JPS6117957A

JPS6117957A - 抗イデイオタイプ抗体による液体試料中の物質の免疫検定法

Info

Publication number: JPS6117957A
Application number: JP14144985A
Authority: JP
Inventors: ピエール　マソン
Original assignee: ANSUTEITEYU INTERN DO PATOROJI; ANSUTEITEYU INTERN DO PATOROJI SERIYUREERU E MOREKIYUREERU
Current assignee: ANSUTEITEYU INTERN DO PATOROJI; ANSUTEITEYU INTERN DO PATOROJI SERIYUREERU E MOREKIYUREERU
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1986-01-25
Also published as: EP0170302A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、生物体液（ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　ｆｌ旧ｄ　
）のような液体試料中に於りる、同定のための重要な決
定基を少なくとも１個含む物質の免疫検定（ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓｄｙ　）法に関する。

非常に高い感度と特異性とを有する物質の検定のための
抗体の使用Ｇｊ公知であり、ラジオイムノアッセイ、醇
素免疫定量法、蛍光イムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｏ　ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）、粒子８１数イＪ・ノアノセ
イ（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ　）などの基礎になっている。

あらゆる場合に於°（、極めて純粋な被検定物質を動物
に注入し、反復注入後、動物から血液を取り出し、Ｉｌ
ｌ旨Ｈを分離し、該物質の検定に於ける試薬として使用
する１、この血清は動物体が産生じた特殊なりラスの蛋
白質を含み、該蛋白質は注入された物質と特異的に結合
し、物質に結合するごとによって、遠心分離または沈澱
または他の有効／“ｊ゛分離方法のいずれかで分離する
ことができる凝集体を住成する。これらの特殊な蛋白質
は″免疫グロブリン゛として知られているクラスに属し
、免疫グロブリンは、はとんどの動物種中に存在してい
て“ＩｇＧ、　ＩｇＡ、　ＩｇＭ、　［ｇＥ、　ＴｇＤ
　”としで知られている５つの主クラスがある。免疫グ
ロブリンの１小部分のみが被検定物質と反応するように
なっており、この１小部分の免疫グロブリン６Ｊ′抗体
”と呼ばれる。例えばヒＩ・に属するかかる免疫グロブ
リンを検定したい場合、ヒト免疫グロブリンの１つ例え
ばＩｇＧを精製し、この精製免疫グロブリンを別の動物
（例えばウサギ）に注入し、同時に、初めにウサギに注
入されたこの特殊なヒト免疫グロブリンを結合するウサ
ギ血清を分１ｉｉ１１ずればよい。ヒト免疫グロブリン
と反応するウサギ血清は恐らくウサギＩｇＧおよびつ（
）−ギＩｇＭ抗体を含み、該抗体は全ＩｇＧまたは１１
！Ｍの約１％〜２％の量で存在する。

明らかに、異なる物質を認識する抗体１，１互いに異な
っており、この差異は被検定物質を認識するために責任
がある免疫グロブリンの１つの特異的部分の化学的配列
にある。この部分は“抗原結合部位゛と呼ばれ、被検定
物質の特異的部分ずなわら“決定基゛と呼ばれる分子の
手鎖を認識する。

しかし、分析しなりれぽならないほとんとの複９（ｔな
物質は分子中に２個以上の特性鎖を有し、従って２個以
にの決定基を有する。産生きれた抗体集団中には、各決
定基に結合する抗体があり、多くの場合、被検定物質の
１つの決定基に結合する抗体は該物質の別の決定′）ｉ
番こは結合しない。要するに、抗血清し、１多くの種類
の抗体を含め　各抗体量は、被検定物質上の異なる決定
基によって凝集しかつ全免疫グｌ：１プリンの小部分で
ある全抗体の一部分に過ぎない。従って、決定基と同じ
くらい多くの抗原結合部位がある。

例えばヒ（１８Ｇに夕、Ｉ　Ｌ、て指向されるつ“リギ
血清の与えられた抗原結合部位を有する各抗体を分乱し
か゛つこれらの抗体の１つを例えばヤギに注入したとす
ると、ヤギし：１ウザギ抗体を認識する抗体を産生ずる
。ごのヤギ抗体はウリーギ免疫グ「ｌプリンに共通な決
定基と反応するが、抗体の中にｔ、Ｊウリーギ抗体の抗
原結合部位中にある決定基を特異的に認識できるものも
ある。これらの決定基は通常“イディ第１・−プ”と呼
ばれ、与えられた抗体の種々のイディオトープの連合は
“イディオタイプ”と呼ばれる。イディオタイプと反応
する抗血清または抗体は“抗イディオタイプ性と呼ばれ
る。

免疫検定は多くの方法に細分され得るが、本開示のため
には、２つの主要な型、すなわち直接凝集検定および凝
集阻止検定に分番）られる。直接凝集検定では、天然形
の被検定物質が凝集に直接関与する。必然的に、被検定
物質６１１個より多くの決定基を有していなければなら
ない。この場合、この凝集方法は抗体−物質−抗体−物
質−抗体などの種類のａ集体を含み、凝集体の大きさは
多くの因子によって左右される。反応終了後、残留する
抗体量は始めに存在していた物質の濃度に反比例する。

しかし、本発明は、第２の型の検定、ずなわら凝集阻止
検定のめに関する。この第２の型の検定は、唯１個の決
定基をもつ物質または唯１個の重要な決定基だりか違う
ような組成が極めて近い物質に夕、・ｊしで舅１味かあ
ることか明らか゛（ある。１例として、この型の検定は
、小さ過ぎて１個」り多くの決定基をち）、、：１“か
・つａ集反応に入る、二とかできないチロキノン（”ｒ
’４）またはゾ１−１５スフ−「Ｊンまたば多くの他の
ボルモンのような中神分子にとって特に興味がある。一
方、癌マーカーである胎児性魚体１皇（ＣＩＥΔ）のよ
うなある種の大型分子は多数の異４１′る決定基を含む
が、ｃ　ｌ−７，Ａ　１：には真に区別−ζきる決定基
は少数しか存在」シラ゛、同物質−１−に存在している
他の決定基は癌マーカーでない。

本発明ｔ＋１、ｆｉｉ純構造の分子の検定を改良するご
とがてきかつ被検定分子の同定のためのずなわらぞの個
性を与える１個または数個の重要な決定基を３む？３ｊ
　Ｗ（［な構造の分子の検定を可能にする新規手段を提
供する。

以下、１例としてＩ・リヨー１′チロニン（Ｔ３）を用
い、ｌｉｔ純分子の検定に通常通用されるような技術を
説明する。デキストランまたはアルブミンのような部分
、ｆ−Ｌこ数個の１゛３を結合さ・１！ることによって
、各決定２□！−が］３である多数の決定基を物質乙こ
授与することが可能である。その時には、デキストラン
−Ｔ３物質は数個の決定基を有する物質になる。

