KR20140099277A

KR20140099277A - 다중특이적 결합제의 자유 결합 파트너의 검출 방법

Info

Publication number: KR20140099277A
Application number: KR1020147016700A
Authority: KR
Inventors: 카이-군나르 슈튜벤라우흐; 우베 베쎌스
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2014-08-11
Also published as: US20150072359A1; JP6203747B2; CN104040350B; RU2633488C2; WO2013092611A3; MX349003B; US9671394B2; WO2013092611A2; CA2853917A1; BR112014011535A2; HK1201920A1; JP2015502547A; RU2014128510A; CN104040350A; MX2014007095A; EP2795335A2; EP2795335B1

Abstract

본원은, 자유 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 부위와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 부위에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 샘플로부터 다중특이적 항체를 제거하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 다중특이적 항체의 자유 항원의 검출 방법을 보고하고 있다 (이에 의해 검출할 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 부위에 의해 특이적으로 결합할 수 있음).

Description

다중특이적 결합제의 자유 결합 파트너의 검출 방법 {METHOD FOR THE DETECTION OF FREE BINDING PARTNER OF A MULTISPECIFIC BINDER}

본 발명은 샘플 중의 다중특이적 결합제에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 자유, 즉 비(非)-복합, 결합 파트너의 검출 방법에 관한 것이며, 이때 상기 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너는 자유 결합 파트너의 검출 전에 샘플로부터 제거 (deplete) 된다.

항체를 사용하는 표준 고체상 면역검정은 고체상에 흡착/고정화된 항체 (포획 항체), 항원, 및 효소 또는 검출가능 표지와 접합된 항원의 또 다른 에피토프에 대한 항체 (트레이서 항체) 사이의 복합체 형성을 포함한다. 상기 검정에서, 다음과 같은 샌드위치가 형성된다: 고체상/포획 항체/항원/트레이서 항체. 샌드위치에 의해 촉매화되는 반응에서, 다른 것들 중 항체-접합된 효소의 활성은 인큐베이션 배지 중의 항원 농도에 비례한다. 항-유전자형 항체 검정은 예를 들어 US 5,219,730; WO 87/002778; EP 0 139 389; 및 EP 0 170 302 에 언급되어 있다. Wadhwa, M., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) 은 치료용 생물학적 제제에 의해 유도된 원치 않는 항체의 검출, 측정 및 분석에 대한 전략을 보고하고 있다. 항-유전자형 (idiotypic) 항체 제조 방법이 EP 1 917 854 에 보고되어 있다.

Chen, Y.-P., et al. (Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725) 은 인간 적혈구 및 헤파티티스 B 바이러스 표면 항원 둘 모두에 대한 이중특이적 디아바디에 의해 매개되는 응집 검정에 의한 헤파티티스 B 바이러스 표면 항원의 신속한 검출을 보고하고 있다. 암 치료요법을 위한 인간화 이중특이적 단일클론 항체의 분석이 Bruynck, A., et al. (J. Cancer 67 (1993) 436-440) 에 의해 보고되어 있다. WO 2006/096697 에서는 단백질 및 항체 치료제의 2 가성을 측정하는 방법이 보고되어 있다.

발명의 개요

본원은 다중특이적 결합제의 하나 이상의 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 자유, 즉 비-복합, 결합 파트너의 양을 측정하고/하거나 그의 존재를 검출하는 방법을 보고하고 있다. 다중특이적 결합제에 의해 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 즉 결합 파트너-다중특이적 결합제-복합체를, 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 제거하는 것이 유리하다고 발견된 바 있다. 본원에 보고하는 바와 같은 방법에 따른 것은, 다중특이적 결합제의 하나의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 샘플을 인큐베이션하여, 상기 단일특이적 결합제가, 측정할 결합 파트너에 결합하지 않는 다중특이적 결합제의 결합 특이부에 특이적으로 결합하게 함으로써, 얻은 다중특이적 결합제를 제거하는 것이다 (도 2 참조).

본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은, 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 (항원, 표적, 분석물) 의 존재 및/또는 양의 시험관내 (in vitro) 측정 방법이며, 이때 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너는, 샘플을 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션함으로써, 결합 파트너를 검출하기 전에 제거된다.

한 구현예에서 검출할 결합 파트너는 비-복합 결합 파트너 또는 자유 결합 파트너이다.

따라서, 본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은 하기 단계를 포함하는 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 시험관내 방법이며, 이로써 상기 결합 파트너가 다중특이적 결합제의 제 1 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있다:

- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 상기 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 상기 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계, 및

- 다중특이적 결합제-제거 샘플 중의 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 상기 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계,

- 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 단계, 및

다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하여, 다중특이적 결합제가 샘플로부터 제거된다. 부수적으로 또한, 결합 파트너-다중특이적 결합제-복합체가 샘플로부터 제거된다.

한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체, 항체 또는 항체 단편 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 단편 및 펩티드 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드에서 선택된다.

한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적항체, 또는 육중특이적 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체이다.

한 구현예에서 단일특이적 결합제는 항-유전자형 항체이다.

한 구현예에서 결합 특이부 (binding specificity) 는 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 결합 부위 또는 쌍이다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 고체상에 결합한다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 비오틴화되며 고체상은 스트렙타비딘 코팅된다. 한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드이다.

본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은 면역검정을 사용하여 샘플 중의 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양을 면역학적으로 측정하는 방법이며, 이때 상기 다중특이적 결합제는 결합 파트너를 측정하기 전에 샘플로부터 제거된다.

본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양상의 한 구현예에서 결합 파트너는 자유 결합 파트너, 즉 다중특이적 결합제에 의해 결합되거나 복합화되지 않는 결합 파트너이다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 다중특이적 결합제에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체이며 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된다.

본원에서 보고하는 바와 같은 방법의 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 고체상에 접합되는 항체 부위에 있어서 상이한 2 개 이상의 항-유전자형 항체를 포함하는 혼합물이다.

한 구현예에서 항체의 그의 접합 파트너에 대한 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기, 약물 항체의 아미노산 뼈대의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체 혼합물은 2 개 이상의 상이한 아미노기를 통해 고체상에 접합된 항-유전자형 항체를 포함한다. 상이한 아미노기를 통한 이러한 커플링은 제 1 단계에서, 화학적 보호제와 ε-아미노기의 일부의 아실화에 의해, 예를 들어 시트라코닐화에 의해 수행될 수 있다. 제 2 단계에서 접합은 잔류 아미노기를 통해 수행된다. 이후 시트라코닐화를 없애고, 잔류 자유 아미노기를 통해 항체가 고체상에 접합된다 (즉, 수득한 항체가, 시트라코닐화에 의해 보호되지 않은 아미노기를 통해 고체상에 접합됨). 적합한 화학적 보호제는 미보호된 측쇄 아민에서 결합을 형성하며, N-말단에서의 이들 결합과 상이하고 이보다 덜 안정하다. 이러한 많은 화학적 보호제가 공지되어 있다 (예를 들어 EP 0 651 761 참조). 한 구현예에서 화학적 보호제는 시클릭 디카르복실산 무수물 예컨대 말레산 또는 시트라코닐산 무수물을 포함한다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 수동적 흡착에 의해 고체상에 접합된다. 수동적 흡착은 예를 들어, "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 에서 Butler, J.E. 에 의해, 그리고 "Immunoassays" (1996) Academic Press (San Diego) 에서 Diamandis, E.P., 와 Christopoulos, T.K. (편집자) 에 의해 기재된다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 접합 (고정화) 된다. 이러한 결합 쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 은 한 구현예에서 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등에서 선택된다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체가 비오틴에 접합되고, 고정화가 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.

