JPH0666796A - 抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体及び糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体及び糖化ヘモグロビンの測定方法Info
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- JPH0666796A JPH0666796A JP5165127A JP16512793A JPH0666796A JP H0666796 A JPH0666796 A JP H0666796A JP 5165127 A JP5165127 A JP 5165127A JP 16512793 A JP16512793 A JP 16512793A JP H0666796 A JPH0666796 A JP H0666796A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便、迅速に糖化ヘモグロビンの測定を行な
うことができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
こと。 【構成】 固相に結合された抗ヘモグロビン抗体と、糖
化ヘモグロビンを含むかもしれない検体とを反応させた
後、抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記糖化ヘモ
グロビン及び前記抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結
合された抗糖化ヘモグロビン抗体を測定することから成
る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供した。粒子に結合
された抗糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを
含むかもしれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起
させた後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測
定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供
した。また、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体３
Ｆ１０を提供した。
うことができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
こと。 【構成】 固相に結合された抗ヘモグロビン抗体と、糖
化ヘモグロビンを含むかもしれない検体とを反応させた
後、抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記糖化ヘモ
グロビン及び前記抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結
合された抗糖化ヘモグロビン抗体を測定することから成
る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供した。粒子に結合
された抗糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを
含むかもしれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起
させた後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測
定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供
した。また、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体３
Ｆ１０を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糖化ヘモグロビンの測
定方法に関する。
定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖化ヘモグロビン（Ａ1C）は、糖尿病患
者においてその血中濃度が増加することが知られてお
り、糖化ヘモグロビンの測定は、血糖値の測定と併用し
て糖尿病の診断及び進行度の測定に利用されている。
者においてその血中濃度が増加することが知られてお
り、糖化ヘモグロビンの測定は、血糖値の測定と併用し
て糖尿病の診断及び進行度の測定に利用されている。
【０００３】従来、糖化ヘモグロビンの測定は、検体
（赤血球抽出液）中の糖化ヘモグロビンを固相に直接結
合させ、洗浄し、標識抗糖化ヘモグロビン抗体を反応さ
せ、洗浄し、前記標識を測定することにより行なわれて
いる。しかしながら、この方法では、それぞれの検体中
の糖化ヘモグロビンを固相に直接結合させるいう前処理
（例えば、４℃で一夜インキュベート）が必要であり、
これは時間がかかり、大量の検体を迅速に測定すること
は不可能である。
（赤血球抽出液）中の糖化ヘモグロビンを固相に直接結
合させ、洗浄し、標識抗糖化ヘモグロビン抗体を反応さ
せ、洗浄し、前記標識を測定することにより行なわれて
いる。しかしながら、この方法では、それぞれの検体中
の糖化ヘモグロビンを固相に直接結合させるいう前処理
（例えば、４℃で一夜インキュベート）が必要であり、
これは時間がかかり、大量の検体を迅速に測定すること
は不可能である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便、迅速に糖化ヘモグロビンの測定を行なうこと
ができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することで
ある。
は、簡便、迅速に糖化ヘモグロビンの測定を行なうこと
ができる糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、抗ヘモグロビン抗体を予め固相に結合したも
のと検体とを反応させ、さらに抗糖化ヘモグロビン抗体
を反応させることにより、それぞれの検体中の糖化ヘモ
グロビンを固相に結合させるという、時間がかかる工程
