JP3312204B2 - 血小板減少症の診断用キット - Google Patents
血小板減少症の診断用キットInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血小板減少症を誘
発する抗血小板抗体を産生するＢ細胞を検出する血小板
減少症の判定方法や、抗血小板抗体を産生するＢ細胞を
スポットとして検出する血小板減少症の診断薬や、特発
性血小板減少性紫斑病等の血小板減少症の診断に有用な
診断用キットに関する。
発する抗血小板抗体を産生するＢ細胞を検出する血小板
減少症の判定方法や、抗血小板抗体を産生するＢ細胞を
スポットとして検出する血小板減少症の診断薬や、特発
性血小板減少性紫斑病等の血小板減少症の診断に有用な
診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板は止血に必須な血球成分であり、
その数の減少は出血傾向をきたし、重篤な場合は頭蓋内
や消化管の出血をきたす。血小板減少症をきたす病態に
は、骨髄での血小板の産生低下、血栓形成による血小板
の消費、免疫学的機序（抗血小板抗体）による血小板の
破壊などが知られている。それぞれの病態に対する治療
法が異なるため、血小板減少症を呈する患者では迅速に
病態を解明し、適切な治療を開始することが臨床の場で
重要である。血小板減少症をきたす病態の中で免疫学的
機序による血小板の破壊を証明するための臨床検査法は
いまだ報告されていない。
その数の減少は出血傾向をきたし、重篤な場合は頭蓋内
や消化管の出血をきたす。血小板減少症をきたす病態に
は、骨髄での血小板の産生低下、血栓形成による血小板
の消費、免疫学的機序（抗血小板抗体）による血小板の
破壊などが知られている。それぞれの病態に対する治療
法が異なるため、血小板減少症を呈する患者では迅速に
病態を解明し、適切な治療を開始することが臨床の場で
重要である。血小板減少症をきたす病態の中で免疫学的
機序による血小板の破壊を証明するための臨床検査法は
いまだ報告されていない。
【０００３】厚生省認定の難病の中で一番患者数が多い
（およそ３万人）特発性血小板減少性紫斑病（idiopath
ic thrombocytopenic purpura；ＩＴＰ）は明らかな原
因や基礎疾患がないにもかかわらず血小板に対する自己
抗体により血小板の破壊が亢進して、血小板減少症をき
たす後天性疾患である（Lancet 349, 1531-1536, 199
7）。ＩＴＰにおける抗血小板自己抗体の標的は血小板
膜表面の血小板凝集に関連するＧＰIIｂ−IIIａやＧＰ
Ｉｂ−IXなどの糖蛋白分子であるとされ、これら血小板
膜糖蛋白分子に対するＩｇＧ型自己抗体が血小板膜表面
に結合し、オプソニン化された血小板がＦｃレセプター
を介して網内系マクロファージに貪食、破壊されるプロ
セスがＩＴＰにおける主要な血小板破壊の機序である。
ＩＴＰは自己抗体を介した比較的単純な自己免疫疾患で
あるが、病因的な抗血小板抗体産生のメカニズムは未だ
明らかではない。また、臨床におけるＩＴＰの診断は未
だ除外診断であり、血小板特異的自己抗体を検出する特
異的な検査法も広く普及していない。
（およそ３万人）特発性血小板減少性紫斑病（idiopath
ic thrombocytopenic purpura；ＩＴＰ）は明らかな原
因や基礎疾患がないにもかかわらず血小板に対する自己
抗体により血小板の破壊が亢進して、血小板減少症をき
たす後天性疾患である（Lancet 349, 1531-1536, 199
7）。ＩＴＰにおける抗血小板自己抗体の標的は血小板
膜表面の血小板凝集に関連するＧＰIIｂ−IIIａやＧＰ
Ｉｂ−IXなどの糖蛋白分子であるとされ、これら血小板
膜糖蛋白分子に対するＩｇＧ型自己抗体が血小板膜表面
に結合し、オプソニン化された血小板がＦｃレセプター
を介して網内系マクロファージに貪食、破壊されるプロ
セスがＩＴＰにおける主要な血小板破壊の機序である。
ＩＴＰは自己抗体を介した比較的単純な自己免疫疾患で
あるが、病因的な抗血小板抗体産生のメカニズムは未だ
明らかではない。また、臨床におけるＩＴＰの診断は未
だ除外診断であり、血小板特異的自己抗体を検出する特
異的な検査法も広く普及していない。
【０００４】上記血小板破壊の機序による血小板減少症
をきたすＩＴＰの診断は、他の原因による血小板減少症
を否定することで行われている（厚生省特定疾患特発性
造血障害調査研究班による診断基準、平成２年度研究業
績報告書）。日常診療では血小板減少症患者は少なくな
く、この点が血小板減少症患者の診断の大きな問題にな
っている。これまで、免疫学的機序による血小板減少症
の診断のため、抗血小板抗体を検出する多くの技術が提
案されており、例えば、血小板結合抗体（ＰＡＩｇＧ）
を用いた検査法（Dixon R, Rosse W, Ebbert L. Quanti
tative determination of antibody in idiopathic thr
ombocytopenic purpura. N Engl J Med1975; 292: 936-
9）は、唯一厚生省に保険適応検査として認定されてい
るが、血小板表面に結合している抗体量（ＩｇＧなど）
を混合受身血球凝集反応、フローサイトメトリーなどを
用いて検出する検査法であり、血小板に対する特異抗体
を測定するものではない。そのため、この検査法の感度
は９０％と高いが、他の機序による血小板減少症や血小
板減少症を有さない自己免疫性甲状腺疾患や慢性肝炎患
者においても陽性となることから疾患特異性は低いとい
う問題点があった（倉田義之、特発性血小板減少性紫斑
病の診断・鑑別疾患. 日常診療と血液 1998;8: 1504-1
1）。
をきたすＩＴＰの診断は、他の原因による血小板減少症
を否定することで行われている（厚生省特定疾患特発性
造血障害調査研究班による診断基準、平成２年度研究業
績報告書）。日常診療では血小板減少症患者は少なくな
く、この点が血小板減少症患者の診断の大きな問題にな
っている。これまで、免疫学的機序による血小板減少症
の診断のため、抗血小板抗体を検出する多くの技術が提
案されており、例えば、血小板結合抗体（ＰＡＩｇＧ）
を用いた検査法（Dixon R, Rosse W, Ebbert L. Quanti
tative determination of antibody in idiopathic thr
ombocytopenic purpura. N Engl J Med1975; 292: 936-
9）は、唯一厚生省に保険適応検査として認定されてい
るが、血小板表面に結合している抗体量（ＩｇＧなど）
を混合受身血球凝集反応、フローサイトメトリーなどを
用いて検出する検査法であり、血小板に対する特異抗体
を測定するものではない。そのため、この検査法の感度
は９０％と高いが、他の機序による血小板減少症や血小
板減少症を有さない自己免疫性甲状腺疾患や慢性肝炎患
者においても陽性となることから疾患特異性は低いとい
う問題点があった（倉田義之、特発性血小板減少性紫斑
病の診断・鑑別疾患. 日常診療と血液 1998;8: 1504-1
1）。
【０００５】そこで、血小板膜表面糖蛋白ＧＰIIｂ−II
Iａ、ＧＰＩｂ−IXなどが抗血小板抗体の標的となって
いることから、これら精製抗原に対する特異抗体を酵素
免疫測定法（enzyme-liked immunosorbent assay;ＥＬ
ＩＳＡ）を用いて測定する手法が提案された。特に、Ｉ
ＴＰ患者の多くでＧＰIIｂ−IIIａが抗血小板抗体の標
的となっていることから、抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体の測
定がＩＴＰの診断に有用と考えられたが、従来の抗体検
査とは異なり、血清または血漿を検体として用いると感
度が非常に低いことが明らかとなった。この理由とし
て、流血中の抗血小板抗体の多くはすでに血小板に結合
した形で存在することが考えられた。そこで、血小板を
検体として用い、その表面に結合している抗体を溶出し
て用いることが発案された。これまで、固相化したモノ
クローナル抗体によりヒト血小板膜可溶分画から精製し
た血小板膜蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡ（microt
itre-well assay; Woods VL, Oh EH, Mason D, McMilla
n. Autoantibodies againstthe platelet glycoprotein
s IIb/IIIa complex in patients with chronic ＩＴ
Ｐ. Blood 1984; 63: 368-75）や、固相化したモノクロ
ーナル抗体により被検血小板より精製した血小板膜蛋白
−抗血小板抗体複合体を検出するＥＬＩＳＡ（monoclon
al antibody specific immobilization of platelet an
tigens; MAIPA;Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mue
