JPH07509128A - 組換型ポリペプチドの修飾方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換型ポリペプチドの修飾方法 発明の背景 多くの自然に形成される蛋白やペプチドが、組換ＤＮＡ技術によって生成されて いる。組換ＤＮＡ技術によって、蛋白とペプチドの形質発現の選択、増幅、及び 操作が可能になった。例えば、組換生成蛋白やペプチドの配列の変化を、部位特 異的変異誘発すなわち欠失突然変異誘発技術を用いてＤＮＡ配列を変えることに より達成することができる。

しかしながら、組換えによって形成された蛋白やペプチドに対する修飾の中には 、ＤＮＡ配列を変えることによって達成することができないものもある。例えば 、多くの自然に形成される蛋白やペプチドのＣ末端αカルボキシル基は、しばし ばアミドとして存在するが、通常、このアミドは、組換型形質発現によっては生 成されず、前駆体蛋白質からアミドへの生体内での形質発現の後、生体に変換さ れるものである。もう１つの例として、組換えによって生成した蛋白あるいはペ プチドのＮ端及び／又はＣ末端端部にＤ−アミノ酸を付加する方法がある。

さらに、組換えによって形成された蛋白あるいはペプチドのＮ−及びＣ−末端α −炭素反応基を選択的に修飾する方が望ましい場合もある。組換えによって形成 された蛋白あるいはポリペプチドは反応側鎖基およびＮ−及びＣ−末端アミノ酸 反応基の多重度を持つ。側鎖反応基としては、チオール、カルボキシル、イミダ ゾール、ｅ−アミン反応基が含まれる。Ｎ−末端ピログルタミル残基の付加やＣ 末端アミノ酸におけるアミドの形成のような、Ｎ端及び／又はＣ−末端α−炭素 反応基における選択的修飾は、逆向きに反応側鎖基に影響を与えずに行なう必要 がある。

組換えによって生成されたポリペプチド」二に酵素の作用によってＣ末端アミド を形成する方法がよく知られている。この酵素はペプチド・グリシンα−アミノ 化モノオキシゲナーゼで、真核器官中に存在する。１．　Ｅｎｇｅｌｓ　（Ｐｒ ｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　１：１９５−１９９　（１９８７））に よって説明されているように、組換えにより生成されたペプチドのＣ末端アミノ 酸に、この酵素を利用して、試験管内のヒト成長ホルモン遊離ホルモンのような 、アミドが形成される。Ｅｎｇｅｌｓｓ蛋白工学、１：１９５−１９９（１９８ 力。

さらに、多くの組換えにより生成された小蛋白やペプチドには、限定された数の 反応側鎖基がある。たとえば、２７個のアミノ酸ヒトガストリン遊離ペプチドに は、Ｎ末端α−アミン及び側鎖ヒドロキシル及びα−アミン反応基が含まれる。

ミオシンＬ鎖キナーゼ・インヒビターには、１０個のアミノ酸を含み、Ｎ末端α −アミン及び側鎖α−アミン反応基持つ。Ｃ末端α−カルボキシル基は、これら の自然生成ペプチドの両方においてアミノ化される。これらのタイプの小蛋白や ペプチドは、限定された数の異なる反応基を持つが、酵素にょるＣ末端アミド化 という従来の方法によってアミノ化されたものである。選択的ではあるが、この 酵素法は、時間がかかり、高価で、収率を予測できない上に、反応後にがなりの 純化を必要とする。酵素法は、また、Ｃ末端アミド化によって、組換生成ペプチ ドの修飾に限定される。

従って、Ｎ末端α−アミン基とＣ末端α−カルボキシル基の一方あるいは双方を 選択的に修飾できる化学的方法が必要とされる。この方法は、末端アミノ酸α− 炭素基の一方あるいは両方に対する選択的修飾を結果としてもたらし、がっ、反 応側鎖基に逆向きに影響を与えない。また、組換生成ポリペプチドの、Ｎ−末端 及び／又はＣ末端α−炭素反応基へ、様々な異なる有機的な部分を付加すること ができる選択的修飾方法で、手軽で、安く、かつ、末端修飾組換型ポリペプチド を高収率で生成することができる方法が必要とされるしたがって、組換え生成ポ リペプチドのＮ末端α−アミン及び／又はＣ末端α−カルボキシル反応基を選択 的に修飾する化学的方法を開発することが、本発明の目的である。

杢魚肌旦炙粒 これらの及び他の目的は、本発明によって達成される。本発明によって、Ｎ末端 α−アミン、Ｃ末端α−カルボキシル、及びその化合物から成る基から選択した 、修飾された末端アミノ酸α−炭素反応基を持っ組換型シングルコピーポリペプ チドを、若しくは、その一部を調製する化学的方法が提供される。この組換型シ ングルコピーポリペプチドはまた、ε−アミン基、水酸基、β−カルボキシル基 、γ−カルボキシル、チオール基、及びこれらの化合物から成る基から選択され た基反応側鎖基を持つ。

この方法のステップには、組換型シングルコピーポリペプチド、あるいはその一 部の形成が含まれ、このシングルコピーポリペプチドは、Ｎ末端α−アミン及び ／又はＣ末端α−カルボキシルにおいて１つ以上の生体付加保護基で保護される ようになっている。次いで、この組換型シングルコピーポリペプチドを、反応側 鎖基を選択的に保護する最大３つの化学薬品保護剤と反応させ、側鎖で保護され た組換型シングルコピーポリペプチドを形成し、これによって、修飾反応の間、 側鎖基の修飾が防止される。この組換型シングルコピーポリペプチドは、生体付 加保護基に特異的に作用する少くとも１つの切断試薬で切断され、非保護末端ア ミノ酸α−炭素反応基で組換型ポリペプチドが形成される。代わりに、生体保護 基に特異的に作用する少くとも１つの切断試薬で、その後、最大３つの化学薬品 保護剤で反応を続けて、このシングルコピーポリペプチドを切断してもよい。

いずれの場合も、非保護末端アミノ酸α−炭素反応基を持つ側鎖被保護シングル コピーポリペプチドが生成される。次いで、非保護末端アミノ酸α−炭素反応基 は、少くとも１つの化学修飾剤で修飾される。次いで、この結果生じた側鎖保護 末端修飾シングルコピーポリペプチドは、側鎖基で保護解除され、末端修飾組換 型シングルコピーポリペプチドが形成される。

組換型シングルコピーポリペプチドあるいはその一部は、末端アミノ酸α−炭素 反応基の１つ以」二の生体付加保護基で形成される。この生体（ツ加保護基は、 アミド結合によってＮ端及び／又はＣ末端α−炭素反応基に結合したペプチド、 ポリペプチド、アミノ酸、あるいは、その化合物であってもよい。生体保護基結 合は安定で、一般に不可逆的であり、従って、酵素を用いであるいは化学的に切 断可能な少くとも１つの認識配列含む。１つ以上の生体付加保護基をもっこの組 換型ポリペプチドは、単数あるいは複数の生体付加保護基を表わすＤＮＡ配列を 、組換え生成蛋白あるいはペプチドを表わす配列に隣接した形質発現カセット中 に取り込むことによって形成される。