次に、例えばマウス中で産生された、デキストラン−Ｔ
３物質に対して指向される抗体を添加すると、これらの
抗体は凝集体すなわち抗体−デキストラン−Ｔ３−抗体
一デキストラン−Ｔ３などを形成する。次に、Ｔ３のみ
（何にも結合していない）を含むヒト血清を添加すると
、このＭｌｉｉｌｌＴ３はマウス抗体の抗原結合部位に
結合し、その結果これらの抗体はそれ以−ヒ反応できな
くなる。次に、デキストランーＴ３を添加するとき、遊
離の抗原結合部位を有する抗体が少ないので凝集が少な
くなる。従って、ヒト血清中の遊離Ｔ３ばデキストラン
−Ｔ３物質に対して指向される抗体の凝集を阻止した。

この技術は公知であり、多くの初期の特許で用いられて
いる。

しかし、」二記技術には幾つかの欠点がある。主な欠点
は次の通りである。

１、単純物質のより大きい分子への有効な方法での結合
が、しばしば高価格でかつ困難である。

かかる価格は抗体産生物質を製造することができるが、
それを検定に於ける“バルク”試薬として用いることは
試薬の価格を非常に増加させることになり得る。

２、抗体が単純物質以外の基を決定基として認識するの
で、すなわち単純物質を大分子中に於けるそれを取り巻
く他の原子または原子配置と組み合わせて認識するので
、多くの検定に於ける感度が制限される。従って、例え
ばＴ３とデキストラン−Ｔ３と抗体とからなるような混
合物では、抗体はデキストラン−Ｔ３を好む。この好み
を凌駕するため、ユーザーは理論的所要量より多量のＴ
３を用いることすなわち感度を下げて研究することを余
儀なくされる。

従って、本発明は、公知の検定法の上記欠点をな（して
、生物体液のような液体試料中に於ける、単純分子構造
物質すなわち同定のための決定基を１個しか含まない物
質であっても同定のための重要な決定基を１個または数
個含む複雑分子横造の物質であってもよい物質の、極め
て高い感度および特異性での免疫検定法を提供するごと
を［］的とする。

このため、本発明によれば、同定のための重要な決定基
を少なくとも１個含む被検定物質を含む液体試料と該物
質に対して指向されかつこの決定基に対して特異的な抗
体と特異１〕Ｙ体に対して指向される抗イディオタイプ
抗体とを反応させ、液体試料中の被検定物質の量を、上
記特異抗体と抗イディオタイプ抗体との間の結合反応に
及ぼず該物質の阻止爪を測定することによって、該物質
量が該結合反応に対して得られる阻止爪に比例するとし
て定置する。

本発明の方法の１つの特別な実施態様によれば、抗イデ
ィオタイプ抗体または特異抗体のいずれかをラテックス
粒子、赤１１１［球の３１うな微細粒子に結合させ、液
体試れ［中の物質の量を、該物質と該４）異抗体および
抗イディオタイプ抗体との反応後、該微細粒子の残留凝
集度またし；１未凝集度の関数として決定する。

本発明の方法の第１の特に有利な実施態様によれば、例
えぼりウマチ因子、補体Ｃ１ｑ囚−ｒ、ポリエチレング
リニ１−ルからなる群力）ら選ばれる、澁集活性を増加
させることができる因子の添加によって、抗イディオタ
イプ抗体の擬集活性を増加させる。

抗イディオタイプ抗体を微細粒子に結合さゼる場合に於
ける本発明の方法のもう１つの特ムこ有利な実施態様に
よれば、被検定物質を含む液体試料を、特異抗体と共に
、約３７゛Ｃの温度に於て約１分〜１８時間、攪拌しな
がらプレイン〜トユー・−１・する。

明らかに、本発明の方法は、標識を用いるラジオイムノ
アッセイの技術、すなわち放ル１性物質、酵素、および
類似物質で標識された抗体の使用を含む技術にも適用可
能である。特に二重抗体（ｄｏｕｂｌｅ　＝−ａｎ　Ｌ
ｉｂｏｄｙ）技術を含むこれらの免疫検定技術にも幾つ
かの欠点がある。この−重抗体技術は、現在実（際に最
も多く用いられている検定技術である。この技術は、被
検定物質に対して指向される抗体を、ポリビニルミク「
Ｉプレー１・、アガロースビーズ、ペーパーディスクな
どでできている固相と接合させることによって不溶化す
ることからなる。これらの不溶化抗体は、被分析試料と
混合するとき、物質を保持する。結合しなかった分子を
洗浄によって廃棄した後、不溶化抗体によって認識され
るものとは異なる抗原決定基を認識する標識抗体の結合
によって、被検定物質の存在を検出する。引く上で明示
したように、抗体は、放射性同位体または酵素で標識さ
れることができ、あるいは蛍光色素またはコロイド粒子
でも標識されることができる。この標識は結合抗体の測
定を可能にし、結合抗体の量は不溶化抗体によって保持
される物質の星に比例する。し７かし、この型の検定に
は、２つの欠点がある。すなわちこの検定法は少なくと
も２個の抗原決定基を有する物質にしか適用できず、Ｔ
３またはプロゲステ［１ンのような小物質には適用でき
ないことと異なる抗原決定基を認識する２つの抗体集団
が所要であることの２つの欠点である。例えば、特異性
の異なる２種の！１１り「１−ン性抗体を使用する、二
上かでき４、。

しかし、ある種の抗体では、Ｊ１屯代特異性（１１　＋
ｌ　Ｉｔ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｓｐｅＣｉ　Ｌｉｃ
ｉ　Ｌｙ　）を有４−るｆｉｔり目−ン性抗体を得る゛
ことかむすかし２い可能性がある。

本発明の検定法は、抗イティ」タイプ抗体の使用のお蔭
でこれらの欠点を克服する、二とができ、かくして同定
のための重要な決定基を１個しか含まない昨純物質の検
定にも使用することが可能である。

従って、本発明のもう１一つの実施態様によれば、抗イ
ディ」タイプ抗体を放射性同位体、酵素、蛍光色素、＝
ｉ　ｃ＋イ１−粒二ｔからなる群から選ばれる活性物質
で標識し、かつ特異抗体を固相に接合さ−Ｕて不溶化し
、かつ被検定物質を含む液体試料を不（８化体体−１添
加してこれらの不溶化ｂ’ｌ：体を該物質と反応さｌ！
、かくして摺られた試料・＼標識された抗イディオタイ
プ抗体を添加し、該標識抗イディオタイプ抗体を反応ざ
・Ｕ、不溶化抗体に結合しΔ′かった標識１冗イデ、ｆ
オフ・イブ抗体を固相から分子＋ｔし、液体試１’ｌ中
の被検定物質のＶを、固相に結８した標識抗イディオタ
イプ抗体の残留活性の関数として決定する。

本発明の第２の特別な実施態様によれば、特異抗体を放
射性同位体、酵素、蛍光色素、コロイド粒子からなる群
から選ばれる活性物質で標識し、かつ抗イディオタイプ
抗体を固相に接合させて不溶化し、かつ被検定物質を含
む液体試料を不７８化抗体へ添加し、これらの不溶化抗
体を該被検定物質と反応させ、かくしで得られた試料へ
標識特異抗体を添加し、該標識特異抗体を反応させ、不
溶化抗体に結合しなかった標識特異抗体を固相から分離
し、液体試料中の被検定物質の量を、固相に結合した標
識特異抗体の残留活性の関数として求める。