を排除することができ、そのため糖化ヘモグロビンの測
定が迅速に行なえることを見出し本発明を完成した。
究の結果、抗ヘモグロビン抗体を予め固相に結合したも
のと検体とを反応させ、さらに抗糖化ヘモグロビン抗体
を反応させることにより、それぞれの検体中の糖化ヘモ
グロビンを固相に結合させるという、時間がかかる工程
を排除することができ、そのため糖化ヘモグロビンの測
定が迅速に行なえることを見出し本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、固相に結合された抗
ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれ
ない検体とを反応させた後、抗糖化ヘモグロビン抗体を
反応させ、前記糖化ヘモグロビン及び前記抗ヘモグロビ
ン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモグロビン抗
体を測定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法
を提供する（以下、この方法を第１の発明ということが
ある）。
ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれ
ない検体とを反応させた後、抗糖化ヘモグロビン抗体を
反応させ、前記糖化ヘモグロビン及び前記抗ヘモグロビ
ン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモグロビン抗
体を測定することから成る糖化ヘモグロビンの測定方法
を提供する（以下、この方法を第１の発明ということが
ある）。
【０００７】本発明の方法では、抗ヘモグロビン抗体を
結合した固相を予め大量に調製しておけば、個々の測定
においては、検体と固相に結合された抗ヘモグロビン抗
体との間で抗原抗体反応を行なわせることにより検体中
の糖化ヘモグロビンを抗ヘモグロビン抗体を介して固相
に結合させることができ、この抗原抗体反応は糖化ヘモ
グロビンを直接固相に結合させる工程に比べれば１／１
０以下の時間で行なえるので、従来方法に比べて大幅な
時間短縮が達成される。
結合した固相を予め大量に調製しておけば、個々の測定
においては、検体と固相に結合された抗ヘモグロビン抗
体との間で抗原抗体反応を行なわせることにより検体中
の糖化ヘモグロビンを抗ヘモグロビン抗体を介して固相
に結合させることができ、この抗原抗体反応は糖化ヘモ
グロビンを直接固相に結合させる工程に比べれば１／１
０以下の時間で行なえるので、従来方法に比べて大幅な
時間短縮が達成される。
【０００８】さらにまた、本発明者らは、粒子に抗糖化
ヘモグロビン抗体を結合させ、これと検体を混合し、生
成する凝集により糖化ヘモグロビンを測定できることを
見いだした。
ヘモグロビン抗体を結合させ、これと検体を混合し、生
成する凝集により糖化ヘモグロビンを測定できることを
見いだした。
【０００９】すなわち、本発明は、粒子に結合された抗
糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかも
しれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起させた
後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測定する
ことから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
（以下、この方法を第２の発明ということがある）。
糖化ヘモグロビン抗体と、糖化ヘモグロビンを含むかも
しれない検体を反応させ、免疫凝集反応を生起させた
後、得られた凝集より前記糖化ヘモグロビンを測定する
ことから成る糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する
（以下、この方法を第２の発明ということがある）。
【００１０】さらに、本発明者らは、糖化ヘモグロビン
に特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを混
合し、その濁度変化により糖化ヘモグロビンを測定する
ことができることを見いだした。
に特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを混
合し、その濁度変化により糖化ヘモグロビンを測定する
ことができることを見いだした。
【００１１】すなわち、本発明は、糖化ヘモグロビンに
特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と糖化ヘモグロ
ビンを含むかもしれない検体とを混合し、その濁度変化
により糖化ヘモグロビンを測定する方法を提供する（以
下、この方法を第３の発明ということがある）。
特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と糖化ヘモグロ
ビンを含むかもしれない検体とを混合し、その濁度変化
により糖化ヘモグロビンを測定する方法を提供する（以
下、この方法を第３の発明ということがある）。
【００１２】上記した、粒子の凝集を利用した方法及び
検体の濁度変化を利用した方法によっても、従来の方法
に比べてはるかに短時間で糖化ヘモグロビンを測定する
ことができる。
検体の濁度変化を利用した方法によっても、従来の方法
に比べてはるかに短時間で糖化ヘモグロビンを測定する
ことができる。
【００１３】以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】第１の発明の方法に用いられる固相は、従
来の免疫分析において用いられているいずれのものであ
ってもよく、例えば、プラスチック製のマイクロプレー
トのウェルを好ましく用いることができる。
来の免疫分析において用いられているいずれのものであ
ってもよく、例えば、プラスチック製のマイクロプレー
トのウェルを好ましく用いることができる。
【００１５】抗ヘモグロビン抗体は、従来より周知であ
り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも構
わない。抗ヘモグロビン抗体の固相への結合は、例えば
１μｇ／ｍｌ程度の濃度の抗体溶液を固相に加え、４℃