たとえば、組換型シングルコピーポリペプチドを、シングルコピー融合蛋白とし て形成することもできる。このシングルコピー融合蛋白は、Ｎ端及び／又はＣ末 端α−炭素反応基でシングルコピーポリペプチドと細胞間結合するペプチドを介 して結合している結合蛋白質を持つ。この細胞間結合ペプチドは、化学試薬ある いは酵素試薬で切断可能な少くとも１つの部位を持ち、生体保護基として働（。

この結合蛋白質と細胞間結合ペプチドは、生体保護基として働くだけでな（、組 換型シングルコピーポリペプチドの純化を助ける。例えば、カルボニックアンヒ ドラーゼからなる結合蛋白質と任意のペプチド配列のポリペプチドとを持つシン グルコピー融合蛋白を、スルフォンアミドベンゼンのような固定化可逆阻害剤を 用いて純化することもできる。さらに、このカルボニックアンヒドラーゼを修飾 して、細胞間結合ペプチドの切断とともに切断される切断部位を除去することも できる。推奨実施例では、２つの切断部位を細胞間結合ペプチド内に取り込み、 融合蛋白の純化後に、結合蛋白質を切断して、シングルコピーポリペプチドのた めの生体保護基として短いペプチド配列（例えば、細胞間結合ペプチド）を残す ことができるようにしている。この半融合蛋白を本発明に従って修飾し、その反 応側鎖基を保護することもできる。短いペプチド配列残基は、半融合蛋白のＮ末 端α−アミンの生体保護基の役をする。この短いペプチド配列の、酵素を用いた 切断、あるいは、化学的切断によって、遊離Ｎ−末端α〜アミンが遊離し、本発 明に従ってさらに修飾が行なわれる。

この組換型シングルコピーポリペプチドは、また、所望のポリペプチドのアミノ 酸配列部だけを持つものやポリペプチドの端を切り取った変形部として形成する こともできる。配列のこの部分は、約１から約１０までポリペプチドの末端アミ ノ酸が欠けていることが望ましい。以上述べたように、組換型シングルコピーポ リペプチドのこの部分は、Ｎ端及び／又はＣ末端端部において、ポリペプチド、 ペプチド、あるいはアミノ酸で生体保護されるように形成される。シングルコピ ーポリペプチドの、この部分あるいはその端を切り取った変形部は、また、マル チコピーポリペプチドあるいは融合蛋白として形成することもできる。

本発明の開始材料は、また、組換えによりマルチコピーポリペプチドあるいは融 合蛋白として形成することもできる。マルチコピーポリペプチドは、縦列に（ｔ ａｎｄｏｍｌｙ）連鎖したシングルコピーポリペプチドのい（つかのコピーを有 するが、細胞内結合ペプチドを持つ場合と持たない場合がある。細胞内結合ペプ チドが存在する場合、化学的切断試薬あるいは酵素を用いた切断試薬によって選 択的に切断可能な少くとも１つの部位がある。細胞内結合ペプチドは、マルチコ ピーポリペプチドに取り込まれた一つ以上のシングルコピーポリペプチドのＣ末 端部分で、生体保護基の役をする。マルチコピー融合蛋白には、マルチコピーポ リペプチドに細胞間結合しているペプチドを介して結合している結合蛋白質を含 む縦列に（ｊａｎｄｏｍｌい連鎖した３つの断片がある。この細胞間結合ペプチ ドは、化学的あるいは酵素的法によって選択的に切断可能な少くとも１つの部位 を持ち、細胞内結合ペプチドとは異なるほうが望ましい。相互連鎖ペプチドをも つ結合蛋白質は、生体保護基の役をし、遺伝子組換マルチコピーポリペプチドの 純化を助ける。シングルコピー融合蛋白に対して上記に説明した実施例のような 、推奨マルチコピー実施例において、マルチコピーポリペプチドは、結合蛋白質 としてカルボニックアンヒドラーゼを持ってもよい。細胞間結合ペプチドと細胞 内結合ペプチドとの両方で使用されるような切断部位を含まないように、カルボ ニックアンヒドラーゼを修飾してもよい。細胞間結合ペプチドは、少（とも２つ の切断部位を含むことが望ましい。結合蛋白質を用いる分離と純化の後、結合蛋 白質フラグメントは、細胞間結合ポリペプチドの範囲の特有の切断部位で切断さ れて除去される。本発明に従って、マルチコピーポリペプチド側鎖から結合蛋白 質フラグメントが分離され、被保護マルチコピーポリペプチドが生成され、これ は、切断されてシングルコピーになり、遊離Ｎ末端アミンから遊離する。生体保 護基及び／又は細胞内結合ペプチドを切断するための、適当な酵素、酵素あるい は化学薬品を選択し付加することによって、所望のポリペプチドのいくつかのコ ピーから遊離α−アミンあるいはα−カルボキシル基が遊離される。次いで、こ の被保護ポリペプチドを、所望に応じて、Ｎ−末端あるいはＣ末端あるいはその 両端で修飾することもできる 本発明の開始材料は、選択され、生体保護基を用いて組換えにより生成される。

この開始材料は、生体保護組換型シングルコピーポリペプチドあるいはその一部 、組換型シングルコピー融合蛋白、組換型マルチコピー融合蛋白、及び生体保護 組換型マルチコピーポリペプチドを含んでいてもよい。推奨開始材料は、組換型 シングルあるいはマルチコピー融合蛋白である。

一旦、本発明の開始材料が選択され、形成されると、開始材料は処理されて、非 保護末端アミノ酸α−炭素反応基を持つ被保護シングルコピーポリペプチドが生 成される。この開始材料を最高３つの化学薬品保護剤で反応させ、修飾剤で側鎖 反応基の反応を抑止する側鎖保護分子が形成される。開始材料は、体付加保護基 に対して特異的に作用する切断試薬で切断され、非保護末端アミノ酸α−炭素反 応基が形成される。最高３つの化学薬品保護剤でこの開始材料を切断し反応させ るステップ番号と配列は、いくつかの変動する要因に左右されるが、次のような ものが含まれる。

（ａ）　本発明の開始材料がマルチコピーポリペプチドあるいは融合蛋白である 場合、付加的な切断ステップを必要とする場合がある。

（ｂ）　所望の修飾がＮ端及び／又はＣ末端α−炭素反応基にある場合、付加的 な切断及び修飾ステップが必要である。

（Ｃ）　所望のポリペプチド、側鎖反応基の数、及び、切断認識配列が存在する か否かが、のアミノ酸配列ポリペプチドを最初に保護するか切断を最初に行なう かに影響を与える。

