). PDE4D 유전자는 염색체(chromosome) 5q12 (STRK1)에 20-cM영역(region)에 존재한다(Gretarsdottir et al., 2003, Gretarsdottir et al., 2002). PDE4D 유전자의 변이가 다른 인종 집단에서 허혈성 뇌졸중과 관련되어 있다고 보고되어 있다(Gretarsdottir et al., 2003, Gretarsdottir et al., 2002, Meschia et al., 2005, Nilsson-Ardnor et al., 2005, Nakayama et al., 2006, Sun andHuang et al., 2009, Staton et al., 2006, Woo et al., 2006, Fidani et al., 2007, Zee et al., 2006, Lohmussaar et al., 2005, Matsushita et al., 2009, Kim et al., 2009, Kuhlenbaumer et al., 2006, Zongli et al., 2009). 그럼에도 불구하고, PDE4D 유전자의 변이가 허혈성 뇌졸중과의 관련성은 일관되지 않으며, 몇몇 연구에서는 뇌졸중과 관련성이 없음을 개시하고 있다(Lohmussaarand Gschwendtner et al., 2005, Matsushita et al., 2009, Kim et al., 2009, Kuhlenbaumer et al., 2006). 아울러, 상기 허혈성 뇌졸중과 관련있는 유전자들의 연구가 대부분 외국인을 대상으로 수행된 것들로서 뇌졸중의 경우와 같은 복합질병(complex disease)의 경우 인구 집단에 따라 기여하는 유전적 요인이 달라질 수 있으므로, 한국인에 있어서의 뇌졸중의 진단을 위해서는 한국인 허혈성 뇌졸중 환자들을 대상으로 한 연구에서 도출된 유전적 지표를 사용하는 것이 정확한 진단을 위하여 필수적인 조치라 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 허혈성 뇌졸중 질환의 발병 및 그의 확률을 조기에 진단할 수 있는 신규한 SNP를 발굴하기 위하여 노력한 결과, 허혈성 뇌졸중 질환이 발병된 개체들의 경우 PDE4D 유전자 내에서 특이적인 SNP들을 동시에 갖고 있음을 확인함으로써, 상기 9개의 SNP들을 이용하여 허혈성 뇌졸중 질환의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 허혈성 뇌졸중을 진단할 수 있는 PDE4D 유전자 내 신규한 9개의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism), 이들의 반수체형(haplotype), 이를 포함하는 마이크로어레이, 및 이를 이용한 허혈성 뇌졸중 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 염기인 단일염기(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 염기인 SNP를 2 이상 포함하는 반수체형(haplotype)을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 염기인 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 염기인 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 마이크로어레이를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 염기인 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검체로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계; 및

2) 상기 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드 27번째에 위치하는 SNP 서열을 결정하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다중 SNP는 허혈성 뇌졸중 환자들에서만 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 SNP의 특정 조합 및 이들의 유전자형을 가지고 있으므로, 허혈성 뇌졸중의 존재 또는 위험의 유무를 조기에 효과적으로 진단할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 다중 SNP는 한국인 집단을 대상으로 하여 수행된 유전성에 근거하여 발굴한 한국인 특이적 허혈성 뇌졸중 진단 지표이므로, 서양인을 대상으로 연구한 소수의 진단지표를 사용하는 경우에 비하여 한국인의 허혈성 뇌졸중의 조기 진단과 예측이 보다 과학적이고, 객관적이며, 정확히 진단할 수 있다.

도 1은 PDE4D 유전자에 있어서 57개 SNP의 유전적 위치를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 SNP(Single Nucleotide Polymorphism, 단일염기다형성) 서열의 27번째에 위치하는 허혈성 뇌졸중 진단용 SNP를 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 9로 표시되는 SNP 위치의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드들은 하기 [표 1]에 기재된 바와 같다:

