KR102520749B1 - 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물은, sP-셀렉틴((soluble platelet selectin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이에 의해 뇌졸중 현장 진단을 위한 질병 진단 시스템을 제공함으로써, 별도의 사전처리나 별도의 진단장소를 거치지 않고 특별한 장비의 도움없이도 현장에서 뇌졸중을 유발할 수 있는 특정 단백질을 검출하여 질병을 진단할 수 있다.

Description

뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법 {STROKE DIAGNOSIS COMPOSITION, STROKE DIAGNOSIS KIT, AND STROKE DIAGNOSIS METHOD USING THE SAME FOR ON-SITE DIAGNOSIS OF STROKE}
본 발명은 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 의료현장에서 뇌졸중을 진단할 수 있는 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke)은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요한 원인 중 하나이며, 고령화와 함께 발생빈도 또한 더욱 증가하고 있어 사회경제적 중요성이 매우 높은 질환이다.
이러한 뇌졸중은 허혈성 뇌경색 또는 뇌출혈로 인해 뇌 혈류 장애를 일으키는 뇌질환으로서, 뇌조직은 뇌졸중이 발생된 이후 급격하게 손상을 입기 때문에 치료가 지연될 경우 환자에게는 매우 심각한 후유증을 유발하게 된다.
따라서 뇌조직 손상을 최소화하여 환자의 회복을 극대화시키는 것이 치료의 가장 중요한 원칙이다. 이를 위해서는 뇌졸중의 조기 진단과 치료효과에 대한 예후 예측이 매우 중요하다.
이에 근래에는 뇌졸중 이후 혈중에서 증가하는 단백질이 연구되고 있고, 이러한 단백질들은 뇌졸중에 의해 나타나는 병태생리학적 변화와 관련이 있다. 이는 다양한 혈액 기반 생체표지자(Blood-based biomarker)의 발현으로 나타나게 되는데 생체표지자로는 일반적으로 단백질을 사용하며, 이러한 생체표지자는 혈액, 혈장, 타액 및 소변 등과 같은 바이오플루이드(biofluids)에서 쉽게 검출된다.
따라서 이러한 혈액 내로 유출된 단백질을 발굴하고 측정할 수 있다면 뇌졸중이 의심되는 환자의 평가를 위해 임상적으로 유용한 조기진단, 손상 정도에 대한 예측, 치료와 재활에 대한 예후 예측 등 다양한 진단기법으로 유용하게 활용되어질 수 있다.
하지만 현재 의료기관에서 사용하고 있는 진단기법들은 대상자로부터 채취된 혈액과 같은 생체 시료를 직접 사용하기에는 어려움이 있어 별도의 사전 처리 절차를 먼저 수행해야 하는 것은 물론, 이를 수행하기 위한 다양한 기기와 시약이 요구된다는 점에서 생체 시료의 오염을 방지할 수 있도록 갖춰진 전문 실험실에서만 수행해야 한다는 점에서 의료 현장에서는 쉽고 간단하게 진단기법을 사용할 수 없다는 문제가 있다.
대한민국공개특허 제10-2015-0055496호
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 별도의 사전처리나 별도의 진단장소를 거치지 않으며 고가의 장비를 요하지 않고 의료 현장에서 뇌졸중 진단이 가능하도록 하는 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법을 제공하는 것이다.
그리고 본 발명은 초기 뇌 허혈에 민감하고 뇌손상에 높은 특이성을 갖는 뇌졸중-특이 혈중표지자를 검출할 수 있는 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 조성물은, sP-셀렉틴((soluble platelet selectin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
그리고 상기 항체에 접합되는 QD(Quantum Dot)를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 항체는 P-셀렉틴(P-selectin) 항체일 수 있다.
그리고 상기 sP-셀렉틴 단백질과 상기 결합물의 결합은, 항원-항체 반응에 의한 결합일 수 있다.
한편, 상기한 본 발명의 다른 목적을 실현하기 위한 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 키트는, 뇌졸중 진단용 조성물; 및 전혈 시료에 포함된 혈액성분을 분리하고, 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 분무되는 멤브레인을 포함한다.
여기서 상기 멤브레인은, 상기 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터; 상기 제1필터부를 거친 상기 전혈 시료로부터 기설정된 크기 이상의 단백질을 분리하는 제2 필터; 및 상기 제2 필터부를 거친 상기 전혈 시료로부터 기설정된 크기 미만의 단백질을 흡착하는 제3 필터를 포함할 수 있다.
그리고 상기 멤브레인은, 상기 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 상하로 적층시키되, 서로 소정의 거리만큼 이격되어 적층되도록 마련되어 상기 전혈 시료가 상부에서 하부로 이동될 수 있다.
또한 상기 뇌졸중 진단용 조성물은, 상기 제3 필터에 상기 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착되면, 상기 멤브레인에서 상기 제1 필터 및 상기 제2 필터가 제거된 상기 제3 필터 상에 분무되어 흡착된 단백질에 포함된 sP-셀렉틴 단백질과 결합할 수 있다.
그리고 상기 제3 필터의 기공 사이즈는, 흡착된 단백질과 상기 뇌졸중 진단용 조성물의 반응을 위하여 1 내지 200 um의 기공 사이즈로 마련될 수 있다.
한편 상기한 본 발명의 또 다른 목적을 실현하기 위한 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단용 키트를 이용한 뇌졸중 진단 방법은, 제1 필터를 통해 전혈 시료로부터 혈구세포가 분리되는 제1 분리단계; 제2 필터를 통해 상기 제1 분리단계를 거친 전혈 시료로부터 기설정된 크기 이상의 단백질이 분리되는 제2 분리단계; 제3 필터를 통해 상기 제2 분리단계를 거친 전혈 시료로부터 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착되는 제3 분리단계; 상기 제3 필터에 흡착된 단백질과 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 반응하는 반응단계; 및 상기 흡착된 단백질 및 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 반응한 상기 제3 필터에 UV(Ultraviolet Ray)가 조사되는 조사단계를 포함한다.
여기서 상기 반응단계는, 상기 혈구세포가 분리된 상기 제1 필터 및 상기 기설정된 크기 이상의 단백질이 분리된 상기 제2 필터가 제거되는 제거단계; 및 상기 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착된 상기 제3 필터 상(上)에 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 분무되는 분무단계를 포함할 수 있다.
그리고 상기 반응단계는, 상기 흡착된 단백질에 포함된 sP-셀렉틴 단백질과 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 항원-항체 반응에 의해 반응할 수 있다.
또한 상기 뇌졸중 진단용 조성물은, sP-셀렉틴 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 및 상기 항체에 접합되는 QD를 포함할 수 있다.
그리고 상기 항체는 P-셀렉틴((soluble platelet selectin) 항체일 수 있다.