ller-Eckhardt C. Monoclonal antibody-specific immo
bolization of platelet antigens (MAIPA); a new too
l for the identification of platelet-reactive anti
bodies. Blood 1987; 70: 1722-6）や、モノクローナル
抗体結合免疫ビーズを用いた検出法（immunobead assa
y;IBA; McMillan R, Tani P, Millard F, Berchtold P,
Renshaw L, Woods VL. Platelet-associated and plas
ma anti-glycoprotein autoantibodies in chronic Ｉ
ＴＰ. Blood 1987; 70: 1040-50）や、精製血小板膜表
面糖蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡ（Hurlimann-Fo
rster M, Steiner B, von Felten A. Quantitation of
platelet-specific autoantibodies in platelet eluat
es of ＩＴＰpatients measured by a novel ELISA usi
ng the purified glycoprotein complexes GPIIb/IIIa
and GPIb/IX as antigens. Br J Haematol 1997; 98: 3
28-35）や、蛍光共鳴エネルギーによる検出法（Fluores
cence resonance energy transfer transfer; FRET; Ko
ksch M, Rothe G, Kiefel V, Schmitz G. Fluorescence
resonance energy transfer as a new method for the
epitope-specific characterization of anti-platele
t antibodies. J. Immunol Methods 1995; 187;53-67）
などが報告されている。
Iａ、ＧＰＩｂ−IXなどが抗血小板抗体の標的となって
いることから、これら精製抗原に対する特異抗体を酵素
免疫測定法（enzyme-liked immunosorbent assay;ＥＬ
ＩＳＡ）を用いて測定する手法が提案された。特に、Ｉ
ＴＰ患者の多くでＧＰIIｂ−IIIａが抗血小板抗体の標
的となっていることから、抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体の測
定がＩＴＰの診断に有用と考えられたが、従来の抗体検
査とは異なり、血清または血漿を検体として用いると感
度が非常に低いことが明らかとなった。この理由とし
て、流血中の抗血小板抗体の多くはすでに血小板に結合
した形で存在することが考えられた。そこで、血小板を
検体として用い、その表面に結合している抗体を溶出し
て用いることが発案された。これまで、固相化したモノ
クローナル抗体によりヒト血小板膜可溶分画から精製し
た血小板膜蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡ（microt
itre-well assay; Woods VL, Oh EH, Mason D, McMilla
n. Autoantibodies againstthe platelet glycoprotein
s IIb/IIIa complex in patients with chronic ＩＴ
Ｐ. Blood 1984; 63: 368-75）や、固相化したモノクロ
ーナル抗体により被検血小板より精製した血小板膜蛋白
−抗血小板抗体複合体を検出するＥＬＩＳＡ（monoclon
al antibody specific immobilization of platelet an
tigens; MAIPA;Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mue
ller-Eckhardt C. Monoclonal antibody-specific immo
bolization of platelet antigens (MAIPA); a new too
l for the identification of platelet-reactive anti
bodies. Blood 1987; 70: 1722-6）や、モノクローナル
抗体結合免疫ビーズを用いた検出法（immunobead assa
y;IBA; McMillan R, Tani P, Millard F, Berchtold P,
Renshaw L, Woods VL. Platelet-associated and plas
ma anti-glycoprotein autoantibodies in chronic Ｉ
ＴＰ. Blood 1987; 70: 1040-50）や、精製血小板膜表
面糖蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡ（Hurlimann-Fo
rster M, Steiner B, von Felten A. Quantitation of
platelet-specific autoantibodies in platelet eluat
es of ＩＴＰpatients measured by a novel ELISA usi
ng the purified glycoprotein complexes GPIIb/IIIa
and GPIb/IX as antigens. Br J Haematol 1997; 98: 3
28-35）や、蛍光共鳴エネルギーによる検出法（Fluores
cence resonance energy transfer transfer; FRET; Ko
ksch M, Rothe G, Kiefel V, Schmitz G. Fluorescence
resonance energy transfer as a new method for the
epitope-specific characterization of anti-platele
t antibodies. J. Immunol Methods 1995; 187;53-67）
などが報告されている。
【０００６】これらの方法による血小板表面から溶出し
た抗体中の抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体の陽性頻度はＩＴＰ
患者において２３〜９３％で、特異性もきわめて高いこ
とが示された。しかし、これらの検査方法では、大量の
血液サンプル（通常２０ｍｌ以上）を必要とし、操作が
煩雑で、施設間で用いる血小板膜可溶分画やモノクロー
ナル抗体が異なるために標準化が困難で、用いたモノク
ローナル抗体の種類によって結果が異なるなどの問題点
がある。そのため、これら検出法のキット化は困難で、
一般検査室までは普及していないのが現状である。
た抗体中の抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体の陽性頻度はＩＴＰ
患者において２３〜９３％で、特異性もきわめて高いこ
とが示された。しかし、これらの検査方法では、大量の
血液サンプル（通常２０ｍｌ以上）を必要とし、操作が
煩雑で、施設間で用いる血小板膜可溶分画やモノクロー
ナル抗体が異なるために標準化が困難で、用いたモノク
ローナル抗体の種類によって結果が異なるなどの問題点
がある。そのため、これら検出法のキット化は困難で、
一般検査室までは普及していないのが現状である。
【０００７】他方、Ｂ細胞における特定の抗体産生は、
ELISA spot assay（ＥＬＩＳＰＯＴ：enzyme-linked im
munospot）を含む色々な試験、例えば、特異的抗体産生
細胞数の測定のための固相免疫酵素法（J. Immunol. Me
thods 57, 301-309, 1983）や、ヒト免疫グロブリン産
生細胞の量を測るためのELISA spot assay（J. Allergy
Clin. Immunol. 88, 235-243, 1991）などを用いて、
インビトロで達成しうることが知られている。また、上
記Ｂ細胞のELISA spot assayは、普通、抗原又は動物の
抗体により一晩コートしたフラットボトムプレートの各
ウエルにＢ細胞を導入して十分な時間培養し、培養後洗
浄することによってウエル中の細胞を取り除き、抗ヒト
ＩｇＧヤギ抗体などを反応させ、抗体−酵素複合体の酵
素に対する基質を用いて染色し、マイクロスコープを用
いてカウントする方法であることも報告されている（J.
