MX2014007095A - Metodo para la deteccion del asociado de union libre de un aglutinante multiespecifico. - Google Patents

Abstract

En la presente se reporta un método para la detección del antígeno libre de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, mientras el antígeno a ser detectado puede estar específicamente unido a través de un primer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de incubar una muestra que comprende el antígeno libre y el anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a un segundo sitio de unión del anticuerpo multiespecífico, que es diferente del primer sitio de unión, y por lo tanto agotar el anticuerpo multiespecífico de la muestra.

Description

METODO PARA LA DETECCION DEL ASOCIADO DE UNION LIBRE DE UN AGLUTINANTE MULTIESPECIFICO DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se dirige a un método para la detección de un asociado de unión libre, es decir no en complejo que puede unirse específicamente por un aglutinante multiespecífico en una muestra, en donde el asociado de unión se une al aglutinante multiespecífico se agota de la muestra antes de la detección del asociado de unión libre.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los inmunoensayos con anticuerpos involucran la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado en una fase sólida (anticuerpo de captura) , el antígeno, y un anticuerpo a otro epítopo del antígeno conjugado con una enzima o etiqueta detectable (anticuerpo rastreador) . En el ensayo, se forma un emparedado fase sólida/anticuerpo de captura/antígeno/anticuerpo rastreador. En la reacción catalizada por el emparedado entre otras cosas la actividad de la enzima conjugada al antígeno es proporcional a la concentración del antígeno en el medio de incubación. Se mencionan los ensayos de anticuerpo anti - idiotípicos , por ejemplo, en US 5,219,730; WO 87/002778; EP 0 139 389; y EP Ref. 248165 O 170 302. Wadhwa, M. , y otros (J. Immunol . Methods 278 (2003) 1-17) reportan estrategias para la detección, medición y caracterización de anticuerpos indeseados inducidos por biológicos terapéuticos. Un método para producir anticuerpos anti - idiotípicos se reporta en EP 1 917 854.

Chen, Y.-P., y otros (Clin. Vac . Immunol. 14 (2007) 720-725) reportan la rápida detección del antígeno de superficie del virus de hepatitis B por un ensayo de aglutinación mediado por un diacuerpo biespecífico contra ambos, eritrocitos humanos y antígeno de superficie del virus de hepatitis B virus. La caracterización de un anticuerpo monoclonal biespecífico humanizado para terapia cancerígena se reportan por Bruynck, A., y otros (J. Cáncer 67 (1993) 436-440) . En WO 2006/096697 se reportan métodos para determinar la bivalencia de los terapéuticos de proteína y anticuerpo.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En la presente se reporta un método para la detección de la presencia y/o para la determinación de la cantidad de un asociado de unión libre, es decir no en complejo que puede unirse específicamente a través de al menos una especificidad de unión de un aglutinante multiespecífico . Se ha encontrado que es ventajoso agotar el asociado de unión que está específicamente unido por el aglutinante multiespecífico, es decir el complejo de asociado de unión-aglutinante multiespecífico, de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre. De acuerdo con los métodos como se reportan en la presente es el agotamiento del aglutinante multiespecífico obtenido por la incubación de la muestra con un aglutinante monoespecí ico que específicamente se une a una especificidad de unión del aglutinante multiespecífico , mientras el aglutinante monoespecífico se une específicamente a una especificidad de unión del aglutinante multiespecífico que no se une al asociado de unión a determinar (ver Figura 2) .

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la determinación in vitro de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión (antígeno, objetivo, analito) , que puede unirse específicamente por una primera especificidad de unión de un aglutinante multiespecífico, en donde el asociado de unión unido al aglutinante multiespecífico se agota antes de la detección del asociado de unión mediante la incubación de la muestra con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico .

En una modalidad el asociado de unión a ser detectado es un asociado de unión no en complejo o asociado de unión libre.

De esta forma, un aspecto como se reporta en la presente es un método in vi tro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión de un aglutinante multiespecífico, mientras el asociado de unión puede estar específicamente unido por una primera especificidad del aglutinante multiespecífico, que comprende el paso de : - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad el método comprende los pasos de: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, y - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado.

En una modalidad el método comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre, y - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado.

Con la incubación con el aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico el aglutinante multiespecífico se remueve de la muestra. Concomitantemente también los complejos de asociado de unión-aglutinante multiespecífico se remueven de la muestra.

En una modalidad el aglutinante multiespecífico se selecciona del anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un polipéptido no de anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un receptor soluble, o un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y una molécula de unión peptídica.

En una modalidad el aglutinante multiespecífico es un anticuerpo. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo tetraespecífico, o un anticuerpo pentaespecífico, o un anticuerpo hexaespecífico . En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico .

En una modalidad el aglutinante monoespecífico es un anticuerpo anti - idiotípico .

En una modalidad la especificidad de unión es un sitio de unión o un par de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.

En una modalidad el anticuerpo anti - idiotípico está unido a una fase sólida.

En una modalidad el anticuerpo anti - idiotípico está biotinilado y la fase sólida está recubierta con estreptavidina . En una modalidad la fase sólida es una perla paramagnética cubierta de estreptavidina o una perla de sefarosa cubierta de estreptavidina.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la determinación inmunológica de la presencia y/o cantidad de un asociado de unión de un aglutinante multiespecífico en una muestra utilizando un inmunoensayo, en donde el aglutinante multiespecífico se agota de la muestra antes de la determinación del asociado de unión.

En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en la presente es el asociado de unión el asociado de unión libre, es decir asociado de unión que no está unido o en complejo por el aglutinante multiespecífico .

En una modalidad el anticuerpo anti -idiotípico es un anticuerpo anti- idiotípico biotinilado frente al el aglutinante multiespecífico y se conjuga a una fase sólida vía estreptavidina .

En una modalidad de los métodos como se reportan en la presente el anticuerpo anti-idiotípico es una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos anti-idiotípicos que difieren en el sitio del anticuerpo en el cual se conjugan en la fase sólida.

En una modalidad la conjugación de un anticuerpo a su asociado de unión se lleva mediante la unión química vía grupos N-terminal y/o e-amino (lisina), grupos e-amino de lisinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo- y/o fenólicos de la infraestructura del aminoácido de los grupos de anticuerpo del fármaco y/o alcohol de azúcar de la estructura carbohidratada del anticuerpo del fármaco.

En una modalidad la mezcla del anticuerpo anti-idiotípico comprende el anticuerpo anti-idiotípico conjugado vía al menos dos diferentes grupos amino a la fase sólida. Tal acoplamiento vía diferente grupos amino puede realizarse por acilación de una parte de los grupos e-amino con agentes de protección química, por ejemplo, por citraconilación, en un primer paso. En un segundo paso la conjugación se lleva a cabo vía los demás grupos amino. Después de que se remueve la citraconilación y el anticuerpo se conjuga a la fase sólida vía los demás grupos amino, es decir el anticuerpo obtenido se conjuga con la fase sólida vía grupos amino que no han sido protegidos por citraconilación. Los agentes de protección química adecuados forman enlaces en aminas de cadena lateral desprotegidas y son menos estables que y diferente de esos enlaces en el extremo N-terminal. Muchos agentes de protección química conocen (ver por ejemplo EP 0 651 761) . En una modalidad agentes de protección química incluyen anhídridos de acido dicarboxílico cíclicos como anhídrido de ácido maleico o citraconílico .

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a la fase sólida por adsorción pasiva. La adsorción pasiva es, por ejemplo, descrita por Butler, J.E., en "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 and Diamandis, E.P., and Christopoulos , T.K. (Editors) , en " Immunoassays " (1996) Academic Press (San Diego) .

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga (inmoviliza) vía un par de unión específico. Tal par de unión (primer componente/segundo componente) es una modalidad se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (ver, por ejemplo, Hermanson, G.T., y otros, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) , lectina/polisacárido, proteína de unión de esteroide/esteroide , receptor de hormona/hormona , enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. En una modalidad el anticuerpo anti- idiotípico se conjuga a biotina y la inmovilización se lleva a cabo vía avidina o estreptavidina inmovilizada.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o cantidad de un antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, mientras el antígeno a ser detectado puede estar específicamente unido por una primera especificidad del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, anticuerpo multiespecífico unido al antígeno y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión.

En una modalidad el método comprende los pasos de : - incubar una muestra que comprende el antígeno y anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, and determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado.

En una modalidad el método comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, agotar el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de antígeno libre, y determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado.

Con la incubación con el anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico el anticuerpo multiespecífico se remueve de la muestra. Concomitantemente también los complejos de antígeno-anticuerpo multiespecífico se remueven de la muestra.

En una modalidad la muestra comprende el anticuerpo multiespecífico , el antígeno libre y los complejos de anticuerpo multiespecífico-antígeno y la detección es del antígeno libre del anticuerpo muítiespecífico .