또한 상기 제3 필터의 기공사이즈는, 상기 흡착된 단백질과 상기 뇌졸중 진단용 조성물의 반응을 위하여 1 내지 200 um의 기공 사이즈로 마련될 수 있다.
상술한 본 발명의 일측면에 따르면, 뇌졸중 현장 진단을 위한 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트 및 이를 이용한 뇌졸중 진단 방법을 제공함으로써, 별도의 사전처리나 별도의 진단장소를 거치지 않고 특별한 장비의 도움없이도 현장에서 뇌졸중을 유발할 수 있는 특정 단백질을 검출하여 뇌졸중을 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 키트의 구성을 설명하기 위한 도면,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인의 구성을 설명하기 위한 도면,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인의 평면을 도시한 개략도,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인을 통해 전혈 시료가 분리되는 모습을 설명하기 위한 개략도,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단 방법을 설명하기 위한 흐름도,
도 6은, 본 발명의 멤브레인을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 면역글로블린 M(IgM)의 검출농도 및 제2 필터의 기공 사이즈에 따른 분리여부를 실험한 결과이고,
도 7은 본 발명의 멤브레인을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 면역글로블린 G(IgG)의 검출농도 및 제2 필터의 기공 사이즈에 따른 분류여부를 실험한 결과이며,
도 8은 본 발명의 멤브레인을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 Apolipoprotein A-1 단백질의 검출농도 및 제2 필터의 기공 사이즈에 따른 분리여부를 실험한 결과이고,
도 9는 본 발명의 멤브레인을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 P-셀렉틴 단백질의 검출농도를 실험한 결과이며,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 생성한 뇌졸중 진단용 조성물의 형광광도를 측정한 실험결과이고, 그리고,
그리고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단 키트를 이용한 이용한 질병 진단 방법의 성능을 평가하기 위한 실험결과이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예와 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하에서는 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단 키트의 구성을 설명하기 위한 도면으로, 본 뇌졸중 진단 키트는 별도의 사전처리나 별도의 진단 장소를 거치지 않으면서 고가의 장비 또한 요하지 않아 의료 현장에서 뇌졸중 현장 진단이 바로 가능하도록 하기 위한 것이다.
이를 위해 본 뇌졸중 진단 키트는, 멤브레인(M), 뇌졸중 진단용 조성물(100)을 포함할 수 있으며, 도시된 바와 같이 별개의 UV(Ultraviolet Ray) 램프(200)를 더 포함하여 뇌졸중을 진단할 수 있다.
멤브레인(M)은 뇌졸중 진단의 대상이 되는 대상자로부터 채혈된 전혈 시료가 투입되면, 투입된 전혈 시료로부터 전혈에 포함된 혈액성분을 분리하기 위해 마련된다. 이를 위해 멤브레인(M)은 복수의 필터를 포함하도록 마련되고, 복수의 필터를 통해 전혈에 포함된 성분들을 성분별로 분리할 수 있다. 특히 본 실시예에 따른 멤브레인(M)은 전혈 시료로부터 기설정된 크기 이상의 단백질을 분리하고 기설정된 크기 미만의 단백질을 흡착할 수 있다. 이러한 멤브레인(M)의 구체적인 구성에 대해서는 후술할 도 2 내지 4에서 자세히 설명하기로 한다.
한편 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 대상자로부터 채혈된 전혈에서 멤브레인(M)을 통해 흡착된 기설정된 크기 미만의 단백질과 반응하여 초기 뇌 허혈에 민감하고 뇌손상에 높은 특이성을 갖는 뇌졸중-특이 혈중표지자를 검출하기 위해 마련된다. 이를 위해 본 실시예에서의 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 대상자의 혈액 내에 존재하는 극미량의 특정 단백질을 검출하기 위한 항체와 QD(Quantum Dot)가 접합(conjugation)된 결합물로 마련될 수 있다.
뇌졸중 진단용 조성물(100)은 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착된 멤브레인(M)의 필터에 분무되고, 이를 통해 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 흡착된 기설정된 크기 미만의 단백질이 반응하게 된다.
특히 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100)에 포함된 항체는 대상자로부터 채혈된 혈액 중에 뇌졸중-특이 혈중표지자인 sP-셀렉틴(soluble platelet selectin)을 검출하기 위한 항체로 P-셀렉틴(P-selectin) 항체이다.
P-셀렉틴은 활성화된 내피세포의 표면에서 발현하는 단백질로서 혈소판에서 활성화되어 기능을 발현하다. 일반적으로는 P-셀렉틴이 내피세포와 혈소판의 표면에 위치하고 있으나 뇌졸중과 같은 질병에 노출된 상황에서는 sP-셀렉틴으로 바뀌게 된다. 특히 sP-셀렉틴의 혈장농도는 급성 뇌경색 환자군에서 증가되는 것으로 보고되고 있으며, 뇌경색 급성기에 sP-셀렉틴의 혈장농도 증가는 급성 뇌경색에 의한 혈소판의 활성화와 내피세포의 손상에 의해 증가되는 것으로 보고되고 있다. 따라서 질병에 의해 용해가능한 형태로 바뀌게 되어 혈장으로 누출된 sP-셀렉틴을 혈중표지자(바이오마커)로 함으로써 P-셀렉틴 항체를 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물(100)과의 반응을 통해 혈장에 누출된 sP-셀렉틴을 검출함으로써 질병 진단, 즉 뇌졸중 진단이 가능해질 수 있다.
그리고 본 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 넓은 흡수 스펙트럼, 좁은 방출 Peak, 형광표백(photobleaching)에 대한 내성, 높은 양자수율과 같은 독특한 광학적 특성을 가진 무기 반도체 나노입자(Inorganic semiconducting nanoparticles)인 QD를 포함하는 QD 용액과 항체를 접합시킴으로써 항체를 통해 특정 단백질이 검출되면 형광으로 검출할 수 있게 된다.
이러한 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 항체와 QD 접합을 위해 PB 버퍼(buffer)와 QD 용액을 섞어 QD 솔루션을 생성하고, 소정의 QD 솔루션에 EDC 및 Sulfo-NHS를 넣어 일정 시간동안 반응시킨 후 원심분리를 통해 미반응 물질을 제거하며, 미반응 물질이 제거된 QD 솔루션에 PB buffer를 넣어 최종 부피가 일정 용량이 되도록 한다. 그리고나서 QD 솔루션에 P-셀렉틴 항체를 넣은 후 상온에서 일정 시간동안 반응을 시키고 항체와의 반응이 끝난 QD 솔루션에 BSA를 넣고 일정 시간동안 반응시켜 생성한 결합물을 본 실시예에서의 특정 단백질인 sP-셀렉틴 단백질을 검출하기 위한 뇌졸중 진단용 조성물(100)로 사용할 수 있다. QD와 항체의 접합을 위해서 본 실시예에서의 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 QD 솔루션 1ml에 2mg/ml 농도의 P-셀렉틴 항체를 넣어 반응시켜 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
이 때 뇌졸중 진단용 조성물(100)의 QD 솔루션과 항체 간의 접합을 확인하기 위한 형광강도(fluorescence intensity)는 형광분광광도계(fluorescence spectrophotometer)로 측정할 수 있다.