Allergy Clin. Immunol. 93, 658-668, 1994）。
ELISA spot assay（ＥＬＩＳＰＯＴ：enzyme-linked im
munospot）を含む色々な試験、例えば、特異的抗体産生
細胞数の測定のための固相免疫酵素法（J. Immunol. Me
thods 57, 301-309, 1983）や、ヒト免疫グロブリン産
生細胞の量を測るためのELISA spot assay（J. Allergy
Clin. Immunol. 88, 235-243, 1991）などを用いて、
インビトロで達成しうることが知られている。また、上
記Ｂ細胞のELISA spot assayは、普通、抗原又は動物の
抗体により一晩コートしたフラットボトムプレートの各
ウエルにＢ細胞を導入して十分な時間培養し、培養後洗
浄することによってウエル中の細胞を取り除き、抗ヒト
ＩｇＧヤギ抗体などを反応させ、抗体−酵素複合体の酵
素に対する基質を用いて染色し、マイクロスコープを用
いてカウントする方法であることも報告されている（J.
Allergy Clin. Immunol. 93, 658-668, 1994）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】感度、特異性が従来の
抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体検出法と同等もしくはそれ以上
で、これら従来手法のもつ問題点を解決し、一般検査室
に広く普及する血小板減少症の診断のための新しい検査
法が求められている。本発明の課題は、従来の検査法に
比べて感度・特異性がより高く、少量の検体で簡便に、
血小板減少症の診断を精確に行うことができる診断用キ
ットや、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を検出する血小板減少
症の判定方法や抗血小板抗体産生Ｂ細胞の検出試薬を提
供することにある。
抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体検出法と同等もしくはそれ以上
で、これら従来手法のもつ問題点を解決し、一般検査室
に広く普及する血小板減少症の診断のための新しい検査
法が求められている。本発明の課題は、従来の検査法に
比べて感度・特異性がより高く、少量の検体で簡便に、
血小板減少症の診断を精確に行うことができる診断用キ
ットや、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を検出する血小板減少
症の判定方法や抗血小板抗体産生Ｂ細胞の検出試薬を提
供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究し、従来の血小板減少症に伴う
抗血小板抗体の検査法の問題点の多くは、抗血小板抗体
のほとんどが流血中で血小板に結合した形で存在するた
めに直接解析できないことに起因する点に着目し、従来
の検出法とは異なり、抗血小板抗体ではなく抗血小板抗
体を産生しているリンパ球（Ｂ細胞）を検出すればよい
のではないかとの考え方に辿り着き、enzyme-linked im
munospot assay（ＥＬＩＳＰＯＴ；Zubler RH, Perrin
LH, Doucet A, Zhang X, Huang YP, Miescher PA. Freq
uencies of HIV-reactive B cells in seropositive an
d seronegative individuals. Clin Exp Immunol 1991;
87: 31-6）という原理を応用して、ＩＴＰ患者におけ
る抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体を測定したところ、抗血小板
抗体を産生しているＢ細胞のみを特異的に感度よく、さ
らに短時間で検出できることを見い出した。また、必要
な検体はわずか１０6個の末梢血単核球（標準的には２
〜５ｍｌの末梢血）で充分であり、従来の血小板を用い
る検査法において問題となった血小板数による影響も受
けないことを確認し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意研究し、従来の血小板減少症に伴う
抗血小板抗体の検査法の問題点の多くは、抗血小板抗体
のほとんどが流血中で血小板に結合した形で存在するた
めに直接解析できないことに起因する点に着目し、従来
の検出法とは異なり、抗血小板抗体ではなく抗血小板抗
体を産生しているリンパ球（Ｂ細胞）を検出すればよい
のではないかとの考え方に辿り着き、enzyme-linked im
munospot assay（ＥＬＩＳＰＯＴ；Zubler RH, Perrin
LH, Doucet A, Zhang X, Huang YP, Miescher PA. Freq
uencies of HIV-reactive B cells in seropositive an
d seronegative individuals. Clin Exp Immunol 1991;
87: 31-6）という原理を応用して、ＩＴＰ患者におけ
る抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体を測定したところ、抗血小板
抗体を産生しているＢ細胞のみを特異的に感度よく、さ
らに短時間で検出できることを見い出した。また、必要
な検体はわずか１０6個の末梢血単核球（標準的には２
〜５ｍｌの末梢血）で充分であり、従来の血小板を用い
る検査法において問題となった血小板数による影響も受
けないことを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、抗血小板抗体に特異的
な抗原とＢ細胞とをインビトロで接触させ、抗血小板抗
体産生Ｂ細胞をスポットとして検出することを特徴とす
る血小板減少症の判定方法（請求項１）や、抗血小板抗
体に特異的な抗原が、血小板膜表面蛋白であることを特
徴とする請求項１記載の血小板減少症の判定方法（請求
項２）や、血小板膜表面蛋白が、ＧＰIIｂ−IIIａ又は
ＧＰＩｂ−IX抗原であること特徴とする請求項２記載の
血小板減少症の判定方法（請求項３）や、抗血小板抗体
に特異的な抗原として、組換え蛋白質を用いることを特
徴とする請求項１〜３のいずれか記載の血小板減少症の
判定方法（請求項４）や、抗血小板抗体に特異的な抗原
が、担体に担持されていることを特徴とする請求項１〜
４のいずれか記載の血小板減少症の判定方法（請求項
５）に関する。
な抗原とＢ細胞とをインビトロで接触させ、抗血小板抗
体産生Ｂ細胞をスポットとして検出することを特徴とす
る血小板減少症の判定方法（請求項１）や、抗血小板抗
体に特異的な抗原が、血小板膜表面蛋白であることを特
徴とする請求項１記載の血小板減少症の判定方法（請求
項２）や、血小板膜表面蛋白が、ＧＰIIｂ−IIIａ又は
ＧＰＩｂ−IX抗原であること特徴とする請求項２記載の
血小板減少症の判定方法（請求項３）や、抗血小板抗体
に特異的な抗原として、組換え蛋白質を用いることを特
徴とする請求項１〜３のいずれか記載の血小板減少症の