본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은 하기 단계를 포함하는 샘플 중의 다중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시험관내 방법이며, 이로써 검출할 상기 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있다:

- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체 결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 및

- 다중특이적 항체-제거 샘플 중의 항원의 양을 측정하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계,

- 자유 항원의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 항-유전자형 항체-다중특이적 항체-복합체를 제거하는 단계, 및

다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여, 다중특이적 결합제가 샘플로부터 제거된다. 부수적으로 또한, 항원-다중특이적 항체-복합체가 샘플로부터 제거된다.

한 구현예에서 샘플은 다중특이적 항체, 자유 항원 및 다중특이적 항체-항원 복합체를 포함하며 검출은 다중특이적 항체의 자유 항원의 검출이다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 상자성 비드에 접합된다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 고체상에 접합된다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 비오틴화되고 고체상은 스트렙타비딘 코팅된다. 한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드이다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 대해 10⁵l/mol*s 이상의 결합 상수 k_a 를 갖는다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 대해 5*10^-8 mol/l 이하의 K_D 값을 갖는다.

한 구현예에서 결합 특이부는 결합 부위이다. 한 구현예에서 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 한 쌍이다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 것은 약 10 분 내지 약 36 시간 동안이다.

한 구현예에서 샘플은 약 2 μg/ml 내지 약 15 μg/ml 의 다중특이적 항체 농도로 조정된다.

한 구현예에서 샘플은 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정된다.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체-결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계, 및

- 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 샘플로부터 제거하는 단계.

한 구현예에서 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체는 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체 및 항-유전자형 항체-다중특이적 항체-항원 복합체의 혼합물이다.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계,

- 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 샘플로부터 제거하는 단계, 및

- 다중특이적-항체 제거 샘플 중의 항원의 양을 측정하는 단계.

한 구현예에서 항원의 양을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다:

- 다중특이적 항체-제거 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 포획 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계, 및

- 형성된 포획 항체-항원 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.

- 다중특이적 항체-제거 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 포획 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계,

- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체 및 트레이서 항체를 항원 상의 비-중첩 에피토프에 결합시키는 단계, 및

- 형성된 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.

- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체 및 트레이서 항체를 항원 상의 비-중첩 에피토프에 결합시키는 단계,

- 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 검출가능 표지를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여, 검출 항체를 트레이서 항체의 가변 도메인 외부의 에피토프에서 트레이서 항체에 특이적으로 결합시키는 단계, 및

한 구현예에서 다중특이적 항체는 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이부를 가지며 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이부를 갖는 이중특이적 항체이다.

본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은 샘플로부터 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합한 항원을 제거하기 위한, 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체의 용도이다.

발명의 상세한 설명

본원은 전임상 및 임상 샘플 중의 이중특이적 항체/약물과 같은 다중특이적 결합제의 "자유 결합 파트너" 가 검출되도록 샘플을 전처리하기 위한 시험관내 방법을 보고한다.

자유 결합 파트너를 검출하기 전에 샘플로부터 다중특이적 결합제가 제거되어야 한다는 것이 발견되었다.

본원은 다중특이적 치료용 항체의 제 2 의 상이한 결합 특이부에 의해 결합할 수 있으나 결합하지 않는 항원의 수준 측정에 있어서의, 치료용 다중특이적 항체의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체의 용도를 보고한다. 항-유전자형 항체는 다중특이적 항체 및 다중특이적 항체-검출할 항원 복합체를 샘플로부터 제거하는데 사용된다.

따라서, 본원은 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 결합제의 자유 결합 파트너 (항원, 표적, 분석물) 를 측정하기 위한 시험관내 방법을 보고하며, 이때 상기 다중특이적 결합제는, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하며 그로써 다중특이적 결합제 및 다중특이적 결합제-결합 파트너-복합체를 샘플로부터 제거시키는 단일특이적 결합제와 함께 샘플을 인큐베이션함으로써 자유 결합 파트너 측정 전에 샘플로부터 제거된다.

총 항원, 이중특이적 항체-결합 항원 및 자유 항원의 측정은 치료용 항체를 사용하는 치료요법의 모니터링에 유용하다. 총 항원은 자유 및 이중특이적 항체-결합 항원의 합을 나타낸다.

하기에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법을 다중특이적 결합제의 구현예와 동일한 항원 상의 에피토프 또는 항원 다수에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체, 및 결합 파트너의 구현예와 같은 다중특이적 항체의 하나의 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합하는 항원으로 예시한다.

본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조를 포괄하며, 이는 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 항체 단편 (원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한) 을 비제한적으로 포함한다.

특정 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이부를 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이부 중 하나는 제 1 항원에 대한 것이고 다른 하나는 상이한 제 2 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 한 구현예에서 항체는 제 1 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다. 한 구현예에서 이중특이적 항체는 i) 항원 상의 제 1 에피토프 또는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이부, 및 ii) 동일한 항원 상의 제 2 에피토프 또는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이부를 갖는다. 한 구현예에서 동일한 항원 상의 제 2 에피토프는 비-중첩 에피토프이다.

다중특이적 항체는 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793 에 기재되어 있다.

"항체 단편" 은 비손상 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 비손상 항체의 일부를 포함하는 비손상 항체 외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체의 "클래스" 는 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변부의 유형을 지칭한다. 주요 5 개 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (동형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂ 로 더 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 칭한다.

용어 "자유 항원" 은 항체의 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있으나 현재 상기 결합 특이부에 결합하지 않는 항원을 의미한다. 한 구현예에서 자유 항원은 항체 결합 항원이 아니거나 비-항체 복합 항원이다.

본원에서 용어 "Fc-부위" 는 일부 이상의 불변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 자연적 서열 Fc-부위 및 변종 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다. 그러나 Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명기하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변부에서의 아미노산 잔기의 번호화는 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242] 에서 기재한 바와 같이 EU 번호화 시스템 (또한 EU 지표로도 지칭함) 에 따른다.

"골격" 또는 "FR" 은 과가변부 (HVR) 잔기 외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

"인간 항체" 는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 원천에서 유래하거나 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.

"인간화" 항체는 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기 및 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 1 개 이상, 통상 2 개의 가변 도메인 모두를 포함하는데, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어 CDR) 은 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의로는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변부의 일부 이상을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.

본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "과가변부" 또는 "HVR" 은 서열에서 과가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 부위를 지칭한다. 일반적으로 자연적 4 개 사슬 항체는, 3 개는 VH (H1, H2, H3) 에 있고, 3 개는 VL (L1, L2, L3) 에 있는 6 개의 HVR 을 포함한다. HVR 은 일반적으로 과가변 루프 및/또는 "상보성 결정 부위 (CDR)" 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는데, 상보성 결정 부위는 서열 가변성이 가장 높고/높거나 항원 인지에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 아미노산 잔기 50-56, L3 의 아미노산 잔기 89-97, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-65 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). VH 에서의 CDR1 은 제외하고, CDR 은 일반적으로 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이부 결정 잔기 (specificity determining residue)" 또는 "SDR" 을 포함한다. SDR 은 단축-CDR 또는 a-CDR 로 지칭하는 CDR 의 부위 내에 포함된다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 아미노산 잔기 50-55, L3 의 아미노산 잔기 89-96, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-58 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). 다르게 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 상기 Kabat et al. 에 따라 번호화된다.

본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 예를 들어 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하거나 단일클론 항체 제제의 생성 동안 생기는 가능한 변이체 항체 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함) 를 제외하고는, 실질적으로 동종 항체, 즉 동일하고/하거나 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는 개별 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 상이한 결정자 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 통상 포함하는 다클론 항체 제제와 반대로, 단일클론 항체 제제의 단일클론 항체 각각은 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 실질적으로 동종 집단의 항체에서 수득한 바와 같은 항체의 형질을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 이해되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있으며, 단일클론 항체를 생성시키기 위한 이러한 방법 및 기타 예시적 방법이 본원에 기재된다.