한편 별개의 UV 램프(200)는 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착된 멤브레인(M)의 필터에 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 분무되면 흡착된 단백질과 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 반응한 제3 필터(F3)에 UV를 조사하기 위해 마련된다.
UV 램프(200)를 통해 이상에서와 같이 QD와 P-셀렉틴 항체와 접합된 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 분무된 멤브레인(M)의 필터에 UV를 조사하게 되면, 최대 파장이 UV 영역인 QD의 존재여부를 사용자가 육안으로 판별할 수 있게 된다.
따라서 특정 단백질, 즉 sP-셀렉틴과 같은 혈중표지자 검출을 위한 고가의 장비를 요하지 않는 것은 물론 채혈된 전혈 시료를 별도의 진단장소가 아닌 현장에서 결과를 확인할 수 있게 된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인(M)의 구성을 설명하기 위한 도면, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인(M)의 평면을 도시한 개략도, 그리고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인(M)을 통해 전혈 시료가 분리되는 모습을 설명하기 위한 개략도이다.
상술한 바와 같이 멤브레인(M)은 대상자로부터 채혈된 전혈을 혈액성분별로 분리하기 위해 마련되는 것으로, 제1 필터(F1), 제2 필터(F2) 및 제3 필터(F3)를 포함하여 마련될 수 있다. 그리고 멤브레인(M)은 도 2에 도시된 바와 같이 제1 필터(F1), 제2 필터(F2) 및 제3 필터(F3)가 상하로 적층되는 구조로 형성되되, 제1 필터(F1)는 최상단에 위치하고 제3 필터(F3)는 최하단에 위치할 수 있다. 그리고 제1 필터(F1), 제2 필터(F2) 및 제3 필터(F3)의 적층 시 각 필터 간에 서로 소정의 거리(L1, L2)만큼 이격되어 적층되도록 마련될 수 있다.
제1 필터(F1)는 대상자로부터 채혈된 전혈 시료로부터 적혈구 및 백혈구를 포함하는 혈구 세포를 분리하기 위해 마련된다. 이를 위해 제1 필터(F1)는 혈구 세포가 통과될 수 없는 기공 사이즈(pore size)와 구조를 가지는 것과 동시에 혈구 세포를 제외한 혈액성분들은 잘 통과할 수 있도록 흡착이 되지 않는 재질로 마련된다. 따라서 제1 필터(F1)는 천연 섬유군에서 선택 사용할 수 있으며, 필터의 기공 사이즈를 크게 만들 수 있는 재질로 마련되는 것이 바람직할 수 있다.
보다 구체적으로 혈구세포를 손상 없이 분리하기 위하여 제1 필터(F1)는 기공 사이즈는 5~15um, 두께 500~1,500um, 무게 100~400gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 2~5um, 홀드-업 볼륨(Hold-up volume)은 20~100ul로 마련될 수 있다.
특히 본 발명의 일 실시예에서의 제1 필터(F1)는 기공 사이즈는 10um, 두께는 1,000um, 무게는 250 gram/m2, 마이크론 등급은 3um 및 홀드-업 볼륨은 50ul인 필터로 마련되는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 제1 필터(F1)에 의해 전혈 시료 중에서 혈구 세포가 분리되어 제1 필터(F1) 위에 잔류하게 되는데, 이렇게 잔류하는 혈구 세포를 포함하는 제1 필터(F1)는 사용자의 필요에 의해 별도의 실험 시료로 활용될 수도 있다.
한편 제2 필터(F2)는 혈구 세포가 분리된 혈액성분을 크기에 따라 분리하기 위해 마련되는 것으로 보다 구체적으로 혈구세포가 분리된 전혈 시료에서 혈소판, 세포 조각, 엑소좀(exosome) 등의 세포 보다 작은 크기의 조각들과 함께 혈장단백질 중에서도 면역글로블린 M(IgM, Immunoglobulin M)과 같이 상대적으로 크기가 큰 단백질을 분리하기 위해 마련된다.
그리고 제2 필터(F2)는 제1 필터(F1)와 마찬가지로 혈장단백질 중 기설정된 크기 미만의 단백질을 포함하는 혈액성분이 잘 통과될 수 있도록 흡착이 되지 않는 재질로 마련될 수 있다.
보다 구체적으로 기설정된 크기 미만의 단백질은 통과시키고 기설정된 크기 이상의 단백질과 혈소판 등을 분리하기 위하여 제2 필터(F2)는, 기공 사이즈는 0.01~1um, 두께 100~1,000um, 무게 100~300gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 1~5um, 홀드-업 볼륨(Hold-up volume)은 20~10ul로 마련될 수 있다.
특히 본 발명의 일 실시예에서의 제2 필터(F2)는, 기공 사이즈는 0.1um, 두께는 300um, 무게는 200 gram/m2, 마이크론 등급은 2um 및 홀드-업 볼륨은 5ul인 필터로 마련되는 것이 바람직할 수 있다.
따라서 이러한 제2 필터(F2)를 통해 기공 사이즈 0.1um 미만의 크기를 갖는 단백질은 제2 필터(F2)를 통과하여 제2 필터(F2)의 하단에 위치한 제3 필터(F3) 측으로 이동할 수 있다.
제3 필터(F3)는 제2 필터(F2)를 거친 전혈 시료로부터 기설정된 크기 미만의 단백질을 흡착하기 위해 마련되는 것으로 보다 구체적으로 제2 필터(F2)를 거친 전혈 시료에서 면역글로블린 G(IgG, Immunoglobulin G), Apolipoprotein A-1 단백질, sP-셀렉틴 단백질과 같이 상대적으로 크기가 작은 단백질을 흡착하기 위해 마련된다.
그리고 크기가 작은 단백질의 흡착을 위해 제3 필터(F3)는 나이트로셀룰로스(NC, Nitrocellulose)와 같이 단백질 결합 친화력이 높은 재질로 마련되고, 기공 사이즈는 1~200um, 두께 50~200um, 홀드-업 볼륨(Hold-up volume)은 20~100ul로 마련될 수 있다.
특히 본 발명의 일 실시예에서의 제3 필터(F3)는, 흡착된 단백질과 뇌졸중 진단용 조성물(100)과의 반응을 통해 특정 단백질인 sP-셀렉틴 단백질의 검출의 효과를 향상시키기 위해서, 기공 사이즈는 10um, 두께는 100um, 홀드-업 볼륨은 40ul인 필터로 마련되는 것이 바람직할 수 있다.