En una modalidad el anticuerpo anti -idiotípico se conjuga a una perla paramagnética .

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a una fase sólida.

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico está biotinilado y la fase sólida está recubierta con estreptavidina . En una modalidad la fase sólida es una perla paramagnética cubierta de estreptavidina o una perla de sefarosa cubierta de estreptavidina.

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico tiene una constante de asociación ka de 105 l/mol*s o más a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico .

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico tiene un valor KD de 5* 10"8 mol/1 o menos para la unión a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico .

En una modalidad la especificidad de unión es un sitio de unión. En una modalidad el sitio de unión es un par de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.

En una modalidad la incubación con el anticuerpo anti-idiotípico es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 36 horas.

En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración del anticuerpo multiespecífico de aproximadamente 2 yg/ml a aproximadamente 15 ug/ml.

En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración total de antígeno de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 250 ng/ml.

En una modalidad el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, antígeno unido al anticuerpo multiespecífico y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico, and remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra.

En una modalidad el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico es una mezcla del complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecí ico y el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico-antígeno .

En una modalidad el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno and anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico, remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado.

En una modalidad la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, and correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno formado con la cantidad del antígeno en la muestra .

En una modalidad la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen al epítopo traslapado en el antígeno, y - correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de capturáantígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen al epítopo traslapado en el antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador con un anticuerpo de detección que comprende una etiqueta detectable, mientras el anticuerpo detector se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo por fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión que específicamente se une al primer antígeno o el primer epítopo en un antígeno y que tiene una segunda especificidad de unión que específicamente se une a un segundo antígeno o a un segundo epítopo en el antígeno.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una primera especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico para el agotamiento del antígeno unido a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico de una muestra.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 - Equilibrio entre el objetivo unido al fármaco (antígeno unido a anticuerpo biespecífico) y objetivo libre (el antígeno libre).

Figura 2 - Agotamiento de la unión VEGF a un anticuerpo anti -ANG2/VEGF biespecífico de un anticuerpo anti-idiotípico dirigido a la especificidad de unión ANG2 del anticuerpo biespecífico; un anticuerpo biotinilado anti-idiotípico frente a la especificidad de unión ANG2 del anticuerpo biespecífico se inmoviliza en perlas magnéticas cubiertas con estreptavidina; después de la incubación de estas perlas magnéticas con una muestra, por ejemplo muestra sérica, el anticuerpo anti-A G2/VEGF biespecífico se une y agota por el anticuerpo anti - idiotípico inmovilizado; VEGF unido al anticuerpo biespecífico se coagota; VEGF libre (no unido al anticuerpo biespecífico) permanece en el sobrenadante de la muestra sérica.

Figura 3 - Emparedado ELISA para la detección de VEGF: Un anticuerpo anti-VEGF inmovilizado y otro anticuerpo anti-VEGF marcado permiten la detección de VEGF unido; el ensayo se utiliza para detectar VEGF "libre" en el sobrenadante de una muestra después del agotamiento; para la detección de c- ET, se aplicó el mismo formato de ensayo utilizando dos anticuerpos anti-c-MET.

Figura 4 - Niveles C-MET antes y después del agotamiento: Muestras con 50 ng/ml de c-MET y una cantidad en aumento del anticuerpo anti- HER3/c- ET biespecífico con un anticuerpo anti - idiotípico que específicamente se une a la especificidad HER3 de unión del anticuerpo biespecífico; el diagrama muestra la concentración de c-MET antes y después del agotamiento determinada por un ELISA; los niveles de c-MET son similares antes del agotamiento independiente de la cantidad de anticuerpo biespecífico; por agotamiento de c-MET - unido a un anticuerpo biespecífico (objetivo unido al fármaco) se remueve; la concentración de c-MET detectada (c-MET libre) después del agotamiento fue de aproximadamente 1 ng/ml en la presencia de 2 microgramos por mi de anticuerpo biespecífico .

Figura 5 - Comparación de varios anticuerpos anti - idiotípicos utilizados para el inmuno-agotamiento: se utilizaron cuatro anticuerpos anti- idiotípicos que específicamente se une a la especificidad de unión HER3 del anticuerpo biespecífico para el agotamiento de c-MET "unido" al anticuerpo biespecífico; el experimento se llevó a cabo como se describe en el Figura 4; el agotamiento con el anticuerpo M2.ll.125 fue menos eficiente que con los otros tres anticuerpos anti - idiotípicos .

Figura 6 - Cantidad de VEGF en el sobrenadante de las muestras de regulador de pH y suero después del agotamiento; se agotaron muestras de regulador de pH y suero con 50 ng/ml de VEGF y una cantidad en aumento del anticuerpo biespecífico anti-ANG2/VEGF con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a las especificidad ANG2de unión del anticuerpo biespecífico; la concentración de VEGF antes y después del inmuno-agotamiento se midieron por un ELISA (Figura 3) ; el agotamiento del objetivo unido al fármaco en suero/plasma es similarmente eficiente como en un regulador de pH de ensayo; la concentración del anticuerpo biespecífico dependiente del curso de la señal antes del agotamiento se debe al formato de ensayo y un traslape de epítopo en VEGF que se une específicamente por el aglutinante multiespecífico y uno de los anticuerpos anti-VEGF utilizado en el ensayo.

Figura 7 - Detección del objetivo unido al fármaco después del inmuno-agotamiento con anticuerpos anti-idiotípicos inmovilizados en perlas de estreptavidina : las perlas magnéticas separadas se transfirieron al analizador ELECSYS 2010; se detectó el VEGF del complejo anticuerpo anti- idiotípico/anticuerpo biespecífico/VEGF unido a las perlas con un anticuerpo anti-VEGF marcado con rutenio.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En la presente se reporta un método in vitro para el pre-tratamiento de una muestra para detectar el "asociado de unión libre" de aglutinantes multiespecífieos , tales como anticuerpos/fármacos biespecífieos , en muestras pre-clínicas y clínicas.

Se ha encontrado que el aglutinante multiespecífico tiene que agotarse de la muestra antes de la detección del asociado de unión libre.

En la presente se reporta el uso de anticuerpos anti-idiotípicos que se unen específicamente a una especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico terapéutico en la determinación del nivel de antígeno que puede pero no está unido por una segunda especificidad de unión diferente del anticuerpo terapéutico multiespecífico .

El anticuerpo anti- idiotípico se utiliza para el agotamiento del anticuerpo multiespecífico y el anticuerpo-antígeno multiespecífico para ser complejos detectados de una muestra.

De esta forma, en la presente se reporta un método para la determinación in vi tro del asociado de unión libre (antígeno, objetivo, analito) de un aglutinante multiespecífico que puede estar específicamente unido por una primera especificidad del aglutinante multiespecífico, en donde el aglutinante multiespecífico se agota de la muestra antes de la determinación del asociado de unión libre mediante la incubación de la muestra con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión y con eso agota el aglutinante multiespecífico y complejos de aglutinante-asociado de unión multiespecíficos de la muestra .

La determinación del total de antígeno, antígeno unido al anticuerpo biespecífico y el antígeno libre es útil para monitorear terapias con anticuerpos terapéuticos. El antígeno total representa la suma de antígeno libre y antígeno unido al anticuerpo biespecífico, En el siguiente método como se reporta en la presente se ejemplifica con un anticuerpo multiespecífico que se une específicamente a una multitud de antígenos o epítopos en el mismo antígeno como la modalidad de un aglutinante multiespecífico y con un antígeno que está específicamente unido por una especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico como la modalidad del asociado de unión.

El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitándose a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos mulitiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo mientras exhiban la actividad de unión a antígeno deseada.

En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico , por ejemplo un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión es para un primer antígeno y el otro es para un segundo antígeno diferente. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos diferentes epítopos del mismo antígeno. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de longitud completa. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un primero y a un segundo antígeno. En una modalidad el anticuerpo biespecífico tiene i) una primera especificidad de unión que específicamente se une al primer antígeno o un primer epítopo en un antígeno, y ii) una segunda especificidad de unión que específicamente se une a un segundo antígeno o un segundo epítopo en el mismo antígeno. En una modalidad el segundo epítopo en el mismo antígeno es un epítopo no de traslape.

Los anticuerpos multiespecíficos se describen en WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, O 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, o WO 2010/145793.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena individual (por ejemplo scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos además pueden dividirse en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGx, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan, d, e, ?, y µ, respectivamente .

El término "antígeno libre" denota el antígeno que puede estar específicamente unido por una especificidad de unión de un anticuerpo pero actualmente no está unido a esta especificidad de unión. En una modalidad el antígeno libre es antígeno no unido al anticuerpo o antígeno en complejo no de anticuerpo.

El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una modalidad, una Fe de región de cadena pesada IgG humana se extiende desde Cys226, o de Pro230, al término carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fe o región constante está de acuerdo con el sistema de numeración de EU, también denominado el índice EU, como se describe en Kabat, E.A. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , Publicación NIH 91-3242.