용어 "가변부" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 자연적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격부 (FR) 및 3 개의 과가변부 (HVR) 를 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), p 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조).

용어 "항-유전자형 항체" 는 모 항체의 결합 부위와 같은 결합 특이부에 특이적으로 결합하는, 즉 예를 들어 모 항체의 항원 결합 부위에 대해 유도되는 항체를 나타낸다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 모 항체의 하나 이상의 CDR 에 특이적으로 결합한다. 한 구현예에서 모 항체는 치료용 항체이다. 한 구현예에서 모 항체는 다중특이적 항체이다. 한 구현예에서 모 항체는 이중특이적 항체이다.

고정화 항체 및 가용성 항원을 사용하는 (그 반대도 가능) 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정에 의해 50% 이상, 한 구현예에서는 75% 이상의 신호 감소가 검출되는 경우, 2 개의 에피토프가 중첩되는데, 이때 의문의 에피토프는 농도가 20-50 nM 이고 에피토프 중첩이 검출되어야 하는 항체는 농도가 100 nM 이다. 대안적으로는, 동일한 항원에 결합하는 2 개 항체의 에피토프 중첩을 경쟁적 시험 시스템을 사용하여 측정하는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 재조합 항원 에피토프를 발현하는 세포를 이용하는 세포-기반 효소 면역검정 (ELISA) 을 사용하여, 에피토프 중첩이 검출되어야 하는 항체가 고정화된 항원에 대한 결합을 위해 다른 항체와 경쟁하는지를 시험한다. 이러한 목적을 위해, 고정화된 항원을 표지된 형태의 항체 및 에피토프 중첩이 측정되어야 하는 과량의 항체와 함께 인큐베이션한다. 결합한 표지 검출에 의해, 에피토프 중첩을 쉽게 확인할 수 있다. 에피토프 중첩이 측정되어야 하는 항체가 10⁵-배 초과인 경우, 신호 감소가 70% 초과, 한 구현예에서는 80% 초과 (동일 농도에서), 또는 변위 (displacement) 가 80% 초과, 한 구현예에서는 90% 초과 (더 높은 농도에서) 라면, 공지된 항체가 측정되고 에피토프 동일성 또는 중첩이 존재하고 두 항체 모두가 동일하거나 동일한 항원 상의 중첩 에피토프에 결합하는 것으로 언급된다.

상이한 면역검정의 원리는 예를 들어 Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R) 에 의해 기재되어 있다. Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) 은 면역검정에서 사용되는 항체의 지향적 고정화를 보고하고 있다. 아비딘-비오틴-매개 면역검정은 예를 들어 [Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469] 에서 Wilchek, M., 과 Bayer, E.A. 에 의해 보고되어 있다.

단일클론 항체 및 그의 불변 도메인은 결합 파트너, 예컨대 표면, 단백질, 중합체 (예를 들어 PEG, 셀룰로오스 또는 폴리스티롤), 효소, 또는 결합 쌍의 일원에 대한 커플링을 위해 다수의 반응성 측쇄를 단백질로서 포함한다. 항체의 화학적 반응기는 예를 들어 아미노기 (리신, 알파-아미노기), 티올기 (시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카르복실산기 (아스파르트산, 글루탐산) 및 당-알코올기이다. 이러한 방법은 예를 들어 ["Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100] 에서 Aslam M., 과 Dent, A. 에 의해 기재되어 있다.

단백질의 가장 흔한 반응기 중 하나는 아미노산 리신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 항체가 풍부한 리신을 포함한다. 리신 아민은 pH 8.0 초과에서 상당히 양호한 구핵 원자이며 (pK_a = 9.18) 따라서 다양한 시약과 용이하고 깔끔하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 아민-반응성 시약은 리신 및 단백질의 α-아미노기와 주로 반응한다. 반응성 에스테르, 특히 N-히드록시-숙신이미드 (NHS) 에스테르가 그 중에서도 가장 흔하게 이용되는 아민기 개질용 시약이다. 수성 환경에서의 반응에 대한 최적 pH 는 pH 8.0 내지 9.0 이다. 이소티오시아네이트는 아민-개질 시약이며 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 이들은 수용액 중에서 단백질 아민과 반응한다 (최적으로는 pH 9.0 내지 9.5 에서). 알데히드는 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 온화한 수성 조건 하에 반응하여 이민 중간체를 형성한다 (쉬프 (Schiff) 염기). 쉬프 염기는 온화하거나 강한 환원제 (예컨대 나트륨 보로히드라이드 또는 나트륨 시아노보로히드라이드) 로 선택적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합이 유도될 수 있다. 아민을 개질하는데 사용된 기타 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA) 은 2 개의 아민-반응성 무수물 기를 포함하는 이관능성 킬레이트제이다. 이는 단백질의 N-말단 및 ε-아민기와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개방되어, 배위 복합체 중 금속에 단단하게 결합할 수 있는 다가, 금속-킬레이트 암 (arm) 을 생성시킨다.

항체에 있어서 또 다른 통상적인 반응기는 황-함유 아미노산 시스틴 및 이의 환원 생성물 시스테인 (또는 하프 시스틴) 으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은 자유 티올기를 포함하는데, 이는 아민보다 더 친핵성이며 일반적으로 단백질에서 가장 반응성인 관능기이다. 티올은 일반적으로 중성 pH 에서 반응성이며, 따라서 아민의 존재 하에 다른 분자와 선택적으로 커플링될 수 있다. 자유 술프히드릴기가 상대적으로 반응성이기 때문에, 이들 기를 갖는 단백질은 종종 디술피드기 또는 디술피드 결합으로서 그의 산화 형태로 이들 기와 함께 존재한다. 이러한 단백질에서, 반응성 자유 티올을 생성시키기 위해, 디티오트레이톨 (DTT) 과 같은 시약으로의 디술피드 결합의 환원이 필요하다. 티올-반응성 시약은 단백질 상에서 티올기와 커플링되어 티오에테르-커플링된 생성물을 형성하는 것들이다. 이들 시약은 약간 산성에서 중성의 pH 에서 빠르게 반응하며, 따라서 아민기의 존재 하에 선택적으로 반응할 수 있다. 반응성 아미노기를 통해 다수의 술프히드릴기를 도입하는 효율적 방법을 제공하기 위한 트라우트 (Traut) 시약 (2-이미노티올란), 숙신이미딜 (아세틸티오) 아세테이트 (SATA) 및 술포숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트 (술포-LC-SPDP) 와 같은 여러 티올화 가교 시약의 용도가 문헌에서 보고되어 있다. 할로아세틸 유도체, 예를 들어 요오도아세트아미드는 티오에테르 결합을 형성하며 또한 티올 개질을 위한 시약이다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약과의 반응은 요오도아세트아미드와의 반응과 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약간 산성에서 중성의 pH 에서 빠르게 반응한다.

항체에 있어서 또 다른 통상적 반응기는 카르복실산이다. 단백질은 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에 및 C-말단 위치에서 카르복실산 기를 포함한다. 물에서의 카르복실산의 상대적으로 낮은 반응성은 통상 이들 기를 사용하여 단백질 및 기타 생분자를 선택적으로 개질하는 것을 어렵게 한다. 이를 수행하는 경우, 카르복실산 기는 통상 수용성 카르보디이미드를 사용하여 반응성 에스테르로 변환되며 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 같은 친핵성 시약과 반응한다. 아민-함유 시약은 약한 염기성이어서, 리신의 보다 매우 염기성인 ε-아민의 존재 하에 활성화 카르복실산과 선택적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성해야 한다. pH 가 8.0 초과로 상승하는 경우, 단백질 가교가 발생할 수 있다.