で一夜放置することにより行なうことができる。結合
後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするため
に、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク質でブロッ
キングを行なう。なお、ヒトの糖化ヘモグロビンを測定
する場合には、抗ヒトヘモグロビン抗体を固相に結合す
ることが好ましい。
り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも構
わない。抗ヘモグロビン抗体の固相への結合は、例えば
１μｇ／ｍｌ程度の濃度の抗体溶液を固相に加え、４℃
で一夜放置することにより行なうことができる。結合
後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするため
に、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク質でブロッ
キングを行なう。なお、ヒトの糖化ヘモグロビンを測定
する場合には、抗ヒトヘモグロビン抗体を固相に結合す
ることが好ましい。
【００１６】次いで、このように固相に結合された抗ヘ
モグロビン抗体と、検体とを反応させ、検体中の糖化ヘ
モグロビンを抗原抗体反応により、前記固相に結合され
た抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結合させる。検体
は、赤血球抽出液又は全血であってよい。この抗原抗体
反応は、例えば、室温で２時間程度で行なうことができ
る。
モグロビン抗体と、検体とを反応させ、検体中の糖化ヘ
モグロビンを抗原抗体反応により、前記固相に結合され
た抗ヘモグロビン抗体を介して固相に結合させる。検体
は、赤血球抽出液又は全血であってよい。この抗原抗体
反応は、例えば、室温で２時間程度で行なうことができ
る。
【００１７】次いで、洗浄後、抗ヘモグロビン抗体を介
して固相に結合された糖化ヘモグロビンと、抗糖化ヘモ
グロビン抗体とを抗原抗体反応させる。糖化ヘモグロビ
ン抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよいが、測定の精度を高めるためにモノクローナル抗
体であることが好ましい。本発明者らは、下記実施例に
詳述する方法により、糖化ヘモグロビンに対して特異的
に反応し、正常なヘモグロビンとは実質的に反応しない
モノクローナル抗体を作製することに成功した（モノク
ローナル抗体３Ｆ１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１１）。
本発明の方法では、このモノクローナル抗体を好ましく
用いることができる。この抗原抗体反応も上記と同様な
条件下で行うことができる。
して固相に結合された糖化ヘモグロビンと、抗糖化ヘモ
グロビン抗体とを抗原抗体反応させる。糖化ヘモグロビ
ン抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよいが、測定の精度を高めるためにモノクローナル抗
体であることが好ましい。本発明者らは、下記実施例に
詳述する方法により、糖化ヘモグロビンに対して特異的
に反応し、正常なヘモグロビンとは実質的に反応しない
モノクローナル抗体を作製することに成功した（モノク
ローナル抗体３Ｆ１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１１）。
本発明の方法では、このモノクローナル抗体を好ましく
用いることができる。この抗原抗体反応も上記と同様な
条件下で行うことができる。
【００１８】次いで、洗浄後、糖化ヘモグロビン及び抗
ヘモグロビン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモ
グロビン抗体を測定する。これは、従来より免疫分析の
分野において周知の種々の方法により行なうことができ
る。例えば、抗糖化ヘモグロビン抗体を酵素、蛍光色素
又は放射製物質等で標識しておき、該標識を測定するこ
とにより行なうことができる。あるいは、抗糖化ヘモグ
ロビン抗体にビオチンを結合しておき、このビオチンを
標識化アビジンと反応させて該標識を測定することによ
っても行なうことができる。さらには、抗糖化ヘモグロ
ビン抗体に特異的に反応する標識化抗体をさらに反応さ
せ、該標識を測定することによっても行なうことができ
る。
ヘモグロビン抗体を介して固相に結合された抗糖化ヘモ
グロビン抗体を測定する。これは、従来より免疫分析の
分野において周知の種々の方法により行なうことができ
る。例えば、抗糖化ヘモグロビン抗体を酵素、蛍光色素
又は放射製物質等で標識しておき、該標識を測定するこ
とにより行なうことができる。あるいは、抗糖化ヘモグ
ロビン抗体にビオチンを結合しておき、このビオチンを
標識化アビジンと反応させて該標識を測定することによ
っても行なうことができる。さらには、抗糖化ヘモグロ
ビン抗体に特異的に反応する標識化抗体をさらに反応さ
せ、該標識を測定することによっても行なうことができ
る。
【００１９】第２の発明の方法において用いられる粒子
としては、直径0.05〜５μｍ、好ましくは０．１〜２μ
ｍのラテックス、直径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及
び動物赤血球を挙げることができる。ここで使用される
ラテックスとしては、例えばスチレン重合体、スチレン
−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリル酸エステル
共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等を挙
げることができる。また、ゼラチン粒子としては、例え
ば特公昭５７−１５３６５８号に記載の粒子等を挙げる
ことができる。さらに、動物赤血球としては、例えばニ
ワトリ、アヒル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物か
ら得られる赤血球を用いることができる。粒子への抗体
の結合方法及はこの分野において周知であり、下記実施
例において詳述するように、抗体の溶液中に粒子を分散
させることにより容易に行うことができる。
としては、直径0.05〜５μｍ、好ましくは０．１〜２μ