본 실시예에서의 제3 필터(F3)의 기공 사이즈가 제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 크게 마련되는 것은 특정 단백질의 검출을 위한 뇌졸중 진단용 조성물(100)의 입자크기를 고려하기 때문으로, 보다 구체적으로 단백질이 흡착된 제3 필터(F3)에 분무되는 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 상술한 바와 같이 항체와 QD를 접합시킨 결합물로써, QD와 항체가 접합함에 따라 입자의 크기가 커지기 때문이다.
본 실시예에서의 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 제3 필터(F3)에 분무되면 제3 필터(F3) 상에는, 뇌졸중 진단용 조성물(100)을 생성하는 과정에서 P-셀렉틴 항체와 접합되지 못한 QD 또는 제3 필터(F3)에 흡착된 기설정된 크기 미만의 단백질과 반응하지 않은 QD가 있을 수 있다. 이에 제3 필터(F3)의 기공 사이즈는 이러한 QD의 크기보다 작게 마련함으로써, QD가 제3 필터(F3)를 통과하지 않도록 할 수 있다. 그리고 제3 필터(F3)의 기공 사이즈는 QD가 통과하지 못하는 크기로 마련됨으로써 시간이 흐를수록 제3 필터(F3)에 잔류하는 QD가 제3 필터(F3)에 흡착된 단백질과 반응할 가능성이 높아지므로 이를 통해 특정 단백질의 검출율을 향상시킬 수 있게 된다.
그리고 멤브레인(M)은 이러한 제1 필터(F1), 제2 필터(F2) 및 제3 필터(F3)가 상하로 적층된 상태를 유지하거나, 필요에 따라 제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)가 쉽게 분리가능하도록 구조의 프레임(M1, M2)을 포함하도록 마련되어 하나의 진단키트로 사용될 수 있다.
즉, 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 제1 필터(F1), 제2 필터(F2) 및 제3 필터(F3)가 상하 적층된 형태의 멤브레인(M)을 진단키트로 현장에 공급될 수 있다. 이에 현장에서 채혈한 전혈 시료를 멤브레인(M)의 제1 필터(F1) 위에 떨어뜨려 투입하면, 종래의 좌우 방향으로 시료가 이동하는 레트로 플루이드 방식이 아닌 상부에서 하부로 이동하는 버티컬 플루이드(vertica fluid) 방식으로 투입된 전혈 시료가 이동할 수 있다.
그리고 전혈 시료에 포함된 혈액 성분이 각각의 필터(F1, F2, F3)를 통과하거나 필터에 흡착되도록 충분한 시간이 경과되고 나면 도시된 바와 같이 복수의 필터들(F1, F2, F3)의 상부에 위치한 상부 프레임(M1)을 분리하여 제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)가 멤브레인(M)에서 제거가능하도록 하는 구조로 마련되는 것이다. 이를 위해 도면에는 미도시되었으나 상부 프레임(M1)과 하부 프레임(M2)이 나사결합을 통해 결합 또는 분리가 되는 구조로 마련되거나, 상부 프레임(M1)과 하부 프레임(M2)의 상호 요철구조를 통한 억지끼움을 통해 결합 또는 분리가능한 구조로 마련될 수도 있다. 또한 도 3에서와 같이 멤브레인(M)의 상부 프레임(M1)의 중앙에는 제1 필터(F1) 위로 시료가 투입되도록 홀(hole)이 형성된다.
한편 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
먼저 본 발명의 뇌졸중 진단 방법을 수행하기 위해 뇌졸중 진단 키트에 포함되는 멤브레인(M)에 대상자로부터 채혈된 전혈 시료가 투입되는 단계가 선행될 수 있다. 전혈 시료에는 혈구 세포, 혈소판, 세포 조각, 혈장 단백질 등의 혈액성분이 포함된다.
이후 제1 필터(F1)를 통해 투입된 전혈 시료로부터 혈구세포가 분리된다(S110). 제1 필터(F1)는 상술한 바와 같이 혈구 세포가 통과될 수 없는 기공 사이즈로 마련되고, 혈구 세포를 제외한 혈액성분들은 잘 통과할 수 있도록 흡착되지 않는 재질로 마련된다. 따라서 투입된 전혈 시료 중에서 적혈구 및 백혈구를 포함하는 혈구 세포는 제1 필터(F1)를 통과하지 못함으로써 전혈 시료에서 혈구 세포가 분리된다. 그리고 전혈 시료에 포함된 혈액 성분중에서 제1 필터(F1)의 기공 사이즈보다 작은 크기를 갖는 혈소판, 세포 조각들과 함께 혈장단백질은 제1 필터(F1)를 통과하게 된다.
그러면 제2 필터(F2)를 통해 제1 필터(F1)를 통과한 전혈 시료로부터 기설정된 크기 이상의 단백질이 분리된다(S120). 이전 단계 S110을 통해 제1 필터(F1)를 통과한 전혈 시료의 혈액 성분 중에서 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 큰 입자크기를 갖는 혈액 성분은 제2 필터(F2)에 의해 분리되고, 제2 필터(F2)의 기공 사이즈 보다 작은 입자크기를 갖는 혈액 성분은 제2 필터(F2)를 통과하게 된다. 여기서 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 큰 혈액성분은, 혈소판, 세포 조각, 엑소좀(exosome) 등의 세포 보다 작은 크기의 조각들과 함께 혈장단백질 중에서도 면역글로블린 M(IgM, Immunoglobulin M)과 같이 상대적으로 크기가 큰 단백질로, 이러한 혈액 성분은 제2 필터(F2)에 의해 분리됨으로써 제3 필터(F3)로의 이동이 제약된다. 반면 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 입자크기가 작아 제2 필터(F2)를 통과하는 단백질은 면역글로블린 G(IgG, Immunoglobulin G), Apolipoprotein A-1 단백질, sP-셀렉틴 단백질과 같이 상대적으로 크기가 작은 단백질이다.
그리고나면 제3 필터(F3)를 통해 제2 필터(F2)를 통과한 전혈 시료로부터 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착된다 (S130). 구체적으로 이전 단계 S120을 통해 제2 필터(F2)를 통과한 전혈 시료의 혈액 성분 중에서 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 작은 단백질, 즉 면역글로블린 G(IgG, Immunoglobulin G), Apolipoprotein A-1 단백질, sP-셀렉틴 단백질과 같이 크기가 작은 단백질을 제3 필터(F3)에 흡착된다. 기설정된 크기 미만의 단백질 흡착을 위해서 제3 필터(F3)는 전술한 바와 같이 나이트로셀룰로스(NC, Nitrocellulose)와 같이 단백질 결합 친화력이 높은 재질로 마련될 수 있다.
이렇게 전혈 시료의 혈액 성분 중에서 기설정된 크기 미만의 단백질이 제3 필터(F3)에 흡착되면(S130), 혈구세포가 분리된 제1 필터(F1) 및 기설정된 크기 이상의 단백질이 분리된 제2 필터(F2)가 멤브레인(M)에서 제거된다(S140).