さらに、本発明のもう１つの特別な実施態様によれば、
特異抗体を固相に接合さ・口て不溶化し、被検定物質を
含む液体試料を不溶化抗体へ添加し、該不溶化抗体を該
物質と反応させ、かくして得られた試料に抗イディオタ
イプ抗体を添加し、政体イディオタイプ抗体を反応させ
、不溶化抗体に結合しなかった抗イディオタイプ抗体を
固相から分離し、抗イディオタイプ抗体に対して指向さ
れる（」１体であって、放射性同位体、酵素、蛍光色素
、ご目゛Ｉ　（ｌ’核粒子らなる群から選ばれる活性物
質で標Ｒｆ！ｌｉされている抗体を固相へ添加し、これ
らの標識抗体を反応させ、抗イディオタイプ抗体ｔこ結
合しなかった標識抗体を固相から分離し、液体試料中の
被検定物質のｈ↓を、固相に結合し７だ標識抗体の残留
活性の関数とＵ７て求める。

本発明の他の詳細、！ｉまひ特？ｔＹ　４よ、本発明の
幾つかの実施態様の限定的゛Ｃない例としで述べる以下
゛の説明から明らかに八′るのであろう。

本発明の免疫検定か、１１Ｉｆにマウフ乙こ於（ノるそ
の産生が公知である特５″シ抗体ずなわら中り１コ一ン
性抗体の使用によっ−ζ実際心、二改良されることも：
１わかるであろう。中クローン性抗体の特性心」、被検
定物質上の１．５異的決定基にそれ１ｉ４１＼が結？、
；することである。従って、例えばヒト成長ホル士ンＯ
弓）ｒ−上に５個の決定基かあるならば、おのおのが各
決定基に苅する５個の異なるｆｉｔりｍｌ−ン性抗体を
用いることができる。各抗体はＩｇＧであるが、そのイ
ディオタイプは異なる。すなわら各抗体は決定基を認識
する領域に於て有効に異なる化学組成を有する。抗体が
異なる化学組成を有するので、理論的には、例えばウサ
ギに特異的屯クローン性抗体を注入するごとによって、
各イディオタイプに対する抗血清を得ることが可能なは
ずである。このウサギ抗血清は確かにマウスＴｇＧに対
して指向される抗体を含むが、これらの抗体中にはイデ
ィオタイプを特異的に認識する部分があり、すなわち抗
血清は抗イディオタイプである。当業者には公知のよう
に、該非常に特異的な抗イディオタイプＴｇＧ抗体を分
離して試薬として用いることができる。

従って、トリヨードチロニン（Ｔ３）の特異的免疫検定
に於ては、もし特異抗体としてマウスｔｉｉクローン性
抗Ｔ３抗体を、マウス１ｙクローン性抗体に対して指向
される抗イディオタイプ抗体としてのウサギＴｇＧ抗イ
ディオタイプ抗体と反応させたならば、抗イディオタイ
プ抗体はマウス単クロ−ン性抗Ｔ　３抗体を凝集する。

今、被検定物質を含む液体試料、ずなわらごの場合、Ｔ
３含有し１・血清をマパノス争り［＋−ン性＋Ｋ　Ｔ　
３抗体と混合してオ＜と、１リヨー！・チロニンはマウ
スｔｉｔクローン性抗体と反応しでしまっており、イデ
７ｆオタイプ中心は１．１鎮されている。逆に、本発明
によって、Ｔ３含有し１・血清とマウス単クローン性抗
体とのこの混合物をウリーギ抗イディオタイプ抗体と反
応させる時には、凝集は実質的に少ない。ヒト血清中の
Ｔ３の量は、実際に凝集反応である特異抗体と抗イディ
オタイプ抗体との間の結合反応に及ぼすＴ３の■ＩＬ度
を測定することにより、Ｔ３量がこの凝集反応に対しζ
得られるｔｉｌｌ止度に比例するとして定量される。従
って、この検定法に於ては、被検定物質を多数の決定基
を含むように高分子に結合させる必要はもはやなくか・
つ結合した物質からなる決定基と遊離の物質からなる決
定基との間の競争もちはやｉ；い。

既述したように、本発明の検定法Ｌ３１、同定のための
重要な決定基を１個だＩＪまたはおそらく数個含む複雑
な分子構造の物質の検定にも拡張することができる。こ
れらの決定基は細菌またはウィルスの壁上に存在してい
てもよく、あるいは複ｊＩＬな分子の小部分であっても
よい。これらの分画または特異的決定基の単＾１１　Ｌ
ｌ、現在の技術では不可能ではないにしても現在の所実
行がしばしば極めて困離である。単クローン性抗体を製
造する当業者にとって、高度に特異的な単クローン性抗
体をもつためのこれら決定基の純粋な状態での分離はし
ばしば不必要である。例えば癌腫瘍の検出にｈ＋ける特
性的要素である胎児性癌抗原（ＣＥＡ）の決定基に対し
て単クローン性抗体を産生させることができる。かかる
準クローン性抗体（例えばマウス単クローン性抗ＣＥＡ
抗体）をウサギに注入すると、ウサギはそれ自体がＣＥ
Ａの特異的決定基に月して指向されるマウス単クローン
性抗体に対して指向されるつ゛す′ギＩｇＧ抗イディオ
タイプ抗体を産生ずる。

ＣＥＡが無い場合、つ１ノ−ギ抗イディオタイプ抗体は
マウス単り「１−ン性抗体と凝集体を形成する。

しかし、マウス単り［Ｉ−ン性抗体を例えばＣ１？、△
含有しＩ・血清と混合すると、ＣＦ、　Ａは畦り［Ｊ−
ン性イディオタイプと反応し、この場合、ウサギ抗イデ
ィオタイプ抗体とマウスＯＬり【、Ｊ−ン性抗体との間
のそれ以上の凝集を妨害する。このｆ疑集龍止の程度は
生物体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ）中のＣ
ＥＡ濃度に比例する。

本発明によれば、被検定物質を含む液体状１１と特異抗
体と抗イディオタイプ抗体との反応または混合は、一般
に、この液体試料とこれらの抗体との問押下に於番」る
。約３７℃の温度での、使用する検定法または物質の型
によっ−Ｃ極めて広範囲の期間、例えば約１５分〜約２
４時間のインキュベーションからなる。

本発明によれば、抗イディオタイプ抗体か微細粒子に結
合している場合に於て、被検定物質を含む液体試料を、
特異抗体と共に、攪拌しながら、約３７°Ｃの温度に於
て、上として被検定物質の型に依存するが約１分〜１８
時間プレインキュへ＝１・することによって、物質の検
定の感度がより良好になることもわかるであろう。標識
抗体を用いる場合には、被検定物質を含む液体試料を、
これらの抗体と共に、すく上でＪべたと同様な温度およ
び時間でプレインキュ・＼−１・する。