SNP GENEBANK 등록번호	서열번호	서열
rs1823066	서열번호1	TGAAATAAAACTTTCAAATTAGTTCA[A/T]AAATCAATGTAACAGATGACATCTG
rs13153653	서열번호2:	CAAAATCTGTGTGTCAGAAAAGTTTC[A/G]TCCAGCTAGCTTTCCTTTTAATGCA
rs6877927	서열번호3	TACACCAAGGGAGTCTTGAATATTCA[C/T]ATAATTTCAATAAAAGCTCAAGACA
rs2607347	서열번호4	GAATAATTAGTGGCTTCATGTTCATA[A/G]AAGTGGACTCAATAATGGGCATGAA
rs1014317	서열번호5	CACCTCCCCATCCTTGCGGGCTTAGC[C/G]TGGGCAATGGCCTCTGACTTGACAG
rs1862563	서열번호6	TCCCTTTCACATGCCTAATACATTAG[C/T]GTGGGCCACTCATTTAAAATTTAAA
rs1961	서열번호7	CTCTGAAAATTCTCCTAAATCTCCAT[C/T]CCAGTATCATTCAAGCTCTTTACAA
rs1824788	서열번호8	CCCTTTATTTACTGTCTCATTTTGTC[A/G]TCTCTGAACATACCATTTACAGCTT
rs2968011	서열번호9	TGCACTGACTTCAACTTTACTTTCTT[A/C]AATTCCATTAATTGCATAGCACTAG

상기 용어 'SNP'는 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성 중에서 가장 많이 존재하는 형태를 의미한다(약 1개/1kb).

상기 NCBI에 등록되어 있는 SNP의 rs 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

상기 '서열번호 1 내지 9'는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오타이드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 SNP들로 이루어진 군에서 선택되는 반수체형(haplotype)을 포함한다.

본 명세서에서 용어, “반수체형(haplotype)”은 생식세포의 감수분열시 하나의 염색체에 위치하는 일련의 SNP들은 함께 유전되는 연관성에 따라 여러 묶음으로 나눌 수 있는데, 이 때 각각의 묶음을 반수체형이라 하며, 이러한 반수체형은 동일 염색체상에 존재하는 여러 SNP의 조합으로서 일정한 SNP의 패턴을 보이게 된다.

본 발명에서는 본 발명에 따른 9개의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)들이 허혈성 뇌졸중 환자들에서만 특이적으로 나타나고 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 것을 확인함으로써, 상기 SNP들을 사용하여 허혈성 뇌졸중 질병을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 9개의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 SNP는 rs1823066, rs13153653, rs6877927, rs2607347, rs1014317, rs1862563, rs1961, rs1824788, 및 rs2968011로 구성된 군으로부터 선택되는 어느하나인 것이 바람직하다.

상기 연속염기는 10 내지 70개의 연속염기인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허혈성 뇌졸중은 혈전성 뇌졸중 또는 색전성 뇌졸중인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 이상이 기판에 고정될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 SNP를 포함하는 마이크로어레이를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SNP들을 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.

상기 허혈성 뇌졸중 진단용 키트는 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.

상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 설계할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.

바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위한 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보 뉴클레오타이드이다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 9개의 SNP를 이용하여 허혈성 뇌졸중을 진단하는 방법을 제공한다:

1) 피검체로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계; 및

2) 상기 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 9로 구성된 폴리뉴클레오타이드 27번째에 위치하는 SNP 서열을 결정하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단의 정보를 제공하기 위한 SNP 서열결정 방법.

상기 단계 1)의 핵산시료는 게놈 DNA 또는 mRNA인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 피검체로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다.

상기 단계 2) 서열 결정은 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR 연량분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, DNA는 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 것이다. 피검체로부터 핵산을 얻는 방법은 PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, SNP의 서열 결정을 하기 위해 사용한 지노타이핑(genotyping) 방법은 매우 다양하며 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, TaqMan 법, 아피메트릭스 SNP 칩(Affymetrix SNP chip)을 이용한 방법, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법, PCR-SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)법, PCR-SSO(Specification Sequence Oligonucleotide)법, 도트혼성화법, PCR-SSO와 도트혼성화법을 조합한 ASO(Allele Specific Oligonucleotide) 혼성화법, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법, Invader 법, SNaPShot 법, MassArray 법, 동적 대립유전자 특이성 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization, DASH) 법, 마이크로플레이트 어레이 대각 겔 전기영동(Microplate Array Diagonal Gel Electrophoresis, MADG) 법, GoldenGate 분석법, SNPlex 법 및 BeadArray 법을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 뇌졸중의 발생확률을 진단할 수 있는 다중 SNP 선별

