JPH0389166A

JPH0389166A - 抗体活性の測定方法

Info

Publication number: JPH0389166A
Application number: JP22701189A
Authority: JP
Inventors: Takashi Tsuji; 孝辻; Yutaka Takarada; 裕宝田; Kenjiro Mori; 健二郎森; Yoko Takamatsu; 高松　洋子
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1989-08-31
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1991-04-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産呈上生に里公立本発明は、抗原抗体反応を利用した単クローン性抗体の
抗体活性の測定方法に関する。

災来旦技歪単クローン性抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒやＭｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって、細胞融合法によって得られることが報告
されて以来、医学分野を中心に急速に応用されている。

この単クローン性抗体は、抗体細胞とミエローマ細胞を
融合したものであって、産生ずる抗体が単クローン由来
であるから、単一の抗原決定基とのみ反応する。そこで
、その高い特異性を利用して、抗原の検出、定量、精製
等に応用されている。また、一定品質の抗体を安定して
、増殖生産させることもできる。

このような単クローン性抗体は、一般に、抗原によって
免疫されたマウス又はラットのリンパ球（抗体産生細胞
、即ち、Ｂ細胞）と骨髄腫細胞（Ｂ細胞株）をポリエチ
レングリコール等の融合剤によって融合し、これを融合
細胞のみが生育する培地組成におくことによって得るこ
とができる。

しかしながら、このような状態においては、多くのクロ
ーンが存在するので、クローニングを行なって、単クロ
ーン性としなければならない。このクローニングには、
通常、限界希釈法とよばれる方法が用いられている。こ
のような方法によれば、単クローン性の抗体産生クロー
ンを得ることができるが、非常に多数のクローン由来の
抗体が産生されるため、目的とする抗原又は抗原決定基
に対応する抗体を選択するには、抗体活性測定のための
評価分析を行なう必要がある。

■が”しよ゛と　るう単クローン性抗体の抗体活性を測定するには、従来より
知られている免疫学的な測定法を応用することができる
。一般には、ＲＩＡ、ＥＩＡ、凝集反応、免疫沈降反応
等が用いられるが、評価分析系を組むにあたっては、多
量の検体数であって、且つ、少量の検体量を迅速高感度
に測定して、有用なりローンを選択し、速やかに次のク
ローニングを行なうことが必要であるので、ＥＩＡが多
用されている。

この方法は、抗原を予め結合した９６ウエルのマイクロ
プレートに培養上清を一定量加え、通常、３０〜１２０
分間静置した後、ウェル内を十分に洗浄し、更に、例え
ば、抗体がマウス由来である場合は、酵素を予め標識し
た抗マウスＩｇＧ又はＦａｂを一定量加え、３０〜１２
０分間静置した後、前記と同様にして、ウェル内を十分
に洗浄し、この後、ウェルに酵素基質発色液を加え、一
定時間インキュベートすることによって、発色の程度を
抗原抗体反応の量として観察するものである。

かかるＥＩＡを利用した方法によれば、一定の操作で抗
体活性を感度よく評価することができるが、しかし、操
作回数が多く、且つ、各段階での反応時間も長いので、
操作が煩雑である。検体を多数処理しようとすれば、洗
浄の操作等によって、各ウェルごとに反応時間にばらつ
きを生じる。また、各ウェルごとに抗原を結合している
ので、抗体結合量にもばらつきが生じる。従って、この
ような要因によって、ＥＩＡを利用した方法は、精度が
著しく低い。更に、抗原抗体反応に一定時間を与えるの
で、抗原抗体反応を起こす抗体量、即ち、力価について
は、これを評価することができるが、抗体との反応速度
、即ち、親和性については評価することができない。更
に、測定に際しては、ウオッシャ−やリーダー等、種々
の機器も必要である。

このように、ＥＩＡを利用した方法によれば、高感度を
得られるものの、操作が煩雑であって、精度にも問題が
あり、更に、抗体の親和性を評価することができない。

抗体の親和性を評価するには、平衡透析法や、蛍光消光
法等と呼ばれる方法が用いられるが、これらは、いずれ
も特殊な器具、機器を必要とするので、多数の検体をス
クリーニングするような一般的な方法としては採用し難
い。