（ｄ）　例えば、修飾型については、修飾反応の型の中には側鎖反応基の保護を 必要としない修飾型もある。

切断及び反応ステップを示す番号と配列が選択され、非保護末端α−炭素反応基 を持つ被保護シングルコピーポリペプチドが得られる。たとえば、組換型マルチ コピー融合蛋白は、次に述べる通り、末端修飾することもできる。この組換型マ ルチコピー融合蛋白は、マルチコピーポリペプチドのＮ−あるいはＣ−末端端部 に結合している細胞間結合ペプチドに結合している結合蛋白質を備えて、組換え によりに形成される。マルチコピーポリペプチドは、細胞内結合ペプチドと結合 しているシングルコピーポリペプチドのコピーをいくつか持つ。細胞間結合ペプ チドと細胞内結合ペプチドは、生体保護基として機能し、各々少くとも１つの化 学的あるいは酵素切断部位を持つ。マルチコピー融合蛋白が、細胞間結合ペプチ ドに特異的に作用する切断試薬で最初に切断され、マルチコピーポリペプチドが 形成される。次いで、このマルチコピーポリペプチドを、反応側鎖基を保護する ために、最大３つの化学薬品保護剤で反応させ、その後、生体付加保護基に特異 的に作用する少くとも１つの切断試薬で切断する。あるいはこの逆の順序の処理 を行なう。生体付加保護基に対して特異的に作用する切断試薬は、細胞内結合ペ プチドで切断し、残っている細胞内結合ペプチド残基を除去する働きをする。い ずれの場合も、非保護末端アミノ酸α−炭素反応基を持つ被保護シングルコピー ポリペプチドが生成される。末端α−炭素反応基は修飾される。末端修飾シング ルコピーポリペプチドは保護解除され、末端修飾組換型シングルコピーポリペプ チドが産出される。

非保護末端α−炭素反応基は、化学修飾剤で反応させることによって修飾するこ ともできる。修飾剤は、末端アミノ酸を付加し、有機部分で置換する役をする。

修飾タイプの特定例として、以下が含まれる二〇末端アミド化、Ｄ−アミノ酸、 ｌ−アミノ酸をもつ末端アミノ酸、アミノ酸誘導体、あるいは以上の酸の化合物 を持つペプチドの付加あるいは置換；Ｎ−アセチル基の形成；Ｎ末端α−アミン と共有結合を形成する反応基を持つ、化学的に生成されたオリゴペプチド、ある いは、有機合成成分と非保護α−アミン基を反応させることによる、Ｎ末端アミ ドあるいは他のＮ末端付加成分の形成末端α−炭素反応基の一方あるいは両方で 修飾をおこなってもよい。

一旦、被保護組換型シングルコピーポリペプチドが修飾されと、元の側鎖反応基 を再生させる条イ′１下でこのペプチドは保護解除される。この末端生成物は、 末端修飾組換生成シングルコピーポリペプチドである。修飾によって、所望の組 換型ポリペプチドの生体活性あるいは生体構造を変化させることができる。

本＾肌Δユ紐望晟肌 組換ＤＮＡ技術によって、数多くの天然蛋白やペプチドの形質発現の選択、増幅 、操作が可能になっている。自然生成蛋白と組換生成ペプチドには、一般に、ヒ ドロキシル、チオール、カルボキシル、ε−アミン基を含む異なる官能基あるい は反応基をもつ側鎖を有するアミノ酸の多重度が含まれる。他の２つの重要な反 応基として、Ｎ末端α−アミン反応基とＣ末端α−カルボキシル反応基がある。

Ｎ−末端α−アミンあるいはＣ−末端α−カルボキシル反応基において組換型ポ リペプチドを選択的に修飾することが、しばしば望ましい。たとえば、天然蛋白 やペプチドのＣ末端反応カルボキシル基を、生体活性を増強するためにアミドに 選択的に変換してもよい。代わりに、Ｄ−アミノ酸あるいはペプチドを加えらた り、あるいは、末端アミノ酸を置き換えてもよい。

これらの修飾の結果、天然リペプチドより長く作用し、より効力のある組換え生 成ポリペプチドの類似体を形成することができる。一般に、組換え生成ポリペプ チドに対するこれらのタイプの修飾は、組換え生成ポリペプチドのＤＮＡ配列の 変形によっては行なわれない。なぜなら、アミノ酸アミドを提供する遺伝コード や、Ｄ−アミノ酸の移入あるいはアミノ酸誘導体がないからである。

本発明は、Ｎ末端α−アミン、Ｃ末端α−カルボキシル及びそれらの化合物から 成る基から選択された末端α−炭素反応基における、組換え生成ポリペプチドの 選択的修飾方法を提供するものである。本方法の第１ステツプは、組換えにより 生成したシングルあるいはマルチコピーポリペプチドを形成し、これを生体付加 保護基で両方の末端α−炭素反応基において保護するようにすることである。

生体付加保護基は、化学薬品あるいは酵素を用いて切断可能な少くとも１つの部 位を含むアミノ酸、ペプチド及び／又はポリペプチドであることが望ましく、ま た、所望のポリペプチドの配列に存在しない配列を持つことが望ましい。

所望のポリペプチドをコード化する遺伝子の５゛及び／又は３′炭素原子末端に 生体付加保護基を表わすＤＮＡ配列を結合することによって、この生体付加保護 基を組換え生成ポリペプチドに（−１加することもできる。一旦、これが形成さ れると、組換え生成ポリペプチドは、末端α−炭素反応基において生体保護がな され、側鎖基を保護する最大３つの化学薬品保護剤で反応され、次いで、少くと も１つの生体保護基に対して特異的に作用する少くとも１つの切断試薬で切断さ れる。この代わりとして、組換型シングルコピーポリペプチドを、α−炭素反応 基において生体保護し、少くとも１つの生体付加保護基に対して特異的に作用す る切断試薬で切断し、次いで、側鎖反応基を保護する働きをする最大３つの化学 薬品保護剤で反応させる。いずれの場合も、ポリペプチドは、非保ＩＤ−あるい はＣ末端α−炭素反応基及び被保護側鎖反応基を持って生成される。非保護末端 アミノ酸α−炭素反応基は、修飾剤で修飾され、末端修飾保護シングルコピーポ リペプチドが形成される。次いで、末端保護シングルコピーポリペプチドは保護 解除され、Ｎ端及び／又はＣ−末端修飾シングルコピーポリペプチドが形成され る。