判定方法（請求項４）や、抗血小板抗体に特異的な抗原
が、担体に担持されていることを特徴とする請求項１〜
４のいずれか記載の血小板減少症の判定方法（請求項
５）に関する。
【００１１】また本発明は、抗血小板抗体に特異的な抗
原と細胞培養液とが含まれており、抗血小板抗体産生Ｂ
細胞をスポットとして検出することを特徴とする血小板
減少症の診断薬（請求項６）や、さらに、標識された二
次抗体が含まれていることを特徴とする請求項６記載の
血小板減少症の診断薬（請求項７）や、標識された二次
抗体が、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体であることを特徴と
する請求項７記載の血小板減少症の診断薬（請求項８）
や、抗血小板抗体に特異的な抗原が、血小板膜表面蛋白
であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の
血小板減少症の診断薬（請求項９）や、血小板膜表面蛋
白が、ＧＰIIｂ−IIIａ又はＧＰＩｂ−IX抗原であるこ
と特徴とする請求項９記載の血小板減少症の診断薬（請
求項１０）や、抗血小板抗体に特異的な抗原として、組
換え蛋白質を用いることを特徴とする請求項６〜１０の
いずれか記載の血小板減少症の診断薬（請求項１１）
や、抗血小板抗体に特異的な抗原が、担体に担持されて
いることを特徴とする請求項６〜１１のいずれか記載の
血小板減少症の診断薬（請求項１２）に関する。
原と細胞培養液とが含まれており、抗血小板抗体産生Ｂ
細胞をスポットとして検出することを特徴とする血小板
減少症の診断薬（請求項６）や、さらに、標識された二
次抗体が含まれていることを特徴とする請求項６記載の
血小板減少症の診断薬（請求項７）や、標識された二次
抗体が、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体であることを特徴と
する請求項７記載の血小板減少症の診断薬（請求項８）
や、抗血小板抗体に特異的な抗原が、血小板膜表面蛋白
であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の
血小板減少症の診断薬（請求項９）や、血小板膜表面蛋
白が、ＧＰIIｂ−IIIａ又はＧＰＩｂ−IX抗原であるこ
と特徴とする請求項９記載の血小板減少症の診断薬（請
求項１０）や、抗血小板抗体に特異的な抗原として、組
換え蛋白質を用いることを特徴とする請求項６〜１０の
いずれか記載の血小板減少症の診断薬（請求項１１）
や、抗血小板抗体に特異的な抗原が、担体に担持されて
いることを特徴とする請求項６〜１１のいずれか記載の
血小板減少症の診断薬（請求項１２）に関する。
【００１２】さらに本発明は、請求項６〜１２のいずれ
か記載の血小板減少症の診断薬を含むことを特徴とする
血小板減少症の診断用キット（請求項１３）や、血小板
減少症が、特発性血小板減少性紫斑病であることを特徴
とする請求項１３記載の血小板減少症の診断用キット
（請求項１４）に関する。
か記載の血小板減少症の診断薬を含むことを特徴とする
血小板減少症の診断用キット（請求項１３）や、血小板
減少症が、特発性血小板減少性紫斑病であることを特徴
とする請求項１３記載の血小板減少症の診断用キット
（請求項１４）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明における血小板減少症の判
定方法としては、抗血小板抗体に特異的な抗原とＢ細胞
とをインビトロで接触させ、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を
スポットとして検出する方法であれば特に制限されるも
のではなく、例えば、抗血小板抗体に特異的な抗原を担
体に担持せしめ、かかる担体に担持された抗血小板抗体
特異的な抗原に被検末梢血を接触させて、抗血小板抗体
を介して前記抗原と抗血小板抗体産生Ｂ細胞とを結合さ
せ、次いで洗浄することによりＢ細胞等を洗い流し、標
識化二次抗体などを用いて、抗原に結合した抗血小板抗
体を検出することにより、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を直
接検出する方法を例示することができる。
定方法としては、抗血小板抗体に特異的な抗原とＢ細胞
とをインビトロで接触させ、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を
スポットとして検出する方法であれば特に制限されるも
のではなく、例えば、抗血小板抗体に特異的な抗原を担
体に担持せしめ、かかる担体に担持された抗血小板抗体
特異的な抗原に被検末梢血を接触させて、抗血小板抗体
を介して前記抗原と抗血小板抗体産生Ｂ細胞とを結合さ
せ、次いで洗浄することによりＢ細胞等を洗い流し、標
識化二次抗体などを用いて、抗原に結合した抗血小板抗
体を検出することにより、抗血小板抗体産生Ｂ細胞を直
接検出する方法を例示することができる。
【００１４】上記担体としては、抗血小板抗体に特異的
な抗原を固相表面に担持しうるものであればどのような
ものでもよく、メンブレン、プレート、ビーズ等の固相
担体を例示することができ、抗原をかかる担体に担持さ
せる方法としては、物理的及び／又は化学的吸着、コー
ティング等を例示することができる。上記標識化二次抗
体としては、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化Ｆ(ａ
ｂ′)2フラグメントや標識化Ｆａｂフラグメントなどを
挙げることができ、標識化二次抗体における標識物質と
してはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等
の酵素やラジオアイソトープ、金コロイド、蛍光物質等
を挙げることができる。これらＲＩＡ、ＥＩＡ、免疫金
法、蛍光抗体法等の固相化した抗原に標識化二次抗体を
用いる方法以外の方法としては、ラテックス表面に抗血
小板抗体特異的抗原を吸着させ、次いで該ラテックスを
被検末梢血と接触させた後、洗浄することによりＢ細胞
等を洗い流し、ラテックスの凝集で抗血小板抗体産生Ｂ
細胞を検出するラテックス凝集法等を例示することがで
きる。
な抗原を固相表面に担持しうるものであればどのような
ものでもよく、メンブレン、プレート、ビーズ等の固相
担体を例示することができ、抗原をかかる担体に担持さ
せる方法としては、物理的及び／又は化学的吸着、コー
ティング等を例示することができる。上記標識化二次抗
体としては、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化Ｆ(ａ
ｂ′)2フラグメントや標識化Ｆａｂフラグメントなどを
挙げることができ、標識化二次抗体における標識物質と
してはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等
の酵素やラジオアイソトープ、金コロイド、蛍光物質等
を挙げることができる。これらＲＩＡ、ＥＩＡ、免疫金
法、蛍光抗体法等の固相化した抗原に標識化二次抗体を
用いる方法以外の方法としては、ラテックス表面に抗血
小板抗体特異的抗原を吸着させ、次いで該ラテックスを