전혈 시료가 멤브레인(M)에 투입되고 투입된 전혈 시료가 상술한 단계 S110, S120 및 S130를 통해 각 필터에서 혈액 성분이 분리 또는 흡착되도록 소정의 시간이 경과되고 나면, 멤브레인(M) 내에 위치한 제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)를 제거한다. 이 때 혈구 세포는 제1 필터(F1)에 잔류하고, 제2 필터(F2)의 기공 사이즈보다 큰 혈장단백질은 제2 필터(F2)에 잔류하게 되므로, 혈액 성분이 잔류한 제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)는 사용자의 필요에 의해 별도의 실험 시료로 활용될 수도 있다.
제1 필터(F1) 및 제2 필터(F2)가 제거되고 나면(S140), 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착된 제3 필터(F3) 상(上)에 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 분무된다(S150). 여기서 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 대상자로부터 채혈된 전혈에서 멤브레인(M)을 통해 흡착된 기설정된 크기 미만의 단백질과 반응하여 초기 뇌 허혈에 민감하고 뇌손상에 높은 특이성을 갖는 뇌졸중-특이 혈중표지자를 검출하기 위해 마련된다. 이를 위해 본 실시예에서의 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 대상자의 혈액 내에 존재하는 극미량의 특정 단백질을 검출하기 위한 항체와 QD(Quantum Dot)가 접합(conjugation)된 결합물이다. 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100)에 포함된 항체는 대상자로부터 채혈된 혈액 중에 뇌졸중-특이 혈중표지자인 sP-셀렉틴(oluble platelet selecin)을 검출하기 위한 항체로 P-셀렉틴(P-selectin) 항체이다.
그리고 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 넓은 흡수 스펙트럼, 좁은 방출 Peak, 형광표백(photobleaching)에 대한 내성, 높은 양자수율과 같은 독특한 광학적 특성을 가진 무기 반도체 나노입자(Inorganic semiconducting nanoparticles)인 QD를 포함하는 QD 용액을 항체와 접합시킴으로써 항체를 통해 특정 단백질이 검출되면 형광으로 검출할 수 있게 된다.
이러한 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 항체와 QD 접합을 위해 PB buffer와 QD 용액을 섞어 QD 솔루션을 생성하고, 소정의 QD 솔루션에 EDC 및 Sulfo-NHS를 넣어 일정 시간동안 반응시킨 후 원심분리를 통해 미반응 물질을 제거하며, 미반응 물질이 제거된 QD 솔루션에 PB buffer를 넣어 최종 부피가 일정 용량이 되도록 한다. 그리고나서 QD 솔루션에 P-셀렉틴 항체를 넣은 후 상온에서 일정 시간동안 반응을 시키고 항체와의 반응이 끝난 QD 솔루션에 BSA를 넣고 일정 시간동안 반응시켜 생성한 결합물을 본 실시예에서의 특정 단백질을 검출하기 위한 뇌졸중 진단용 조성물(100)로 사용할 수 있다.
이후 제3 필터(F3)에 흡착된 단백질과 특정 단백질의 검출을 위한 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 반응한다(S160).
여기서 특정 단백질의 검출을 위한 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 흡착된 단백질이 반응하는 것은, 흡착된 단백질에 포함된 특정 단백질을 검출하기 위한 항체를 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 흡착된 단백질에 포함된 특정 단백질이 반응하는 항원-항체 반응일 수 있다.
이후 흡착된 단백질과 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 반응한 제3 필터(F3)에 UV(Ultraviolet Ray)가 조사된다(S170). 여기서 흡착된 단백질과 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 반응한 제3 필터(F3)라 함은 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 제3 필터(F3) 상에 분무된 상태로 특정단백질인 sP-셀렉틴 단백질의 검출을 위한 소정의 시간이 경과되어 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 특정 단백질이 반응한 상태의 제3 필터(F3)를 포함하는 멤브레인(M)이며, 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 분무된 제3 필터(F3)를 포함하는 멤브레인(M)에 UV가 조사될 수 있다. 또는 필요에 따라서 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 분무된 상태의 제3 필터(F3)가 멤브레인(M)에서 분리된 후, 제3 필터(F3)에 UV가 조사될 수도 있다.
이렇게 뇌졸중 진단용 조성물(100)이 제3 필터(F3)에 흡착된 단백질과 반응하여 흡착된 단백질 내에 sP-셀렉틴과 같은 특정 단백질이 잔류하는 경우에는 QD와 접합된 항체, 즉 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 반응하게 되고, 최대 파장이 UV 영역인 QD의 존재여부를 사용자가 육안으로 판별할 수 있게 된다.
따라서 특정 단백질, 즉 sP-셀렉틴과 같은 혈중표지자 검출을 위한 고가의 장비를 요하지 않는 것은 물론 대상자로부터 채혈된 전혈 시료를 별도의 진단장소가 아닌 현장에서 혈중표지자의 검출 결과를 확인할 수 있게 된다.
특히 본 실시예에 따른 뇌졸중 진단 방법을 통해서 혈액 내에 존재하는 극미량의 단백질을 검출할 수 있고, QD를 이용하므로 2차 항체반응 시간을 요하지 않아 반응시간을 감소시킬 수 있음은 물론 진단 방법도 간단하다. 특히 타겟 단백질인 특정 단백질을 검출함에 있어 고가의 장비를 요하지 않는 다는 점에서 경제적이다.
도 6은, 본 발명의 멤브레인(M)을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 면역글로블린 M(IgM)의 검출농도 및 제2 필터(F2)의 기공 사이즈에 따른 분리여부를 실험한 결과로서, 도6 (a)에 도시된 바와 같이 IgM은 발색반응을 확인한 결과 1/1000의 농도에서 검출되는 것을 확인할 수 있다. 특히 IgM의 경우에는 후술할 도 7 (a)와 비교했을 때 IgG의 발색반응보다 색상이 더 짙은 것을 통해 알 수 있듯이 IgM의 검출 민감도의 한계는 1/1000보다 더 낮은 것을 확인할 수 있다.
그리고 도 6 (b)는 순수 분리된 혈장단단백질을 서로 다른 기공사이즈를 갖는 제2 필터(F2)에 떨어뜨려 실험한 결과이고, 도 6 (c)는 전혈과 순수 분리된 혈장을 각각 서로 다른 기공사이즈를 갖는 제2 필터(F2)에 떨어뜨려 실험한 결과이다. 이를 통해 전혈이 제2 필터(F2)를 통과하는 경우와 혈장이 제2 필터(F2)를 통과하는 경우를 비교할 수 있다.
실험 결과 도시된 바와 같이 전혈 및 순수 분리된 혈장 모두 제2 필터(F2)의 기공 사이즈가 0.03um인 경우에는 IgM이 제2 필터(F2)를 통과하여 제3 필터(F3) 상에서 검출되었다.