本発明の方法におけるステップの配列と番号は、所望の修飾、所望のポリペプチ ドのアミノ酸配列、及び選択された開始材料に基づいて変えることができる。本 発明の開始材料には、組換え生成シングルコピーポリペプチドあるいはその一部 、マルチコピーポリペプチド、シングルコピー融合蛋白、及びマルチコピー融合 蛋白が含まれてもよい。

たとえば、本発明の方法によって、組換え生成シングルコピーポリペプチドの選 択的なＮ末端α−アミンとＣ末端α−カルボキシル修飾が提供される。組換え生 成シングルコピーポリペプチドが形成され、Ｎ末端α−アミンが、細胞間結合ペ プチドへの、また、選択的に結合蛋白へのアミド結合によって生体保護され、ま た、Ｃ末端α−カルボキシルはアルギニン残基へのアミド結合によって生体保護 されるようになる。Ｎ−及びＣ末端α−炭素両反応基において生体保護された組 換型シングルコピーポリペプチドを、次いで、最大３つの化学薬品保護剤で反応 させ、組換型シングルコピーポリペプチドに存在する反応側鎖基を保護して、修 飾剤で反応させるのに利用できなくなるようにする。次いで、被保護シングルコ ピーポリペプチドを、Ｎ−末端生体保護基に対して特異的に作用する切断試薬で 切断し、非保護α−アミノ酸基を化学薬品修飾試薬で反応させる。次いで、修飾 された側鎖被保護シングルコピーポリペプチドをＣ末端生体保護基に対して特異 的に作用する切断試薬で切断する。非保護Ｃ末端α−カルボキシル基を第２修飾 剤で反応させ、修飾された側鎖保ＩＮ−末端とＣ末端修飾シングルコピーポリペ プチドが形成される。保護された、Ｎ末端、Ｃ末端修飾シングルコピーポリペプ チドは、側鎖反応基で保護解除され、分子のＮ−及びＣ末端端部で修飾された組 換型シングルコピーポリペプチドが形成される。組換型シングルコピーポリペプ チドの連続したＮ末端α−アミンとＣ末端α−カルボキシル修飾を示す反応スキ ームは、次に述べる通りである：反応スキームＩ： 組　型シングルコピーポリペプチドのＮ　びＣアミノ　にお（る選　がＢＰＩ　 １−５ｃＰＰ　−Ａｒｇ （リ　Ｎ−末端（ＢＰＩＩ）及びＣ末端（Ａｒｇ）端部において生体保護される 組換型シングルコピーポリペプチドの形成 （２）化学薬品保護剤 ＢＰ［１１−５ｃＰＰ−Ａｒ ＮＨＣＯＲ （３）Ｎ−末端生体保護基に特異的に作用する第１切断試薬。

ＮＨ２−ｓｃＰＰ　（ＢＰＩＩ）　Ａｒｇ　＋ＨＣＯＲ （４）第１修飾剤。

ＭＩＮＨ５ｃＰＰ　Ａｒｇ ＮＨＣＯＲ （５）Ｃ末端生体保護基に特異的に作用する第２切断試薬； ＭＩＮＨ５ｃＰＰ　−（Ａｒｇ）　Ｃ０ＯＨ十ＨＣＯＲ （６）第２修飾剤： ＭＩＮＨ５ｃＰＰ　Ｃ０Ｍ２ ＮＨＣＯＲ （７）保護解除： ＭＩＮＨ５ｃＰＰ　Ｃ０Ｍ２ と ＢＰＩＩ　−５ｃＰＰ　Ａｒｇ　＝オプションの結合蛋白質（ＢＰ）及び細胞間 結合ペプチド（Ｉ１）へのアミド結合によるＮ末端α−アミン生体保護 組換型シングルコピー融合蛋白 （ｓｃＰＰ）及びアルギニン（Ａｒｇ）残基を持つＣ末端α−カルボキシルで保 護 ＢＰＩＩ　ｓｃＰＰ−Ａｒｇ　＝側鎖反応基（ＮＨＣＯＲ）で保護される組換型 シングルコピーポリペプチ ド・ＮＨＣＯＲ ＮＨ２５ｃＰＰ　Ａｒｇ　＝Ｎ［−ＩＣＯＲ非保：４Ｎ末端α−アミン（ＮＨ２ ）をもつ側鎖保護組換型シングルコピーポリペプチド。

ＭＩＮＨ−ｓｃＰＰ−Ａｒｇ　＝修飾されたＮ末端α−アミン、（ＮＨＭｌ）を もつ側鎖保護組換型シングルコピーポリペプチド： ＮＨＣＯＲ ＭＩＮＨ−ｓｃＰＰ−Ａｒｇ　＝非保護Ｃ末端α−カルボキシル基をもつＮ−末 端被修飾側鎖保護組換型シングルコピーポリペプチド。

ＮＨＣＯＲ ＭＩＮＨ−ｓｃＰＰ−Ｃ０Ｍ２−Ｃ末端（Ｃ０Ｍ２）被修飾側鎖被保護シングル コピーポリペプチドＮＨＣＯＲ ＭＩＮＨ−ｓｃＰＰ−Ｃ０Ｍ２＝Ｎ及びＣ末端修飾シングルコピーポリペプチド ：本発明の方法のもう１つの変形として、組換え生成マルチコピーポリペプチド から誘導されるシングルコピーポリペプチドのＣ−末端修飾が含まれる。このマ ルチコピーポリペプチドは、細胞内結合ペプチドで結合している所望のポリペプ チドの複数のコピーで形成される。細胞内結合ペプチドは、シングルコピーポリ ペプチドのＣ末端α−カルボキシル反応基のための生体保護基の役をする。組換 え生成マルチコピーポリペプチドは、細胞内結合ペプチドに特異的に作用する切 断試薬で切断され、非保ＷＩＮ末端α−アミンを持つシングルコピーポリペプチ ドと、非像１ｃ末端α−カルボキシル基と、非像ＩＮ末端α−アミンを持つがシ ングルコピーポリペプチドと、Ｃ末端α−カルボキシル基の細胞内結合ペプチド の第１混合液が形成される。反応側鎖基及び非保護Ｎ末端α−アミン反応基にお いて保護基を形成する少なくとも１つの化学薬品保護剤で、この第１混合液を反 応させる。次いで、細胞内結合ペプチド残基を消化する切断試薬を用いた切断に よって、Ｃ末端α−カルボキシル基の細胞内結合ペプチドは除去され、非像１ｃ 末端α−カルボキシル基を持つ側鎖被保護シングルコピーポリペプチドが形成さ れる。次いで、非保護Ｃ末端α−カルボキシル基は修飾剤で修飾される。次いで 、修飾されたＣ末端α−カルボキシル基をもつ側鎖被保護シングルコピーポリペ プチドは保護解除され、Ｃ末端修飾シングルコピーポリペプチドが形成される。