"Estructura" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable diferente de los residuos de la región hipervariable (HVR, por sus siglas en inglés) . La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2 , FR3 , y FR4. Por consiguiente, las secuencias HVR y FR generalmente aparecen en siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácido que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o célula de humano o se deriva de una fuente no humana que utiliza los repertorios de anticuerpo humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanos y residuos de aminoácido de FR humanos. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a los de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FR corresponden a los de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante del anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.

El término "región hipervariable " o "HVR", como se utiliza en la presente, se refiere a cada una de las regiones de un dominio de anticuerpo variable que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, cuatro anticuerpos de cadena nativos comprenden seis HVR; tres en VH (HI, H2 , H3), y tres en VL (LI, L2 , L3) . Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácido de bucles hipervariables y/o forman las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR, por sus siglas en inglés) , las anteriores siendo la más alta variabilidad de secuencia y/o involucradas en el reconocimiento del antígeno. Los bucles hipervariables ilustrativos ocurren en los residuos de aminoácido 26-32 (LI) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol . 196 (1987) 901-917). Las CDR ilustrativas (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3 , CDR-H1, CDR-H2 , y CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácido 24-34 de Ll, 50-56 de L2 , 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2 , y 95-102 de H3 (Kabat, E.A. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , NIH Publication 91-3242) . Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácido que forman bucles hipervariables . Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad", o "SDR", que son residuos que se ponen en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominados CDR abreviados o a-CDR . Los a-CDR (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácido 31-34 de Ll , 50-55 de L2 , 89-96 de L3, 31-35B de Hl , 50-58 de H2 , y 95-102 de H3 (Almagro, J.C. y Fransson, J., Front . Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que se indique lo contrario, los residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en la presente de acuerdo con Kabat y otros, supra .

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen el mismo epítopo, excepto para posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contiene mutaciones de existencia natural o que surgen durante la producción de la preparación de un anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. En contraste las preparaciones de anticuerpos policlonales , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en un antígeno. De esta forma, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construye como requiriendo la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse mediante una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitándose a el método de hibridoma, métodos de ADN recombinante , método de despliegue de fago, y métodos que utilizan animales transgénicos con todos o una parte del sitio de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros métodos ilustrativos para hacer los anticuerpos monoclonales que se describen en la presente.

El término "región variable" o "dominio variable" se refieren al dominio de una cadena pesada o ligera del anticuerpo que está involucrado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, cada dominio comprende cuatro regiones de estructura conservadas (FR) y res regiones hipervariables (HVR) (ver, por ejemplo, Kindt, T.J. y otros Kuby Immunology, 6a. ed., .H. Freeman y Co., N.Y. (2007), página 91). Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir la especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para clasificar una colección de dominio VL o VH complementarios, respectivamente (ver, por ejemplo, Portolano, S. y otros, J. Immunol . 150 (1993) 880-887; Clackson, T. y otros, Nature 352 (1991) 624-628) .

El término "anticuerpo anti-idiotípico" denota un anticuerpo, que se une específicamente a una especificidad de unión tal como un sitio de unión de un anticuerpo progenitor, es decir que se dirige por ejemplo contra un sitio de unión de antígeno de un anticuerpo progenitor. En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico se une específicamente a una o más de las CDR del anticuerpo progenitor. En una modalidad el anticuerpo progenitor es un anticuerpo terapéutico. En una modalidad el anticuerpo progenitor es un anticuerpo multiespecífico . En una modalidad el anticuerpo progenitor es un anticuerpo biespecífico .

Dos epítopos que se traslapan si una señal de reducción de 50% o más, en una modalidad de 75% o más, se detecta mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) utilizando el anticuerpo inmovilizado y el antígeno soluble, o viceversa, con el epítopo en cuestión a una concentración de 20-50 nM y el anticuerpo con el que se traslapa el epítopo no se ha detectado a una concentración de 100 nM. Alternativamente se puede utilizar un método en donde el epítopo de traslapa de dos anticuerpos que se unen al mismo antígeno que se determina con la ayuda de un sistema de ensayo competitivo. Para este propósito, por ejemplo con la ayuda de un inmunoensayo enzimático a base de célula (ELISA, por sus siglas en inglés) utilizando epítopos de antígeno recombinante que expresan células, se ensayan si el anticuerpo para el cual se traslapa el epítopo que ha sido detectado compite con el otro anticuerpo para la unión con el antígeno inmovilizado. Para este propósito, el antígeno inmovilizado se incuba con el anticuerpo en forma marcada y tiene que determinarse un exceso del anticuerpo con el cual el epítopo se traslapa. Por la detección de la marcación unida puede fácilmente confirmarse el traslape del epí opo. Si una reducción de señal de más de 70%, en una modalidad de más de 80%, a la misma concentración, o a un desplazamiento de más de 80%, en una modalidad de más de 90%, a concentraciones mayores, en un caso con un exceso de más de 105 veces del anticuerpo con el que se traslapa el epítopo tiene que determinarse, referido como un anticuerpo conocido se determinar entonces la identidad del epítopo o si el traslape está presente, y ambos anticuerpos se unen al mismo o un epítopo traslapante en el mismo antígeno.

Los principios de diferentes inmunoensayos se describen, por ejemplo, por Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R) . Lu, B.f y otros (Analyst 121 (1996) 29R-32R) reportan la inmovilización orientada de anticuerpos para el uso en inmunoensayos. Los inmunoensayos mediados por avidina-biotina se reportan, por ejemplo, por Wilchek, M . , y Bayer, E.A., en Methods Enzymol . 184 (1990) 467-469.

Los anticuerpos monoclonales y sus dominios constantes contienen como proteínas un número de cadenas laterales reactivas para el acoplamiento con un asociado de unión, tal como una superficie, una proteína, un polímero (por ejemplo PEG, celulosa o poliestirol ) , una enzima, o un miembro de un par de unión.

Los grupos reactivos químicos de anticuerpos son, por ejemplo, grupos araino (grupos lisinas, alfa-amino) , grupos tiol (cistinas, cisteínas, y metioninas) , grupos de ácido carboxílico (ácidos aspárticos, ácidos glutámicos) , y grupos de azúcar alcohólica. Tales métodos son por ejemplo descritos por Aslam M . , y Dent, A., en "Bioconjugation" , MacMillan Ref . Ltd. 1999, pp . 50-100.

Uno de los grupos reactivos más comunes de proteínas es la e-amina alifática de lisina de aminoácido. En general, casi todos los anticuerpos contienen abundante lisina. Las aminas de lisina son razonablemente buenos nucleófilos por arriba de un pH de 8.0 (pKa = 9.18) y por lo tanto reaccionan fácil y limpiamente con una variedad de reactivos para formar enlaces estables. Los reactivos que reaccionan con amina reaccionan principalmente con lisinas y los grupos a-amino de proteínas.

Los esteres reactivos, particularmente ésteres de N-hidroxi-succinimida (NHS) , están entre los reactivos más comúnmente empleados para la modificación de los grupos amina. El pH óptimo para la reacción en un entorno acuoso es un pH 8.0 a 9.0. Los isotiocianatos son reactivos que modifican aminas y forma enlaces de tiourea con proteínas. Estos reaccionan con proteína aminas en solución acuosa (óptimamente a un pH 9.0 a 9.5) . Los aldehidos reacciona bajo condiciones acuosas ligeras con aminas, hidracinas, e hidracidas alifáticas y aromáticas para formar un intermediario de imina (base Schiff ) . Una base Schiff puede reducirse selectivamente con agentes de reducción ligeros o fuertes (tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio) para derivar un enlace de alquilamina estable. Otros reactivos que han sido utilizados para modificar aminas son los anhídridos ácidos. Por ejemplo, el anhídrido de dietilentriaminapentaacético (DTPA) es un agente quelatador bifuncional que contiene dos grupos anhídridos reactivos con amina. Pueden reaccionar con grupos N-terminal y e -amina de proteínas para formar enlaces amida. Los anillos anhídridos se abren para crear brazos multivalentes , quelatadores de metal para unirse firmemente a los metales en un complejo de coordinación.