한편 제2 필터(F2)의 기공 사이즈가 0.01um인 경우에는 전혈 및 순수 분리된 혈장 모두 IgM이 제3 필터(F3) 상에서 미검출된 것을 통해 알 수 있듯이 제2 필터(F2)가 0.01um의 기공 사이즈를 갖도록 마련되면 IgM과 같이 단백질의 크기가 큰 혈장단백질은 제2 필터(F2)에 의해 분리될 수 있음을 확인할 수 있다.
반면 도 7은 본 발명의 멤브레인을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 면역글로블린 G(IgG)의 검출농도 및 제2 필터의 기공 사이즈에 따른 분류여부를 실험한 결과로, 도 7 (a)에 도시된 바와 같이 IgG는 발생반응을 확인한 결과, IgM과 마찬가지로 1/1000의 농도에서 검출되는 것을 확인할 수 있다.
그리고 도 6의 IgM의 검출농도 및 분리여부와 동일하게 제2 필터(F2)의 기공 사이즈를 각각 0.03um 및 0.01um으로 마련하여 실험한 결과, IgG는 IgM 과는 다르게 기공 사이즈 0.01um로 마련된 제2 필터(F2)를 통과하여 제3 필터(F3) 상에서 검출된 것을 확인할 수 있다. 또한 도 7 (c)에 도시된 바와 같이 IgG 역시 IgM과 마찬가지로 전혈을 제2 필터(F2)로 통과시킨 결과는 순수 분리된 혈장만을 통과시켜 확인한 결과와 동일한 것을 알 수 있다.
한편 도 8은 본 발명의 멤브레인(M)을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 Apolipoprotein A-1 단백질의 검출농도 및 제2 필터(F2)의 기공 사이즈에 따른 분리여부를 실험한 결과이다.
도 8에 도시된 바와 같이 Apolipoprotein A-1 단백질이 검출되는 농도를 확인하기 위하여 후술할 실험조건에서와 같이 표준물질(재조합단백질)을 이용하였다. 도 8 (a)에서와 같이 표준물질을 농도별로 희석하여 제3 필터(F3)에 도팅(dotting)한 후, 항원-항체 반응을 통한 발색반응으로 확인한 결과 5ng/ul 농도에서 약하게 검출되는 것을 확인할 수 있다. 그리고 발색반응으로 검출농도를 확인한 후 혈장 내 존재하는 분자량이 작은 Apolipoprotein A-1을 이상에서와 같이 서로 다른 기공사이즈를 갖는 제2 필터(F2)에 떨어뜨려 실험한 결과인 도 8 (b)에서와 같이 제2 필터(F2)가 0.03um의 기공 사이즈로 마련되는 경우에는 많은 양의 Apolipoprotein A-1 단백질이 통과하는 것을 알 수 있고, 제2 필터(F2)가 0.01um의 기공 사이즈로 마련되는 경우에도 제2 필터(F2)를 통과하여 Apolipoprotein A-1 단백질이 제3 필터(F3)에서 검출되는 것을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 멤브레인(M)을 이용한 혈액성분 분리실험 결과에서 P-셀렉틴 단백질의 검출농도를 실험한 결과로, P-셀렉틴 단백질이 검출되는 농도를 확인하기 위하여 후술할 실험조건에서와 같이 표준물질을 이용하였다. 그리고 표준물질을 농도별로 희석하여 제3 필터(F3)에 도팅한 후, 항원-항체 반응을 통한 발색반응으로 확인한 결과 도 9 (a) 상단에 도시된 도면에서와 같이 5ng/ul 농도에서 P-셀렉틴 단백질이 약하게 검출되는 것을 확인할 수 있다. 또한 도 9 (a)의 하단에 도시된 도면은 단백질 검출 민감도가 높은 ECL(Enhanced chemiluminescence)로 P-셀렉틴 단백질의 검출결과로써, 도시된 바와 같이 도 9 (a)의 상단에 나타난 결과와 동일한 농도에서 P-셀렉틴 단백질이 검출됨을 확인할 수 있다. 또한 도 9 (b)는 표준물질을 농도별로 희석한 후 웨스턴 블랏(wetern blot)을 실시하여 P-셀렉틴 단백질의 검출을 확인한 결과로 노출시간에 따라 신호가 더 강하게 나타나는 것을 알 수 있다.
한편 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 생성한 뇌졸중 진단용 조성물 (100)의 형광강도를 측정한 실험결과로, 도 10 (a)에서와 같이 P-셀렉틴 항체를 QD에 접합하여 형광강도를 측정하였다. 그 결과 본 발명에서의 QD와 항체가 접합된 결합물인 뇌졸중 진단용 조성물(100)의 형광강도가 단일 QD(QD) 및 단일 항체(Antibody)에 비해 높은 것을 알 수 있다.
그리고 도 10의 (b)와 같이 QD와 항체의 접합을 확인하기 위해 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 실험한 결과 항체와 QD가 접합된 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 QD에 비해 분자량이 더 크기 때문에 도 10 (b)의 2에서와 같이 밴드의 차이를 볼 수 있고, QD와 P-셀렉틴 항체가 성공적으로 결합한 것으로 알 수 있다.
또한 도 10의 (c)는 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100)의 안정성을 확인하기 위해 QD와 P-셀렉틴 항체의 접합 이후 4주간 형광을 측정한 결과로서, 도시된 바와 같이 접합 후 2주부터는 형광이 급격하게 떨어지는 것을 확인할 수 있다.
한편 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌졸중 진단용 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단용 키트를 이용한 질병 진단 방법의 성능을 평가하기 위한 실험결과로, QD 및 P-셀렉틴 항체가 접합된 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 항원과의 반응 민감도를 측정한 실험결과이다. 여기서 뇌졸중 진단용 조성물 (100)과 항원 간의 반응 민감도 측정을 위해 항체가 접합되지 않은 QD, 항체와 QD가 접합된 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물(100) 및 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 P-셀렉틴 표준물질을 혼합하여 반응시킨 반응물을 나이트로셀룰로스(NC, Nitrocellulose) 필터인 제3 필터(F3)에 도팅(dotting)하여 측정하였다. 그리고 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 P-셀렉틴 표준물질의 혼합 시 P-셀렉틴 표준물질을 고농도에서 저농도로 희석하여 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 반응시켰고, 네거티브 컨트롤(negative control)은 PBS를 항체가 접합되지 않은 QD, 항체와 QD가 접합된 뇌졸중 진단용 조성물(100)과 반응시킨 후 도팅하였다.
그리고 UV 램프를 통해 도팅된 제3 필터(F3)에 자외선을 조사한 결과 도 11에서와 같이 P-셀렉틴 표준물질의 농도가 높을수록 형광강도가 강화(enhance)되었고, 0.5ng/ul의 농도에서도 시각적으로 검출될 수 있음을 알 수 있다.