ｍのラテックス、直径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及
び動物赤血球を挙げることができる。ここで使用される
ラテックスとしては、例えばスチレン重合体、スチレン
−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリル酸エステル
共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等を挙
げることができる。また、ゼラチン粒子としては、例え
ば特公昭５７−１５３６５８号に記載の粒子等を挙げる
ことができる。さらに、動物赤血球としては、例えばニ
ワトリ、アヒル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物か
ら得られる赤血球を用いることができる。粒子への抗体
の結合方法及はこの分野において周知であり、下記実施
例において詳述するように、抗体の溶液中に粒子を分散
させることにより容易に行うことができる。
【００２０】粒子上には、抗糖化ヘモグロビン抗体のみ
を結合してもよいが、抗原との反応により強い凝集像を
形成させるためには、抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモ
グロビン抗体との混合物を結合させることが好ましい。
この場合、粒子に結合される抗糖化ヘモグロビンと抗ヘ
モグロビン抗体との比率は１：１程度が好ましい。この
時、抗ヘモグロビン抗体は、これ自体でヘモグロビンを
凝集しないものを選択する。
を結合してもよいが、抗原との反応により強い凝集像を
形成させるためには、抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモ
グロビン抗体との混合物を結合させることが好ましい。
この場合、粒子に結合される抗糖化ヘモグロビンと抗ヘ
モグロビン抗体との比率は１：１程度が好ましい。この
時、抗ヘモグロビン抗体は、これ自体でヘモグロビンを
凝集しないものを選択する。
【００２１】粒子上に抗糖化ヘモグロビン抗体のみが結
合されている場合には、検体と粒子とを例えば黒色のス
ライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無
を観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出
することができる。また、吸光度測定により糖化ヘモグ
ロビンを定量することも可能である。同様に、粒子上に
抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモグロビン抗体の両方が
結合されている場合でも、検体中に糖化ヘモグロビン抗
体が存在すれば、強い凝集像が形成されるので、この凝
集像を肉眼で観察することにより糖化ヘモグロビンを検
出することが可能である。
合されている場合には、検体と粒子とを例えば黒色のス
ライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無
を観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出
することができる。また、吸光度測定により糖化ヘモグ
ロビンを定量することも可能である。同様に、粒子上に
抗糖化ヘモグロビン抗体と抗ヘモグロビン抗体の両方が
結合されている場合でも、検体中に糖化ヘモグロビン抗
体が存在すれば、強い凝集像が形成されるので、この凝
集像を肉眼で観察することにより糖化ヘモグロビンを検
出することが可能である。
【００２２】なお、第２の発明の方法においても、抗糖
化ヘモグロビン抗体としては、下記実施例で詳述する、
高感度なモノクローナル抗体３Ｆ１０を用いることが好
ましい。
化ヘモグロビン抗体としては、下記実施例で詳述する、
高感度なモノクローナル抗体３Ｆ１０を用いることが好
ましい。
【００２３】第３の発明の方法では、ヒト糖化ヘモグロ
ビンに特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体と
を混合する。検体中に糖化ヘモグロビン抗体が存在する
と、混合液の濁度が増大するので、混合液の濁度変化を
観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出す
ることができる。この場合においても、ヒト糖化ヘモグ
ロビンに特異的なモノクローナル抗体としては、下記実
施例で詳述する、高感度なモノクローナル抗体３Ｆ１０
を用いることが好ましい。
ビンに特異的なモノクローナル抗体を含む溶液と検体と
を混合する。検体中に糖化ヘモグロビン抗体が存在する
と、混合液の濁度が増大するので、混合液の濁度変化を
観察することにより検体中の糖化ヘモグロビンを検出す
ることができる。この場合においても、ヒト糖化ヘモグ
ロビンに特異的なモノクローナル抗体としては、下記実
施例で詳述する、高感度なモノクローナル抗体３Ｆ１０
を用いることが好ましい。
【００２４】
【実施例】実施例１ (1) 糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体の作
製 糖化ヘモグロビンをフロイントコンプリートアジュバン
トに十分に分散させこの１００μｌでＢａｌｂ／ｃマウ
スに２週間おきに４回免疫した。この免疫マウスを屠殺
後脾臓を摘出し、これより脾細胞を１０6 個得た。それ
をマウスミエローマ細胞とＰＥＧの存在下で融合させ培
養した。増殖した細胞の上清を採取しＥＬＩＳＡ法によ
り抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体の有無を調べた。該抗体
が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、抗ヒト糖化ヘ
モグロビン抗体を産生している細胞を確認した。
製 糖化ヘモグロビンをフロイントコンプリートアジュバン
トに十分に分散させこの１００μｌでＢａｌｂ／ｃマウ
スに２週間おきに４回免疫した。この免疫マウスを屠殺
後脾臓を摘出し、これより脾細胞を１０6 個得た。それ
をマウスミエローマ細胞とＰＥＧの存在下で融合させ培
養した。増殖した細胞の上清を採取しＥＬＩＳＡ法によ
り抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体の有無を調べた。該抗体
が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、抗ヒト糖化ヘ
モグロビン抗体を産生している細胞を確認した。
【００２５】これにより得られた細胞を抗ヒト糖化ヘモ
グロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリ
ドーマ細胞）として大量に培養し、マウス腹腔中に注射
した。２週間後より３日おきに腹水を採取し、目的の抗
ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を得た。この
抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を３Ｆ１０
と命名し、３Ｆ１０を産生するハイブリドーマを平成４
年６月１０日に微工研に寄託した。この寄託は平成５年
５月２５日に国際寄託に切り替えられ、その受託番号は
ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１１である。なお、３Ｆ１０はＩ
ｇＧであることを確認した。
グロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリ
ドーマ細胞）として大量に培養し、マウス腹腔中に注射
した。２週間後より３日おきに腹水を採取し、目的の抗
ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を得た。この
抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を３Ｆ１０
と命名し、３Ｆ１０を産生するハイブリドーマを平成４
年６月１０日に微工研に寄託した。この寄託は平成５年
５月２５日に国際寄託に切り替えられ、その受託番号は
ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１１である。なお、３Ｆ１０はＩ
ｇＧであることを確認した。
【００２６】(2) ＥＬＩＳＡ法によるヒト糖化ヘモグロ
ビンの測定 抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギ抗体）１０μｇ／ｍｌ
をＮｕｎｃ社の９６穴エライザ用プレートに各５０μｌ
ずつ分注し、４℃で一夜放置した。このプレートを２％
ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝化生理
食塩水で５回洗浄し、最後にこの緩衝液２００μｌを加
え４℃保存した。このプレートの上清を除去し糖化ヘモ
グロビンを含む検体１５０μｌを滴下し、室温で２時間
放置した。このプレートを０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む生理食塩水で４回洗浄した。
ビンの測定 抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギ抗体）１０μｇ／ｍｌ
をＮｕｎｃ社の９６穴エライザ用プレートに各５０μｌ
ずつ分注し、４℃で一夜放置した。このプレートを２％
ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝化生理
食塩水で５回洗浄し、最後にこの緩衝液２００μｌを加
え４℃保存した。このプレートの上清を除去し糖化ヘモ
グロビンを含む検体１５０μｌを滴下し、室温で２時間
放置した。このプレートを０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む生理食塩水で４回洗浄した。
【００２７】次に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト糖化ヘ
モグロビン特異マウスモノクローナル抗体１５０μｌ
（５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間放置した
後、再び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で
４回洗浄後、０．１％２，２’−アゾビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を含む
Ｈ2 Ｏ2 溶液（０．００５％）を２００μｌ添加し、室
温で３０分放置後、その発色を比色測定した。比色測定
は、４１５ｎｍ及び４９２ｎｍにおける吸光度を測定す
ることにより行なった。下記表１にその結果を示す。
モグロビン特異マウスモノクローナル抗体１５０μｌ
（５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間放置した
後、再び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で
４回洗浄後、０．１％２，２’−アゾビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を含む
Ｈ2 Ｏ2 溶液（０．００５％）を２００μｌ添加し、室
温で３０分放置後、その発色を比色測定した。比色測定
は、４１５ｎｍ及び４９２ｎｍにおける吸光度を測定す
ることにより行なった。下記表１にその結果を示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】実施例２、比較例１ 実施例１で作製した抗糖化ヒトヘモグロビンモノクロー
ナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体を用い、種々の濃度の糖化ヒトヘモグロビンを
含む検体中の糖化ヒトヘモグロビンを定量した。定量は
次のように行なった。実施例１で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体又は市販の抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体（ケミコン社、米国）を
９６穴マイクロプレートに感作した。次いで、ペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）標識した糖化ヘモグロビン抗原を添