Otro grupo reactivo común en anticuerpos es el residuo tiol de azufre con aminoácido cisteína y su producto de reducción cisteína (o media cisteína) . La cisteína contiene un grupo tiol libre, que es más nucleófilo que las aminas y generalmente es el grupo funcional más reactivo en una proteína. Los tioles son generalmente reactivos a un pH neutral, y por lo tanto pueden acoplarse a otras moléculas selectivamente en la presencia de aminas nucleófilas. Debido a que los grupos sulfhidrilo libres son relativamente reactivos, las proteínas con estos grupos por lo general existen con ellas en su forma oxidada como grupos disulfuro o enlaces disulfuro. En tales proteínas, la reducción de los enlaces de disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) es requerida para generar el tiol libre reactivo. Los reactivos que reaccionan tiol son aquellos que se acoplarán a los grupos tiol en proteínas, formando productos acoplados a tioéter. Estos reactivos reaccionan rápidamente a un pH de ácido ligero a neutral y por lo tanto pueden reaccionar selectivamente en la presencia de grupos amina. La literatura reporta que el uso de varios reactivos de entrelazamiento de titulación tales como el reactivo de Traut (2 - iminotiolano) , succinimidil (acetiltio) acetato (SATA, por sus siglas en inglés) , y sulfosuccinimidil 6- [3- ( 2 -piridilditio) propionamido] hexanoato (Sulfo-LC-SPDP) para proporcionar formas eficientes para la introducción de múltiples grupos sulfhidrilo vía grupos amino reactivos. Los derivados de haloacetilo, por ejemplo yodoacetamida, forman enlaces de tioéter y también son reactivos para la modificación del tiol. Los reactivos útiles adicionales son maleimidas. La reacción de las maleimidas con reactivos que reaccionan con tiol es esencialmente igual que con yodoacetamidas . Las maleimidas reaccionan rápidamente a un pH ligeramente ácido a neutral.

Otro grupo reactivo común en anticuerpos son los ácidos carboxílieos . Los grupos de ácido carboxílico que contienen proteínas en la posición C-terminal y dentro de las cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico.

La relativamente baja reactividad de los ácidos carboxílicos en agua usualmente hace difícil utilizar estos grupos para selectivamente modificar proteína y otras biomoléculas . Cuando se hace esto, el grupo de ácido carboxílico usualmente se convierte en un éster reactivo por el uso de una carbodiimida soluble en agua y reacciona con un reactivo nucleofilo tal como una amina, hidracida, o hidracina. El reactivo que contiene la amina deberá ser débilmente básico con el fin de reaccionar selectivamente con el ácido carboxílico activado en la presencia de e-aminas más altamente básicas de lisina para formar un enlace de amida estable. El entrelazamiento de la proteína puede ocurrir cuando el pH se eleva por arriba de 8.0.

Se puede utilizar periodato sódico para oxidar la parte de alcohol de un azúcar dentro de una fracción carbohidratada acoplada a un anticuerpo para un aldehido. Cada grupo aldehido puede reaccionar con una amina, hidracida, o hidracina como se describe para ácidos carboxílicos. Ya que la fracción carbohidratada se encuentra predominantemente en la región del fragmento cristalizable (Fe) de un anticuerpo, la conjugación puede obtenerse a través de modificación dirigida al sitio del carbohidrato lejos del sitio de unión del antígeno. Se forma un intermediario base Schiff, que puede reducirse a una alquilamina a través de la reducción del intermediario con agentes de reducción solubles en agua, cianoborohidruro de sodio (ligero y selectivo) o borohidruro de sodio (fuerte) .

El término "muestra" incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de un organismo vivo u organismo vivo anterior. Tales organismos vivos incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos, y otros animales. En una modalidad la muestra se obtiene de un mono, especialmente un mono cynomolgus, o un conejo, o un ratón o rata. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, en una modalidad sangre entera, suero, o plasma de un individuo que son las fuentes más ampliamente utilizadas de muestras en la rutina clínica.

El término "fase sólida" denota una sustancia no de fluido, e incluye partículas (incluyendo micropartículas y perlas) echas de materiales tales como polímero, metal (partículas paramagnéticas , ferromagnéticas ) , vidrio y cerámica; sustancias en gel tales como geles de sílice, alúmina y polímero; capilares, que pueden hacerse de polímero, metal, vidrio y/o cerámica; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microtitulación; tiras sólidas; y tubos de laboratorio, tubos u otros recipientes de muestras del espectrómetro. Un componente de fase sólida se distingue de las superficies sólidas inertes en que una "fase sólida" contiene al menos una fracción en su superficie, que pretende interactuar con una sustancia en una muestra. Una fase sólida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, tubo de laboratorio, o placa de microtitulación, o pueden ser componentes no estacionarios, tales como perlas y micropartículas . Una variedad de micropartículas que permitan ya sea el acoplamiento no covalente o covalente de las proteínas y otras sustancias pueden utilizarse. Tales partículas incluyen partículas poliméricas tales como poliestireno y poli (metilmetacrilato) ; partículas de oro tales como nanopartículas y coloides de oro; y partículas cerámicas tales como sílice y vidrio, y partículas de óxido metálico. Ver por ejemplo Martin, C.R., y otros, Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, o Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

De los cromógenos (grupos y tintes fluorescentes o luminiscentes), enzimas, grupos activos NMR, partículas metálicas, o haptenos, tales como digoxigenina, la etiqueta detectable se selecciona en una modalidad. La etiqueta detectable también puede ser un grupo de entrelazamiento fotoactivable , por ejemplo un grupo azido o azirina. Los quelatos metálicos que pueden detectarse por electroquimioluminiscencia también son en una modalidad grupos emisores de señal, con preferencia particular dada a quelatos de rutenio, por ejemplo un quelato de rutenio (bispiridilo) 32+ · Los grupos marcadores de rutenio adecuados se describen, por ejemplo en EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511, y WO 92/14138.

En la presente se reporta un método para la determinación de la presencia y/o la cantidad de antígeno (libre) de un anticuerpo multiespecífico en una muestra que comprende un anticuerpo anti -idiotípico inmovilizado de fase sólida que específicamente se une a una especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que no es la especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico que específicamente se une al antígeno (libre) a ser determinado por el agotamiento del anticuerpo multiespecífico , ya sea en forma en complejo o en una forma no en complejo, de la muestra antes de la determinación de la cantidad del antígeno (libre) .

En una modalidad la determinación de la presencia y/o cantidad del antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado es por un inmunoensayo de transición de antígeno. En una modalidad el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo rastreador, en donde la captura se conjuga a una fase sólida, y el anticuerpo rastreador se conjuga a una etiqueta detectable.

En una modalidad el método comprende el agotamiento del complejo de aglutinante monoespecífico- aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, mientras el antígeno a ser detectado puede estar específicamente unido por una primera especificidad del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo muítiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, y consecuentemente remover el anticuerpo multiespecífico de la muestra.

Un experto en la técnica sabe que una muestra que comprende un antígeno y un anticuerpo que específicamente se une al antígeno comprende una mezcla del antígeno libre, el antígeno unido al anticuerpo y el anticuerpo libre debido a termodinámicos de equilibrio.

En una modalidad el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti- idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico, y remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra.

En una modalidad el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y el anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico , remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado.

En una modalidad el método comprende el paso de: agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante muítiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre.

En una modalidad el método comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre, y - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado.

En una modalidad la determinación de la presencia y/o la cantidad del antígeno es por medio de un inmunoensayo de transición de antígeno.

En una modalidad la determinación de la presencia y/o la cantidad del antígeno es la determinación de la cantidad del antígeno libre.

En una modalidad la determinación de la presencia y/o cantidad del antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, y - correlacionar la cantidad del complejo de anticuerpo de captura-antígeno formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad la determinación de la presencia y/o cantidad del antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno , - incubar el complejo de anticuerpo de captúraantígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen al epítopo traslapado en el antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad el anticuerpo rastreador comprende una etiqueta detectable.

En una modalidad la determinación de la presencia y/o cantidad del antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno , - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen al epítopo traslapado en el antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador con un anticuerpo de detección que comprende una etiqueta detectable, mientras el anticuerpo detector se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo por fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y - correlacionar el complejo formado de anticuerpo de captura- antígeno libre-anticuerpo rastreador con la cantidad del antígeno en la muestra.

En una modalidad el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador se unen al epítopo no traslapado en el antígeno.

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico y/o el anticuerpo de captura se conjugan a una fase sólida.

El anticuerpo anti-idiotípico y/o el anticuerpo de captura útiles en un método como se reportan en la presente pueden conjugarse a una fase sólida. La conjugación en una modalidad se realiza por la unión química vía grupos N-terminal y/o e-amino (lisina) , grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo-, y/o fenólicos de la estructura del aminoácido del anticuerpo y/o - grupos de alcohol de azúcar de la estructura carbohidratada del anticuerpo. El anticuerpo anti-idiotípico y/o el anticuerpo de captura en una modalidad es una mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados a una fase sólida, en donde al menos dos anticuerpos conjugados a una fase sólida difieren en el sitio en el cual se conjugan en la fase sólida. Por ejemplo, la mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados a una fase sólida puede comprender un anticuerpo conjugado vía un aminoácido de la estructura del aminoácido del anticuerpo a la fase sólida y un anticuerpo conjugado vía un grupo de alcohol de azúcar de una estructura carbohidratada del anticuerpo a la fase sólida. También, por ejemplo, la mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados a una fase sólida puede comprender anticuerpos conjugados a la fase sólida vía diferentes residuos de aminoácido de sus estructuras del aminoácido. La expresión, "diferente residuo de aminoácido" denota ya sea dos clases diferentes de aminoácidos, tales como por ejemplo lisina y ácido aspártico, o tirosina y ácido glutámico, o dos residuos de aminoácido de la estructura del aminoácido difieren en su posición en la secuencia de aminoácido del anticuerpo. En el último caso el aminoácido puede ser de la misma clase o de clase diferente. En la expresión "difiere en el sitio del anticuerpo" denota una diferencia ya sea en la clase de sitio, por ejemplo aminoácido o grupo de alcohol de azúcar, o en el número de aminoácidos de la estructura del aminoácido, por ejemplo en donde el anticuerpo se conjuga a la fase sólida. Se aplica lo mismo viceversa al anticuerpo rastreador útil en un método como se reporta en la presente.