被検末梢血と接触させた後、洗浄することによりＢ細胞
等を洗い流し、ラテックスの凝集で抗血小板抗体産生Ｂ
細胞を検出するラテックス凝集法等を例示することがで
きる。
【００１５】本発明の抗血小板抗体に特異的な抗原とし
ては、上記抗血小板抗体に特異的な抗原であればどのよ
うなものでもよく、例えば、ＧＰIIｂ−IIIａ、ＧＰＩ
ｂ−IX、ＧＰＩａ−IIａ、ＧＰIV、ＧＰＶ等の血小板膜
表面蛋白やそれらのエピトープを具体的に挙げることが
できるが、上記本発明の血小板減少症の判定方法におい
て感度、特異性の面で優れているＧＰIIｂ−IIIａ、Ｇ
ＰＩｂ−IX等がより好ましい。血小板膜表面蛋白等の上
記抗血小板抗体に特異的な抗原の調製方法としては特に
制限されず、例えば、プールしたヒト血小板からアフィ
ニティーカラムで精製することにより製造することもで
きるが、血小板輸血を受けた患者間でのアミノ酸配列の
個人差（polymorphism）の問題や収量の問題を考慮する
と、単一の遺伝子より作製したリコンビナント抗原（組
換え蛋白質）を使用することが好ましく、かかるリコン
ビナント抗原を使用することにより、実用化（キット
化）及び標準化が一層容易になる。
ては、上記抗血小板抗体に特異的な抗原であればどのよ
うなものでもよく、例えば、ＧＰIIｂ−IIIａ、ＧＰＩ
ｂ−IX、ＧＰＩａ−IIａ、ＧＰIV、ＧＰＶ等の血小板膜
表面蛋白やそれらのエピトープを具体的に挙げることが
できるが、上記本発明の血小板減少症の判定方法におい
て感度、特異性の面で優れているＧＰIIｂ−IIIａ、Ｇ
ＰＩｂ−IX等がより好ましい。血小板膜表面蛋白等の上
記抗血小板抗体に特異的な抗原の調製方法としては特に
制限されず、例えば、プールしたヒト血小板からアフィ
ニティーカラムで精製することにより製造することもで
きるが、血小板輸血を受けた患者間でのアミノ酸配列の
個人差（polymorphism）の問題や収量の問題を考慮する
と、単一の遺伝子より作製したリコンビナント抗原（組
換え蛋白質）を使用することが好ましく、かかるリコン
ビナント抗原を使用することにより、実用化（キット
化）及び標準化が一層容易になる。
【００１６】また、本発明の血小板減少症の診断薬とし
ては、前記抗血小板抗体に特異的な抗原と細胞培養液と
が含まれており、抗血小板抗体産生Ｂ細胞をスポットと
して検出するものであれば特に制限されるものではない
が、標識された二次抗体が含まれているものが好まし
く、特に担体に担持されている抗原が含まれている診断
薬が好ましい。上記担体としては、前記のように、抗血
小板抗体に特異的な抗原を固相表面に担持しうるもので
あればどのようなものでもよく、メンブレン、プレー
ト、ビーズ、ラテックス等の固相担体を例示することが
でき、抗原をかかる担体に担持させる方法としては、物
理的及び／又は化学的吸着、コーティング等を例示する
ことができる。上記標識化二次抗体としては、標識化抗
ヒトＩｇＧ抗体、標識化Ｆ(ａｂ′)2フラグメントや標
識化Ｆａｂフラグメントなどを挙げることができ、標識
化二次抗体における標識物質としてはβ−ガラクトシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ等の酵
素や、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ等のラジオアイソトープ
や、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テト
ラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、Ｇ
ＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク
質などを融合させた融合タンパク質や、金コロイドなど
を挙げることができる。上記前記抗血小板抗体に特異的
な抗原としては、ＧＰIIｂ−IIIａ又はＧＰＩｂ−IX等
の血小板膜表面蛋白を好適に例示することができる。
ては、前記抗血小板抗体に特異的な抗原と細胞培養液と
が含まれており、抗血小板抗体産生Ｂ細胞をスポットと
して検出するものであれば特に制限されるものではない
が、標識された二次抗体が含まれているものが好まし
く、特に担体に担持されている抗原が含まれている診断
薬が好ましい。上記担体としては、前記のように、抗血
小板抗体に特異的な抗原を固相表面に担持しうるもので
あればどのようなものでもよく、メンブレン、プレー
ト、ビーズ、ラテックス等の固相担体を例示することが
でき、抗原をかかる担体に担持させる方法としては、物
理的及び／又は化学的吸着、コーティング等を例示する
ことができる。上記標識化二次抗体としては、標識化抗
ヒトＩｇＧ抗体、標識化Ｆ(ａｂ′)2フラグメントや標
識化Ｆａｂフラグメントなどを挙げることができ、標識
化二次抗体における標識物質としてはβ−ガラクトシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ等の酵
素や、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ等のラジオアイソトープ
や、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テト
ラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、Ｇ
ＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク
質などを融合させた融合タンパク質や、金コロイドなど
を挙げることができる。上記前記抗血小板抗体に特異的
な抗原としては、ＧＰIIｂ−IIIａ又はＧＰＩｂ−IX等
の血小板膜表面蛋白を好適に例示することができる。
【００１７】本発明の血小板減少症の診断用キットとし
ては、上記血小板減少症の診断薬を含むものであれば特
に制限されるものではないが、通常の診断用キットに含
まれる緩衝剤等を含んでいてもよい。かかる診断用キッ
トを用いることにより特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴ
Ｐ）を直接的に診断することができる他、ＩＴＰ以外の
血小板減少症である白血病、骨髄異形性症候群、肝硬
変、再生不良性貧血、血栓性血小板減少性紫斑病等を間
接的・消極的に診断することができる。かかる診断用キ
ットに用いられる検体としては、被検者の末梢血、骨
髄、脾臓等から得ることができる単核球を具体的に挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではない。
ては、上記血小板減少症の診断薬を含むものであれば特
に制限されるものではないが、通常の診断用キットに含
まれる緩衝剤等を含んでいてもよい。かかる診断用キッ
トを用いることにより特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴ
Ｐ）を直接的に診断することができる他、ＩＴＰ以外の
血小板減少症である白血病、骨髄異形性症候群、肝硬
変、再生不良性貧血、血栓性血小板減少性紫斑病等を間
接的・消極的に診断することができる。かかる診断用キ
ットに用いられる検体としては、被検者の末梢血、骨