加した。この際、添加量（希釈率）を種々変えて添加し
た。次いで、室温下で２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗浄した。１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2 Ｏ2 （基
質）を添加し、室温下で１時間反応させた。反応停止液
５０μｌを添加し、４１５ｎｍの波長の吸光度を測定し
た。
ナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体を用い、種々の濃度の糖化ヒトヘモグロビンを
含む検体中の糖化ヒトヘモグロビンを定量した。定量は
次のように行なった。実施例１で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体又は市販の抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体（ケミコン社、米国）を
９６穴マイクロプレートに感作した。次いで、ペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）標識した糖化ヘモグロビン抗原を添
加した。この際、添加量（希釈率）を種々変えて添加し
た。次いで、室温下で２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗浄した。１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2 Ｏ2 （基
質）を添加し、室温下で１時間反応させた。反応停止液
５０μｌを添加し、４１５ｎｍの波長の吸光度を測定し
た。
【００３０】結果を図１に示す。図１から明らかなよう
に、市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体を用いた場合
（比較例１）は、抗原濃度の増加に対応できず、ほとん
ど応答がとれないのに対し、実施例１で作製した抗ヒト
糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を用いた場合（実
施例２）には、抗原の濃度に応じて吸光度が比例して増
大している。従って、実施例１で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体を用いることにより、広
い濃度範囲の糖化ヘモグロビンを測定できることが明ら
かになった。
に、市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体を用いた場合
（比較例１）は、抗原濃度の増加に対応できず、ほとん
ど応答がとれないのに対し、実施例１で作製した抗ヒト
糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体を用いた場合（実
施例２）には、抗原の濃度に応じて吸光度が比例して増
大している。従って、実施例１で作製した抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体を用いることにより、広
い濃度範囲の糖化ヘモグロビンを測定できることが明ら
かになった。
【００３１】実施例３ 抗糖化ヘモグロビンマウスＩｇＧ結合ラテックスの調製 ポリスチレンラテックス（日本合成ゴム社製、１０％
（ｗ／ｖ）、直径０．２５４μｍ）１００μｌを、実施
例１で作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル
抗体３Ｆ１０を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液９００μｌ（３
Ｆ１０濃度：４０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０）に混合し、
エンドオーバーミキサーで攪拌した。これを遠心分離
（5000 g x 15 分）し、生理食塩水で４回洗浄し、１重
量％ＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に
懸濁させ（0.5 wt%)、保存した。
（ｗ／ｖ）、直径０．２５４μｍ）１００μｌを、実施
例１で作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル
抗体３Ｆ１０を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液９００μｌ（３
Ｆ１０濃度：４０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０）に混合し、
エンドオーバーミキサーで攪拌した。これを遠心分離
（5000 g x 15 分）し、生理食塩水で４回洗浄し、１重
量％ＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に
懸濁させ（0.5 wt%)、保存した。
【００３２】実施例４ ラテックス凝集によるヒト糖化ヘモグロビンの測定 ヒト赤血球破裂液（ｐＨ５．０）５μｌと実施例３で調
製したラテックス懸濁液５０μｌを黒色ガラススライド
上で混和させ、数回ゆるやかにウェーブさせた。１分後
にその凝集の有無を目視で確認した。結果を下記表２に
示す。
製したラテックス懸濁液５０μｌを黒色ガラススライド
上で混和させ、数回ゆるやかにウェーブさせた。１分後
にその凝集の有無を目視で確認した。結果を下記表２に
示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例５ ラテックス凝集による吸光度変化の測定 実施例３と同様に調製した、直径０．２５４μｍのラテ
ックス上に３Ｆ１０が担持された0.025 wt% ラテックス
溶液２ｍｌに３種類の溶血検体５μｌをキュベット内で
混合し、波長７５０ｎｍでの吸光度変化を経時的に調べ
た。結果を下記表４に示す。
ックス上に３Ｆ１０が担持された0.025 wt% ラテックス
溶液２ｍｌに３種類の溶血検体５μｌをキュベット内で
混合し、波長７５０ｎｍでの吸光度変化を経時的に調べ
た。結果を下記表４に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】実施例６ 抗３Ｆ１０抗体のＡ1Cへの特異性 直径０．２５４μｍの未感作ポリスチレンラテックス溶