<1-1> 실험대상

한국인 중 허혈성 뇌졸중 환자로 판명되어 치료중인 환자군(673명)과 뇌졸중 증상이없는 정상인군(267명)을 한국한의학연구원에 연결된 한방병원으로부터 모집하였고, 상기 환자들은 허혈성 뇌졸중 발생 1달 이내에 한방병원에서 확인된 환자들이다(표 2). 상기 허혈성 뇌졸중 환자 및 정상인군은 상세한 병인(etiology) 분류를 위하여 MRI를 수행하였다. 모든 참가자에 대하여 KIOM을 통해 사전 동의를 받았으며, 본 연구는 KIOM의 연구윤리위원회로부터 승인을 받았다. 상기 환자들의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 일루미나비비드어레이 골든게이트 에세이(IlluminaBeadArray platform and GoldenGate Assay)를 이용하여 SNP 유전형 검사를 수행하였으며, 검사가 수행된 SNP들의 유전형 데이터로부터 환자군에서 특이적으로 나타나는 조합을 통계적으로 분석하여 뇌졸중의 발생확률을 진단할 수 있는 다중 SNP를 선별하였다.

<1-2> DNA 시료 준비

상기 <1-1>에 기재된 방법으로 모집한 뇌졸중으로 판명되어 치료 중인 환자군(673명)과 뇌졸중 증상이 없는 정상인(267명)으로부터 DNA 시료 준비를 하기 위하여, 상기 대상의 혈액으로부터 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 염색체 DNA는 Molecular cloning: A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Sping Harbor Press, 1989에 기재된 방법으로 추출하였으며, 당업계의 알려진 방법으로 Gentra system, D-50K 키트를 사용하였다. 상기 추출된 DNA 중순도 기준이 UV 측정비율(260/280nm)로 최소 1.7 이상 되는 것만을 선별하여 사용하였다.

<1-3> SNP 의 유전형( genotype ) 분석

SNP의 유전자형 분석을 하기 위하여, 약 1000개의 프로브가 고정된 일루미나 비드어레이 골든게이트에세이(IlluminaBeadArray platform and GoldenGate Assay)를 이용하여 수행하였다.

<1-4> 다중 SNP 선별

상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법으로 분석한 유전형 검사결과를 바탕으로 뇌졸중 환자에서 자주 발견되는 SNP의 조합, 즉 다중 SNP를 선별하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 마이크로어레이를 이용한 유전형 검사로부터 940명에 대한 93개의 SNP에 대한 유전형 데이터를 얻었다. 다중 SNP 마커에 대하여, 뇌졸중 환자군과 정상군 사이의 유전형 데이터 빈도에 대한 오즈비와 그에 대한 95% 신뢰구간을 분석하여 다중 마커의 위험요인 정도를 평가하였으며, 카이제곱 검정을 통하여 그에 대한 통계적 유의성을 평가하였다. 상기 카이제곱 검정에 의한 유의확률이 우성/열성/가법분석에서 P값이 0.05보다 작은 다중 SNP 마커를 최종 선별하였다(표 3). 상기 카이제곱 검정은 두 변수 사이의 연관성을 평가하기 위하여 교차분석에서 사용하는 통계적 검정으로, 두 변수가 연관성이 없다는 귀무가설 하에서, 표 3에 나타낸 특정 SNP의 집단별 유전형 빈도에 대한 교차 분할표로부터 [수학식 1]로 계산된 카이제곱 통계량은 자유도가(분할표 컬럼수-1)×(분할표 줄수-1) 인 카이제곱 분포를 한다는 것을 이용하여 관측된 데이터가 나올 수 있는 유의확률을 계산하는 통계적 검정법이다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 9개의 다중 SNP 마커(rs1823066, rs13153653, rs6877927, rs2607347, rs1014317, rs1862563, rs1961, rs1824788, 및 rs 2968011)를 확인하였다. 또한, SNP rs1014317G>C 및 rs1961T>C는 뇌졸중 위험과 밀접하게 연관되는 것을 확인하였고, rs1823066T>A, rs13153653G>A, rs6877927T>C, 및 rs2607347A>G는 우성 및 가법분석(additive analyses)에 있어서 낮은 연관성을 나타내는 것을 확인하였다. rs1862563T>C는 우성 분석에 있어서 높은 위험성을 나타내었으며, 본페로니 보정(Bonferroni correction)이 적용된 후, rs1823066T>A는 우성 분석에 있어서 유의적으로 나타내는 것을 확인하였다(본페로니 P = 0.0062)(표 3).