髄、脾臓等から得ることができる単核球を具体的に挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ＩＴＰ患者と健常人における各組織中の抗Ｇ
ＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度の比較］ （血小板減少症の診断に用いられる単核球の調整） 厚生省による診断基準を満たし、血小板数５万／μｌ以
下が６ヶ月以上持続し、骨髄検査で骨髄巨核球数が正常
又は増加していたＩＴＰ患者及び健常人の末消血（２２
例，６例）、骨髄（５例，３例）、脾臓（８例，４例）
から公知の方法により単核球をそれぞれ分離した。分離
した各単核球をＰＢＳで１回、ＲＰＭＩ培養液（１０％
のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
添加ＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄した後、ＲＰＭＩ培
養液中で最終的に５×１０5／ｍｌの細胞濃度に調整し
た。
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 実施例１［ＩＴＰ患者と健常人における各組織中の抗Ｇ
ＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度の比較］ （血小板減少症の診断に用いられる単核球の調整） 厚生省による診断基準を満たし、血小板数５万／μｌ以
下が６ヶ月以上持続し、骨髄検査で骨髄巨核球数が正常
又は増加していたＩＴＰ患者及び健常人の末消血（２２
例，６例）、骨髄（５例，３例）、脾臓（８例，４例）
から公知の方法により単核球をそれぞれ分離した。分離
した各単核球をＰＢＳで１回、ＲＰＭＩ培養液（１０％
のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
添加ＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄した後、ＲＰＭＩ培
養液中で最終的に５×１０5／ｍｌの細胞濃度に調整し
た。
【００１９】 （精製ヒトＧＰIIｂ−IIIａ抗原の固相化） 抗ＧＰIIｂ−IIIａモノクローナル抗体を結合させたア
フィニティーカラムを用いて、健常人由来の血小板から
ヒトＧＰIIｂ−IIIａ抗原を精製し、この精製したヒト
ＧＰIIｂ−IIIａ抗原をＰＢＳ−Ｃａ（０．５ｍＭのＣ
ａＣｌ2含有ＰＢＳ）に３０μｇ／ｍｌの濃度になるよ
うに溶解し調整した。９６ウェルメンブレンプレート
（Millipore社、Bedford、MA、USA）の各ウェルにエタ
ノールを５０μｌずつ分注し、各ウェルをＰＢＳ−Ｃａ
２００μｌで２回洗浄した後、上記調整したヒトＧＰII
ｂ−IIIａ溶液を５０μｌずつ加え、４℃で１２時間放
置し、ヒトＧＰIIｂ−IIIａをメンブレンに吸着させ
た。吸着後、各ウェルをＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで３回
洗浄し、さらに１％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ−
Ｃａを１００μｌ加えて室温で３０分放置し、メンブレ
ン上の非結合部位をブロックした。
フィニティーカラムを用いて、健常人由来の血小板から
ヒトＧＰIIｂ−IIIａ抗原を精製し、この精製したヒト
ＧＰIIｂ−IIIａ抗原をＰＢＳ−Ｃａ（０．５ｍＭのＣ
ａＣｌ2含有ＰＢＳ）に３０μｇ／ｍｌの濃度になるよ
うに溶解し調整した。９６ウェルメンブレンプレート
（Millipore社、Bedford、MA、USA）の各ウェルにエタ
ノールを５０μｌずつ分注し、各ウェルをＰＢＳ−Ｃａ
２００μｌで２回洗浄した後、上記調整したヒトＧＰII
ｂ−IIIａ溶液を５０μｌずつ加え、４℃で１２時間放
置し、ヒトＧＰIIｂ−IIIａをメンブレンに吸着させ
た。吸着後、各ウェルをＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで３回
洗浄し、さらに１％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ−
Ｃａを１００μｌ加えて室温で３０分放置し、メンブレ
ン上の非結合部位をブロックした。
【００２０】（単核球の培養） 各ウェル中の溶液を取り除いた後、各ウェルをＰＢＳ−
Ｃａ２００μｌで１回洗浄し、前記調整した５×１０5
／ｍｌの単核球縣濁液２００μｌ（１×１０5細胞）
を、ヒトＧＰIIｂ−IIIａをコートした各ウェルに加
え、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ2、加
湿条件下で４時間培養した。なお、同一検体につき計１
０ウェルの培養を行った。
Ｃａ２００μｌで１回洗浄し、前記調整した５×１０5
／ｍｌの単核球縣濁液２００μｌ（１×１０5細胞）
を、ヒトＧＰIIｂ−IIIａをコートした各ウェルに加
え、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ2、加
湿条件下で４時間培養した。なお、同一検体につき計１
０ウェルの培養を行った。
【００２１】 （抗原に結合した抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞の
検出） 上記培養後、各ウェル中の溶液を取り除き、０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで各ウェ
ルを３回洗浄した後、０．１％のウシ血清アルブミン含
有ＰＢＳ−Ｃａで１，０００倍に希釈したアルカリフォ
スファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Capp
el社、Aurora、OH、USA）を、各ウエルに１００μｌず
つ添加し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェル
中の溶液を取り除き、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０添加
ＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで４回、ＰＢＳ−Ｃａで１回洗
浄した。酵素基質を含む発色液［３００μｇ／ｍｌのni
troblue tetrazolium（シグマ社、St. Louis、MO、US
A）、６０μｇ／ｍｌの5-bromo-4-chloro-3-inddolyl p
hosphate（Sigma社）、１００ｍＭのトリス、５０ｍＭ
のＭｇＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ９．５］
を、各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で２０分間
発色させた。発色後、各ウェルを滅菌精製水２００μｌ
で１０回洗浄し、メンブレンを乾燥させ、各ウェルの発
色スポット数［抗血小板抗体を産生しているリンパ球
（Ｂ細胞）数］を実体顕微鏡下で数えた。１０ウェルの