既述したように、本発明の方法は、ラジオイムノアッセ
イの範囲内で、少くとも標識抗体を用いることによって
、二重抗体技術のような現在なラジオイムノ７ソセイ技
術で起こる欠点、すなわち少なくとも２個の抗原決定基
を含む物質にのみ適用することが可能であり、井重複特
異性をもつｍクローン性抗体を得ることができないとい
う事実を示さすに、適用することができる。これに関し
ては、二重抗体技術に関する添付第１図に示しである。

既に説明したように、第１抗体を固相に結合させ、第２
抗体を放射性同位体または酵素または蛍光色素またはコ
ロイ、ド粒子で標識する。本発明によれば、添付図面の
第２図に見られるような標識抗イディオタイプ抗体の使
用は、公知のラジオイムノ７ソセイの限界を克服するこ
とを可能にしかつＴ３またロプロゲステロンのような煩
純分子構造の物質の検定を可能にする。第２し１に見ら
れるように　抗イディ」タイプ抗体を放躬性同伯体抽ま
たは酵装置また乙、Ｊ蛍光色素置またはＺｌ　ｌ’ｌ・
ｆ１粒子種の活性物質で標識し、か′つ１．￥異抗体を
、例えばポリ塩化ビュルミクｒ’ｌプし・−１−またｉ
ＪＹカしＩ　−スビースまたＬＪペーパーディスクよた
εＩヒルＩＪ−スディヌつててき−（いろ固相Ｃに接合
さ一１！る。υ、′Ｃ２二、被検定物質ずなわ４３被検
定抗Ｊｊ：？をＡ′む液体試料を不溶化抗体へ１６９加
し、不溶化抗体を抗原と１ソ（１−１させ、かくして得
られた試料−標識抗イデ「ｌ夕・イブ抗体を冷力ｎして
該標識抗イディオタイプ抗体を反応させ、不溶化抗体に
結合しなかった標識面・イディオタイプ抗体を固相から
分離し、液体試料中の被検定物質の量を、固相に結合Ｕ
また標識抗イディオタイプ抗体の残留活性の関数としで
求める。

事実、抗＋１ｉの抗体への結合が標識抗イデイオターイ
ブ抗体と不溶化抗体との結合をｌ！Ｉｌ　＋Ｌ−する（
阻１１、試験）。従って、標識によって与えられる信号
は抗原の間の増加と共に減少する。

本発明のもう１つの実施態様は不溶化抗イディオタイプ
抗体を使用することからなり、この場合には、第３図に
見られるように、標識抗体が被検定抗原ずなわら被検定
物質に対して指向される抗体である。この場合も前の場
合と同様に進行するが、明らかに、不溶化抗体に結合し
なかった標識特異抗体を固相から分離し、液体状゛Ｖ：
［中の被検定抗原物質の量を、固相に結合した標識特異
抗体の残留活性の関数として求める。

本発明による第３の可能性は第３の型の抗体を使用する
ことからなり、この場合にはこれらの抗体が標識抗体で
ある。最終的には前の２つの場合と非常に類似している
この検定の原理を第４図に示す。この場合には、特異抗
体を実際に固相へ接合させ、被検定抗原すなわち被検定
物質を含む液体試料を、かくして不溶化された抗体へ添
加し、該不溶化抗体を抗原物質と反応さ・υ、かくして
得られた試料に抗イディオタイプ抗体を添加し、該抗イ
ディオタイプ抗体を反応させ、不溶化抗体に結合しなか
った抗イディオタイプ抗体を固相から分冊１し、この固
相へ抗イディオタイプ抗体に対して指向される標識抗体
を添加し、実際に抗イディオタイプ抗体が属する免疫グ
ロブリンを認識する該標識抗体を反応させ、抗イディオ
タイプ抗体に結合しなかった標識抗体を固相から分離し
、液体試料中の被検定抗原物質の量を固相に結合した標
識抗体の残留活性の関数として求める。この場合も、前
の２つの場合と同様に、固相はポリビニルミク「１プレ
ー１・、アガ［＋−スビーズ、ペーパーディスクなどの
ようなポリマー担体製のものでよい。

３つの前記実施態様に於て、結合しなかった抗体の固相
からの分離は、一般に、食塩水による洗浄にＣ１゛って
、あるいばさらに単なる排液またはデカンテーションま
たは沈澱または遠心分離によって行われる。本発明の方
法は、アレルゲンのような複雑な分子の検定に特に適し
ている。

以下、３つの実施例で本発明の方法をさらに説Ｉす目−
る。

実施例１− 粒子−■−数免−疫検定（り△ｑ−Ｉ△ラー全川シ）る
１用免ヱじ（町ブ」）］雅／は一子上ｑ挟定２７種の異
なるマウス単クローン性抗体をヒト血清中の被検定Ｉｇ
Ｅ分子に対して指向させ、これらの単クローン性抗体の
１つを選んだ。この抗体を以後Ｂ９と称す。単クロニン
性抗体Ｂ９はＩｇＥのＣＨ３）メインとＣ）＋４ドメイ
ンとを含むＤ２領域中の決定基と特異的に反応した。マ
ウス腹水液（ａｓｃｉｔｉｃ　１ｉｑｕｉｄ　）から得
られるＢ９単クローン性抗体をプロティンＡ−セファロ
ースクロマトグラフィーによって精製し〔ニゲ（Ｅ’ｇ
）ら、イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　）　〜１５〜４２９−’４３６．１９７８）、
それらをｐＨ６分画（ＩｇＧ　１分画）中に溶出させた
。この分画は、抗ＩｇＥ活性のない多クローン性ＩｇＧ
からなる不純物を２０％含んでいた。

単クローン性抗体〔フロイント完全アジュバンＩ・０．
５　ｍ　７！中に乳化されたＮａＣ１’（ｇ／ｌり０、
５　ｍ　７！中１００．＋７ｇ）を、２週間毎に、ニュ
ーシーラント産白ウサギに、多数の部位に於て皮肉注射
した。第３回の注射の１０日後、および次の各ブースタ
ー注射後にこれらのウサギから薄液をとった〔マグヌノ
ソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　）ら、Ｃｌ　ｉ　ｎＡｌｌ
ｅｒｇｙ　］　１１５４３−５６１．１９８．１）、こ
れらの抗イディオタイプ抗体から、血清蛋白質およびマ
ウスＩｇＧの非イディオタイプ決定基に対して指向され
る抗体を、１１ＩＬ清蛋白質およびマウスＩｇＧがグル
タルアルデヒ］によって結合されているセファ１−１−
スカラムを通して抗イディオタイプ抗血清を逐次通過さ
せることによって分離した（カンビオソ（Ｃａｍｂｉｏ
ｓｏ）ら、イムノゲミストリ−（Ｉｍｍｕｎｏ　　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　、１２．２７３１７８．１９７５）
。吸着された抗血清からプロティンＡ−セファロースク
ロマトグラフィーによってウナギＩＨＧ抗イディオタイ
プ抗体を精製した〔マグヌソソンとマソソニ／　（Ｍａ
ｇｎｕｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍ＋１ｓｓｏｎ　）、Ｊ。