組換え生成マルチコピーポリペプチドから誘導されるシングルコピーポリペプチ ドの選択的なＣ末端修飾を詳述する反応スキームは、次に述べる通りである：反 応スキーム！■； 組換型マルチコピーポリペプチドから誘導されるシングルコピーポリペプチドの 選択的なＣ末端修飾・ＮＨ２ｍｃ　（ＰＰＩ２）　ｎｃＯＯＨ（１）生体付加保 護基として細胞内結 合ペプチド（Ｉ２）を持つ組換型マルチコピーポリペプチドを形成 （２）細胞内結合ペプチドに対して特 異的に作用する切断試薬 第１混合液 ＮＨ２ｓｃ（ＰＰ）ＣＯＯＨ ＮＨ２ｓｃ（ＰＰ）１２ （３）化学薬品保護剤 ＮＨＣＯＲｓｃ（ＰＰ）ＣＯＯＨ ＮＨＣＯＲｓｃ（ＰＰ）１２　第２混合液ＮＨＣＯＲｓｃＰＰＣＯＯＨ ＮＨＣＯＲｓｃＰＰＣＯＭ ＮＨ２ｓｃ　ＣＯＭ （４）Ｃ末端生体保護基の除去に対し て特異的に作用する切断試薬 （５）修飾剤 （６）保護解除 土二 ＮＨ２ｍｃ（ＰＰｒ２）ｎＰｃＯＯＨ＝細胞内結合ペプチド（Ｉ２）で細胞内結 合されたマルチコピーポリペプチド（ｍｃＰＰ）　：ＮＨ２ｓｃＰＯＣＯＯＨ＝ 非保；４Ｎ宋端α−アミン及びＣ末端Ｃ０ＯＨ及び側鎖基をもつシングルコ ピー（ｓｃ）ポリペプチド： ＮＨ２ｓｃＰＰＩ２　＝非保ＩＮ末端α−アミン及びＣ末端細胞内結合ペプチド 残基をもつシング ルコピーポリペプチド・ ＮＨＣＯＲｓｃＰＰＣＯＭ　＝側鎖保護（ＮＨＣＯＲ）シングルコピーポリペプ チド： ＮＨＣＯＲｓｃＰＰＩ２　−　Ｃ末端細胞内結合残基を持つ側鎖被保護シングル コピーポリペブチ向 ＮＨＣＯＲｓｃＣＯＭ　＝側鎖保護修飾シングルコピーポリペプチド： ＮＨ２ｓｃＰＰＣＯＭ　＝末端修飾シングルコピーポリペプチド： 終止を示す番号と配列を含む本発明の方法の他の変形を利用して、組換え生成ポ リペプチドのＮ−末端及びＣ末端α−炭素反応基の選択的修飾を行なうこともで きる。選択的Ｎ−末端及び／又はＣ末端修飾を結果として導く適当なステップの 組合せは、以下の選択に左右される：（ａ）開始材料−マルチコピーポリペプチ ド、あるいは、融合蛋白によって、シングルコピーポリペプチドを形成する追加 的切断ステップが必要とされる。

（ｂ）　Ｎ端及び／又はＣ末端α−炭素反応基において修飾が行なわれるがどう かに関係なく、Ｎ及びＣ末端修飾が、付加的なステップを必要とする；（Ｃ）所 望のポリペプチドのアミノ酸配列、特に異なる側鎖反応基番号（切断認識配列が ポリペプチドの配列中に存在するかどうかに関係なく）；（ｄ）修飾タイプ、修 飾のタイプによっては、側鎖基の保護を必要としない。

本発明のマルチコピー法の推奨変形は、半融合蛋白という概念に基づくものであ る。細胞間結合ペプチドには２つの特有の切断部位が含まれ、その１つは細胞内 結合ポリペプチドの中に現れるものと選択的に同じである。細胞間結合及び細胞 内結合ペプチドの切断部位が結合蛋白質中に現れないように、結合蛋白質は修飾 される。融合蛋白の分離並びに純化の後、第１切断剤での切断によって、所望の ポリペプチド及び短いペプチド配列（すなわち、細胞間結合ペプチド）の複数の コピーを含む半融合蛋白がＮ末端α−アミンのための生体保護基として遊離され る。この半融合蛋白の側鎖は保護される。細胞間結合ペプチド残基は、Ｎ末端α −アミンのための保護基として機能し、そのコピー自身は、細胞内コピーの細胞 内Ｎ及びＣ末端基のための保護基の役をし、半融合蛋白のＣ末端は、アルギニン のようなもう１つのアミノ酸で保護される。保護を施した後、切断剤を添加し、 所望に応じてＮ−末端生体保護基を切断し、所望のポリペプチドの種々のコピー を遊離させ、遊離Ｎ末端アミンあるいは遊離Ｃ末端カルボン酸を、細胞内結合ペ プチド残基の特異的性質に従って所望に応じて作製する。Ｎ−末端あるいＣ末端 、あるいはその両端で化学薬品による修飾を行なうことにより所望のＮ端あるい はＣ末端修飾ポリペプチドを生成し、その後、末端の保護基及び残基の除去が行 なわれる。

Ａ、　開始材料の調製：Ｎ端及び／又はＣ末端α−カーボン反応基における生゛ 保、ｌＩ　型ポリペプチドの≦Ｊ １、　所望のペプチドの選択及び修飾 ポリペプチドとは、アミド結合によって連鎖したアミノ酸のポリマーであり、一 方の端部（Ｎ末端）に反応α−アミン基をもつ末端アミノ酸基を、また、もう一 方の端部（Ｃ末端）に末端アミノ酸をもつ反応α−カルボキシル基を有している 。通常、ポリペプチドは、Ｎ末端α−アミンを含む少くとも１つの反応アミン基 すなわち官能アミン基を有する。さらに、このポリペプチドはりシンからなるε アミノ基を含む一つ以上の反応側鎖を持ってもよい。他のアミノ酸には、チオー ル、ヒドロキシル、フェノールヒドロキシル、イミダゾール及びカルボン酸基の ような反応基すなわち官能基をもつ側鎖がある。組換え生成ポリペプチドとは、 ポリペプチドに対して遺伝子を分離あるいは合成し、宿主生物体での遺伝子の形 質発現の増幅及び操作を可能にするベクター中にこの遺伝子を導入することによ り生成したポリペプチドである。

その開始材料は、選択され、設Ｊ１され、次いで、組換えによりに生成される。

開始材料は次のような要因によって選択される：（ａ）所望の修飾、サイズ、及 びアミノ酸組成を含む所望のポリペプチドの形質。

（ｂ）分子の両方端部において生体付加保護基を必要とする、Ｎ端及び／又はＣ 端アミノ酸α−炭素反応基での修飾を行なうかどうか：（Ｃ）シングルあるいは マルチコピー融合蛋白の形成を可能にする、組換え生成ポリペプチドの純化を促 進するための純化の容易さ本発明の開始材料を形成する前に、所望のポリペプチ ドを、その機能、サイズ、アミノ酸組成によって選択する。

