JPH0666796A - 抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体及び糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体及び糖化ヘモグロビンの測定方法Info
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Abstract
うことができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
こと。 【構成】 固相に結合された抗ヘモグロビン抗体と、糖
化ヘモグロビンを含むかもしれない検体とを反応させた
後、抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記糖化ヘモ
グロビン及び前記抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結
合された抗糖化ヘモグロビン抗体を測定することから成
る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供した。粒子に結合
された抗糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを
含むかもしれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起
させた後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測
定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供
した。また、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体3
F10を提供した。
Description
定方法に関する。
者においてその血中濃度が増加することが知られてお
り、糖化ヘモグロビンの測定は、血糖値の測定と併用し
て糖尿病の診断及び進行度の測定に利用されている。
(赤血球抽出液)中の糖化ヘモグロビンを固相に直接結
合させ、洗浄し、標識抗糖化ヘモグロビン抗体を反応さ
せ、洗浄し、前記標識を測定することにより行なわれて
いる。しかしながら、この方法では、それぞれの検体中
の糖化ヘモグロビンを固相に直接結合させるいう前処理
(例えば、4℃で一夜インキュベート)が必要であり、
これは時間がかかり、大量の検体を迅速に測定すること
は不可能である。
は、簡便、迅速に糖化ヘモグロビンの測定を行なうこと
ができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することで
ある。
究の結果、抗ヘモグロビン抗体を予め固相に結合したも
のと検体とを反応させ、さらに抗糖化ヘモグロビン抗体
を反応させることにより、それぞれの検体中の糖化ヘモ
グロビンを固相に結合させるという、時間がかかる工程
を排除することができ、そのため糖化ヘモグロビンの測
定が迅速に行なえることを見出し本発明を完成した。
ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれ
ない検体とを反応させた後、抗糖化ヘモグロビン抗体を
反応させ、前記糖化ヘモグロビン及び前記抗ヘモグロビ
ン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモグロビン抗
体を測定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法
を提供する(以下、この方法を第1の発明ということが
ある)。
結合した固相を予め大量に調製しておけば、個々の測定
においては、検体と固相に結合された抗ヘモグロビン抗
体との間で抗原抗体反応を行なわせることにより検体中
の糖化ヘモグロビンを抗ヘモグロビン抗体を介して固相
に結合させることができ、この抗原抗体反応は糖化ヘモ
グロビンを直接固相に結合させる工程に比べれば1/1
0以下の時間で行なえるので、従来方法に比べて大幅な
時間短縮が達成される。
ヘモグロビン抗体を結合させ、これと検体を混合し、生
成する凝集により糖化ヘモグロビンを測定できることを
見いだした。
糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかも
しれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起させた
後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測定する
ことから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
(以下、この方法を第2の発明ということがある)。
に特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを混
合し、その濁度変化により糖化ヘモグロビンを測定する
ことができることを見いだした。
特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と糖化ヘモグロ
ビンを含むかもしれない検体とを混合し、その濁度変化
により糖化ヘモグロビンを測定する方法を提供する(以
下、この方法を第3の発明ということがある)。
検体の濁度変化を利用した方法によっても、従来の方法
に比べてはるかに短時間で糖化ヘモグロビンを測定する
ことができる。
来の免疫分析において用いられているいずれのものであ
ってもよく、例えば、プラスチック製のマイクロプレー
トのウェルを好ましく用いることができる。
り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも構
わない。抗ヘモグロビン抗体の固相への結合は、例えば
1μg/ml程度の濃度の抗体溶液を固相に加え、4℃
で一夜放置することにより行なうことができる。結合
後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするため
に、常法に基づき、BSAのようなタンパク質でブロッ
キングを行なう。なお、ヒトの糖化ヘモグロビンを測定
する場合には、抗ヒトヘモグロビン抗体を固相に結合す
ることが好ましい。
モグロビン抗体と、検体とを反応させ、検体中の糖化ヘ
モグロビンを抗原抗体反応により、前記固相に結合され
た抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結合させる。検体
は、赤血球抽出液又は全血であってよい。この抗原抗体
反応は、例えば、室温で2時間程度で行なうことができ
る。
して固相に結合された糖化ヘモグロビンと、抗糖化ヘモ
グロビン抗体とを抗原抗体反応させる。糖化ヘモグロビ