八ｌｌｃｒｇｙ　　ｅｔ　　Ｃ１１ｎ、　　１ｍｍ、、
　　７　０　、３　２　６　−３３６　．１９Ｂ２）。

精製したＩｇＧを、次にペプシン消化〔マグヌノソン（
Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　）ら、Ｃｌ１ｎ、　Ａｌｌｅｒｇ
ｙ−１−１−８５４３５６１，１９８１）によってＦ　
（ａｂ　’　）２　　フラグメントにした。

８亥Ｆ（ａｂ’）ｚ　　フラグメント４００μｇをカー
レボジイミドによって１００μｌのカマホキシル化うテ
ックス（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ　１ａｔｅｘ）　　
（１００ｇ　／　（！　。

ニスタボ−Ｋ　１００　（Ｅａｔａｐｏｒ　Ｋ　１００
）　、ｌ’−１ソトＮｏ、５０１、ロー不−プーレンク
（Ｐｈｏｎｅ　−Ｐｏｕｌｅｎｃ　）　、クールへボア
エ（Ｃｏｕｒｂｅｖｏｉｅ）　、仏画〕にカンプリング
させた〔マグヌソソンとマノソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ
　ａｎｄ　Ｍａｓｓｏｎ　）、Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　
ａｎｄＣｌｉｎ、　１ｍｍ、、　　７０．３２６−３３
６．１９　Ｂ　２）。

ラテックスは、使用ｎ；１に１６０倍に希釈した。かく
して、ウザギＩｇＧ抗イディオタイプ抗体は１’（ａｂ
’）ｚ　　フラグメントで皮膚されたラテックスの懸濁
液となった。

被検定ＴｇＥを含むヒト血清を、Ｎ　ａ　Ｏ＋−１でｐ
Ｈ９゜２に調節したＮａＣ７！含有グリシン希釈剤で希
釈し、牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）　　１０　ｍｇ
／ｒｎ　Ｉ！、、１０％正常ウサギ血清（ＮＲ３）、グ
ルタルアルデヒドａ集つザギＦ（ａｂ’）２　　フラグ
メントを補充して可能な抗Ｆ（ａｂ’）２　　フラグメ
ント抗体を吸収するようにした。希釈剤と抗体とからな
るこのン容液を以後Ｎ　ＲＳ　−Ｂ　Ｓ　Ａ　−１・゛
と称ず。実際に、希釈剤は５０ミリモルのエチ１／ンジ
アミン四酢酸と０．　（ｉ　モＪｌｚ（２”１Ｎ　、Ｊ
Ｃ７！とを倉む０，１Ｍグリシン中のデー１−ストうン
”「５００（ファルマンア　　　　（Ｐｈａｒｍｄｃｉ
ａ　）　、ラブ」ノラ（Ｌｌｐｐｓｏｌａ　）　、スウ
ェーデン〕　２０１萌／川ｅ力・らなっており、この７
容ｌ夜はＮ　ａ　Ｏ１１でｐＨ９，２に調節されていた
、Ｂ９単クローン性抗体とＩｇＢとの反応を追跡するた
め、ヒ１〜血清試料を、Ｂ９屯り目−ン性抗体と共に種
々の時間プレインキュ・＼−１・した後、Ｂ９抗体に対
して特異的な抗イディオタイプ抗体で皮膚されたラテッ
クスに対するこれらＲ９ＭＳ−クローン性抗体の残留凝
集活性を測定した。凝集は、自動的ナンプリングおよび
インキュヘーシジン装値に連結した光学的粒子ｄ数品で
非凝集粒子を計数するごとによって測定した〔例えばマ
グヌソソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　、）ら、１９８１参
照〕。明らかに、凝集したラテックス■を直接測定する
ことも可能であった。

典型的な実験に於て、装置はＩｇＥとＢ９単クロ−ン性
抗体を含む試料混合物３　Ｑ　７７１ずつを吸引し、こ
れらを、ラテックスにカップリングさせたウサギＩｇＧ
抗イディオタイプ抗体ＣＦ　（ａｂ　’　）２フラグメ
ントとして〕３０μｌが逐次かつ自動的に添加されてい
る反応管中へ注入した。３７゛Ｃに於て連続渦攪拌下に
２５分間インキユヘーションした後、非凝集粒子を計数
した。Ｂ９とプレインキュヘーション無しにＩｇＥを検
定する場合には、Ｂ９を希釈剤と共に添加した。この相
関研究のためには、マグヌソソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ
　）らが記載しているｒｇＥ検定法（１９８１）を用い
た。

凝集用物質として用いられる８９争クロ一ン性抗体の適
当な濃度を選択する場合、所要範囲にわたって最適な感
度と満足な精度との相矛盾する要求を調節しなければな
らない。最適感度は、Ｓ形凝集曲線の最急勾配部分の凝
集用物質濃度の選択を必要とする。しかし、精度は、阻
止剤が無い場合に凝集体が高比率の抗体被覆ラテックス
を結合するときにのみ得られ得るより広い範囲を必要と
する〔マグヌソソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　）ら、１９
８３）。

これらの基（１（に基づいて、７５％の凝集を起こずＢ
９　ｉｉ′ＬりＬＩ−ン性抗体の２０．ｕｇ／ρの濃度
をｊＺんだ。これに関連して、一般に、ｌｆｆ１＋ｌ−
刑の不在下に於て抗イディオタイプ抗体にいて少なくと
も５０％の凝集度を得ることかできる試Ｆｌ液体中の特
異抗体濃度をぶふことがわかるであろう。

Ｂ９抗イディオタイプ抗体で被覆されたラテックスに幻
するＢ９単りｌ−１−ン性抗体の凝集活性にりえるＩＭ
Ｅによる阻止を、ＩｇＥとＢ　９　ｔｐ−クローン性抗
体とを種々の時間・インキユヘーションした後試験した
（第５図参照）。第５図に見られるように、実際に非凝
年ラテックス粒子の数を任意の単１☆で示すピーク冒さ
ば、試料中のＩｇＲａ度が増すと増加する。このことは
、実際にＩｇＥの添加量を増すと、それに比例し７てラ
テックスに幻するＢ９ｆｐりｌＴｌ−ン１ノ１１Ｊ！Ｌ
体の凝集活性を１ｉｆＪ　＋Ｉすることを意味しティる
。４　＋Ｉｂ＆ｊ旧（１１）差異Ｌ、１、Ｉｇｒ〕と１
３９中りＩ：１−ン性抗体とのプ］・イン−１・工・・
−ン」、／の検定感度に及ばず影■（ゝを示しており、
ブト・「ン；１−Ｊ・、−ション無し２の最後の曲線は
最小感度を〜える。

事実、感度は、プレインキュヘーション時間を０分から
９０分に増加するとき４０ＴＵ／ｍ７！から６１０／ｍ
ｊ！のＩｇＥに増加した。ブレインキｊヘーション時間
を増加すると、よりゃ勾配の■止曲線を与え、従ってよ
り良い精度を与える。