En una modalidad del método el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura, un anticuerpo rastreador y un anticuerpo detector, en donde el anticuerpo de captura es un anticuerpo biotinilado frente al antígeno conjugado a una fase sólida vía estreptavidina , el anticuerpo rastreador es un anticuerpo frente al antígeno conjugado a digoxigenina , y el anticuerpo detector es un anticuerpo frente a digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano picante.

El método general para el agotamiento de los complejos consiste de anticuerpos biespecífieos que específicamente se unen al antígeno X y al antígeno Y, y de muestras que comprenden el antígeno X y/o antígeno Y para la determinación del antígeno X o antígeno Y, respectivamente, comprende los siguientes pasos: - ensamblar los complejos entre el anticuerpo biespecífico que se une específicamente al antígeno X y al antígeno Y (anticuerpo anti-X/Y) : Una concentración constante del antígeno X se incuba con una cantidad en aumento del anticuerpo monoclonal biespecífico, que se une específicamente al antígeno X con una primera especificidad de unión y que se une específicamente al antígeno Y con una segunda especificidad de unión (anticuerpo anti-X/Y) , a temperatura ambiente por 1 hora. A continuación, esta muestra se utiliza como control positivo en el paso de agotamiento. - paso de agotamiento: Para el agotamiento del antígeno X unido a un anticuerpo anti-X/Y un anticuerpo anti-idiotípico biotinilado frente a la especificidad de unión que se une específicamente al antígeno Y (anticuerpo-BI anti-id Y) se une a perlas cubiertas de estreptavidina magnética (perlas SA) a aproximadamente 10 yg/ml. Para cada muestra, 600 µ? de Perlas-SA se lavaron y separaron del sobrenadante con un separador magnético. Se mezclaron 600 µ? de un anticuerpo biotinilado anti-id Y conteniendo solución con las Perlas-SA e incubaron durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo anti-idiotípico no unido se removió lavando tres veces las perlas con un separador magnético. A continuación, las perlas recubiertas con el anticuerpo anti-idiotípico se incubaron con aproximadamente 250 µ? de una muestra con complejos de anticuerpo anti-X Y y antígeno X. La mezcla se incubó a temperatura ambiente con agitación durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, las perlas se separaron de la muestra con un separador magnético. El sobrenadante se recolectó para análisis de antígeno X "libre" en ELISA (ver por ejemplo el Ejemplo 2) . Las demás perlas se transfirieron a un recipiente ELECSYS y el antígeno unido a las perlas (antígeno unido al anticuerpo biespecífico X) es se analizó con el analizador ELECSYS 2010 de acuerdo con los procedimientos operacionales estándar de la guía del usuario (ver por ejemplo el Ejemplo 3) .

Para el agotamiento del antígeno Y unido a un anticuerpo anti-X/Y un anticuerpo biotinilado anti-idiotípico frente a la especificidad de unión que se une específicamente al antígeno X (anticuerpo-BI anti-id X) se une a perlas recubiertas con estreptavidina magnética (perlas-SA) a aproximadamente 10 µg/ml. Para cada muestra, 600 µ? de Perlas-SA se lavaron y separaron del sobrenadante con un separador magnético. Se mezclaron 600 µ? de un anticuerpo anti-id X biotinilado con solución con las Perlas-SA e incubaron durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo anti-idiotípico sin unir se removió lavando tres veces las perlas con un separador magnético. A continuación, las perlas recubiertas con el anticuerpo anti-idiotípico se incubaron con aproximadamente 250 µ? de una muestra con los complejos del anticuerpo anti-X/Y y el antígeno Y. La mezcla se incubó a temperatura ambiente con agitación durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, las perlas se separaron de la muestra con un separador magnético. El sobrenadante se recolectó para análisis de antígeno Y "libre" en ELISA (ver por ejemplo el Ejemplo 2) . Las demás perlas se transfirieron a un recipiente ELECSYS y el antígeno Y unido a las perlas (antígeno unido al anticuerpo biespecífico Y) se analizó con el analizador ELECSYS 2010 de acuerdo con los procedimientos operacionales estándar de la guía del usuario (ver por ejemplo el Ejemplo 3) .

En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico tiene una constante de asociación ka de 105 l/mol*s o más. En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico tiene una constante de asociación DE 1 * 105 l/mol*s o más. En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico además tiene un valor KD de 5* 10"8 mol/1 o menos. En una modalidad el anticuerpo anti-idiotípico además tiene un valor KD de 1 * 10"9 mol/1 o menos.

En una modalidad la incubación en el paso de agotamiento es de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 36 horas. En una modalidad la incubación en paso de agotamiento es de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 30 horas.

En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración del anticuerpo multiespecífico de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 15 pg/ml . En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración del anticuerpo multiespecífico de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 12 g/ml.

En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración total del antígeno de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración total del antígeno de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 500 ng/ml. En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración total del r antígeno de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 250 ng/ml. En una modalidad la muestra se ajusta a una concentración total del antígeno de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.

En el caso de un anticuerpo biespecífico frente a ANG2 y VEGF el mecanismo de acción se bloquea de ambos antígenos para la unión a sus receptores correspondientes. En ausencia del antígeno libre (capaz de unirse al receptor), la trayectoria de señal se inhibe. Una diferenciación entre el antígeno libre (s) y el (los) antígeno (s) unido al anticuerpo es ventajosa.

Los siguientes ejemplos y figuras son provistos para ayudar en el entendimiento de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se determina en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos determinados sin apartarse del espíritu de la invención.