ン抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよいが、測定の精度を高めるためにモノクローナル抗
体であることが好ましい。本発明者らは、下記実施例に
詳述する方法により、糖化ヘモグロビンに対して特異的
に反応し、正常なヘモグロビンとは実質的に反応しない
モノクローナル抗体を作製することに成功した(モノク
ローナル抗体3F10、FERM BP−4311)。
本発明の方法では、このモノクローナル抗体を好ましく
用いることができる。この抗原抗体反応も上記と同様な
条件下で行うことができる。
ヘモグロビン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモ
グロビン抗体を測定する。これは、従来より免疫分析の
分野において周知の種々の方法により行なうことができ
る。例えば、抗糖化ヘモグロビン抗体を酵素、蛍光色素
又は放射製物質等で標識しておき、該標識を測定するこ
とにより行なうことができる。あるいは、抗糖化ヘモグ
ロビン抗体にビオチンを結合しておき、このビオチンを
標識化アビジンと反応させて該標識を測定することによ
っても行なうことができる。さらには、抗糖化ヘモグロ
ビン抗体に特異的に反応する標識化抗体をさらに反応さ
せ、該標識を測定することによっても行なうことができ
る。
としては、直径0.05〜5μm、好ましくは0.1〜2μ
mのラテックス、直径0.5 〜10μmのゼラチン粒子及
び動物赤血球を挙げることができる。ここで使用される
ラテックスとしては、例えばスチレン重合体、スチレン
−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリル酸エステル
共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等を挙
げることができる。また、ゼラチン粒子としては、例え
ば特公昭57−153658号に記載の粒子等を挙げる
ことができる。さらに、動物赤血球としては、例えばニ
ワトリ、アヒル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物か
ら得られる赤血球を用いることができる。粒子への抗体
の結合方法及はこの分野において周知であり、下記実施
例において詳述するように、抗体の溶液中に粒子を分散
させることにより容易に行うことができる。
を結合してもよいが、抗原との反応により強い凝集像を
形成させるためには、抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモ
グロビン抗体との混合物を結合させることが好ましい。
この場合、粒子に結合される抗糖化ヘモグロビンと抗ヘ
モグロビン抗体との比率は1:1程度が好ましい。この
時、抗ヘモグロビン抗体は、これ自体でヘモグロビンを
凝集しないものを選択する。
合されている場合には、検体と粒子とを例えば黒色のス
ライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無
を観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出
することができる。また、吸光度測定により糖化ヘモグ
ロビンを定量することも可能である。同様に、粒子上に
抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモグロビン抗体の両方が
結合されている場合でも、検体中に糖化ヘモグロビン抗
体が存在すれば、強い凝集像が形成されるので、この凝
集像を肉眼で観察することにより糖化ヘモグロビンを検
出することが可能である。
化ヘモグロビン抗体としては、下記実施例で詳述する、
高感度なモノクローナル抗体3F10を用いることが好
ましい。
ビンに特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体と
を混合する。検体中に糖化ヘモグロビン抗体が存在する
と、混合液の濁度が増大するので、混合液の濁度変化を
観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出す
ることができる。この場合においても、ヒト糖化ヘモグ
ロビンに特異的なモノクローナル抗体としては、下記実
施例で詳述する、高感度なモノクローナル抗体3F10
を用いることが好ましい。
製 糖化ヘモグロビンをフロイントコンプリートアジュバン
トに十分に分散させこの100μlでBalb/cマウ
スに2週間おきに4回免疫した。この免疫マウスを屠殺
後脾臓を摘出し、これより脾細胞を106 個得た。それ
をマウスミエローマ細胞とPEGの存在下で融合させ培
養した。増殖した細胞の上清を採取しELISA法によ
り抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体の有無を調べた。該抗体
が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、抗ヒト糖化ヘ
モグロビン抗体を産生している細胞を確認した。
グロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞(ハイブリ
ドーマ細胞)として大量に培養し、マウス腹腔中に注射
した。2週間後より3日おきに腹水を採取し、目的の抗
ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を得た。この
抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を3F10
と命名し、3F10を産生するハイブリドーマを平成4
年6月10日に微工研に寄託した。この寄託は平成5年
5月25日に国際寄託に切り替えられ、その受託番号は
FERM BP−4311である。なお、3F10はI
gGであることを確認した。
ビンの測定 抗ヒトヘモグロビン抗体(ウサギ抗体)10μg/ml
をNunc社の96穴エライザ用プレートに各50μl
ずつ分注し、4℃で一夜放置した。このプレートを2%
BSA/0.02%Tween20/リン酸緩衝化生理
食塩水で5回洗浄し、最後にこの緩衝液200μlを加
え4℃保存した。このプレートの上清を除去し糖化ヘモ
グロビンを含む検体150μlを滴下し、室温で2時間
放置した。このプレートを0.02%Tween20を
含む生理食塩水で4回洗浄した。
モグロビン特異マウスモノクローナル抗体150μl
(500ng/ml)を加え、室温で2時間放置した
後、再び0.02%Tween20を含む生理食塩水で
4回洗浄後、0.1%2,2’−アゾビス(3−エチル
ベンゾチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)を含む
H2 O2 溶液(0.005%)を200μl添加し、室
温で30分放置後、その発色を比色測定した。比色測定
は、415nm及び492nmにおける吸光度を測定す