'오즈비(odds ratio)'는 정상군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률의 비율을 나타낸다. 오즈비는 1보다 훨씬 크거나, 1보다 훨씬 작을 때 해당 다중 SNP가 환자군과 연관성이 있음을 나타낸다(표 4). 또 본페로니(Bonferroni) 통계값은 일반적인 P값인 0.05를 우연히 나타날 수 있는 실험마커의 수로 나누어줌으로써, 0.05보다 낮은 훨씬 엄격한 확률값을 적용하는 것을 나타낸다.

<1-5> 반수체형 ( haplotype ) 분석

상기 실시예 <1-4>에 기재된 방법으로 9개의 연관성을 보인 마커로 구성된 rs1823066, rs13153653, rs6877927, rs2607347, rs1014317, rs1862563, rs1961, rs1824788, 및 rs2968011에 대해 반수체형 분석을 하기 위하여 반수체형 카이 제곱 검증(haplotype chi-square test)를 수행하였다.

구체적으로, 상기 반수체형은 한 불평형 블록에서, 한가닥의 DNA에 존재하는 다중 SNP마커가 가지는 조합을 계산한 것으로, 한 조합을 가지는 경우와 가지지 않은 경우의 유의성을 카이자승 검정을 수행하여 측정하였다. 또한, PDE4D 유전자에 있어서 57개 SNP의 유전적 위치는 도 1에 나타내었으며(도 1), 반수체형 카이자승 검증(haplotype chi-square test)를 수행하기 위하여 13 교차 불평형 블록(linkage disequilibrium blocks)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 반수체형 ht 10(GG)는 뇌졸중에 있어서 가장 높은 예방 효과를 나타내었으며(P = 0.0056), 반수체형 ht 9(ACTCAA), ht 10(GA), 및 ht 3(TAC)는 유의적으로 뇌졸중 민감성이 감소하는 것을 확인하였다. 블록 9(P = 0.0118)에 있어서 반수체형 ACTCAA, 블록 10에 있어서 반수체형 GA(P = 0.0494), 및 GG(P = 0.0057) 또한 성별 및 나이에 맞춘 후, 허혈성 뇌졸중의 위험과 유의적으로 연결되는 것을 확인하였다.

< 실시예 2> 뇌졸중의 발생확률을 진단할 수 있는 다중 SNP 가 고정된 마이크로어레이 제작

상기 실시예 <1-4>에 기재된 방법으로 선별된 9개의 다중 SNP가 고정된 마이크로어레이를 제작하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-4>에 기재된 방법으로 선별된 9개의 다중 SNP를 기판상에 고정하여 마이크로어레이를 제작하였다. 하기 표 5에 나타낸 각 서열번호로 구성된 폴리뉴클레오타이드에서 각 SNP 위치(서열번호 1 내지 서열번호 9) 염기를 포함하는 20개의 연속 염기로 구성되는 폴리큐클레오타이드들(각 SNP는 상기 27개 중 11번째에 위치함)을 기판상에 고정하였다. 각 SNP 위치에 두 개의 대립형질이 존재하므로 각 서열마다 2개씩의 폴리뉴클레오타이드를 기판상에 고정화하였다. 상기 각각 폴리뉴클레오타이드의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem사)에 스팟팅하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2×SSC(saline-sodium citrate, pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅을 한 후, 건조기에 넣은 다음 결합을 유도하고 0.2% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액을 사용하여 2분 동안 세척한 뒤, 3차 증류수로 2분 동안 세척하여 결합 되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분 동안 처리하여 변성을 유도하였다. 그런 다음, 1.0g NaBH4, 300 mL PBS(pH 7.4) 및 100 mL EtOH이 포함된 블로킹 용액을 사용하여 15분 동안 세척하였고, 0.2% SDS 용액으로 1분 동안 세척하였으며, 3차 증류수를 사용하여 2분 동안 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