Modalidades Específicas 1. Un método para la determinación in vitro de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión, que puede unirse específicamente por una primera especificidad de unión de un aglutinante multiespecíf ico, en donde el asociado de unión unido al aglutinante multiespecíf ico se agota antes de la detección del asociado de unión mediante la incubación de la muestra con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico . 2. Un método para la determinación inmunológica de la presencia y/o cantidad de un asociado de unión de un aglutinante multiespecífico en una muestra utilizando un inmunoensayo, en donde el aglutinante multiespecí fico se agota de la muestra antes de la determinación del asociado de unión. 3. Un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión de un aglutinante multiespecífico , mientras el asociado de unión puede estar específicamente unido por una primera especificidad del aglutinante multiespecífico , que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión. 4. Un método in vitro para la determinación de la presencia y/o cantidad de un antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, mientras el antígeno a ser detectado puede estar específicamente unido por una primera especificidad del anticuerpo multiespecífico, que comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico, anticuerpo unido al anticuerpo multiespecífico y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico, que es diferente de la primera especificidad de unión. 5. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 3 to 4, caracterizado porque además comprende como segundo paso el paso de: - agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión libre. 6. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 3 a 5, caracterizado en que comprende como paso final : - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado. 7. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 2 a 6, caracterizado en que comprende los siguientes pasos : incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre, y - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante mul iespecífico agotado. 8. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 7, caracterizado en que el asociado de unión se selecciona del grupo que comprende antígeno, objetivo, y analito . 9. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8, caracterizado en que el asociado de unión es el asociado de unión no en complejo o el asociado de unión libre. 10. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 9, caracterizado en que la especificidad de unión es un sitio de unión o un par de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. 11. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 10, caracterizado en que el aglutinante multiespecífico se selecciona del anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un polipéptido no de anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un receptor soluble, o un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y una molécula de unión peptídica. 12. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 11, caracterizado en que el aglutinante multiespecífico es un anticuerpo. 13. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 8 a 12, caracterizado en que la determinación de la presencia y/o la cantidad del antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, y - correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno formado con la cantidad del antígeno en la muestra . 14. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 8 a 13, caracterizado en que la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno , - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador que se une al epítopo no traslapado en el antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra. 15. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 8 a 1 , caracterizado en que la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra con el anticuerpo muítiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno , - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador que se une al epítopo no traslapado en el antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador con un anticuerpo de detección que comprende una etiqueta detectable, mientras el anticuerpo detector se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo por fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra. 16. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 11 a 15, caracterizado en que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo tetraespecífico, o un anticuerpo pentaespecífico , o un anticuerpo hexaespecífico . 17. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 11 a 16, caracterizado en que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico . 18. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 11 a 17, caracterizado en que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión que específicamente se une al primer antígeno o primer epítopo en un antígeno y que tiene una segunda especificidad de unión que específicamente se une al segundo antígeno o a un segundo epítopo en el antígeno. 19. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 18, caracterizado en que el aglutinante monoespecífico es un anticuerpo anti- idiotípico . 20. El método de acuerdo con el punto 19, caracterizado en que el método comprende los siguientes pasos : - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico , antígeno unido al anticuerpo multiespecífico y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico, y remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra. 21. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 20, caracterizado en que el método comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico, remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y - determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado. 22. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 20 a 21, caracterizado en que el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico es una mezcla del complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico y el complejo de anticuerpo anti- idiotí ico-anticuerpo-antígeno multiespecífico . 23. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 22, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico tiene una constante de asociación ka de 105 l/mol*s o más para la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico . 24. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 23, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico tiene un valor KD de 5* 10"8 mol/1 o menos para la unión a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico . 25. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 24, caracterizado en que la incubación con el anticuerpo anti-idiotípico es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 36 horas. 26. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 25, caracterizado en que la muestra se ajusta a una concentración del anticuerpo multiespecífico de aproximadamente 2 g/ml a aproximadamente 15 pg/ml . 27. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizado en que la muestra se ajusta a una concentración total del antígeno de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 250 ng/ml. 28. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 27, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico se une o conjuga a una fase sólida. 29. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 28, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga (inmoviliza) vía un par de unión específico. 30. El método de acuerdo con el punto 29, caracterizado en que el par de unión (primer componente segundo componente) se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina , anticuerpo/antígeno, lectina/polisacárido, proteína de unión de esteroide/esteroide , receptor de hormona/hormona, enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G. 31. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 29 a 30, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a biotina y la inmovilización se lleva a cabo vía avidina o estreptavidina inmovilizada. 32. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 31, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico está biotinilado y la fase sólida está recubierta con estreptavidina. 33. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 31, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo anti - idiotípico biotinilado frente al aglutinante multiespecífico y se conjuga a una fase sólida vía estreptavidina. 34. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 28 a 33, caracterizado en que la fase sólida es una perla paramagnética cubierta de estreptavidina o una perla de sefarosa cubierta de estreptavidina. 35. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 34, caracterizado en que el anticuerpo ant i - idiot ípico es una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos anti - idiotípicos que difieren en el sitio del anticuerpo en el cual se conjugan en la fase sólida. 36. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 19 a 35, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico mixture comprende el anticuerpo anti-idiotípico conjugado vía al menos dos diferentes grupos amino to la fase sólida. 37. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 28 a 36, caracterizado en que la conjugación de el anticuerpo anti-idiotípico a su asociado de unión se lleva mediante la unión química vía grupos N-terminal y/o e-amino (lisina) , y/o grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo- y/o fenólicos de la estructura del aminoácido del anticuerpo fármaco, y/o grupos de alcohol de azúcar de la estructura carbohidratada del anticuerpo fármaco. 38. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 28 a 37, caracterizado en que el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a la fase sólida por adsorción pasiva . 39. El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 38, caracterizado en que la muestra comprende anticuerpo multiespecífico, el antígeno libre y los complejos de anticuerpo-antígeno multiespecífico y la detección es del antígeno libre del anticuerpo multiespecífico . 40. El uso de un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una primera especificidad de unión de un anticuerpo multiespecíf ico para el agotamiento del antígeno unido a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico de una muestra.

Ej emplos Ejemplo 1 Agotamiento del objetivo unido al fármaco (antígeno unido al anticuerpo) - en casos de moléculas de fármaco biespecíficas .

Agotamiento de complejos de anticuerpo anti-ANG2/VEGF-VEGF de una muestra A) Ensamble de complejos de anticuerpo anti-ANG2/VEGF y VEGF Una concentración constante de VEGF se incubó con una cantidad en aumento del anticuerpo biespecífico que se une específicamente a A G2 con una primera especificidad de unión y que se une específicamente a VEGF con una segunda especificidad de unión (anticuerpo anti -A G2 /VEGF) a temperatura ambiente por 1 hora. A continuación, estas muestras se utilizaron como controles positivos para/en el paso de agotamiento.

B) Paso de Agotamiento Para el agotamiento del VEGF unido a un anticuerpo anti -ANG2/VEGF se unió un anticuerpo biotinilado anti - idiotípico frente a la especificidad de unión que se une específicamente a ANG2 (anti-id ANG2 ant icuerpo-BI ) en perlas recubiertas con estreptavidina magnéticas (perlas SA) 10 g/ml. Para cada muestra, se lavaron y separaron 600 µ? de Perlas-SA del sobrenadante con un separador magnético. Aproximadamente 600 µ? de un anticuerpo anti-id ANG2 con solución se mezclaron con las Perlas-SA e incubaron por 1 h a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo no unido se eliminó lavando 3 veces las perlas con un separador magnético. Después, las perlas cubiertas con el anticuerpo se incubaron con 250 µ? de muestras con complejos de anticuerpo anti-A G2/VEGF y VEGF. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación por 1 hora. Después de la incubación, las perlas se separaron de la muestra con un separador magnético. Se recolectó el sobrenadante para análisis de VEGF "libre" utilizando un ELISA (ver Ejemplo 2) . Las demás perlas se transfirieron a un recipiente ELECSYS y VEGF unido a las perlas (VEGF unido al anticuerpo anti-A G2/VEGF) se analizó con el analizador ELECSYS 2010 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Ejemplo 3) .

Dos diferentes anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra la especificidad de unión ANG2 se utilizaron para el agotamiento de VEGF (ver también Ejemplo 5) : i) anticuerpo policlonal anti-id A G2 Rb-IgG-BI, ii) anticuerpo monoclonal anti-id A G2 M-2.3.55- BI .

Agotamiento de complejos de anticuerpo-c-MET anti -HER3/c-MET de una muestra A) Ensamble de complejos de anticuerpo anti-HER3/c-MET y c-MET Una concentración constante de c-MET se incubó con cantidades en aumento de anticuerpo biespecífico que se une específicamente to HER3 con una primera especificidad de unión y que se une específicamente a c-MET con una segunda especificidad de unión (anticuerpo anti-HER3/c-MET) a temperatura ambiente por 1 hora. Después, esta muestra se trató con perlas para el agotamiento de complejos del anticuerpo-c-MET anti-HER3/c-Met .

B) Paso de agotamiento Para el agotamiento del c-MET unido anticuerpo un anti-HER3/c-MET, se unió un anticuerpo biotinilado anti-idiotípico frente a la especificidad de unión que se une específicamente a HER3 (anticuerpo-BI anti-id HER3 ) en perlas recubiertas con estreptavidina magnéticas (perlas-SA) a aproximadamente 10 g/ml. Para cada muestra, se lavaron y separaron 600 µ? de Perlas-SA del sobrenadante con un separador magnético. Aproximadamente 600 µ? de un anticuerpo anti-id HER3 M1.1.10-BI que comprende solución se mezclaron con las Perlas-SA e incubaron por 1 h a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo no unido se eliminó lavando 3 veces las perlas con un separador magnético. Después, las perlas cubiertas con el anticuerpo se incubaron con 250 µ? de muestras con complejos de anticuerpo anti-HER3/c-MET y c-MET. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación por 1 hora. Después de la incubación, las perlas se separaron de la muestra con un separador magnético. Se recolectó el sobrenadante para análisis de c-MET "libre" en ELISA.

Se evaluaron cuatro anticuerpos anti - idiotípicos dirigidos contra la especificidad de unión para el agotamiento del c-MET unido al anticuerpo anti -HER3/c-MET (ver también Ejemplo 4) : i) anticuerpo monoclonal anti-id HER3 M-l.1.10- IgG, ii) anticuerpo monoclonal anti-id HER3 M-2.11.123-IgG, iii) anticuerpo monoclonal anti-id HER3 M-2.5.45-IgG, iv) anticuerpo monoclonal anti-id HER3 M-2.9.55- IgG.

Ejemplo 2 Ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima ELISA para la detección de VEGF Se había utilizado un inmunoensayo de emparedado comercialmente disponible de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R+D Systems Cat# DVEOO) .