나트륨 페리오데이트를 사용하여, 항체에 부착된 탄수화물 부분 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시킬 수 있다. 각각의 알데히드기는 카르복실산에 대해 기재한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 부분이 항체의 결정가능 (crystallizable) 단편 (Fc) 부분에서 대부분 발견되기 때문에, 접합은 항원-결합 부위에서 떨어진 탄수화물의 위치-지정 개질을 통해 이루어질 수 있다. 쉬프 염기 중간체가 형성되어, 나트륨 시아노보로히드라이드 (온화하고 선택적) 또는 나트륨 보로히드라이드 (강함) 수용성 환원제로의 상기 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.

용어 "샘플" 은 비제한적으로, 살아있는 생명체 또는 이전에 살아있던 생명체로부터의 임의 수량의 물질을 포함한다. 이러한 생명체는 비제한적으로, 인간, 마우스, 원숭이, 랫트, 토끼 및 기타 동물을 포함한다. 한 구현예에서 샘플은 원숭이, 특히 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey), 또는 토끼, 또는 마우스 또는 랫트로부터 수득된다. 이러한 물질은 한 구현예에서 개인으로부터의 전혈, 혈청 또는 혈장을 비제한적으로 포함하는데, 이는 임상 업무에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원이다.

용어 "고체상" 은 비-유체 물질을 나타내며, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로 만들어진 입자 (미세입자 및 비드 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 고체상 성분은, "고체상" 이 샘플 중에서 물질과 상호작용하는 것으로 의도되는 하나 이상의 부분을 이의 표면 상에 포함한다는 점에 있어서 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐벳 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 정지성 (stationary) 성분일 수 있거나, 비드 및 미세입자와 같은 비-정지성 성분일 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비-공유 또는 공유 결합을 가능하게 하는 다양한 미세입자를 사용할 수 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어 [Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A], 또는 [Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23] 을 참조한다.

한 구현예에서, 검출가능 표지가 크로모겐 (형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성기, 금속 입자, 또는 합텐, 예컨대 디곡시게닌으로부터 선택된다. 검출가능 표지는 또한 광활성가능 가교기, 예를 들어 아지도 또는 아지린 기일 수 있다. 한 구현예에서, 전기화학발광법에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 신호-방출기이며, 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄 (비스피리딜)₃ ²⁺ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지기는 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138 에 기재되어 있다.

본원은, (자유) 항원의 양을 측정하기 전에 샘플로부터 복합 형태 또는 비-복합 형태인 다중특이적 항체를 제거하기 위한 측정할 (자유) 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체의 결합 특이부가 아닌 다중특이적 항체의 하나의 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 고체상 고정화 항-유전자형 항체를 포함하는 샘플 중의 다중특이적 항체의 (자유) 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 방법을 보고한다.

한 구현예에서 다중특이적 항체-제거 샘플 중의 항원의 존재 및/또는 양의 측정은 항원 브릿지연결 (bridging) 면역검정에 의한 것이다. 한 구현예에서 면역검정은 포획 항체 및 트레이서 항체를 포함하며, 이때 포획물은 고체상에 접합되고, 트레이서 항체는 검출가능 표지에 접합된다.

한 구현예에서 상기 방법은 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 것을 포함한다.

본원에서 보고하는 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 샘플 중의 다중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 시험관내 방법이며, 이로써 검출할 항원은 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있다:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 샘플로부터 다중특이적 항체를 제거하는 단계.

당업자는 항원 및 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 샘플이 평형 열역학으로 인해 자유 항원, 항체-결합 항원 및 자유 항체의 혼합물을 포함한다는 것을 알고 있다.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계, 및

- 샘플로부터 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 제거하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 샘플로부터 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 제거하는 단계, 및

- 다중특이적-항체 제거 샘플 중의 항원 양을 측정하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 단계.

한 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계,

- 다중특이적 결합제-제거 샘플 중의 결합 파트너 양을 측정하는 단계.

한 구현예에서 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 것은 항원 브릿지연결 면역검정에 의한 것이다.

한 구현예에서 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 것은 자유 항원의 양을 측정하는 것이다.

한 구현예에서 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다:

- 형성된 포획 항체-항원 복합체의 양을 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.

한 구현예에서 트레이서 항체는 검출가능 표지를 포함한다.

- 형성된 포획 항체-자유 항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.

한 구현예에서 포획 항체 및 트레이서 항체는 항원 상의 비-중첩 에피토프에 결합한다.

한 구현예에서 항-유전자형 항체 및/또는 포획 항체는 고체상에 접합된다.

본원에 보고하는 바와 같은 방법에서 유용한 항-유전자형 항체 및/또는 포획 항체는 고체상에 접합될 수 있다. 한 구현예에서 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기, 항체의 아미노산 뼈대의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체 및/또는 포획 항체는 고체상에 접합된 2 개 이상의 항체의 혼합물이며, 이때 고체상에 접합된 상기 2 개 이상의 항체는 이들이 고체상에 접합하는 부위에 있어서 상이하다. 예를 들어, 고체상에 접합된 2 개 이상의 항체의 혼합물은 항체의 아미노산 뼈대의 아미노산을 통해 고체상에 접합된 항체 및 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기를 통해 고체상에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 고체상에 접합된 2 개 이상의 항체의 혼합물은 그의 아미노산 뼈대의 상이한 아미노산 잔기를 통해 고체상에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 표현 "상이한 아미노산 잔기" 는 예를 들어 리신 및 아스파르트산, 또는 티로신 및 글루탐산과 같은 2 개의 상이한 종류의 아미노산, 또는 항체의 아미노산 서열에 있어서 그 위치가 상이한 아미노산 뼈대의 2 개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 항체의 아미노산 서열에 있어서 그 위치가 상이한 아미노산 뼈대의 2 개의 아미노산 잔기인 경우, 아미노산은 동일한 종류의 것이거나 상이한 종류의 것일 수 있다. 표현 "항체 부위에 있어서 상이한" 은 부위의 종류 (예를 들어 아미노산 또는 당 알코올기) 에 있어서, 또는 예를 들어 항체가 고체상에 접합되는 아미노산 뼈대의 아미노산 수에 있어서의 차이를 나타낸다. 본원에 보고하는 바와 같은 방법에서 유용한 트레이서 항체에도 또한 동일하게 적용된다.

방법의 한 구현예에서 면역검정은 포획 항체, 트레이서 항체 및 검출 항체를 포함하는데, 이때 포획 항체는 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된 항원에 대한 비오틴화 항체이고, 트레이서 항체는 디곡시게닌에 접합된 항원에 대한 항체이고, 검출 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 접합된 디곡시게닌에 대한 항체이다.

각각 항원 X 또는 항원 Y 의 측정을 위한, 항원 X 및/또는 항원 Y 를 포함하는 샘플로부터 항원 X 및 항원 Y 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로 이루어지는 복합체를 제거하기 위한 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 항원 X 및 항원 Y 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 (항-X/Y 항체) 사이의 복합체의 어셈블리 단계:

일정 농도의 항원 X 를, 제 1 결합 특이부를 갖는 항원 X 에 특이적으로 결합하고 제 2 결합 특이부를 갖는 항원 Y 에 특이적으로 결합하는 증가량의 이중특이적 단일클론 항체 (항-X/Y 항체) 와 함께, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그 후, 상기 샘플을 제거 단계에서 양성 대조군으로서 사용한다.