スポット数の平均を求め、単核球１０5個あたりの抗Ｇ
ＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞数を算出した。
検出） 上記培養後、各ウェル中の溶液を取り除き、０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで各ウェ
ルを３回洗浄した後、０．１％のウシ血清アルブミン含
有ＰＢＳ−Ｃａで１，０００倍に希釈したアルカリフォ
スファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Capp
el社、Aurora、OH、USA）を、各ウエルに１００μｌず
つ添加し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェル
中の溶液を取り除き、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０添加
ＰＢＳ−Ｃａ２００μｌで４回、ＰＢＳ−Ｃａで１回洗
浄した。酵素基質を含む発色液［３００μｇ／ｍｌのni
troblue tetrazolium（シグマ社、St. Louis、MO、US
A）、６０μｇ／ｍｌの5-bromo-4-chloro-3-inddolyl p
hosphate（Sigma社）、１００ｍＭのトリス、５０ｍＭ
のＭｇＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ９．５］
を、各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で２０分間
発色させた。発色後、各ウェルを滅菌精製水２００μｌ
で１０回洗浄し、メンブレンを乾燥させ、各ウェルの発
色スポット数［抗血小板抗体を産生しているリンパ球
（Ｂ細胞）数］を実体顕微鏡下で数えた。１０ウェルの
スポット数の平均を求め、単核球１０5個あたりの抗Ｇ
ＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞数を算出した。
【００２２】結果を図１に示す。この結果から、抗ＧＰ
IIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞はＩＴＰ患者のみに検出さ
れ、末梢血、骨髄、脾臓のいずれの部位にも存在するこ
とがわかった。特に脾臓では単核球の約２０％を占める
Ｂ細胞２００〜２，０００個中に１個とかなり高頻度に
認められた。これらのことから、本発明の抗ＧＰIIｂ−
IIIａ抗体産生Ｂ細胞の検出は血小板数に左右されるこ
となく、簡便に短時間で行えることから、ＩＴＰの診断
に極めて有用であることが確認できた。また、同一患者
では、抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度と血小板
数は負の相関を示すことから、疾患活動性のモニタリン
グとしても用いることができると考えられる。さらに、
ＩＴＰ患者Ｂ細胞は単球に比べて低濃度（約１／１０）
のＧＰIIｂ−IIIａ濃度でもＧＰIIｂ−IIIａ反応性Ｔ細
胞株の増殖を誘導することから、ＩＴＰにおけるＧＰII
ｂ−IIIａ反応性Ｔ細胞のプライミングや活性化の維持
に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられ
る。
IIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞はＩＴＰ患者のみに検出さ
れ、末梢血、骨髄、脾臓のいずれの部位にも存在するこ
とがわかった。特に脾臓では単核球の約２０％を占める
Ｂ細胞２００〜２，０００個中に１個とかなり高頻度に
認められた。これらのことから、本発明の抗ＧＰIIｂ−
IIIａ抗体産生Ｂ細胞の検出は血小板数に左右されるこ
となく、簡便に短時間で行えることから、ＩＴＰの診断
に極めて有用であることが確認できた。また、同一患者
では、抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度と血小板
数は負の相関を示すことから、疾患活動性のモニタリン
グとしても用いることができると考えられる。さらに、
ＩＴＰ患者Ｂ細胞は単球に比べて低濃度（約１／１０）
のＧＰIIｂ−IIIａ濃度でもＧＰIIｂ−IIIａ反応性Ｔ細
胞株の増殖を誘導することから、ＩＴＰにおけるＧＰII
ｂ−IIIａ反応性Ｔ細胞のプライミングや活性化の維持
に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられ
る。
【００２３】 実施例２［各血小板減少症患者及び健常人を対象とした
本発明の検査法による感度と特異性の検討］ 厚生省による診断基準を満たし、血小板数５万／μｌ以
下が６ヶ月以上持続し、骨髄検査で骨髄巨核球数が正常
又は増加していたＩＴＰ患者６７例、コントロールとし
て、免疫学的な機序の関与が否定的な血小板減少症患者
４２例及び健常人３６例から、それぞれヘパリン入り容
器で採血した末梢血約１０ｍｌに同量のリン酸緩衝液生
理食塩水（phosphate-buffered saline；ＰＢＳ）を添
加し、Lymphoprep（Nycomed Pharma AS、Oslo、Norwa
y）を用いた密度勾配遠心分離（２，０００ｒｐｍ×３
０分間）により末梢血単核球を得た。これらの末梢血単
核球を前記のようにＲＰＭＩ培養液中で５×１０5／ｍ
ｌの細胞濃度に調整し、実施例１と同様の方法により単
核球１０5個あたりの抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞
数を算出した（表１）。
本発明の検査法による感度と特異性の検討］ 厚生省による診断基準を満たし、血小板数５万／μｌ以
下が６ヶ月以上持続し、骨髄検査で骨髄巨核球数が正常
又は増加していたＩＴＰ患者６７例、コントロールとし
て、免疫学的な機序の関与が否定的な血小板減少症患者
４２例及び健常人３６例から、それぞれヘパリン入り容
器で採血した末梢血約１０ｍｌに同量のリン酸緩衝液生
理食塩水（phosphate-buffered saline；ＰＢＳ）を添
加し、Lymphoprep（Nycomed Pharma AS、Oslo、Norwa
y）を用いた密度勾配遠心分離（２，０００ｒｐｍ×３
０分間）により末梢血単核球を得た。これらの末梢血単
核球を前記のようにＲＰＭＩ培養液中で５×１０5／ｍ
ｌの細胞濃度に調整し、実施例１と同様の方法により単
核球１０5個あたりの抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞
数を算出した（表１）。
【００２４】
【表１】
【００２５】表１の結果から、ＥＬＩＳＰＯＴにより検
出された抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞数は免疫学
的機序で血小板が破壊されるＩＴＰ患者では平均１２．
１（０．２〜３６．４）、他の血小板減少症患者では
０．３４（０〜１．２）、健常人では０．２６（０〜
０．７）であり、ＩＴＰ患者では他の２群（血小板減少
症や健常人）に比べて有意に高値を示していた（ｐ＜
０．００００１、Student'st-test）。末梢血単核球１