得られた阻止および凝集機構ば、Ｂ９とＩｇｌＦ、との
相互作用から本質的に生し、Ｂ９のイディオタイプがＩ
ｇＥの結合によってマスクされたために抗Ｂ９ラテツク
スの１Ｊｆｆｌを阻止すると考えられる。

しかし、ＩｇＥは対称分子でありかつすべてのそのエピ
トープを二重に包むので、抗原−抗体ネノドワークの単
なる形成ば、おそら＜Ｂ９９抗と抗Ｂ９ラテツクスとの
間の凝集の■止過稈に関与するとも考えられる。この仮
説を、Ｃ９イデイ第１・−ブに対して特異的にされてい
ない、ずなわら精製されていない抗Ｃ９イディオタイプ
抗体かり得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントで被覆さ
れたラテックスで試験した。このラテックスは５　ｍ　
ｇ　／　１２のＢ９単クローン性抗体で６０％まで凝集
することがわかった。このことは非吸収抗Ｂ９抗皿清が
イディ第１・−プでない抗原決定基と反応していたこと
を示す。Ｂ９単りｍｌ−ン性抗体の調製物が２０％の多
りしＩ−ン性１ｇＧで汚染されていることを考えると、
このラテックスは抗ＴｇＧ被覆ラテックスに対する凝集
活性に関与することができたであろう（ｎｉｉ記参照）
。抗ｆｌＥ抗体活性をもたないＩＢＧによるこのｌη染
にもかかわらず、４０　１０７ｍ　ｊ！のＩｇＥの添加
ば凝集を約１０％だけ阻止した。かくして、ｆｉｔクロ
ーン性抗体とその抗原（ＴｇＥ分子）との抗原−抗体複
合物の中なる生成がある程度阻止過程に寄与するが、抗
原結合（ＩＭＥ分子）によるイディオトープ（Ｂ９）の
マスキングが確かに主要な役割を果た′していると結論
することができきる。

公知のよ・うに、試ネ−１および標準のための希釈剤と
してのＮ’Ｒ３−ＢＳＡ−Ｆ　（コレンｉ・−カノサ１
□　（Ｃｏ’１ｌｅｔ’−Ｃａ５ｓａｒｔ）　ら、１９
５３）の使用はウサギＩｇＧのＦ（ａｂ’）ｚフラグメ
ントで被覆されたラテックスの非特異的凝集を阻止する
。他の可能な妨害因子を調へるため、低いレヘル（１０
０１０以下）のＩｇＥを含む２０種の血清を試験した。

１：１０希釈後、試料とＢ９単クローン性抗体とのプレ
インキュヘーション工程無しで血清を検定した。これら
の条件下で、これら試料中のＩｇＥは検出限界以下であ
った。非凝集粒子の濃度の変動係数は２％であり、これ
は０．５ピーク高さ単位に相当した。この非常に低い変
動係数の値は、妨害が非常に少ないこと、従って信頼で
きる条件が存在することを示している。一方、１ｇＭリ
ウマチ因子の高力価を有しかつウサギＩｇＧすなわち抗
イディオタイプ抗体と強く反応する２種の血清は抗Ｂ９
ラテツクスを凝集しなかった。このことは、ラテックス
粒子表面上に於ける無傷のＩｇＧの代わりのＦ（ａｂ’
）ｚフラグメンｌ−の使用がリウマチ因子によってひき
起こされる凝集を有効に阻止することを示した。

分梶皿双半１０〜７７０　　１１　／ｍ１．のＩｇＥを含む１０人
の患者の血清を２０００ＩＵ／ｍβのＩｇＥで補充し、
これら血清のＩｇＥを、ＮＲ３−ＢＳＡ−Ｆで１０７ｔ
：ｉ希釈後検定ｔノ、：、Ｉ、、ｒシのｒｒｚ均匁Ｊ）
ｉ’　ｌｉｔ　１１ν率１：Ｉ：９５．８！、　８．７
χ　（村；イｉ！Ｉ（、ｌｉ差）であり　変動（糸数は
９．１％であっ）ご。この、こ、！：　ＬＪ’、　Ｉｇ
　ＥとＮ＋−ンＳ　１３ＳＡ　　Ｉ・礼釈剤との間に実
質的妨害がなかっノご、ことを示し７ている。

（旧−朋直接凝集（Ｉｇｒ’：凝集性抗１ｇ１Ｅ被）やラテ７・
クス）によって既に検定しである４１種の１ｆ１１清中
の１８Ｅを本発明のイディオタイプ阻１１に、１、って
検定した。この１泪止検定に於けるＩｇＥ含有血清とＢ
９とのプレ・インキュ・＼−ジョン時間は３０分であっ
た。

本発明のイティオタイプ明止検定で得たＩＨＥ検定結果
と直接凝集検定との間の相関を第６図に示す。

第６図かられかるように、両方の結果は実質的に似てお
り、同し領域では実際的に一惰゛Ｃある。この２種の検
定法の間の相関係数はｒ・０．９　ｆｉであり、回帰線
はｙ＝０．７７ｘ＋９７．４　　（ｙ＝−１（ｌＩ止試
験値、Ｘ＝・直接凝集試験値）である。

実施例−３アーンー！シゲン−（デノに一アート！−アー二１゛イ
ーデーｚ−°ブーを旧−丹’ｙ’３Ｘ７　（Ｄｅｒｍａ
ｊｏｐｈａＨｏｉ＋ｊｅｓ　ｐｔｅｒｏＨｙｓｓｊｎｕ
ｓ）　＊ｉｓ↓よ−Ｕし−ＰＴ）−ｔｌｌｕと５什−ン
ーオニーイーーノ艶ノーーンで娑−イ一本検定の原理Ｌ
ｊ、添付図面の第４図に示しである。ポリビニルプレー
ト　（フロー・ラホラトリーズ（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　）　）のウェルに、アレルギー患者か
ら１５たヒト抗ＤＰＴ免疫グロブリン（抗血清１ｇＧ）
を塗布した。この目的のため、プレートを、ウコールに
つき、５０ミリモルのグリシンでｐ１１９．２に緩衝し
、１０μｇ／ｍ１２の抗血清ＩｇＧを含む食塩水（９ｇ
／ｌ　　１００　ｐρと共に、３７“Ｃの温度で６時間
インキュへ−１・した。緩衝食塩水で洗浄後、アレルゲ
ン（１’）ＰＴ）を、０．０５Ｍ＋−リスでｐｌ＋７．
５に緩衝しかつ０．１％の胎児子牛血清を含む食塩水（
９ｇ／ｌ　　（１’５Ａ−Ｆｅ２）で連続希釈したもの
をピペットでウェルるこ入れ、プ１／−１・を３７°Ｃ
で２時間インキエベー１・した。食塩水（９ｇ／＋２）
で４回洗浄後、Ｔ舒−Ｆｅ２て希釈されている（　２　
ｍｇ　／　ｒｎβ）ウリギ抗イディオタイプＩ　ＨＧ抗
体を５０μａずっ各つ：１−ルに入れ、３７°Ｃに於て
８時間インキエベートした。