이처럼 본 실시예에 따른 질병 진단 시스템을 이용한 질병 진단 시스템은 혈액 내에 존재하는 극미량의 단백질을 검출할 수 있는 것은 물론, QD는 2차 항체반응시간이 없으므로 반응시간을 줄일 수 있고 과정이 간단하다는 장점은 물론이거니와 QD, 즉 양자점의 최대 파장이 자외선 영역이어서 경제적이고 간단한 UV 램프를 사용하여 양자점의 존재여부를 육안으로 식별할 수 있다는 것이다.
특히 멤브레인(M)에 포함된 필터를 통과한 소량의 면역글로블린은 2차 항체반응을 통해 긍정 오류(false positive)에 영향을 줄 수 있지만 본 발명에서와 같이 항체와 QD가 접합된 결합물을 이용하는 경우에는 이러한 긍정 오류를 방지할 수 있으므로, 진단에 대한 정확도를 높일 수 있다.
<시험예 1] 검출한계 확인
본 실시예에 따른 질병 진단 방법의 성능을 확인하기 위해 이하에서와 같은 실험과정을 수행하였다.
(1) 혈액 수집
경북대학교병원에서 제공받은 전혈은 EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 튜브에 넣어 보관하여 48시간 이내에 사용하였으며, 이를 위한 모든 실험은 경북대학교병원 윤리위원회 및 기관심의위원회의 승인을 받아 관련지침 및 규정에 따라 수행되었다.
(2) 샘플 준비
EDTA 튜브에 보관된 혈액 샘플을 일반 튜브로 옮겨 3,000g에서 원심분리한 후 혈장을 분리하였다. 분리하는 과정에서 버피 코트(buffy coat) 또는 혈병(blood clot)등과 같은 혈장 이외의 혈액 성분이 섞이지 않도록 주의하고, 분리된 혈장은 -80℃에서 보관하였다.
(3) 혈장단백질 검출
혈액에서 분리된 혈장 단백질의 농도를 확인하기 위해 BSA(Bovine Serum Albumin) assay 로 확인한다. 혈장 내 존재하는 단백질을 항원-항체 반응을 통해 확인할 수 있는 검출한계(LOD, limit of detection)를 확인하기 위해 혈장 단백질의 농도를 ng/ul ~ ug/ul로 희석하여 준비한다.
혈장은 나이트로셀룰로스(NC, Nitrocellulose) 멤브레인(membrane)에 1ul씩 도팅(dotting)한 후 상온(RT, Room Temperature)에서 5분동안 건조(dry)한다. 그리고 NC 멤브레인은 1% BSA(bovine serum albumin, A7906, Sigma) in PBS(phosphate buffered saline)로 상온에서 10분간 블럭킹(blocking)한다. 여기서 블락킹은 멤브레인 상에서 불필요한 곳에 단백질이 흡착하는 것을 방지하기 위한 과정이다. 0.1M Tris buffer 로 5분간 워싱(washing)한 후 Mouse anti-Human IgG Secondary antibody(HRP)(SA1-35470, ThermoFisher scientific), Goat anti-Human IgM Secondary antibody(HRP)(31415, ThermoFisher scientific), (1:500 in 1% BSA/PBS), ApolipoproteinA-1(R&D systems)는 상온에서 10분간 반응한다. 발색반응 확인을 위해 0.1M Tris buffer 로 5분간 워싱하여 TMB-D(#4600, Kem-En-Tec Diagnostics) 솔루션(solution)을 NC 멤브레인이 잠기도록 떨어뜨린 후 5분간 반응한다. 반응이 끝난 NC 멤브레인은 증류수(DW, Distilled water)에 워싱한다.
(4) 표준물질을 이용한 단백질 검출
표준물질을 이용한 특정 단백질의 검출을 위해서 재조합 단백질을 이용하였다. Recombinant Human P-selectin/CD62P (ADP3-050, R & D systems)와 Apolipoprotein A-1 단백질은 증류수(Distilled water)로 연속희석(serial dilution)하였다. 표준물질의 농도(20ng/ul to 0.05ng/ul serial dilutions)를 준비한 후 항원-항체 반응을 통해 확인할 수 있는 검출한계(LOD)를 확인하기 위해 dot blot assay를 실시하였다. 표준물질은 NC 멤브레인에 1ul씩 도팅한 후 상온에서 5분동안 건조한다. NC 멤브레인은 1% BSA(bovine serum albumin, A7906, Sigma) in PBS(phosphate buffered saline)로 상온에서 10분간 블럭킹(blocking)한다. 0.1M Tris buffer 로 5분간 워싱한 후 Human SELP/P-selectin/CD62P Antibody(LS-C296359, LSBio), (1:50 in 1% BSA/PBS)와 Apolipoprotein A-1는 상온에서 1시간 반응한다. 0.1M Tris buffer 로 5분간 워싱 한 후 secondary antibody, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074, Cell Signaling)는 RT에서 1시간 반응한다. 발색반응으로 확인하기 위해 TMB-D(#4600, Kem-En-Tec Diagnostics) 솔루션(solution)을 NC 멤브레인이 잠기도록 떨어뜨린 후 5분간 반응한다. 반응이 끝난 NC 멤브레인은 증류수에 워싱한다. 또는 ECL (enhanced chemiluminescence)반응으로 단백질 검출을 위해서 PicoEPD Western reagent(#EBP1073, ELPIS-BIOTECH)을 사용하였다.
(5) 멤브레인을 이용한 혈장분리
복수의 필터를 이용한 전혈에서의 혈장분리과정은 전혈에서 1차적으로 혈구세포를 분리하고 혈장 단백질을 구성하고 있는 수많은 단백질 중에서 단백질의 크기에 따른 분리과정을 복수의 필터를 이용하였다 필터 1과 필터 2를 통과하여 분리된 혈장 단백질의 검출 확인은 필터 3을 통해 확인하였다. 여기서 필터 3은 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인이며, NC 멤브레인은 1% BSA in PBS로 상온에서 10분간 블럭킹(blocking)한다. 0.1M Tris buffer 로 5분간 washing 한 후 Goat anti-Human IgM Secondary antibody(HRP)(1:500 in 1% BSA/PBS)는 상온에서 30분간 반응한다. 0.1M Tris buffer 로 5분간 워싱한 후 ECL (enhanced chemiluminescence)로 확인하였다.