本発明の方法のために選択されたポリペプチドの官能基を、Ｎ端及び／又はＣ末 端アミノ酸の選択的修飾によって変形してもよい。ポリペプチドへの修飾によっ て、ポリペプチドの構造上の形質や生体活性を変化させてもよい。例えば、マス トパランのような多くの小ペプチドのＣ末端アミド化あるいは、ヒトガストリン 遊離ペプチドは、これらのペプチドの生体活性を増強する。もう１つの例として 、有機合成成分あるいは有機合成／オリゴペプチド成分をもつＮ−末端反応によ って、これらのペプチドの生体活性はかなりの程度変えられる。さらに、Ｄ−ま たはＬ−アミノ酸を持つペプチドを付加することによって、特定のタイプの細胞 にポリペプチドの標的を行ない、ペプチドの分解とクリアランスの速度を変化さ せ、ポリペプチドの生体活性を増大させ、生体潜在力を増大させることができる 。Ｄ−アミノ酸、あるいは、ペプチド、あるいは、アミノ酸誘導体を付加するこ とによって、結果的に、アンタゴニストを形成することもできる。ポリペプチド の選択と修飾は、ペプチドの構造的活性あるいは生体活性の所望の変化に基づい て行なうことができる。特に推奨される修飾はペプチドのＣ末端アミド化である 。　修飾されたポリペプチドのいくつかの例及びこの修飾と関連する生体活性の 変化については、Ｋｉｒｋ−ＯＴｈｍｅｒ化学工学百科辞典（第４版）第１２巻 、ｐｐ。

６０３〜６１７（１９９１）に説明されており、参考として本明細書に取り入れ らでいる。

選択されたポリペプチドのサイズは、約４個のアミノ酸からなるペプチドから、 約４０００個（約５（１０，０００のダルトン）のアミノ酸からなるポリペプチ ドの範囲になる場合もある。より大きいポリペプチドは、通常、シングルコピー 融合蛋白すなわちポリペプチドとして組換えによりに生成される。５０個あるい はそれ以上のアミノ酸を持つ小ペプチドは、マルチコピー融合蛋白すなわちポリ ペプチドとして生成することが望ましい。特に推奨できるものとしては、５０個 若しくはそれ以下のアミノ酸を持つ生体活性小ペプチドである。

所望のポリペプチドのアミノ酸組成は、側鎖官能反応基の多重度を持つものであ ってもよいが、本方法は、１つもしくは２つのタイプの反応側鎖基を持つポリペ プチドに対して用いることが望ましい。たとえば、特に推奨できるポリペプチド は、反応側鎖基としてε−アミン基のみを持つポリペプチドである。特に推奨で きるその他のポリペプチドとしては、ε−アミン、ヒドロキシルあるいはカルボ キシル側鎖をもつポリペプチドがある。マガイニンボリペプチドのような多くの 生体活性小ペプチドは、官能基あるいは反応側鎖基として限定されたタイプを持 つものとなる。

反応側鎖基としてｌ型もし７くは２型を持つポリペプチドの特定例としては、米 国特許Ｎｏ、４，８１０，７７７　（１９８９年３月７日発行）においてＺａｓ ｌｏｆｆ他によって開示されたような、マガイニンポリペプチドＩ、　ＩＩ、　 ＩＩＩが含まれる。また、米国特許Ｎｏ。

５．０４５，５３１　（１９９１年９月３日発行）においてＢｃｒｋｏｗｉｊｚ 他によって開示されたような、Ａ　１ａ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　−Ａ　Ｉａ 　−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌａ　−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ　 −Ｐｈ■|５ｅｒ− Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　１）のよ うな癒傷ペプチドがある。これらの開示は、参考として本明細書に取り入れらで いる。

適当なポリペプチドの他の例としては、マガイニンポリペプチド１、マガイニン ボリペプチド２、マガイニンポリペプチド３、癒傷ペプチド、ミオシンＬ鎖キナ ーゼインヒビター、Ｐ物質、マストパラン、マストパランＸ、ヒトアミリン、ラ ットアミリン、イカリア（Ｉｃａｒｉａ）走化性ペプチド、カラシン、ヒトガス トリン遊離ペプチド、ケプタミド（ｋｅｍｐｔａｍｉｄｅ）　、ミオシン・キナ ーゼ抑制ペプチド、クエルセチン（ｍｅｌｃｌｊｉｎ）　、ｉ　Ｌｅｕ５　］− エンケファラミド（ｅｎｋｅｐｈｌａｍｉｄｅ）、［Ｍｅ＋’　］−エンケファ ラミド（ｅｎｋｅｐｈｌａｍｉｄｅ）　、メトロツェナミド（ｍｅｊｒｏｐｈｃ ｎａｍｉｄｃ）　ＳＳ　ＣＰ　ｅＳアラトスチン（ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ） 　１％アラトスチン（ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ）　３、甲殻類ペプチド、ＦＭ ＲＦ（軟体心臓興奮性神経ペプチド）、ＦＭＲＦ様ペプチドＦ１、ニューロメデ ィアン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉａｎ）　Ｂ、ボンベシン、白血球ピロキニン（Ｉｅ ｕｋｏｐｙｒｏｋｉｎｉｎ）　、アリエテシン（ａｌｙｅｔｃｓｉｎ）　、コラ ゾニン（ｃｏｒａｚｏｎｉｎ）及びリトニン（ｌｉｏｏｒｉｎ）がある・一旦、 所望のポリペプチドと修飾が選択されると、開始材料が、Ｎ端及び／又はＣ末端 α−炭素反応基が生体付加保護基を持つように、段山され、組換え生成を行なう ことができる。

２、　ポリペプチドのＮ−及び／又はＣ末端α−炭素反応基への生　・　、基寸 選 開始材料を形成する前に、生体付加保護基が選択される。生体付加保護基は、Ｎ 端及び／又はＣ末端α−炭素反応基にアミド結合によって連鎖されたポリペプチ ド、ペプチド端及び／又はアミノ酸であってもよい。形成された結合のタイプは 、一般に取り消すことができない。従って、生体保護基の配列は、酵素を用いて 、あるいは、化学薬品を用いて切断可能な少くとも１つの部位を含み、生体保護 基を選択的に除去することができるようになっている。生体付加保護基の配列は 、所望のポリペプチド中に存在しないことが望ましい。Ｎ及びＣ末端α−炭素反 応基が両方とも、生体付加保護基で保護されているとき、Ｎ末端α−炭素反応基 における生体付加保護基は、Ｃ末端α−炭素反応基と異なったもので、Ｎ及びＣ 末端生体保護基の連続切断が可能になっていることが望ましい。