次に、プ［）−１を食塩水（９ｇ　／　１　）で４回洗
った。次に、抗血清１ｇＧに結合したつＪＪギ抗イディ
オタイプ抗体の量を、ウサギＩｇＧ抗イディオタイプ抗
体に火１して指向される標識抗体によって測定した。　
”’Ｉ　　（５０，０００ｃｐｍ　）で標識さン１かつ
ＴＳＡ−Ｆｅ２で希釈したヤギ抗体５０１１１ずつをピ
ペットでウェル乙こ入れ、２１°Ｃで１６時間インキュ
・＼−１−Ｌ、洗浄後、放１・］能をγ線計数器で計数
した。第７図に見られるように、ウサギ抗イディオタイ
プ抗体の結合の阻Ｗはアレルゲンの濃度に比例した。結
果は、次式で計算された。

対照Ａ　Ｌ；ｉ抗イディオタイプ抗体無し、の場合のウ
コールの放射能、ずなわらヤギ抗体の担体への結合から
生しるジ目￥異的放射能てあり、対照Ｂはア１．−　＋
１ゲン（Ｄ　Ｐ　Ｔ）無しの場合のウェルの放射ＮＦ　
−３’　ｊＪわち実際の最大放射能を示し、ｃｐｍは力
・“ノンｌ　−′分を意味する。

一人旅但ａ十［子１を数−（−ハ左ＬＡ）　　によ−イ１プニリニ
ンン−□（二Ｖ−土＞ＣＯ共定単り「Ｊ−ン抗体Ｔ４抗体のイディオタイプ〔ハイプリ
チック　（Ｉｌｙｂｒｉｔｅｃ）　、リーダ（Ｌｉｅｇ
ｅ　）、ベルギー〕に対して指向されるウリ°ギ抗血清
を、単クローン抗体１ｇＥ抗体に対しで指向される抗イ
ディオタイプ抗血清について上述したようにして調製し
た。この抗イディオタイプ抗血清を、次に、抗イディオ
タイプ抗体で被覆されたラテックスまたは単クローン性
抗体で被覆されたラテックスのいずれかを用いることに
より、Ｔ４の検定に用いた。

第１の方法（ＴｇＥについての特異的測定のために示し
た詳細ｊ１１りに厳密に従う。実施例１参照）では、実
施例のＩｇＥの検定で記載したように、ラテックスを抗
イディオタイプＩｇＧのＦ（ａｓ’）ｚフラグメントで
被覆した。次に、単クローン性抗体の凝集活性を測定し
た。８０％凝集をひき起こす１０μｇ／ρの単りＩ′：
＋−ン性抗体の濃度が回正試験で最高の感度を与えるこ
とがわかった。ｆｉｔクローン抗体Ｔ４抗体の凝集活性
に及はず食塩水（９ｇ／ｌ）中に溶解したＴ４による阻
止を、Ｔ４と屯りＬＩ−ン抗体Ｔ４抗体とを種々の時間
インキ□・＼−シゴンした後に試験した。３ピーク高さ
１１１位として定義される感度は、インキ−１−・・−
ジョン時間を０分から３０分に増ｊＪ１１することによ
って４０ｎｇ／βから２０ｎｇ／ρに増加した。３０分
を越える長時間のインキ工・＼−シコンば感度を改良し
なかった。動的範囲は２０〜３２０　Ｂ／ｍβにわたっ
ていた。

第２の方法では、ラテックスをｌ’ｃクローン性抗抗体
抗体で被覆し、抗イディオタイプ抗血清を凝集用物質と
して用いた。米国特許第４，４２７，７８１月記載のよ
うに、１／４０００弄釈のこの抗血清の凝集活性を］／
′５０希釈のリウマチ血清の添加によって増強した。こ
のリウマチ血清は、ウリギＴｇＧで被覆されたラテック
スに対して強い凝集活性を示しかつマウスＴｇＧで被覆
されたラテックスに対して凝集活性が無いごとに基づい
て選択された。凝集に及ばず食塩水（９ｇ／ｊ）ａこｌ
８解したＴ４！こよる阻止を、リウマチ因子で補充した
ウサギ抗イディオクイブの添加前にＴ４と抗Ｔ４ラテッ
クスとを種々の時間インキュー・−ジョンした後試験し
た。ブレインキュベーション時間を０分から３０分に増
加したとき、感度は２５　ｎｇ／ｒｎ　Ｉ！かｌｎｇ／
ｒｎｎに増加した。３０分より長いインキュベーション
はｌｎｇ／ｍｊ！を越えて感度を改良しなかった。動的
範囲ば１　　ｎｇ／ｍβから１００ｎＢ／ｉ２にわたっ
ていた。

本発明が上述のような実施態様に限定されるものではな
く、かつ本発明の範囲から逸脱することなく多くの変化
がなされ得るものであることば言うまでもない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、免疫検定の二重抗体技術を示す図であり、第２図は、標識抗イディオタイプ抗体と不溶化特異抗体
とを用いる不発明の１つの実施態様を示す図であり、第３図は、不）容化体イディオタイプ抗体と標識特異抗
体とを用いる本発明（７）もら１−ノの実施態様を示ず
図−（あり、第４図Ｃ：Ｉ、４！（！識された第３の抗体を用いろ不
発明のもろ１・］〕の実施態様の原理を示′づ図−（あ
り第５図は、Ｂ９抗イディオタイプＩＪ’ｔ　７＋、で
被覆されたラテックスに対する１３９　Ｑ（りじＪ−ン
性抗体の凝集活性に与えるＴｇＥζこよる１イ１１市に
及ぼずＪｇＥとＢ９８ｉ（クローン性抗体とのインキ１
ヘーンヨン時間の影響を示すグラフであり、第６図は、本発明のイディオタイプ１１市検定結果と直
接凝集検定結果との相関を示すグラフであり・第７図は、つ１ツギ抗・イディオタイプ抗体の抗血清Ｔ
ｇＧへの結合の閉止がアレルゲン濃度に比例するこきを
示すグラフである。１＋’ｌｒ’、ＵｐゴＳａイ、ｉｕ＋１ｍ。ＦＩＧ、６