(6) 웨스턴 블랏(Western blot)
표준물질 P-selectin 단백질 검출을 웨스턴 블랏(western blot)을 실시하여 확인하고자 하였다. 표준물질 P-selectin 은 5ug~1ng의 농도로 희석하여 겔 전기영동(gel electrophoresis)하였다. 겔(Gel)은 NC 멤브레인에 이동(transfer)하여 3% BSA(in TBS-T) blocking buffer에서 1시간 반응하였다. 0.1M Tris buffer saline(TBS/0.05% Tween-20)로 5분간 3회 워싱한 후 Human SELP/P-selectin/CD62P Antibody(LS-C296359, LSBio), (1:500 in 3% BSA/TBST)는 상온에서 1시간 반응한다. 0.1M Tris buffer saline(TBS/0.05% Tween-20)로 5분간 3회 워싱한 후 secondary antibody, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074, Cell Signaling)는 상온에서 1시간 반응한다. ECL (enhanced chemiluminescence)반응으로 단백질 검출을 위해서 PicoEPD Western reagent(#EBP1073, ELPIS-BIOTECH)을 사용하였다.
(7) QD-항체 접합 프로토콜(uantum dot (QD)-antibody conjugation protocol)
QD와 항체(antibody)의 접합(bioconjugation)을 위해 hydrophilic QD(CZM-620W, ZEUS)와 P-selectin 항체(antibody)를사용하였다. 10mM PB buffer 980ul에 5mg/ml의 QD용액 20ul를 넣고 섞은 QD solution 1ml에 100ug/ml의 EDC(22981, SIGMA), 200ug/ml의 Sulfo-NHS(24510, SIGMA)를 각각 10ul씩 넣고 30분 동안 반응한다. 반응이 끝난 QD 솔루션(solution)은 미반응 물질을 제거하기 위해 ultrafiltration unit(vivaspin500, sartorius)를 이용하여 5000RPM으로 3분간 원심 분리한다. 농축된 QD 솔루션에 10mM PB buffer를 넣어 최종 부피가 1ml이 되도록 한다. QD 솔루션 1ml에 2mg/ml농도의 P-selectin 항체를 넣은 후 상온에서 1시간동안 반응한다. 항체와의 반응이 끝난 QD transfer에 BSA를 넣고 1시간동안 반응한다. QD-합체 접합 확인을 위한 형광강도(Fluorescence intensity)은 형광분광광도계(fluorescence spectrophotometer)로 측정하였다.
(8) Quantum dot (QD)-antibody- antigen reaction
QD와 항체가 접합된 뇌졸중 진단용 조성물(QD-antibody conjugation)과 항원과의 반응을 확인하기 위해 P-셀렉틴 표준물질을 이용하였다. P-셀렉틴 표준물질은 0.5ng/ul~10ng/ul 농도별로 희석하여 결합물과 상온에서 30분 반응시킨 후 반응물을 기공 사이즈(pore size)가 10um인 NC 멤브레인(LFNC-C, NUPORE) 위에서 확인하였다. 결합물과 항원이 반응한 반응물 20ul를 NC 멤브레인에 떨어뜨린 후 UV파장에서 발광 신호를 확인 후 이미지(image)를 캡처(capture)했다.
(9) 결과
뇌졸중-특이 혈중표지자(blood biomarker)중에서, 뇌-특이 단백질인 Adhesion molecule P-셀렉틴(selectin)(CD62P)은 혈액세포와 내피세포 사이의 상호작용을 조절하는 역할을 한다. 그간의 실험 및 임상연구를 통해 급성 뇌경색 환자군에서 sP-셀렉틴의 혈장 농도가 증가하는 것으로 보고된 바 있기에 본 발명에서의 질병 진단 방법은 뇌졸중 시에 혈장 내로 분비되는 바이오마커인 sP-셀렉틴을 검출하고자 하였다.
이상의 과정을 통해 수행된 실험결과는 도 6 내지 도 11과 같으며, 구체적인 실험결과는 도 6 내지 도 11과 함께 전술하였다. 이상의 시험을 통해 뇌졸중-특이 혈중 단백질 p-selectin 항체를 이용하여 항원과의 반응을 통해 검출의 한계를 상술한 도 9에서와 같이 확인할 수 있었다. immunoblot assay은 단백질 분석에서 자주 사용되어진다. Immuoblot를 이용한 P-selectin 결과에서는 5ng/ul의 농도까지 검출되는 것을 보여주었지만, 본 발명에서와 같이 QD와 항체가 접합된 결합물을 이용한 검출한계는 상술한 도 11에서와 같이 0.5ng/ul의 농도이다.
이러한 검출한계를 비교하면 QD를 사용하여 p-셀렉틴을 형광으로 검출한 결과가 immunoblot의 검출 결과보다 10배 향상시키는 것을 볼 수 있다. 따라서 본 발명에서의 QD와 항체가 접합된 뇌졸중 진단용 조성물(100)은 특정 단백질의 검출을 위한 민감도를 향상시킴에 있어서 종래의 기술이 제공하지 못하는 높은 민감도를 제공할 수 있는 것을 확인하였다.
이상에서는 본 발명의 다양한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.
M : 멤브레인 F1 : 제1 필터
F2 : 제2 필터 F3 : 제3 필터
M1 : 상부 프레임 M2 : 하부 프레임
100 : 뇌졸중 진단용 조성물 200 : UV 램프

Claims (15)

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  5. sP-셀렉틴(soluble platelet selectin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체및 상기 항체에 접합되는 QD(Quantum Dot)를 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물; 및
    전혈 시료에 포함된 혈액성분을 분리하고, 상기 뇌졸중 진단용 조성물이 분무되는 멤브레인을 포함하고,
    상기 멤브레인은,
    상기 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터;
    상기 제1필터를 거친 상기 전혈 시료로부터 기설정된 크기 이상의 단백질을 분리하는 제2 필터; 및
    상기 제2 필터를 거친 상기 전혈 시료로부터 기설정된 크기 미만의 단백질을 흡착하는 제3 필터를 포함하며,
    상기 제3 필터는,
    상기 단백질의 흡착을 위해 나이트로셀룰로스(NC, Nitrocellulose) 재질로 마련되되, 상기 QD를 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물의 입자크기를 고려하여 상기 제1 필터 및 제2 필터의 기공 사이즈보다 크게 마련되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 뇌졸중 진단용 조성물의 상기 항체는,
    P-셀렉틴(P-selectin) 항체인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 키트.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 멤브레인은,
    상기 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 상하로 적층시키되, 서로 소정의 거리만큼 이격되어 적층되도록 마련되어 상기 전혈 시료가 상부에서 하부로 이동되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 뇌졸중 진단용 조성물은,
    상기 제3 필터에 상기 기설정된 크기 미만의 단백질이 흡착되면, 상기 멤브레인에서 상기 제1 필터 및 상기 제2 필터가 제거된 상기 제3 필터 상에 분무되어 흡착된 단백질에 포함된 sP-셀렉틴 단백질과 항원-항체 반응에 의해 결합하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 키트.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제3 필터의 기공 사이즈는,
    흡착된 단백질과 상기 뇌졸중 진단용 조성물의 반응을 위하여 1 내지 200 um의 기공 사이즈로 마련되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 키트.
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