ることにより行なった。下記表1にその結果を示す。
ナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体を用い、種々の濃度の糖化ヒトヘモグロビンを
含む検体中の糖化ヒトヘモグロビンを定量した。定量は
次のように行なった。実施例1で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体又は市販の抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体(ケミコン社、米国)を
96穴マイクロプレートに感作した。次いで、ペルオキ
シダーゼ(POD)標識した糖化ヘモグロビン抗原を添
加した。この際、添加量(希釈率)を種々変えて添加し
た。次いで、室温下で2時間反応させ、PBS−Twe
enで洗浄した。100μlのABTS/H2 O2 (基
質)を添加し、室温下で1時間反応させた。反応停止液
50μlを添加し、415nmの波長の吸光度を測定し
た。
に、市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体を用いた場合
(比較例1)は、抗原濃度の増加に対応できず、ほとん
ど応答がとれないのに対し、実施例1で作製した抗ヒト
糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を用いた場合(実
施例2)には、抗原の濃度に応じて吸光度が比例して増
大している。従って、実施例1で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体を用いることにより、広
い濃度範囲の糖化ヘモグロビンを測定できることが明ら
かになった。
(w/v)、直径0.254μm)100μlを、実施
例1で作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル
抗体3F10を含む20mM酢酸緩衝液900μl(3
F10濃度:40μg/ml、pH6.0)に混合し、
エンドオーバーミキサーで攪拌した。これを遠心分離
(5000 g x 15 分)し、生理食塩水で4回洗浄し、1重
量%BSAを含む20mM酢酸緩衝液(pH5.0)に
懸濁させ(0.5 wt%)、保存した。
製したラテックス懸濁液50μlを黒色ガラススライド
上で混和させ、数回ゆるやかにウェーブさせた。1分後
にその凝集の有無を目視で確認した。結果を下記表2に
示す。
ックス上に3F10が担持された0.025 wt% ラテックス
溶液2mlに3種類の溶血検体5μlをキュベット内で
混合し、波長750nmでの吸光度変化を経時的に調べ
た。結果を下記表4に示す。
液(トリス−コハク酸緩衝液(pH5.5、0.2%ト
ライトンX−100(商品名)を含む。ラテックス濃度
0.025%)2mlを37℃に調節したセルに入れ
た。これにイオン交換クロマトグラフィー精製により得
られたA1C抗原(1mg/ml)又はヒトヘモグロビン
(A0 抗原)(1mg/ml)を別々に加え、37℃で
5分間攪拌しながら加温した。5分後、A0 抗原を感作
したラテックス液には3F10抗体(8mg/ml)
を、A1C抗原を感作したラテックス液には3−4抗体
(抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、8mg/m
l)を各2μlずつ加え、直ちに日立220分光光度計
で波長750nmの吸光度変化を測定した。さらに14
分後、A0 抗原を感作したラテックス液に3−4抗体
を、A1C抗原を感作したラテックス液に3F10抗体を
それぞれ終濃度が8μg/mlになるように添加した。
結果を図2に示す。
たラテックスに対してF310はほとんど反応しなかっ
た。これに対して、3−4抗体を加えると凝集反応が起
こり吸光度の上昇を認めた。同様にして、A1Cラテック
スでは3F10抗体あるいは3−4抗体の添加で同等の
反応性を示した。
クローナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体
を用いて種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビンを含む検体
中のヒト糖化ヘモグロビンを測定した結果を示す図であ
る。
固定化したラテックス粒子液に3F10抗体又は3−4
抗体をそれぞれ加え、次いで3−4抗体又は3F10抗
体をそれぞれ加えた際の吸光度の経時的変化を示す図で
ある。
Claims (7)
- 【請求項1】 固相に結合された抗ヘモグロビン抗体
と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれない検体とを反応
させた後、抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記糖
化ヘモグロビン及び前記抗ヘモグロビン抗体を介して固
相に結合された抗糖化ヘモグロビン抗体を測定すること
から成る糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 【請求項2】 粒子に結合された抗糖化ヘモグロビン抗
体と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれない検体を反応
させ、免疫凝集反応を生起させた後、得られた凝集より
前記糖化ヘモグロビンを測定することから成る糖化ヘモ
グロビンの測定方法。 - 【請求項3】 粒子が直径0.05〜5μmのラテックス、
直径0.5 〜10μmのゼラチン粒子及び動物赤血球から
成る群より選択される請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 抗ヘモグロビン抗体と抗糖化ヘモグロビ
ン抗体の混合物が前記粒子に結合されている請求項2記
載の方法。 - 【請求項5】 糖化ヘモグロビンに特異的なモノクロー
ナル抗体を含む溶液と糖化ヘモグロビンを含むかもしれ
ない検体とを混合し、その濁度変化により糖化ヘモグロ
ビンを測定する方法。 - 【請求項6】 前記抗糖化ヘモグロビン抗体はモノクロ
ーナル抗体3F10である請求項1ないし4のいずれか
1項に記載の方法。 - 【請求項7】 抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
3F10。
Priority Applications (1)
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JP5165127A JP2596322B2 (ja) | 1992-06-10 | 1993-06-10 | 総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法 |
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