La muestra del sobrenadante del paso de agotamiento (ver Ejemplo 1) se diluyó 10 veces y agregó a las cavidades de una microplaca pre-cubierta (R+D Systems) . El VEGF libre contenido en la muestra se unió por el anticuerpo anti-VEGF recubierto en las cavidades de la microplaca. Después de 2 horas de tiempo de incubación a temperatura ambiente, la muestra no unida se removió lavando tres veces la placa. Después, se agregó un anticuerpo anti-VEGF unido a HRP policlonal (anticuerpo anti-VEGF unido a peroxidasa de rábano picante) a las cavidades y se incubó por otras 2 horas a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado, se agregó la solución del sustrato TMB a las cavidades. La reacción de color se detuvo por la adición de ácido sulfúrico antes de la medición (ver Figura 3) .

ELISA para la detección de c-MET Se utilizó un inmunoensayo de emparedado comercialmente disponible (R+D Systems Cat# DY358) .

Se diluyó un anticuerpo monoclonal anti -c-MET de ratón a aproximadamente 180 g/ml en salina regulada en pH con fosfato (PBS) . Se midieron con pipeta aproximadamente 100 µ? de esta solución en cada cavidad de una placa Nunc Maxisorb e incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después de recubrir las cavidades del placa con el anticuerpo de captura, la placa se lavó tres veces con PBS suplementado con 0.05% (p/v) de Tween y bloqueó con PBS que comprende 1% (p/v) de albúmina de suero de bovino (BSA) por 1 hora a temperatura ambiente. Antes de la adición de las muestras, la placa se lavó 3 veces con PBS .

El sobrenadante del paso de agotamiento de c-MET (ver Ejemplo 1) se diluyó 10 veces. Se midieron con pipeta aproximadamente 100 µ? de cada dilución de muestra así como una serie de estándares de calibración diluidos en 2 cavidades de la microplaca cubierta y bloqueada e incubaron por 1 hora a temperatura ambiente .

Después de la incubación la muestra no unida se removió lavando tres veces la placa. Después, se agregó un anticuerpo anti-c-MET enlazado a biotina policlonal a las cavidades e incubó por otras 2 horas a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado, se diluyó el conjugado de estreptavidina-HRP (R+D systems) 200 veces y se midieron con pipeta 100 µ? de esta solución en cada cavidad de la microplaca y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado, se agregó la solución de sustrato TMB a las cavidades y se detuvo la reacción de color por la adición de ácido sulfúrico antes de la medición (ver Figura 4) .

Ejemplo 3 ELECSYS para la detección de complejos unidos del antígeno X y el anticuerpo anti-X/Y Las perlas utilizadas en el paso de agotamiento (ver ejemplo 1) se lavaron y separaron con un separador magnético 3 veces en regulador de pH de ensayo ELECSYS para remover las sustancias no unidas. Las perlas de cada muestra se disolvieron en 600 µ? de regulador de pH de ensayo ELECSYS y se recolectaron para análisis.

En resumen, 170 µ? de las perlas se incubaron con 10 µ? de regulador de pH y 20 µ? de anticuerpo marcado con rutenio frente al antígeno X (15 µg/ml) por 15 minutos. El anticuerpo marcado con rutenio se unió al complejo inmovilizado del antígeno X-anticuerpo anti-X/Y- anticuerpo anti - idiotípico en Perlas-SA se detectó (ver por ejemplo Stockmann, W. , y otros, Wien. Klin. Wochenschr. 110 (1998) Suppl . 3: 10-21; Forest, J.C., y otros, Clin. Biochem. 31 (1998) 81-88) .

Ejemplo 4 Evaluación de anticuerpos anti - idiotípicos como herramientas para el agotamiento De acuerdo con el método como se describe en el Ejemplo 1, se utilizaron diferentes anticuerpos anti-idiotípicos con diferentes constantes cinéticas para el agotamiento del anticuerpo anti-HER3/c-MET y sus complejos.

Evaluación de las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-idiotípicos que específicamente se unen la especificidad de unión HER3 del anticuerpo ant i -HER3/c-MET por resonancia de plasmón de superficie Todas las mediciones se realizaron con el instrumento BIAcore® T100 utilizando un chip CM5. El revestimiento del chip se obtuvo por acoplamiento de amina estándar. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizaron en HBS - regulador de pH (HEPES, NaCl, pH 7.4) a 25°C. Una cantidad de saturación de un anticuerpo Fc-gamma anti-ratón de cabra policlonal se inmovilizó por acoplamiento de amina en una célula de flujo del chip CM5. Posteriormente, los anticuerpos de ratón monoclonales diferentes dirigidos contra la especificidad de unión del anticuerpo anti-HER3/c-MET, que se une específicamente a HER3 , se inyectaron por 60 segundos a una velocidad de flujo de 30 µ?/min y se unieron por el anticuerpo Fe anti-ratón. Todo el suero del animal se diluyó en Regulador de pH HBS. La unión (asociación) se analizó por inyección del anticuerpo anti-HER3/c-MET por 60 segundos a una velocidad de flujo de 30 µ?/min. La disociación se midió lavando la superficie del chip con regulador de pH HBS por 180 segundos. Utilizando el Software BIAevaluat ion de BIAcore® los valores constantes de disociación (=ka; kd; KD) se calcularon con un modelo de adaptación Langmuir a 1:1.

Tabla : Parámetros cinéticos para la unión de varios anticuerpos anti-idiotípicos frente a la especificidad de unión HER3 del anticuerpo anti-HER3/c-MET determinados por el análisis SPR.

Los resultados también se muestran en la Figura 5.

Se puede ver de la Figura 5 que el agotamiento del anticuerpo anti-HER3/c-Met con el anticuerpo monoclonal anti-id HER3 M-2.11.123 - IgG no es efectivo como con otros anticuerpos.

Agotamiento de c-Met unido al fármaco y detección de c-MET libre C-MET unido al anticuerpo unti-HER3/c-MET se agotó utilizando anticuerpos anti - idiotípicos como se describe en el Ejemplo 1. El sobrenadante se midió en c-MET ELISA como se describe en Ejemplo 2.

Ejemplo 5 Agotamiento de VEGF unido al fármaco en suero humano y regulador de pH De acuerdo con el Ejemplo 1 anticuerpo anti-A G2/VEGF se diluyó a 10/5/1/0.5/0.25 y 0 yg/ml e incubó con VEGF a una concentración constante de 50 ng/ml . Las diluciones se generaron en dos diferentes matrices: • regulador de pH de cruce bajo (Candor Bioscience GmbH , #100500) • Suero del Grupo Humano (Trina, matriz Base NHS) Las muestras se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora. Después, las muestras se agotaron como se describe en Ejemplo 1.

El anticuerpo anti- id A G2 M-2.3.55-BI monoclonal se utilizó para capturar complejos de VEGF con el anticuerpo anti -ANG2/VEGF .

Después del agotamiento el sobrenadante se midió en ELISA VEGF como se describe en Ejemplo 2.

La cantidad de VEGF residual del sobrenadante después del agotamiento se fijó con relación a la muestra de control (50 ng/ml) incubado sin ningún anticuerpo biespecíf ico . Los resultados se muestran en la siguiente Tabla como recuperación relativa en %.

Tabla ; Cantidad de VEGF relativa en el sobrenadante de regulador de pH y muestras séricas después del inmuno-agotamiento de determinó con relación a los niveles antes del agotamiento. influencia concentración del antígeno libre en el agotamie to mostrado con el anticuerpo anti -HER3 /c -MET De acuerdo con el Ejemplo 1 el agotamiento del anticuerpo ant i -HER3 /c -MET unido a c-MET se llevó a cabo en muestras con varias concentraciones de c-MET. Se incubaron tres diferentes concentraciones de c-MET (5, 10, 50 ng/ml) se incubaron con una cantidad en aumento del anticuerpo ant Í-HER3 /c-MET a temperatura ambiente. La incubación se realizó por 1 hora y durante la noche. Después, en estas muestras se agotaron los complejos de anticuerpo c-MET ant i -HER3 /c -MET como se describe en Ejemplo 1.

Los resultados se muestran como la recuperación de las concentraciones de c-MET en cada muestra de la concentración ajustada en las siguientes Tablas a y b.

Tabla a: Recuperación de c-MET después del agotamiento con un tiempo de incubación de una hora y dependencia en la concentración del fármaco (anticuerpo bi e spec í f i co ) y objetivo (antígeno) .

Tabla b; La recuperación de c-MET después del agotamiento con tiempo de incubación nocturno y dependencia en la concentración del fármaco (anticuerpo biespecíf ico) y objetivo (antígeno) .

Ejemplo 7 Influencia de VEGF en el agotamiento El anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico se ajustó a 500 µ? de plasma del grupo cynomolgus a 100 yg/ml. El suero ajustado se dividió en 5 alícuotas con 100 µ? cada una. Cada alícuota se ajustó con diferentes cantidades de VEGF en el intervalo de 0 ng/ml a 100 ng/ml.

Las muestras se procesaron con perlas de sefarosa magnéticas recubiertas con estreptavidina con el anticuerpo M2.45.51-BI anti-id VEGF unido. Las muestras y perlas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente.