< 실시예 3> 다중 SNP 가 고정된 마이크로어레이를 이용한 뇌졸중 진단

상기 <실시예 2>에 기재되어 있는 방법으로 제조한 마이크로어레이를 이용하여 뇌졸중 진단을 하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에 기재되어 있는 방법으로 모집한 허혈성 뇌졸중군 및 뇌졸중 가능성을 진단하고자 하는 대상의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고 형광표지 시켰다. UniHyb 혼성화 용액(TeleChem 사) 하에서 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분 동안 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조한 후, 상기 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000, GSI Lumonics 사)으로 스캔하였다. 상기 스캔 결과를 퀀트어레이이(QuantArray, GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover사)를 사용하여 분석하였으며, 상기 대상이 본 발명에 따른 다중 SNP 전부 또는 일부를 가지고 있는지 확인함으로써, 뇌졸중의 발병 가능성 및 뇌졸중에 대한 감수성을 측정하였다.

그 결과, 다중 SNP가 고정된 마이크로어레이를 이용하여 P<=0.05의 유의성을 가지고 뇌졸중군을 분별할 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Korea Institute of Oriental Medicine <120> Multiple SNPs for diagnosis of ischemic stroke and use thereof <130> 13P-07-44 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs1823066 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is A or T <400> 1 tgaaataaaa ctttcaaatt agttcanaaa tcaatgtaac agatgacatc tg 52 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs13153653 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is A or G <400> 2 caaaatctgt gtgtcagaaa agtttcntcc agctagcttt ccttttaatg ca 52 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs6877927 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is C or T <400> 3 tacaccaagg gagtcttgaa tattcanata atttcaataa aagctcaaga ca 52 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs2607347 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is A or G <400> 4 gaataattag tggcttcatg ttcatanaag tggactcaat aatgggcatg aa 52 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs1014317 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is C or G <400> 5 cacctcccca tccttgcggg cttagcntgg gcaatggcct ctgacttgac ag 52 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs1862563 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is C or T <400> 6 tccctttcac atgcctaata cattagngtg ggccactcat ttaaaattta aa 52 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs1961 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is C or T <400> 7 ctctgaaaat tctcctaaat ctccatncca gtatcattca agctctttac aa 52 <210> 8 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs1824788 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is A or G <400> 8 ccctttattt actgtctcat tttgtcntct ctgaacatac catttacagc tt 52 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> SNPrs2968011 <220> <221> variation <222> (27) <223> n is A or C <400> 9 tgcactgact tcaactttac tttcttnaat tccattaatt gcatagcact ag 52

Claims

서열번호 5로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 서열의 27번째 위치하는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 SNP는 rs1014317인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 연속염기는 10 내지 70개의 연속염기인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 허혈성 뇌졸중은 혈전성 뇌졸중 또는 색전성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 하나 이상이 기판에 고정된 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트.
서열번호 5로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트.
1) 피검체로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계; 및
2) 상기 핵산 시료로부터 서열번호 5로 구성된 폴리뉴클레오타이드 27번째에 위치하는 SNP 서열을 결정하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌졸중 진단의 정보를 제공하기 위한 SNP 서열결정 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 1)의 핵산시료는 게놈 DNA 또는 mRNA인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단의 정보를 제공하기 위한 SNP 서열 결정 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2) 서열 결정은 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR 연량분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단의 정보를 제공하기 위한 SNP 서열 결정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 서열번호 2 내지 4 또는 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드에 있어서 서열의 27번째 위치하는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 마이크로어레이.
제 7항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 2 내지 4 또는 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드에 있어서 각 서열의 27번째 위치하는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)에서 핵산시료는 서열번호 2 내지 4 또는 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 27번째에 위치하는 SNP 서열을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 진단의 정보를 제공하기 위한 SNP 서열결정 방법.