生体付加保護基は、少くとも１つの切断部位を持ち、生体保護基の一部あるいは すべてを除去できるようになっていなければならない。生体保護基の切断部位と してとして作用することができるペプチド及びアミノ酸の特定例、切断酵素、あ るいは、条件を表１に示す。

ニレテロキナーゼ　（Ａｓｐ）４Ｌｙｓ　ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＡＫ（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）要因Ｘａ　ＩｌｅＧ ｌｕＧｌｙＡｒｇ　ＡＴｒＧＡＡＧＧＡＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１３）トロンビン　ＡｒｇＧｌｙＰｒｏＡｒｇ　ＡＧＡＧＧＡ ＣＣＡＡＧＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：リ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）ユビキ チン　ＡｒｇＧｌｙＧＩｙ　ＡＧＡＧＧＡＧＧＡ切断酵素 レニン　ＨｉｓＰｒｏＰｈｅＨｉｓＬｃｕ−ＣＡＴＣＣＴＴｒＴＣＡＴＣ−Ｌｃ ｕＶａｌＴｙｒ　ＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡ丁トリプンン　Ｌｙｓ　ｏｒ　Ａｒｇ　 ＡＡＡ　ＯＲＣＧＴキモトリプシン　Ｐｈｃ　ｏｒ　Ｔｙｒ　ｏｒ　Ｔｒｐ　Ｔ Ｔｒ　ｏｒ　ＴＡＴ　ｏｒ　ＴＧＧクロストリパイン　Ａｒｇ　ＣＧＴ Ｓ、黄色Ｖ８　Ｇｌｕ　ＧＡＡ 化学薬品 以既　」仙Ｊ亙　且狙ｙ皿 （ＰＨ３で）　ＡｓｐＧｌｙ　ｏｒ　ＡｓｐＰｒｏ　ＧＡＴＧＧＡ（ヒドロキシ ルアミン）　ＡｓｎＧＩｙ　ＡＡＴＣＣＡ（ＣＮＢｒ）　メチオニン　ＡＴＧ ＢＮＦＳ−スカトール　Ｔｒｐ　ＴＧＧこの生体保護基には、１つの以上の酵素 を用いた及び／又は化学薬品を用いた切断部位を含めることが可能であり、化学 薬品試薬によって切断された少くとも１つの部位及び酵素によって切断された少 くとも１つの部位を含むことが望ましい。この代わりとして、この生体保護基は 、少くとも２つの異なる酵素切断部位、あるいは、少くとも２つの異なる化学薬 品切断部位を有していてもよい。複数の切断部位を持つ生体保護基の特定例を、 以下のペプチドによって例示する。

（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）　： Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　（Ｐｈｅ　Ｖａｌ 　ＡＳＮＢ）　：Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇｃ翼ＭｃｔＤ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓ ｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　：Ａｓｐ　ＬｙｓＡ　Ｖａｌ　ＡｓｎＢ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ａｒｇｃ翼ＭｅｔＤ翼：Ａ＝ニレテロキナーゼ切断部位： Ｂ：ヒドロキシルアミン切断部位： Ｃ＝トロンビン切断部位： Ｄ＝臭化シアン切断部位。

複数の切断部位をもつ生体保護基は、また、細胞間結合ペプチドあるいは細胞内 結合ペプチドとしても働くことができる。本発明を限定する意図はまったくない が、生体保護基における化学薬品によるあるいは酵素による切断配列の結合は、 純化及び切断効率に効果を与えるものである。

この生体保護基は、また、例えば、組換型シングルコピー融合蛋白におけるよう なポリペプチドとペプチドとの化合物であってもよい。組換型シングルコピー融 合蛋白は、縦列に（ｊａｎｄｏｍｌいつながれた３つの断片を持つ。第１断片は 結合蛋白質であり、第２断片は細胞間結合ペプチドであり、第３断片はシングル コピーは、ポリペプチドである。細胞間結合ペプチドは、Ｎ末端あるいはＣ末端 α−炭素反応基において結合蛋白質をシングルコピーポリペプチドに結合してい る。細胞間結合ペプチドは、少くとも１つの化学薬品あるいは酵素を用いた切断 部位を持ち、シングルコピーポリペプチドにはない配列を持つことが望ましい。

Ｎ末端α−アミンあるいはＣ末端α−カルボキシル基における生体付加保護基と しての、この細胞間結合ペプチド、及び、オプションとして、結合蛋白質は、ま た、組換えにより誘導されたシングルコピーポリペプチドの純化を行なうもので もある。もう１つの例は、縦列に（＋ａｎｄｏｍｌｙ）つながれた３つの断片か ら成る組換型マルチコピー融合蛋白である。

第１断片は結合蛋白質であり、第２断片は細胞間結合ペプチドであり、第３断片 はマルチコピーポリペプチドである。この細胞間結合ペプチドは、マルチコピー のポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端α−炭素反応基に結合蛋白質を結合する 。このマルチコピーポリペプチドには、細胞内結合ペプチドによって結合してい るシングルコピーポリペプチドのいくつかのコピーが含まれ、できれば、細胞間 結合ペプチドと細胞内結合ペプチドの両方は、切断可能な少なくとも１つの部位 を持ち、シングルコピーポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を含まないこと が望ましい。細胞内結合ペプチドと細胞間結合ペプチドとは、シングルあるいは マルチコピーポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端α−炭素反応基の生体保護 基として機能することができる。Ｃ末端とＮ末端α−炭素反応基の両方を修飾す る場合、細胞間結合ペプチドと細胞内結合ペプチドは、異なる切断部位を持ち、 連続切断を行なえることが望ましい。

一旦、ポリペプチドと所望の修飾が選択されると、Ｎ末端及び／又はＣ末端α− 炭素反応基に生体付加される保護基が選択される。所望のポリペプチドと結合さ せる生体付加保護基を選択するための要因には、以下が含まれる＝（ａ）シング ルコピーポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）ポリペプチドが、組換えによりに 、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドとして生成されるかどうか；（Ｃ ）単独あるいは複数切断部位が所望のものであるかどうか；（ｄ）酵素あるいは 化学薬品を用いた切断が所望のものであるかどうか：（Ｃ）融合蛋白は、純化を 提供するするために所望のものであるかどうか；（ｇ）化学薬品保護剤と生体保 護基のアミノ酸配列との適合性。

３、　標亭組換ＤＮＡ法による、１つ以上の生体付加保護基を用いて保護した、 Ｎ末端及び／又はＣ末端α−炭素反応基における組換型シングルあるいはマルチ コピーポリペプチドの形成　□ 本発明の方法の、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドあるいは融合蛋白 開始材料は、標準組換ＤＮＡ法によって形成される。所望のポリペプチドあるい はその一部の遺伝子配列をクローン化することができ、小ペプチドの場合、自動 合成によって合成することができる。生体付加保護基をコード化する遺伝子配列 を、自動オリゴヌクレオチド合成によって合成する。この生体付加保護基の遺伝 子配列を、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドあるいはその一部の遺伝 子配列と結合し、この生成されたシングルあるいはマルチコピーポリペプチドが 、Ｎ末端及び／又はＣ末端α−炭素反応基において少くとも１つの切断可能な生 体付加保護基を持つようにする。