- 제거 단계:

항-X/Y 항체에 결합한 항원 X 의 제거를 위해, 항원 Y 에 특이적으로 결합하는 결합 특이부에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체 (항-id Y 항체-BI) 를 약 10 μg/ml 에서 자성 스트렙타비딘 코팅 비드 (SA-비드) 에 결합시킨다. 각각의 샘플에 대해, 자성 분리기를 사용하여 600 μl SA-비드를 세척하고 상청액으로부터 분리시킨다. 600 μl 의 비오틴화 항-id Y 항체 함유 용액을 SA-비드와 혼합하고 실온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션한다. 자성 분리기를 사용하여 비드를 3 회 세척하여, 과량의 미결합 항-유전자형 항체를 제거하였다. 그 후, 항-유전자형 항체 코팅 비드를 항-X/Y 항체 및 항원 X 의 복합체를 함유하는 약 250 μl 의 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 상기 혼합물을 약 1 시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 자성 분리기를 사용하여 비드를 샘플로부터 분리시킨다. ELISA 에서 "자유" 항원 X 의 분석을 위해 상청액을 채취한다 (예를 들어 실시예 2 참조). 남아 있는 비드를 ELECSYS 용기에 옮기고, 사용자 가이드의 표준 작동 절차에 따라 ELECSYS 2010 분석기를 사용하여 비드-결합 항원 X (이중특이적 항체-결합 항원 X) 를 분석한다 (예를 들어 실시예 3 참조).

항-X/Y 항체에 결합한 항원 Y 의 제거를 위해, 항원 X 에 특이적으로 결합하는 결합 특이부에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체 (항-id X 항체-BI) 를 약 10 μg/ml 에서 자성 스트렙타비딘 코팅 비드 (SA-비드) 에 결합시킨다. 각각의 샘플에 대해, 자성 분리기를 사용하여 600 μl SA-비드를 세척하고 상청액으로부터 분리시킨다. 600 μl 의 비오틴화 항-id X 항체 함유 용액을 SA-비드와 혼합하고 실온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션한다. 자성 분리기를 사용하여 비드를 3 회 세척하여, 과량의 미결합 항-유전자형 항체를 제거하였다. 그 후, 항-유전자형 항체 코팅 비드를 항-X/Y 항체 및 항원 Y 의 복합체를 함유하는 약 250 μl 의 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 상기 혼합물을 약 1 시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 자성 분리기를 사용하여 비드를 샘플로부터 분리시킨다. ELISA 에서 "자유" 항원 Y 의 분석을 위해 상청액을 채취한다 (예를 들어 실시예 2 참조). 남아 있는 비드를 ELECSYS 용기에 옮기고, 사용자 가이드의 표준 작동 절차에 따라 ELECSYS 2010 분석기를 사용하여 비드-결합 항원 Y (이중특이적 항체-결합 항원 Y) 를 분석한다 (예를 들어 실시예 3 참조).

한 구현예에서 항-유전자형 항체는 10⁵ l/mol*s 이상의 결합 상수 k_a 를 갖는다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 1*10⁵ l/mol*s 이상의 결합 상수를 갖는다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 또한 5*10^-8 mol/l 이하의 K_D 값을 갖는다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 또한 1*10^-9 mol/l 이하의 K_D 값을 갖는다.

한 구현예에서 제거 단계에서의 인큐베이션은 약 5 분 내지 약 36 시간 동안이다. 한 구현예에서 제거 단계에서의 인큐베이션은 약 15 분 내지 약 30 시간 동안이다.

한 구현예에서 샘플은 약 2 μg/ml 내지 약 15 μg/ml 의 다중특이적 항체 농도로 조정된다. 한 구현예에서 샘플은 약 3 μg/ml 내지 약 12 μg/ml 의 다중특이적 항체 농도로 조정된다.

한 구현예에서 샘플은 약 1 pg/ml 내지 약 1 μg/ml 의 총 항원 농도로 조정된다. 한 구현예에서 샘플은 약 10 pg/ml 내지 약 500 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정된다. 한 구현예에서 샘플은 약 100 pg/ml 내지 약 250 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정된다. 한 구현예에서 샘플은 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정된다.

ANG2 및 VEGF 에 대한 이중특이적 항체의 경우, 작용 메커니즘은 두 항원 모두의 상응하는 수용체 상의 결합에 대한 봉쇄이다. 자유 항원 (수용체에 결합할 수 있는) 의 부재 하에, 신호 경로는 저해된다. 자유 항원(들) 과 항체-결합 항원(들) 사이의 차이는 유리한 것이다.

본 발명의 이해를 돕기 위해 하기의 실시예 및 도면을 제공하며, 이의 참된 범주를 첨부된 특허청구범위에서 나타낸다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고, 나타낸 절차에 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.

특정 구현예

1. 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 이때 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너를, 샘플을 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 결합 파트너를 검출하기 전에 제거하는 방법.

2. 면역검정을 사용하는 샘플 중의 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 면역학적 측정 방법으로서, 이때 다중특이적 결합제를, 결합 파트너를 측정하기 전에 샘플로부터 제거하는 방법.

3. 하기 단계를 포함하는 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 결합 파트너가 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 방법:

- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계.

4. 하기 단계를 포함하는 샘플 중 다중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 검출할 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 방법:

5. 항목 3 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 제 2 단계로서 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

- 자유 결합 파트너의 존재 및/또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 단계.

6. 항목 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 최종 단계로서 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

7. 항목 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 결합 파트너가 항원, 표적 및 분석물을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 결합 파트너가 비-복합 결합 파트너 또는 자유 결합 파트너인 것을 특징으로 하는 방법.

10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 결합 특이부가 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 결합 부위 또는 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.

11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 결합제가 항체, 항체 또는 항체 단편 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 단편 및 펩티드 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 결합제가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.

13. 항목 8 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

14. 항목 8 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 항원의 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

15. 항목 8 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 항원의 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

16. 항목 11 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 항체가 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.

17. 항목 11 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.

18. 항목 11 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 항체가 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이부 및 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이부를 갖는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.

19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 단일특이적 결합제가 항-유전자형 항체인 것을 특징으로 하는 방법.

20. 항목 19 에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체-결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계, 및

21. 항목 19 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계,

- 다중특이적-항체 제거 샘플 중 항원의 양을 측정하는 단계.

22. 항목 20 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체가 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체 및 항-유전자형 항체-다중특이적 항체-항원 복합체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.

23. 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 대해 10⁵l/mol*s 이상의 결합 상수 k_a 를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.

24. 항목 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합하기 위해 5*10^-8 mol/l 이하의 K_D 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.

25. 항목 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 것이 약 10 분 내지 약 36 시간 동안인 것을 특징으로 하는 방법.

26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 약 2 μg/ml 내지 약 15 μg/ml 의 다중특이적 항체 농도로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.

27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.

28. 항목 19 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 고체상에 결합 또는 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.

29. 항목 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 특정 결합 쌍을 통해 접합 (고정화) 되는 것을 특징으로 하는 방법.

30. 항목 29 에 있어서, 결합 쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 이 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원, 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

31. 항목 29 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 비오틴에 접합되고 고정화가 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

32. 항목 19 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 비오틴화되고 고체상이 스트렙타비딘 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.

33. 항목 19 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 결합제에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체이고 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.

34. 항목 28 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 고체상이 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드인 것을 특징으로 하는 방법.

35. 항목 19 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 고체상에 접합되는 항체 부위에 있어서 상이한 2 개 이상의 항-유전자형 항체를 포함하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.

36. 항목 19 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체 혼합물이 2 개 이상의 상이한 아미노기를 통해 고체상에 접합된 항-유전자형 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

37. 항목 28 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체의 이의 접합 파트너에 대한 접합이 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신), 및/또는 상이한 리신의 ε-아미노기, 약물 항체의 아미노산 뼈대의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기를 통한 화학적 결합에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

38. 항목 28 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 항-유전자형 항체가 수동적 흡착에 의해 고체상에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.

39. 항목 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 다중특이적 항체, 자유 항원 및 다중특이적 항체-항원 복합체를 포함하고 검출이 다중특이적 항체의 자유 항원의 검출인 것을 특징으로 하는 방법.

40. 샘플로부터 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합한 항원을 제거하기 위한, 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체의 용도.