液（トリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ５．５、０．２％ト
ライトンＸ−１００（商品名）を含む。ラテックス濃度
０．０２５％）２ｍｌを３７℃に調節したセルに入れ
た。これにイオン交換クロマトグラフィー精製により得
られたＡ1C抗原（１ｍｇ／ｍｌ）又はヒトヘモグロビン
（Ａ0 抗原）（１ｍｇ／ｍｌ）を別々に加え、３７℃で
５分間攪拌しながら加温した。５分後、Ａ0 抗原を感作
したラテックス液には３Ｆ１０抗体（８ｍｇ／ｍｌ）
を、Ａ1C抗原を感作したラテックス液には３−４抗体
（抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、８ｍｇ／ｍ
ｌ）を各２μｌずつ加え、直ちに日立２２０分光光度計
で波長７５０ｎｍの吸光度変化を測定した。さらに１４
分後、Ａ0 抗原を感作したラテックス液に３−４抗体
を、Ａ1C抗原を感作したラテックス液に３Ｆ１０抗体を
それぞれ終濃度が８μｇ／ｍｌになるように添加した。
結果を図２に示す。
液（トリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ５．５、０．２％ト
ライトンＸ−１００（商品名）を含む。ラテックス濃度
０．０２５％）２ｍｌを３７℃に調節したセルに入れ
た。これにイオン交換クロマトグラフィー精製により得
られたＡ1C抗原（１ｍｇ／ｍｌ）又はヒトヘモグロビン
（Ａ0 抗原）（１ｍｇ／ｍｌ）を別々に加え、３７℃で
５分間攪拌しながら加温した。５分後、Ａ0 抗原を感作
したラテックス液には３Ｆ１０抗体（８ｍｇ／ｍｌ）
を、Ａ1C抗原を感作したラテックス液には３−４抗体
（抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、８ｍｇ／ｍ
ｌ）を各２μｌずつ加え、直ちに日立２２０分光光度計
で波長７５０ｎｍの吸光度変化を測定した。さらに１４
分後、Ａ0 抗原を感作したラテックス液に３−４抗体
を、Ａ1C抗原を感作したラテックス液に３Ｆ１０抗体を
それぞれ終濃度が８μｇ／ｍｌになるように添加した。
結果を図２に示す。
【００３７】図２に示されるように、Ａ0 抗原で感作し
たラテックスに対してＦ３１０はほとんど反応しなかっ
た。これに対して、３−４抗体を加えると凝集反応が起
こり吸光度の上昇を認めた。同様にして、Ａ1Cラテック
スでは３Ｆ１０抗体あるいは３−４抗体の添加で同等の
反応性を示した。
たラテックスに対してＦ３１０はほとんど反応しなかっ
た。これに対して、３−４抗体を加えると凝集反応が起
こり吸光度の上昇を認めた。同様にして、Ａ1Cラテック
スでは３Ｆ１０抗体あるいは３−４抗体の添加で同等の
反応性を示した。
【図１】実施例で作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノ
クローナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体
を用いて種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビンを含む検体
中のヒト糖化ヘモグロビンを測定した結果を示す図であ
る。
クローナル抗体及び市販の抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体
を用いて種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビンを含む検体
中のヒト糖化ヘモグロビンを測定した結果を示す図であ
る。
【図２】ヒトヘモグロビン又はヒト糖化ヘモグロビンを
固定化したラテックス粒子液に３Ｆ１０抗体又は３−４
抗体をそれぞれ加え、次いで３−４抗体又は３Ｆ１０抗
体をそれぞれ加えた際の吸光度の経時的変化を示す図で
ある。
固定化したラテックス粒子液に３Ｆ１０抗体又は３−４
抗体をそれぞれ加え、次いで３−４抗体又は３Ｆ１０抗
体をそれぞれ加えた際の吸光度の経時的変化を示す図で
ある。
フロントページの続き (72)発明者 谷本 徹二 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富士 レビオ株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 固相に結合された抗ヘモグロビン抗体
と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれない検体とを反応
させた後、抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記糖
化ヘモグロビン及び前記抗ヘモグロビン抗体を介して固
相に結合された抗糖化ヘモグロビン抗体を測定すること
から成る糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 【請求項２】 粒子に結合された抗糖化ヘモグロビン抗
体と、糖化ヘモグロビンを含むかもしれない検体を反応
させ、免疫凝集反応を生起させた後、得られた凝集より
前記糖化ヘモグロビンを測定することから成る糖化ヘモ
グロビンの測定方法。 - 【請求項３】 粒子が直径0.05〜５μｍのラテックス、
直径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及び動物赤血球から
成る群より選択される請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 抗ヘモグロビン抗体と抗糖化ヘモグロビ
ン抗体の混合物が前記粒子に結合されている請求項２記
載の方法。 - 【請求項５】 糖化ヘモグロビンに特異的なモノクロー
ナル抗体を含む溶液と糖化ヘモグロビンを含むかもしれ
ない検体とを混合し、その濁度変化により糖化ヘモグロ
ビンを測定する方法。 - 【請求項６】 前記抗糖化ヘモグロビン抗体はモノクロ
ーナル抗体３Ｆ１０である請求項１ないし４のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項７】 抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