本発明は、従来の単クローン性抗体の抗体活性の評価に
おける上記した問題、特に、ＥＩＡを利用した方法にお
ける問題を解決するためになされたものであって、単ク
ローン性抗体の抗体活性を受身凝集反応によって測定す
る方法において、単クローン性抗体に反応性を有する物
質を結合させたラテックスを用いて、抗原抗体反応を利
用して、短時間に高感度高精度にクローン性抗体の抗体
活性を測定する方法を提供することを目的とする。

゛　るための本発明は、単クローン性抗体の抗体活性を受身凝集反応
にて測定する方法において、予め抗原を結合させた担体
と共に、単クローン性抗体に反応性を有する物質を結合
させてなるラテックス粒子を共存させてなる溶液に被検
液を混合することを特徴とする。

受身凝集反応とは、担体に予め抗原を結合しておき、そ
の水溶液に検体を混合し、検体中に抗体が存在するとき
に生じる担体の凝集の有無や程度を判定することによっ
て、抗体の存在又は量を測定する方法である。上記凝集
の程度を肉眼で観察することによって定性的に、また、
単位時間当りの濁度変化として光学的に測定することに
よって定量的に、抗原抗体反応量を測定することができ
る。

このような受身凝集反応においては、担体としては、赤
血球を用いてもよいが、本発明においては、ラテックス
粒子が好ましく用いられ、特に、ポリスチレンラテック
ス粒子が好ましく用いられる。かかるラテックスの凝集
程度を可視的に測定するには、ラテックス粒子は０．２
〜０．４μｍの粒径を有するのが好ましく、光学的に測
定するには、例えば、分光光度計による吸光度変化等を
測定するには、０．１〜０．４μｍの粒径を有するのが
好ましい。

ラテックス粒子に抗原を結合させるには、一般に知られ
ている方法によればよく、例えば、ポリスチレンラテッ
クス粒子に物理吸着させ、或いは縮合剤を用いて、カル
ボキシル化ポリスチレンラテックス粒子に共有結合させ
ればよい。このような縮合剤としては、例えば、水溶性
カルボジイミドを用いる方法がよく知られている。

次に、本発明の方法において、単クローン性抗体に反応
性を有する物質（以下、単クローン性抗体反応性物質と
いう。）としては、例えば、単クローン性抗体がマウス
由来の場合は、抗マウスイムノグロブリン或いは抗マウ
スＩｇＧを用いることができる。また、プロティンＡを
用いることもできる。しかし、抗体のサブクラスによっ
て反応性が異なることと、プロティンＡが高価なことか
ら、前者を用いるのが好ましい。

単クローン性抗体反応性物質を感作させるラテックス粒
子は、特に、限定されるものではないが、本来の受身凝
集反応の反応系に影響を与えないものが用いられる。即
ち、抗原を感作したラテックス粒子と同じものを用いれ
ば、目的とする抗原抗体反応の有無にかかわらず、マウ
ス■ｇＧの存在によって、同一の凝集反応があられれる
こととなるので、抗原を感作させたラテックス粒子を凝
集反応を引き起こさないか、或いは極めて微弱な　凝集
反応しか引き起こさないラテックス粒子が用いられる。

このようなラテックス粒子としては、粒径０．１〜０．
２μｍのカルボキシル化ポリスチレンラテックスや、粒
径０．１〜０．３μｍのカルボキシル化ポリメタクリル
酸メチルラテックスが好ましく用いられる。

このようなラテックス粒子に単クローン性抗体反応性物
質を結合させるには、前述した通常の方法を用いればよ
く、特に、共有結合法が好ましい。

かかるラテックス粒子の表面にカルボキシル基を有せし
めたラテックス粒子を用いれば、物理吸着量は極めて僅
かであって、カルボキシル基を利用して、単クローン性
抗体反応性物質を容易に共有結合にて結合させることが
できる。

本発明の方法に従って、反応を行なうには、受身凝集反
応系に単に単クローン性抗体反応性物質を結合させたラ
テックスを混合するのみでよい。

測定の精度を高めるには、このラテックス粒子を後から
加えるのがよい。これは、目的とする抗原抗体反応が起
こる前に、ラテックス粒子が抗体分子をトラップし、反
応を阻害するおそれがあるからである。単クローン性抗
体反応性物質を結合させたラテックス粒子の混合割合は
、予め設定しておく必要がある。これは、ラテックス粒
子に結合した単クローン性抗体反応性物質の量及び反応
性によるものであるが、過剰量添加することによって達
成される。