도 1: 약물-결합 표적 (이중특이적 항체에 결합한 항원) 과 자유 표적 (자유 항원) 사이의 평형
도 2: 이중특이적 항체의 ANG2 결합 특이부에 유도된 항-유전자형 항체 사용에 의한 이중특이적 항-ANG2/VEGF 항체에 결합한 VEGF 의 제거; 이중특이적 항체의 ANG2 결합 특이부에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체는 스트렙타비딘-코팅된 자성-비드에 고정화되고; 이들 자성 비드를 샘플, 예를 들어 혈청 샘플과 함께 인큐베이션한 후, 이중특이적 항-ANG2/VEGF 항체가 결합하고 고정화 항-유전자형 항체에 의해 제거되고; 이중특이적 항체에 결합한 VEGF 가 함께 제거되고; 자유 VEGF (이중특이적 항체에 미결합) 는 혈청 샘플의 상청액 중에 남아 있다.
도 3: VEGF 의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 고정화 항-VEGF 항체를 VEGF 에 결합시키고 또 다른 표지된 항-VEGF 항체로 결합 VEGF 를 검출할 수 있으며; 상기 검정을 사용하여, 제거 후 샘플의 상청액 중의 "자유" VEGF 를 검출하고; c-MET 의 검출을 위해서, 2 개의 항-c-MET 항체를 사용하는 동일한 검정 포맷을 적용하였다.
도 4: 면역 제거 (immuno depletion) 전 및 후 C-MET 수준: 50 ng/ml c-MET 및 증가량의 이중특이적 항-HER3/c-MET 항체를 갖는 샘플에서, 이중특이적 항체의 HER3 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체를 사용하여 이중특이적 항체를 제거하였다; 상기 도해는 ELISA 에 의해 측정된 제거 전 및 후의 c-MET 농도를 나타내고; c-MET 의 수준은 이중특이적 항체의 양에 대해 독립적으로 제거 전과 유사하고; 이중특이적 항체에 결합한 c-MET (약물-결합 표적) 의 제거에 의해 없어지고; 제거 후 검출된 c-MET (자유 c-MET) 농도는 1 ml 당 2 μg 이중특이적 항체의 존재 하에 약 1 ng/ml 이었다.
도 5: 면역 제거에 사용한 여러 항-유전자형 항체의 비교: 이중특이적 항체의 HER3 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 4 개의 항-유전자형 항체를 사용하여 이중특이적 항체-"결합" c-MET 를 제거하였고; 상기 실험을 도 4 에서 기재한 바와 같이 실행하였다; 항체 M2.11.123 을 사용한 제거는 3 개의 다른 항-유전자형 항체를 사용한 것 보다 덜 효율적이었다.
도 6: 제거 후 완충액 및 혈청 샘플의 상청액 중의 VEGF 양: 50 ng/ml VEGF 및 증가량의 이중특이적 항-ANG2/VEGF 항체를 갖는 완충액 및 혈청 샘플을 이중특이적 항체의 ANG2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체로 제거하였다; 면역 제거 전 및 후의 VEGF 농도를 ELISA 에 의해 측정하였다 (도 3); 혈청/혈장 중의 약물-결합 표적의 제거는 검정 완충액에서와 유사하게 효율적이며; 제거 전 이중특이적 항체 농도 의존적 신호 과정은 검정에서 사용한 항-VEGF 항체 중 하나 및 다중특이적 결합제에 의해 특이적으로 결합한 VEGF 상의 에피토프 중첩 및 검정 포맷으로 인한 것이다.
도 7: 스트렙타비딘 비드 상에 고정화된 항-유전자형 항체로의 면역 제거 후 약물-결합 표적의 검출: 분리한 자성 비드를 ELECSYS 2010 분석기에 옮기고; 비드-결합 항-유전자형 항체/이중특이적 항체/VEGF-복합체의 VEGF 를 루테늄-표지된 항-VEGF 항체로 검출하였다.

실시예

실시예 1

약물-결합 표적 (항체-결합 항원) 의 제거 - 이중특이적 약물 분자의 경우

샘플로부터의 항- ANG2 / VEGF 항체- VEGF 복합체의 제거

A) 항-ANG2/VEGF 항체 및 VEGF 의 복합체의 어셈블리

일정한 농도의 VEGF 를, 제 1 결합 특이부로 ANG2 에 특이적으로 결합하고 제 2 결합 특이부로 VEGF 에 특이적으로 결합하는 증가량의 이중특이적 항체 (항-ANG2/VEGF 항체) 와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 이들 샘플을 제거 단계에서/제거 단계에 대해 양성 대조군으로서 사용하였다.

B) 제거 단계

항-ANG2/VEGF 항체에 결합한 VEGF 를 제거하기 위해, ANG2 에 특이적으로 결합하는 결합 특이부에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체 (항-id ANG2 항체-BI) 를 10 μg/ml 에서 자성 스트렙타비딘 코팅 비드 (SA 비드) 에 결합시켰다. 각 샘플에 대해, 자성 분리기를 사용하여 600 μl SA-비드를 세척하고 상청액으로부터 분리시켰다. 약 600 μl 의 항-id ANG2 항체 함유 용액을 SA-비드와 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 자성 분리기를 사용하여 비드를 3 회 세척하여, 과량의 미결합 항체를 제거하였다. 그 후, 항체 코팅 비드를 항-ANG2/VEGF 항체 및 VEGF 의 복합체를 함유하는 250 μl 의 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 1 시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 자성 분리기를 사용하여 비드를 샘플로부터 분리시켰다. ELISA 를 사용하는 "자유" VEGF 의 분석을 위해 상청액을 채취하였다 (실시예 2 참조). 남아 있는 비드를 ELECSYS 용기에 옮기고, 제조사 지시사항에 따라 ELECSYS 2010 분석기를 사용하여 비드-결합 VEGF (항-ANG2/VEGF 항체-결합 VEGF) 를 분석하였다 (실시예 3 참조).

ANG2 결합 특이부에 대해 유도된 2 개의 상이한 항-유전자형 항체를 VEGF 제거에 사용하였다 (또한 실시예 5 참조):

i) 다클론 항-id ANG2 항체 Rb-IgG-BI,

ii) 단일클론 항-id ANG2 항체 M-2.3.55-BI.

샘플로부터의 항- HER3 /c- MET 항체-c- MET 복합체의 제거

A) 항-HER3/c-MET 항체 및 c-MET 의 복합체의 어셈블리

일정한 농도의 c-MET 를, 제 1 결합 특이부로 HER3 에 특이적으로 결합하고 제 2 결합 특이부로 c-MET 에 특이적으로 결합하는 증가량의 이중특이적 항체 (항-HER3/c-MET 항체) 와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 샘플을 항-HER3/c-Met 항체-c-MET 복합체 제거를 위해 비드로 처리하였다.

B) 제거 단계

항-HER3/c-MET 항체에 결합한 c-MET 를 제거하기 위해, HER3 에 특이적으로 결합하는 결합 특이부에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체 (항-id HER3 항체-BI) 를 약 10 μg/ml 에서 자성 스트렙타비딘 코팅 비드 (SA-비드) 에 결합시켰다. 각 샘플에 대해, 자성 분리기를 사용하여 600 μl SA-비드를 세척하고 상청액으로부터 분리시켰다. 약 600 μl 의 항-id HER3 항체 M1.1.10-BI 포함 용액을 SA-비드와 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 자성 분리기를 사용하여 비드를 3 회 세척하여, 과량의 미결합 항체를 제거하였다. 그 후, 항체 코팅 비드를 항-HER3/c-MET 항체 및 c-MET 의 복합체를 함유하는 250 μl 의 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 1 시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 자성 분리기를 사용하여 비드를 샘플로부터 분리시켰다. ELISA 에서 "자유" c-MET 의 분석을 위해 상청액을 채취하였다.