３Ｆ１０。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5165127A JP2596322B2 (ja) | 1992-06-10 | 1993-06-10 | 総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-177444 | 1992-06-10 | ||
| JP17744492 | 1992-06-10 | ||
| JP5165127A JP2596322B2 (ja) | 1992-06-10 | 1993-06-10 | 総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0666796A true JPH0666796A (ja) | 1994-03-11 |
| JP2596322B2 JP2596322B2 (ja) | 1997-04-02 |
Family
ID=26489978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5165127A Expired - Lifetime JP2596322B2 (ja) | 1992-06-10 | 1993-06-10 | 総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2596322B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067611A1 (ja) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 |
| WO2010067612A1 (ja) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法 |
| JP2014530367A (ja) * | 2011-10-17 | 2014-11-17 | オームクス コーポレイション | 酵素誘発レドックス変化化学的脱離（ｅ−ｔｒａｃｅ）イムノアッセイを使用する、ヘモグロビンａ１ｃのパーセンテージの単回直接検出 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109073646A (zh) | 2016-05-13 | 2018-12-21 | 荣研化学株式会社 | 求取待测物在对比物中所占比例的方法、程序、存储介质及装置 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61172064A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-08-02 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 |
| JPS61280571A (ja) * | 1985-03-29 | 1986-12-11 | ダコ アクティーゼルスカブ | モノクロナ−ル抗体 |
| JPH028743A (ja) * | 1988-02-04 | 1990-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫原及び抗体の取得法 |
-
1993
- 1993-06-10 JP JP5165127A patent/JP2596322B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61172064A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-08-02 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 |
| JPS61280571A (ja) * | 1985-03-29 | 1986-12-11 | ダコ アクティーゼルスカブ | モノクロナ−ル抗体 |
| JPH028743A (ja) * | 1988-02-04 | 1990-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫原及び抗体の取得法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067611A1 (ja) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 |
| WO2010067612A1 (ja) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法 |
| JP5743550B2 (ja) * | 2008-12-11 | 2015-07-01 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 |
| US9169320B2 (en) | 2008-12-11 | 2015-10-27 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Antibody to N-terminal region of hemoglobin β-chain |
| US9624522B2 (en) | 2009-08-07 | 2017-04-18 | Ohmx Corporation | Single, direct detection of hemoglobin A1c percentage using enzyme triggered redox altering chemical elimination (e-trace) immunoassay |
| JP2014530367A (ja) * | 2011-10-17 | 2014-11-17 | オームクス コーポレイション | 酵素誘発レドックス変化化学的脱離（ｅ−ｔｒａｃｅ）イムノアッセイを使用する、ヘモグロビンａ１ｃのパーセンテージの単回直接検出 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2596322B2 (ja) | 1997-04-02 |
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