０5中に１個をカットオフとした際の陽性頻度はＩＴＰ
患者では６４／６７（９６％）、他の血小板減少症患者
では２／４２（５％）、健常人では０／３６（０％）で
あった。したがって、本発明の抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体
産生Ｂ細胞を検出する方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）のＩＴＰ
における感度は９６％で、特異性は９７％となり、ＩＴ
Ｐの診断に極めて有用な検査法と考えられる。
出された抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞数は免疫学
的機序で血小板が破壊されるＩＴＰ患者では平均１２．
１（０．２〜３６．４）、他の血小板減少症患者では
０．３４（０〜１．２）、健常人では０．２６（０〜
０．７）であり、ＩＴＰ患者では他の２群（血小板減少
症や健常人）に比べて有意に高値を示していた（ｐ＜
０．００００１、Student'st-test）。末梢血単核球１
０5中に１個をカットオフとした際の陽性頻度はＩＴＰ
患者では６４／６７（９６％）、他の血小板減少症患者
では２／４２（５％）、健常人では０／３６（０％）で
あった。したがって、本発明の抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体
産生Ｂ細胞を検出する方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）のＩＴＰ
における感度は９６％で、特異性は９７％となり、ＩＴ
Ｐの診断に極めて有用な検査法と考えられる。
【００２６】
【発明の効果】本発明によると、特発性血小板減少性紫
斑病（ＩＴＰ）を直接的に診断することができる上に、
従来の技術に比べて、少量の検体で、感度よく、ＩＴＰ
特異的に診断することができる。加えて、多くの一般検
査室にある低速遠心機、ＣＯ2インキュベーター以外に
特殊な装置を必要とすることがなく、検査にかかる時間
も約８時間と短く、迅速に結果が得られるという利点も
ある。したがって、本発明の診断用キットを用いると、
多くの一般検査室でＩＴＰの診断・検査を簡便に行うこ
とができる。
斑病（ＩＴＰ）を直接的に診断することができる上に、
従来の技術に比べて、少量の検体で、感度よく、ＩＴＰ
特異的に診断することができる。加えて、多くの一般検
査室にある低速遠心機、ＣＯ2インキュベーター以外に
特殊な装置を必要とすることがなく、検査にかかる時間
も約８時間と短く、迅速に結果が得られるという利点も
ある。したがって、本発明の診断用キットを用いると、
多くの一般検査室でＩＴＰの診断・検査を簡便に行うこ
とができる。
【図１】ＩＴＰ患者と健常人における末梢血、骨髄、脾
臓中のＩｇＧ抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度の
比較を示す図である。
臓中のＩｇＧ抗ＧＰIIｂ−IIIａ抗体産生Ｂ細胞頻度の
比較を示す図である。
フロントページの続き (56)参考文献 特表 平５−502103（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−503770（ＪＰ，Ａ) 桑名正隆，臨床病理，日本，日本臨床 病理学会，2000年 ９月30日，ＶＯＬ. 48，106 桑名正隆，日本内科学会雑誌，日本, 社団法人 日本内科学会，ＶＯＬ．89 ＮＯ．６，35−40 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/564
Claims (14)
- 【請求項１】 抗血小板抗体に特異的な抗原とＢ細胞と
をインビトロで接触させ、抗血小板抗体産生Ｂ細胞をス
ポットとして検出することを特徴とする血小板減少症の
判定方法。 - 【請求項２】 抗血小板抗体に特異的な抗原が、血小板
膜表面蛋白であることを特徴とする請求項１記載の血小
板減少症の判定方法。 - 【請求項３】 血小板膜表面蛋白が、ＧＰIIｂ−IIIａ
又はＧＰＩｂ−IX抗原であること特徴とする請求項２記
載の血小板減少症の判定方法。 - 【請求項４】 抗血小板抗体に特異的な抗原として、組
換え蛋白質を用いることを特徴とする請求項１〜３のい
ずれか記載の血小板減少症の判定方法。 - 【請求項５】 抗血小板抗体に特異的な抗原が、担体に
担持されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
か記載の血小板減少症の判定方法。 - 【請求項６】 抗血小板抗体に特異的な抗原と細胞培養
液とが含まれており、抗血小板抗体産生Ｂ細胞をスポッ
トとして検出することを特徴とする血小板減少症の診断
薬。 - 【請求項７】 さらに、標識された二次抗体が含まれて
いることを特徴とする請求項６記載の血小板減少症の診
断薬。 - 【請求項８】 標識された二次抗体が、酵素標識抗ヒト
ＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項７記載の血小
板減少症の診断薬。 - 【請求項９】 抗血小板抗体に特異的な抗原が、血小板
膜表面蛋白であることを特徴とする請求項６〜８のいず
れか記載の血小板減少症の診断薬。 - 【請求項１０】 血小板膜表面蛋白が、ＧＰIIｂ−III
ａ又はＧＰＩｂ−IX抗原であること特徴とする請求項９
記載の血小板減少症の診断薬。 - 【請求項１１】 抗血小板抗体に特異的な抗原として、
組換え蛋白質を用いることを特徴とする請求項６〜１０
のいずれか記載の血小板減少症の診断薬。 - 【請求項１２】 抗血小板抗体に特異的な抗原が、担体
に担持されていることを特徴とする請求項６〜１１のい
ずれか記載の血小板減少症の診断薬。 - 【請求項１３】 請求項６〜１２のいずれか記載の血小
板減少症の診断薬を含むことを特徴とする血小板減少症
の診断用キット。 - 【請求項１４】 血小板減少症が、特発性血小板減少性
紫斑病であることを特徴とする請求項１３記載の血小板
減少症の診断用キット。
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| JP2000316269A JP3312204B2 (ja) | 2000-10-17 | 2000-10-17 | 血小板減少症の診断用キット |
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-
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- 2000-10-17 JP JP2000316269A patent/JP3312204B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 桑名正隆，日本内科学会雑誌，日本，社団法人 日本内科学会，ＶＯＬ．８９ ＮＯ．６，３５−４０ |
| 桑名正隆，臨床病理，日本，日本臨床病理学会，２０００年 ９月３０日，ＶＯＬ．４８，１０６ |
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