Después de la incubación, las perlas magnéticas se separaron de la muestra con una unidad de separación magnética .

El nivel de anticuerpo anti-A G2/VEGF restante en el sobrenadante después del tratamiento de perlas/agotamiento de base de perlas se determinó utilizando un ELISA.

En el ELISA, el VEGF biotinilado se unió a placas de microt itulación recubiertas con estreptavidina (SA-MTP) en el primer paso. El exceso de VEGF unido se removió por lavado. Las muestras/estándares, por ejemplo el anticuerpo anti-A G2/VEGF ajustado en plasma de cynomolgus, se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se utilizó el anticuerpo R10Z8E9 Fcy pan anti- humano monoclonal digoxigenilado para la detección y se incubó por 1 hora. Después del lavado el anticuerpo R10Z8E9 Fcy pan anti-humano monoclonal digoxigenilado unido se detectó con un conjugado peroxidasa de rábano picante anticuerpo anti -digoxigenina (HRP) . El conjugado de enzima cataliza la reacción de color del sustrato ABTS . La señal se midió por medio de un lector ELISA a 405 nm de longitud de onda (longitud de onda de referencia: 490 nm) .

Los valores de absorbencia de cada muestra sérica se determinaron por triplicado. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla.

Tabla: Como se muestra en la Tabla anterior, el agotamiento del anticuerpo biespecífico monoclonal es independiente de la cantidad del primer antígeno (es decir VEGF como en este ejemplo) en la muestra. Por consiguiente, puede concluirse que la cantidad del segundo antígeno no tiene influencia en la determinación de la concentración el primer antígeno libre (es decir A G2 libre como en este ej emplo) .

Sin desear estar unido por esta teoría la fuerza de las interferencias potenciales por medio del primer antígeno puede obtenerse por ejemplo i) utilizando un anticuerpo anti - idiotípico con una mayor afinidad al anticuerpo biespecífico que la afinidad del primer antígeno al anticuerpo biespecífico, o ii) por el uso de un anticuerpo anti-idiotípico no neutralizante que no se une a la misma parte de las CDR como el antígeno.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (40)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para la determinación in vitro de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión, que puede unirse específicamente por una primera especificidad de unión de un aglutinante multiespecífico, caracterizado porque el asociado de unión unido al aglutinante multiespecífico se agota antes de la detección del asociado de unión mediante la incubación de la muestra con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico .

2. Un método para la determinación inmunológica de la presencia y/o cantidad de un asociado de unión de un aglutinante multiespecífico en una muestra utilizando un inmunoensayo , caracterizado porque el aglutinante multiespecífico se agota de la muestra antes de la determinación del asociado de unión.

3. Un método in vitro para la determinación de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión de un aglutinante multiespecífico , mientras el asociado de unión puede estar específicamente unido por una primera especificidado del aglutinante multiespecífico, caracterizado porque comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión.

4. Un método in vitro para la determinación de la presencia y/o cantidad de un antígeno de un anticuerpo multiespecífico en una muestra, mientras el antígeno a ser detectado puede estar específicamente unido por una primera especificidad del anticuerpo multiespecífico, caracterizado porque comprende el paso de: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico , anticuerpo unido al anticuerpo multiespecífico y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico , que es diferente de la primera especificidad de unión.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, caracterizado porque además comprende como segundo paso el paso de: agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia y/o la cantidad de asociado de unión libre.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque comprende como paso final : - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el asociado de unión y el aglutinante multiespecífico con un aglutinante monoespecífico que específicamente se une a una segunda especificidad del aglutinante multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, agotar el complejo de aglutinante monoespecífico-aglutinante multiespecífico de la muestra antes de la determinación de la presencia o la cantidad de asociado de unión libre, y - determinar la cantidad de asociado de unión en la muestra con aglutinante multiespecífico agotado.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el asociado de unión se selecciona del grupo que comprende antígeno, objetivo, y analito.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el asociado de unión es el asociado de unión no en complejo o el asociado de unión libre.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la especificidad de unión es un sitio de unión o un par de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el aglutinante multiespecífico se selecciona del anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un polipéptido no de anticuerpo, un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un receptor soluble, o un polipéptido de fusión que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y una molécula de unión peptídica.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el aglutinante multiespecífico es un anticuerpo.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la determinación de la presencia y/o la cantidad del antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno formado con la cantidad del antígeno en la muestra .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador que se une al epítopo no traslapado en el antígeno, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 to 14, caracterizado porque la determinación de la cantidad de antígeno comprende los siguientes pasos: incubar una muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado con un anticuerpo de captura que específicamente se une al antígeno para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno con un anticuerpo rastreador, mientras el anticuerpo de captura y el anticuerpo rastreador que se une al epítopo no traslapado en el antígeno, - incubar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador con un anticuerpo de detección que comprende una etiqueta detectable, mientras el anticuerpo detector se une específicamente al anticuerpo rastreador en un epítopo por fuera de los dominios variables del anticuerpo rastreador, y correlacionar el complejo de anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo rastreador formado con la cantidad del antígeno en la muestra.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo triespecífico , o un anticuerpo tetraespecífico, o un anticuerpo pentaespecífico, o un anticuerpo hexaespecífico .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico .

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad de unión que específicamente se une al primer antígeno o e primer epítopo en un antígeno y que tiene una segunda especificidad de unión que específicamente se une a un segundo antígeno o a un segundo epítopo en el antígeno.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el aglutinante monoespecífico es un anticuerpo anti-idiotípico.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el anticuerpo multiespecífico , antígeno unido al anticuerpo multiespecífico y el antígeno libre con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico, y remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - incubar una muestra que comprende el antígeno y anticuerpo multiespecífico con un anticuerpo anti-idiotípico que específicamente se une a una segunda especificidad del anticuerpo multiespecífico que es diferente de la primera especificidad de unión, para formar un complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico , remover el complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico de la muestra, y determinar la cantidad de antígeno en la muestra con el anticuerpo multiespecífico agotado.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, caracterizado porque el complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo multiespecífico es una mezcla del complejo de anticuerpo anti-idiotípico-anticuerpo multiespecífico y el complejo de anticuerpo anti - idiotípico-anticuerpo-antígeno multiespecífico .

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque el anticuerpo anti - idiotípico tiene una constante de asociación ka de 105 l/mol*s o más para la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico .

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque el anticuerpo anti - idiotípico tiene un valor KD de 5* 10"8 mol/l o menos para la unión a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico .

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque la incubación con el anticuerpo anti-idiotípico es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 36 horas.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque la muestra se ajusta a una concentración del anticuerpo multiespecífico de aproximadamente 2 µ9/p?1 a aproximadamente 15 µ9/p?1.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque la muestra se ajusta a una concentración total del antígeno de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 250 ng/ml .

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico se une o conjuga a una fase sólida .

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga (inmoviliza) vía un par de unión específico.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el par de unión (primer componente/segundo componente) se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina , anticuerpo/antígeno, lectina/polisacárido, proteína de unión de esteroide/esteroide , receptor de hormona/hormona, enzima/sustrato, IgG/Proteína A y/o G.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a biotina y la inmovilización se lleva a cabo vía avidina o estreptavidina inmovilizada .

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico está biotinilado y la fase sólida está recubierta con estreptavidina.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo anti-idiotípico biotinilado frente al aglutinante multiespecífico y se conjuga a una fase sólida vía estreptavidina.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque la fase sólida es una perla paramagnética cubierta de estreptavidina o una perla de sefarosa cubierta de estreptavidina .

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34, caracterizado porque el anticuerpo anti- idiotípico es una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos anti - idiotípicos que difieren en el sitio del anticuerpo en el cual se conjugan en la fase sólida .

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35, caracterizado porque la mezcla de anticuerpo anti - idiotípico comprende el anticuerpo anti-idiotípico conjugado vía al menos dos diferentes grupos amino to la fase sólida.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, caracterizado porque la conjugación de el anticuerpo anti-idiotípico a su asociado de unión se lleva mediante la unión química vía grupos N-terminal y/o e-amino (lisina), y/o grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo- , hidroxilo- y/o fenólicos de la estructura del aminoácido del anticuerpo del fármaco, y/o grupos alcohol de azúcar de la estructura carbohidratada del anticuerpo del fármaco.

38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37, caracterizado porque el anticuerpo anti-idiotípico se conjuga a la fase sólida por adsorción pasiva.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, caracterizado porque la muestra comprende anticuerpo multiespecífico , el antígeno libre y los complejos de anticuerpo-antígeno multiespecífico y la detección es del antígeno libre del anticuerpo multiespecífico .

40. El uso de un anticuerpo anti- idiotípico que específicamente se une a una primera especificidad de unión de un anticuerpo multiespecífico para el agotamiento del antígeno unido a la segunda especificidad de unión del anticuerpo multiespecífico de una muestra.