凝集程度を評価するには、簡便には、ガラス板上で凝集
の強さを肉眼で判定すればよい。しかし、分光光度計や
リーダーを用いるのが好ましく、分光光度計で評価する
場合は、単位時間当りの吸光度変化の量として測定すれ
ばよい。

金凱坐剋果前述したように、従来のＥＩＡを利用した方法によれば
、有用なりローンを選択するのに、半日乃至−日もの長
時間を必要とするのに対して、本発明の方法によれば、
簡単に且つ短時間に選択することができる。更に、本発
明の方法によれば、測定感度が高い。特に、光学的方法
によれば、従来と同等の感度で測定することができ、し
かも、抗体の親和性を評価することができる。

実益型以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１（ａ）　　抗ヒト・α−フェトプロティン単クり−ン性
抗体の調製Ｂａ１ｂ／ｃマウス腹腔内にフロイント完全アジュバン
トと１：１に混合したヒト・α−フェトプロティン２０
μｇを２週間間隔で免疫し、３回の免疫後、ブースター
をかけた。３日後、ポリエチレングリコール４０００　
（シグマ社製）を用いて、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８／６５３　
（−５エローマ細胞）と、免疫したマウスから採取した
牌細胞を常法に従って細胞融合させた。

１５％ウシ胎児血清を加えたＨＡＴ培地中、無菌的に９
６ウエルマイクロプレート中で２週間培養した。マイク
ロプレートの各ウェルから採取した培養上清を被検液と
した。

（ｂ）　　ヒト・α−フェトプロティン感作プレートの
作製ＰＢＳにて２０ｕｇ／ｍｌに調整したヒト・α−フェト
プロティンをＥＩＡ用９６ウエルマイクロプレート（タ
イターチック社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し
、４℃で一晩静置した。翌日、各ウェルをＰＢＳにて洗
浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を２００ｕｆずつ各ウェ
ルに加え、４℃で一晩静置した。このプレートをＰＢＳ
にて洗浄して、ヒト・α−フェトプロティン感作プレー
トとした。

（Ｃ）ＥＩＡによる抗体活性の測定ヒト・α−フェトプロティン感作プレートにＰＢＳにて
２倍希釈した培養上清１００μｌを加え、室温で１時間
静置した。ＰＢＳにて各ウェルを３回洗浄した後、予め
ＰＢＳにて３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を各ウェルに１００μ
ｌずつ分注した。

室温で１時間静置し、各ウェルを３回洗浄した後、酵素
基質発色液（０−フェニレンジアミン４０■と３０％過
酸化水素水溶液１０μ２をクエン酸−リン酸緩衝液に溶
解させて調製した。）２００μｌを加え、１５分間、室
温にて静置した。更に、６Ｎ硫酸５０μｌを加えて、反
応を停止した後、直ちに４９２ｎｍの吸光度をマイクロ
プレート専用分光光度計（リーダー）にて測定した。

結果を第１表に示す。

（ｄ）　　抗原結合ラテックスの調製カルボキシル化ポリスチレンラテックス（粒径０．３１
μｍ、粒子表面カルボキシル基量１．９μモル／ｎＩ）
を５重量％濃度にて含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５
，０，１モル／ｌ）５閘ｌに、上記と同じホウ酸緩衝液
２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混合し、これに１−エチル
−３−（３−ジメチルアξノブロピル）カルボシイ逅ド
塩酸塩水溶液（２■／ａ＋１）２ｍｌを加え、１０分後
にヒト・α−フェトプロティン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を
加え、４°Ｃで２４時間、反応させた。

次いで、それぞれの反応混合物に１０重量％アルギニン
水溶液１０ｍ１を加えて、１時間インキュベートして、
反応混合物中に残存する過剰の上記カルボシイくドを消
費させた。この後、トリス緩衝液（ｐＨ８，２，０，０
１モル／ｌ）にて遠心洗浄を３回行なった後、同じ緩衝
液に再分散させ、全量５ｎ＋１として、抗原結合ラテッ
クスを得た。

（ｅ）　　抗マウスＩｇＧ結合ラテックスの調製カルボ
キシル化ポリスチレンラテックス（粒径０．１０ａｍ、
粒子表面カルボキシル基１１１．３μモル／ホ）及び抗
マウスｒｇｃ　（ダコ社製）を用いて、前記（ｄ）に記
載した方法と同様にして、抗マウスＩｇＧ結合ラテック
スを調製した。