HER3 결합 특이부에 대해 유도된 4 개의 항-유전자형 항체를 항-HER3/c-MET 항체-결합 c-MET 의 제거에 대해 평가하였다 (또한 실시예 4 참조):

i) 단일클론 항-id HER3 항체 M-1.1.10-IgG,

ii) 단일클론 항-id HER3 항체 M-2.11.123-IgG,

iii) 단일클론 항-id HER3 항체 M-2.5.45-IgG,

iv) 단일클론 항-id HER3 항체 M-2.9.55-IgG.

실시예 2

효소 결합 면역흡착 검정

VEGF 검출을 위한 ELISA

시판 샌드위치 면역검정을 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다 (R+D Systems 카탈로그# DVE00).

제거 단계로부터의 상청액 샘플 (실시예 1 참조) 을 10-배 희석하고 사전코팅된 마이크로플레이트 (R+D Systems) 의 웰에 첨가하였다. 샘플에 함유된 자유 VEGF 를 마이크로플레이트의 웰에 코팅된 항-VEGF 항체에 의해 결합시켰다. 실온에서 2 시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 3 회 세척하여 미결합 샘플을 제거하였다. 그 후, 다클론 HRP-결합 항-VEGF 항체 (서양고추냉이 퍼옥시다아제 결합 항-VEGF 항체) 를 웰에 첨가하고 실온에서 추가 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계 후, TMB 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 측정 전에 황산을 첨가하여 색 반응을 중단시켰다 (도 3 참조).

c- MET 검출을 위한 ELISA

시판 샌드위치 면역검정을 사용하였다 (R+D Systems 카탈로그# DY358).

마우스 단일클론 항-c-MET 항체를 인산 완충 식염수 (PBS) 중에서 약 180 μg/ml 의 작동 농도로 희석하였다. 약 100 μl 의 상기 용액을 Nunc Maxisorb 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 포획 항체를 플레이트의 웰에 코팅한 후, 상기 플레이트를 0.05% (w/v) Tween 이 보충된 PBS 로 3 회 세척하고 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 을 포함하는 PBS 로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 샘플 첨가 전에, 플레이트를 PBS 로 3 회 세척하였다.

c-MET 제거 단계로부터의 상청액 (실시예 1 참조) 을 10-배 희석하였다. 약 100 μl 의 각 샘플 희석물 뿐 아니라 일련의 희석된 교정 표준을, 코팅되고 블로킹된 마이크로플레이트의 2 개 웰에 각각 피펫팅하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션한 후, 플레이트를 3 회 세척하여 미결합 샘플을 제거하였다. 그 후, 다클론 비오틴-결합 항-c-MET 항체를 웰에 첨가하고 실온에서 추가 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계 후, 스트렙타비딘-HRP 접합체 (R+D systems) 를 200-배 희석하고, 100 μl 의 상기 용액을 마이크로플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계 후, TMB 기질 용액을 웰에 첨가하고, 측정 전에 황산을 첨가하여 색 반응을 중단시켰다 (도 4 참조).

실시예 3

항원 X 및 항-X/Y 항체의 결합 복합체 검출을 위한 ELECSYS

제거 단계에서 사용한 비드 (실시예 1 참조) 를, ELECSYS 검정 완충액 중에서 자성 분리기를 사용하여 3 회 세척 및 분리시켜, 미결합 물질을 제거하였다. 각 샘플로부터의 비드를 600 μl ELECSYS 검정 완충액에 용해하고 분석을 위해 채취하였다.

170 μl 의 비드를 10 μl 완충액 및 항원 X 에 대한 20 μl 루테늄 표지 항체 (15 μg/ml) 와 함께 15 분 동안 짧게 인큐베이션하였다. SA-비드 상의 항원 X-항-X/Y 항체-항 유전자형 항체의 고정화된 복합체에 결합한 루테늄-표지 항체를 검출하였다 (예를 들어 Stockmann, W., et al., Wien. Klin. Wochenschr. 110 (1998) Suppl. 3:10-21; Forest, J.C., et al., Clin. Biochem. 31 (1998) 81-88 참조).

실시예 4

제거 도구로서의 항-유전자형 항체의 평가

실시예 1 에서 기재한 바와 같은 방법에 따라서, 상이한 반응 속도 상수를 갖는 상이한 항-유전자형 항체를 항-HER3/c-MET 항체 및 이의 복합체의 제거에 사용하였다.

표면 플라즈몬 공명에 의한 항- HER3 /c- MET 항체의 HER3 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체의 반응 속도 상수 평가

모든 측정을, CM5-칩을 사용하여 BIAcore® T100 기기로 수행하였다. 칩의 코팅은 표준 아민 커플링에 의해 수행하였다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 인큐베이션을 HBS-완충액 (HEPES, NaCl, pH 7.4) 중에서 25℃ 에서 수행하였다. 포화량의 다클론 염소 항-마우스 Fc-감마 항체를 아민 커플링에 의해 CM5-칩의 한 플로우 셀 (flow cell) 상에 고정화시켰다. 이후, HER3 에 특이적으로 결합하는, 항-HER3/c-MET 항체 결합 특이부에 대해 유도된 상이한 단일클론 마우스 항체를 30 μl/분의 유량으로 60 초 동안 주입하고 항-마우스 Fc 항체에 의해 결합시켰다. 모든 동물 혈청을 HBS 완충액 중 희석하였다. 30 μl/분의 유량으로 60 초 동안 항-HER3/c-MET 항체를 주입하여 결합 (연관) 을 분석하였다. 180 초 동안 HBS 완충액으로 칩 표면을 세척하여, 해리를 측정하였다. BIAcore® 로부터의 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여, 해리 상수 값 (=k_a; kd; K_D) 을 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 피팅 모델로 계산하였다.

표: SPR-분석에 의해 측정한 항-HER3/c-MET 항체의 HER3 결합 특이부에 대한 여러 항-유전자형 항체의 결합에 대한 반응 속도 매개변수

결과를 또한 도 5 에 나타낸다.

도 5 에서, 단일클론 항-id HER3 항체 M-2.11.123-IgG 로의 항-HER3/c-Met 항체 제거가 다른 항체의 경우만큼 효율적이지 않다는 것을 관찰할 수 있다.

약물-결합 c- MET 의 제거 및 자유 c- MET 의 검출

실시예 1 에서 기재한 바와 같이 항-유전자형 항체를 사용하여 항-HER3/c-MET 항체에 결합한 C-MET 를 제거하였다. 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 상청액을 c-MET ELISA 에서 측정하였다.

실시예 5

인간 혈청 및 완충액 중의 약물 결합 VEGF 제거

실시예 1 에 따라서 항-ANG2/VEGF 항체를 10/5/1/0.5/0.25 및 0 μg/ml 로 희석하고 50 ng/ml 의 일정 농도에서 VEGF 와 함께 인큐베이션하였다. 2 개의 상이한 기질 중에서 희석물을 생성시켰다:

ㆍ 저 교차 완충액 (Low Cross buffer) (Candor Bioscience GmbH, #100500)

ㆍ 인간 풀 (Pool) 혈청 (Trina, NHS Base matrix)

샘플을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플에 대해 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 제거 절차를 수행하였다.

단일클론 항-id ANG2 항체 M-2.3.55-BI 를 사용하여 VEGF 와 항-ANG2/VEGF 항체와의 복합체를 포획하였다.

제거 후, 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 상청액을 VEGF ELISA 에서 측정하였다.

제거 후 상청액의 잔존 VEGF 양을, 어떠한 이중특이적 항체도 없이 인큐베이션한 대조군 샘플 (50 ng/ml) 과 상호관련시켰다. 결과를 상대적 회수율 (%) 로서 하기 표에서 나타낸다.