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生物体液のような液体試料中に於ける、少なくと
も１個の同定のための重要な決定基を含む物質の免疫検
定法であって、被検定物質を含む液体試料と該物質に対
して指向されかつ該決定基に対して特異的な抗体と特異
抗体に対して指向される抗イディオタイプ抗体とを反応
させ、かつ上記特異抗体と抗イディオタイプ抗体との間
の結合反応に及ぼす該物質の阻止度を測定することによ
って、該結合反応に対して得られる阻止度に比例する液
体試料中の該物質の量を定量する免疫検定法。
（２）抗イディオタイプ抗体または特異抗体のいずれか
を微細粒子に結合させかつ液体試料中の物質の量を、該
物質と該特異抗体と抗イディオタイプ抗体との反応の後
に、該微細粒子の残留凝集度または非凝集度の関数とし
て定量する特許請求の範囲第（１）項記載の検定法。
（３）ラテックス粒子または赤血球を微細粒子として用
いる特許請求の範囲第（２）項記載の検定法。
（４）液体試料中の特異抗体の濃度が、阻止物質の不在
下に於て抗イディオタイプ抗体と少なくとも５０％の凝
集度を得ることができるような濃度である特許請求の範
囲第（２）項または第（３）項のいずれかに記載の検定
法。
（５）上記特異抗体の濃度が、抗イディオタイプ抗体と
約７５〜８０％の凝集度を得ることができるような濃度
である特許請求の範囲第（４）項記載の検定法。
（６）抗イディオタイプ抗体の凝集活性を、かかる活性
を増加する能力のある因子の添加によって増加させる特
許請求の範囲第（２）項〜第（５）項のいずれか１項に
記載の検定法。
（７）抗イディオタイプ抗体の凝集活性を増加する能力
のある因子がリウマチ因子、補体Ｃｌｑ因子、ポリエチ
レングリコールからなる群から選ばれる特許請求の範囲
第（６）項記載の検定法。
（８）抗イディオタイプ抗体を微細粒子に結合させる場
合に於て、被検定物質を含む液体試料を特異抗体と共に
、約３７℃の温度で約１分〜１８時間、攪拌しながらプ
レインキュベートする特許請求の範囲第（２）項〜第（
７）項のいずれか１項に記載の検定法。
（９）抗イディオタイプ抗体を放射性同位体、酵素、蛍
光色素、コロイド粒子からなる群から選ばれる活性物質
で標識し、かつ特異抗体を固相に接合して不溶化させ、
かつ被検定物質を含む液体試料を該不溶化抗体へ添加し
、これらの不溶化抗体を該物質と反応させ、かくして得
られた試料に標識抗イディオタイプ抗体を添加して該標
識抗イディオタイプ抗体を反応させ、不溶化抗体に結合
しなかった標識抗イディオタイプ抗体を固相から分離し
、液体試料中の被検定物質の量を、固相に結合した標識
抗イディオタイプ抗体の残留活性の関数として定量する
特許請求の範囲第（１）項記載の検定法。
（１０）特異抗体を放射性同位体、酵素、蛍光色素、コ
ロイド粒子からなる群から選ばれる活性物質で標識し、
かつ抗イディオタイプ抗体を固相に接合させて不溶化し
、かつ被検定物質を含む液体試料を不溶化抗体へ添加し
、これらの不溶化抗体を該物質と反応させ、かくして得
られた試料に該標識特異抗体を添加して該標識特異抗体
を反応させ、不溶化抗体に結合しなかった標識特異抗体
を固相から分離し、かつ液体試料中の被検定物質の量を
、固相に結合した標識特異抗体の残留活性の関数として
定量する特許請求の範囲第（１）項記載の検定法。
（１１）特異抗体を固相に接合させて不溶化し、被検定
物質を含む液体試料を該不溶化抗体へ添加し、該不溶化
抗体を該物質と反応させ、かくして得られた試料に抗イ
ディオタイプ抗体を添加し、該抗イディオタイプ抗体を
反応させ、不溶化抗体に結合しなかった抗イディオタイ
プ抗体を固相から分離し、抗イディオタイプ抗体に対し
て指向される抗体であって、放射性同位体、酵素、蛍光
色素、コロイド粒子からなる群から選ばれる活性物質で
標識されている抗体を該固相へ添加し、これらの標識抗
体を反応させ、抗イディオタイプ抗体に結合しなかった
標識抗体を固相から分離し、かつ液体試料中の被検定物
質の量を、固相に結合した標識抗体の残留活性の関数と
して定量する特許請求の範囲第（１）項記載の検定法。
（１２）固相がポリ塩化ビニルミクロプレート、アガロ
ース、ビーズ、ペーパーディスクまたはセルロースディ
スクでできている特許請求の範囲第（９）項〜第（１１
）項のいずれか１項に記載の検定法。
（１３）未結合抗体の固相からの分離を食塩水で洗浄す
ることによって行う特許請求の範囲第（９）項〜第（１
１）項のいずれか１項に記載の検定法。
（１４）被検定物質を含む液体試料を、標識抗体と共に
、約３７℃の温度で約１分〜１８時間、攪拌しながらプ
レインキュベートする特許請求の範囲第（９）項〜第（
１３）項のいずれか１項に記載の検定法。
（１５）上記反応が被検定物質を含む液体試料の、およ
び特異抗体の、および抗イディオタイプ抗体の、約３７
℃の温度に於て約１５分〜２４時間、攪拌下に於けるイ
ンキュベーションからなる特許請求の範囲第（１）項〜
第（１４）項のいずれか１項に記載の検定法。
（１６）被検定物質が同定のための重要な決定基を１個
だけ含む単純な分子構造の物質である特許請求の範囲第
（１）項〜第（１５）項のいずれか１項に記載の検定法
。
（１７）単純な物質がトリヨードチロニン（Ｔ３）であ
り、特異抗体がマウスの単クローン性抗Ｔ３抗体であり
かつ抗イディオタイプ抗体がマウス単クローン性抗体に
対して指向されるうさぎＩｇＧ抗イディオタイプ抗体で
ある特許請求の範囲第（１６）項記載の検定法。
（１８）単純な物質がチロキシンであり、特異抗体がマ
ウス単クローン性抗Ｔ４抗体であり、かつ抗イディオタ
イプ抗体がマウス単クローン性抗体に対して指向される
うさぎＩｇＧ抗イディオタイプ抗体である特許請求の範
囲第（１６）項記載の検定法。
（１９）被検定物質が同定のための重要な決定基を１個
以上含む複雑な分子構造の物質である特許請求の範囲第
（１）項〜第（１５）項のいずれか１項に記載の検定法
。
（２０）複雑な物質が胎児性癌抗原（ＣＥＡ）であり、
特異抗体がマウス単クローン性抗ＣＥＡ抗体でありかつ
抗イディオタイプ抗体がマウス単クローン性抗体に対し
て指向されるうざぎＩｇＧ抗イディオタイプ抗体である
特許請求の範囲第（１９）項記載の検定法。
（２１）複雑な物質がＩｇＥ免疫グロブリンであり、特
異抗体がマウス単クローン性抗ＩｇＥ抗体であり、かつ
抗イディオタイプ抗体がマウス単クローン性抗体に対し
て指向されるうさぎＩｇＧ抗イディオタイプ抗体である
特許請求の範囲第（１９）項記載の検定法。
（２２）抗イディオタイプ抗体が、ラテックス粒子に結
合されるとき、Ｆ（ａｂ′）、フラグメントで被覆され
たラテックスの懸濁液としてである特許請求の範囲第（
２１）項記載の検定法。
（２３）複雑な物質がアレルゲンであり、特異抗体がヒ
ト抗アレルゲン抗体であり、かつ抗イディオタイプ抗体
がヒト抗体に対して指向されるうさぎＩｇＧ抗イディオ
タイプ抗体であり、かつうさぎＩｇＧに対して指向され
かつ＾１＾２＾５Ｉで標識された抗体を標識抗体として
用いる特許請求の範囲第（１９）項記載の検定法。