（ｆ）　　本発明の方法による抗体活性の測定ガラス板
（血清反応板）のウェル内に培養上清４０μｌを入れ、
更に、前記（イ）にて調製したラテックス溶液（０，９
％食塩水溶液及び０．２％ウシ血清アルブミン含有０．
０１ｍｏｌ／ｆｆｉ　）リス緩衝液（ｐＨａ２）にて１
重量％になるように希釈して調製した。）２０μｌを入
れ、室温にて３分間混合した。

更に、前記（ｅ）にて調製したラテックス溶液（上記緩
衝液にて０．５重量％に希釈して調製した。）２０μｌ
を入れ、更に、２分間混合した。

このときの凝集程度を肉眼にて観察し、判定した。結果
を第２表に示す。

実施例２（ａ）　　抗原結合ラテックスの調製カルボキシル化ポリスチレンラテックス（粒径０．１μ
ｍ、粒子表面カルボキシル基！６．４μモル／ホ）を５
重量％濃度にて含有するように調製したホウ酸緩衝液（
ｐＨ７，５，０，１ｍｏｌ／　ｉｔ　）を用いて、実施
例１の（ｄ）と同様にして、抗原結合ラテックスを調製
した。

（ｂ）　　抗マウスＩｇＧ結合ラテックスの調製カルボ
キシル化ポリメタクリル酸メチルラテックス（粒径０．
１μｍ、粒子表面カルボキシル基量２．７μモル／ｒｄ
）を用いて、実施例１の（ｅ）と同様にして、抗マウス
ＩｇＧ結合ラテックスを調製した。

（Ｃ）　　本発明の方法による抗体活性の測定実施例１
（ａ）にて調製した培養上清を０．９％食塩水溶液及び
０．２％ウシ血清アルブミン含有０．０１ｍｏｌ／ｊ！
　）　！Ｊ　ス緩衝液（ｐＨ８，２）　ニテ１００倍希
釈し、これを平底９６六マイクロプレートの各ウェルに
加えた。更に、本実施例（ａ）にて調製したラテックス
及び本実施例（ｂ）にて調製したラテックスを等量混合
した後、それぞれのラテックスが０．１重量％となるよ
うに上記緩衝液にて希釈した。

予め培養上清を加えたそれぞれのウェルに上記ラテック
スの混合溶液２５μｌを加え、振盪、混合し、ＥＩＡリ
ーダーにて７００ｎｍの吸光度を測定した。更に、５分
間室温に静置した後、同様にして、吸光度を測定し、５
分間の吸光度差を求めた。

結果を第３表に示す。

次に、実施例１の（Ｃ）に記載した方法及び実施例２の
（Ｃ）に記載した方法によって、同一の被検液（培養上
清）を１０回測定することによって、口内再現性を調べ
た。結果をそれぞれ第４表及び第５表に示す。

第４表第表結果を第３表に示すように、本発明の方法は、従来のＥ
ＩＡ法と同等の感度を有し、しかも、２〜５分間にて反
応を完了させるので、所謂レート・アッセイ（ｒａｔｅ
　ａｓｓａｙ）であり、抗体の親和性を評価しているこ
とが明らかである。

更に、本発明の方法は、操作が簡単であって、再現性に
すぐれる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）単クローン性抗体の抗体活性を受身凝集反応にて
測定する方法において、予め抗原を結合させた担体と共
に、単クローン性抗体に反応性を有する物質を結合させ
てなるラテックス粒子を共存させてなる溶液に被検液を
混合することを特徴とする抗体活性の測定方法。
（２）単クローン性抗体に反応性を有する物質が抗マウ
ス若しくはラツトイムノグロブリン、抗マウス又はラッ
トＩｇＧ、又はプロテインＡであることを特徴とする請
求項第１項記載の抗体活性の測定方法。
（３）単クローン性抗体に反応性を有する物質を結合さ
せてなるラテックス粒子が単クローン性抗体に反応性を
有する物質を結合させてなるカルボキシル化ポリスチレ
ンラテックス又はカルボキシル化ポリメタクリル酸メチ
ルラテックスであることを特徴とする請求項第１項又は
第２項記載の抗体活性の測定方法。
（４）抗原を結合させた担体が抗原を結合させたラテッ
クスであることを特徴とする請求項第１項記載の抗体活
性の測定方法。