표: 제거 전 수준과 상호관련된, 면역 제거 후 완충액 및 혈청 샘플의 상청액 중의 상대적 VEGF 양

실시예 6

항- HER3 /c- MET 항체로 나타낸 제거에 대한 자유 항원 농도의 영향 평가

실시예 1 에 따라, 다양한 농도의 c-MET 를 함유하는 샘플 중에서 항-HER3/c-MET 항체 결합 c-MET 의 제거를 수행하였다. 3 개의 상이한 농도의 c-MET (5, 10, 50 ng/ml) 를 증가량의 항-HER3/c-MET 항체와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 1 시간 동안, 그리고 밤새 수행하였다. 그 후, 이들 샘플에서 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 항-HER3/c-MET 항체-c-MET 복합체를 제거하였다.

결과를, 하기 표 a 및 b 에서 스파이킹한 농도로부터의 각 샘플에서의 c-MET 농도 회수율로서 나타낸다.

표 a: 1 시간 인큐베이션하여 제거 후 c-MET 의 회수율 및 약물 (이중특이적 항체) 및 표적 (항원) 의 농도에 대한 의존도

표 b: 밤새 인큐베이션하여 제거 후 c-MET 의 회수율 및 약물 (이중특이적 항체) 및 표적 (항원) 의 농도에 대한 의존도

실시예 7

제거에 대한 VEGF 의 영향

이중특이적 항-ANG2/VEGF 항체를 100 μg/ml 에서 500 μl 시노몰구스 풀 혈장으로 스파이킹하였다. 스파이킹한 혈청을 각각 100 μl 로 5 개 분취액으로 나누었다. 각각의 분취액을 0 ng/ml 내지 100 ng/ml 범위의 상이한 양의 VEGF 로 스파이킹하였다.

샘플을 항-id VEGF 항체 M2.45.51-BI 가 결합한 스트렙타비딘 코팅 자성 세파로오스 비드로 처리하였다. 샘플 및 비드를 주변 온도에서 밤새 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 자성 분리 유닛을 사용하여 자성 비드를 샘플로부터 분리시켰다.

비드-처리/비드 기반 제거 후 상청액 중의 남아 있는 항-ANG2/VEGF 항체 수준을 ELISA 를 사용하여 측정하였다.

ELISA 에서, 비오틴화 VEGF 를 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅 마이크로타이터 플레이트 (SA-MTP) 에 결합시켰다. 과량의 미결합 VEGF 를 세척에 의해 제거하였다. 샘플/표준, 예를 들어 시노몰구스 혈장 중 스파이킹한 항-ANG2/VEGF 항체를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 디곡시게닐화 단일클론 항-인간-Fcγ pan-항체 R10Z8E9 를 검출에 사용하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 결합한 디곡시게닐화 단일클론 항-인간-Fcγ pan-항체 R10Z8E9 를 항-디곡시게닌-항체 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 접합체로 검출하였다. 효소 접합체는 ABTS 기질의 색 반응에 촉매 작용한다. 405 nm 파장 (참조 파장: 490 nm) 에서 ELISA 판독기에 의해 신호를 측정하였다. 각 혈청 샘플의 흡광값을 삼중으로 측정하였다. 결과를 하기 표에서 나타낸다.

표:

상기 표에서 나타낸 바와 같이, 이중특이적 단일클론 항체의 제거는 샘플 중의 제 1 항원 (즉 이 실시예에서와 같은 VEGF) 의 양과는 관계가 없다. 그러므로, 제 2 항원의 양은 자유 제 1 항원 (즉 이 실시예에서와 같은 자유 ANG2) 의 농도 측정에 영향을 갖지 않는다고 결론내릴 수 있다.

이러한 가설에 얽매이는 일 없이, 예를 들어 i) 이중특이적 항체에 대한 제 1 항원의 친화성보다 더 높은 이중특이적 항체에 대한 친화성을 갖는 항-유전자형 항체를 사용하거나, ii) 항원으로서 CDR 의 동일 부분에 결합하지 않는 비-중화 항-유전자형 항체를 사용하여, 제 1 항원에 의한 잠재적 간섭에 대한 견고성을 얻을 수 있다.

Claims

다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 이때 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너를, 샘플을 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 결합 파트너를 검출하기 전에 제거하는 방법.
면역검정을 사용하는 샘플 중의 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 면역학적 측정 방법으로서, 이때 다중특이적 결합제를, 결합 파트너를 측정하기 전에 샘플로부터 제거하는 방법.
하기 단계를 포함하는 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 결합 파트너가 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 방법:
- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계.
하기 단계를 포함하는 샘플 중 다중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정 방법으로서, 검출할 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 방법:
- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체 결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 단계.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 하기 단계를 제 2 단계로서 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 자유 결합 파트너의 존재 및/또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 단계.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 최종 단계로서 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 다중특이적 결합제-제거 샘플 중의 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.
제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계,
- 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 제거하는 단계, 및
- 다중특이적 결합제-제거 샘플 중의 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 파트너가 항원, 표적 및 분석물을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 파트너가 비-복합 결합 파트너 또는 자유 결합 파트너인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 특이부가 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 결합 부위 또는 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 결합제가 항체, 항체 또는 항체 단편 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 단편 및 펩티드 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 결합제가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 다중특이적 항체-제거 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 포획 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.
제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원의 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 다중특이적 항체-제거 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 포획 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계,
- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체 및 트레이서 항체를 항원 상의 비-중첩 에피토프에 결합시키는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.
제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원의 양을 측정하는 것이 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 다중특이적 항체-제거 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 포획 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계,
- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체 및 트레이서 항체를 항원 상의 비-중첩 에피토프에 결합시키는 단계,
- 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 검출가능 표지를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여, 검출 항체를 트레이서 항체의 가변 도메인 외부의 에피토프에서 트레이서 항체에 특이적으로 결합시키는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 상호관련시키는 단계.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이부 및 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이부를 갖는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 결합제가 항-유전자형 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체-결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계, 및
- 샘플로부터 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 제거하는 단계.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이부와 상이한 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하여, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성시키는 단계,
- 샘플로부터 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체를 제거하는 단계, 및
- 다중특이적-항체 제거 샘플 중 항원의 양을 측정하는 단계.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체가 항-유전자형 항체-다중특이적 항체 복합체 및 항-유전자형 항체-다중특이적 항체-항원 복합체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 대해 10⁵l/mol*s 이상의 결합 상수 k_a 를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합하기 위해 5*10^-8 mol/l 이하의 K_D 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체와 함께 인큐베이션하는 것이 약 10 분 내지 약 36 시간 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 약 2 μg/ml 내지 약 15 μg/ml 의 다중특이적 항체 농도로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml 의 총 항원 농도로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 고체상에 결합 또는 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 특정 결합 쌍을 통해 접합 (고정화) 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 결합 쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 이 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원, 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 비오틴에 접합되고 고정화가 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 비오틴화되고 고체상이 스트렙타비딘 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 다중특이적 결합제에 대한 비오틴화 항-유전자형 항체이고 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체상이 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 고체상에 접합되는 항체 부위에 있어서 상이한 2 개 이상의 항-유전자형 항체를 포함하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체 혼합물이 2 개 이상의 상이한 아미노기를 통해 고체상에 접합된 항-유전자형 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체의 이의 접합 파트너에 대한 접합이 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신), 및/또는 상이한 리신의 ε-아미노기, 약물 항체의 아미노산 뼈대의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기를 통한 화학적 결합에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-유전자형 항체가 수동적 흡착에 의해 고체상에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 다중특이적 항체, 자유 항원 및 다중특이적 항체-항원 복합체를 포함하고 검출이 다중특이적 항체의 자유 항원의 검출인 것을 특징으로 하는 방법.
샘플로부터 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이부에 결합한 항원을 제거하기 위한, 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이부에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체의 용도.