この生体付加保護基の遺伝子配列によって、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸 、あるいはそれらの化合物がコード化される。この遺伝子配列によって約５０以 下のアミノ酸ペプチドがコード化され、化学薬品試薬による１つの切断部位及び 少（とも１つの酵素による切断部位が与えられることが望ましい。一旦、生体保 護基が選択されると、ＤＮＡ配列が自動合成によって形成され、標準組換ＤＮＡ 法によって、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドの遺伝子配列と結合さ れる。アミノ酸切断部位に対応するＤＮＡ配列の特定例を、表１に示す。化学薬 品と酵素による切断部位をコード化するＤＮＡ配列と結合させて、自動化オリゴ ヌクレオチド合成によって、単一の生体保護基の遺伝子配列中に入れることもで きる。

シングルあるいはマルチコピーポリペプチドは、また、組換型シングルあるいは マルチコピー融合蛋白として形成することもできる。この融合蛋白には、縦列に （＋ａｎｄｏｍｌｙ）つながれた３つの断片を持つ。第１断片は、結合蛋白質で あり、結合蛋白質リガンドへの強い、可逆的な結合を示すものであるが、酵素あ るいは酵素様結合蛋白質に対する可逆阻害剤であることが望ましい。第２断片は 細胞間結合ペプチドであり、酵素及び／又は化学薬品を用いた技術によって選択 的に切断可能なものである。３番目の断片は、シングルあるいはマルチコピーポ リペプチドである。相互連鎖ペプチドをもっこの結合蛋白質は、組換えにより生 成されたシングルあるいはマルチコピーポリペプチドの純化を行ない、Ｎ末端あ るいはＣ末端α−炭素反応基のための生体保護基として機能する。この結合蛋白 質と細胞間結合ペプチドは、共に、推奨実施例において生体保護基として機能す るが、細胞間結合ペプチドには、２つの選択的な切断部位が含まれ、この結合蛋 白質が除去するこができるように、そして、細胞間結合ペプチドが残るようにな っている。この推奨実施例における純化の後、この結合蛋白質を切断して、ペプ チド・フラグメント、すなわち、生体保護基として機能する細胞間結合ペプチド を残すようにしてもよい。この結果として生ずる半融合蛋白のために、残りのス テップによって、結合蛋白質ペプチド配列を運搬する必要がなくなり、結合蛋白 質から誘導される生体保護基という利点が保存される。参考として本明細書に取 り入れらでいる係属中の出願、出願番号Ｎｏ、　０７１５５２，８１０において 議論されているように、シングルあるいはマルチコピー融合蛋白が標準組換ＤＮ Ａ法によって生成される。組換えにより生成されたシングルあるいはマルチコピ ー融合蛋白の形成について説明する。

融合蛋白の結合蛋白質断片は、一般に、抗体、抗体りあるいはＨ鎖、酵素、レク チン、アビジンあるいは、抗原、基質、インヒビター、糖あるいはビオチンのよ うなりガントへの選択的結合のための結合部位を持つ任意の形質発現蛋白である 。この結合蛋白質は、酵素に限らず、端を切り取って変形あるいは修飾した官能 基を持つ変形部（以下修飾官能基変形部と呼ぶ）を含む酵素様蛋白であることが 望ましい。結合は、強く、選択的であることが望ましい。酵素に対して、このリ ガンドは、酵素様蛋白の可逆阻害剤であることが望ましい。

特に、酵素結合蛋白質の推奨実施例には、任意のソース（特に、哺乳動物あるい はヒト）から誘導されるカルボニックアンヒドラーゼ、及び、それから作られる 修飾官能基変形部（これは、インヒビター、サルファニルアミド、あるいはその 誘導体と結合するものであるカリが含まれる。この修飾されたカルボニックアン ヒドラーゼ酵素の特に推奨される実施例は、（Ｉ）メチオニンを含まず、（ＩＩ ）もう１つのアミノ酸（アスパルテートが望ましい）によって置換された、すべ であるいはいくつかのグルタメートを持ち、（Ｉｎ）もう１つのアミノ酸（リシ ンが望ましい）によって置換された、すべであるいはいくつかのアルギニンを持 ち、（ｒｖ）もう１つのアミノ酸（アラニンに変化したグルタミンもしくはグリ シンが望ましい）によって置換された、グリシンの隣にアスパラギン持ち、（Ｖ ）もう１つのアミノ酸（ロイシンが望ましい）によって置換されたメチオニンを 持ち、（■りもう１つのアミノ酸（セリンが望ましい）によって１６換されたシ スティンを持ち、（ＶＩ＋）もう１つのアミノ酸（ロイシンあるいはセリン及び イソロイシンが望ましい）によって置換されたメチオニンを、位置２４０に持つ 、修飾官能基変形部である。

生体特異的に（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌいかつ可逆的に低分子量リガンド と結合する、抗体あるいは個々の鎖、部位、あるいは、これらからなる上記に特 徴づけたようなフラグメント、及び他の蛋白に、同じ方法で、同じ働きを行なわ せ、蛋白純化の状況において酵素様蛋白が作り上げるのと同じ結果に到達でき、 従って、これらも、結合蛋白質としての本発明の範囲内で推奨されるものである 。抗体あるいはそれに対応する鎖、部位あるいはフラグメントに対して、そのリ ガンドは、低い分子量抗体であり、ジニトロフェノールのような芳香成分である ことが望ましい。

適当な結合蛋白質及びそれに対応するリガンドには、表２に示されるものが含ま れる キサンチンオキシダーゼ　アロプリノール　強い　１アデノシンデアミナーゼ　 コツオルミシン（Ｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）　＜１．２Ｅ−１０１アデノシンデア ミナーゼ　デオキシコツオルミシン（Ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）　２． ５Ｅ−１２２アデノシンデアミナーゼ　エリトロ−９−（２−ヒドロキシ−３１ ，６Ｅ−９２ ｎｏｎｙｌ）アデニン ジヒドロ葉還元酵素　メトトレキセート　１．２Ｅ−９４ジヒドロ葉還元酵素　 メトトレキセート　２．３Ｅ−９５ジヒドロ葉還元酵素　アミノブチＩル　３． ７Ｅ−９５ジヒドロ葉還元酵素　Ｔｒｉｍｅ＋ｈｏｐｒｉｎ　４．６Ｅ−９５リ ブロースビスフオスフエイト カルボキシラーゼ　２カラポキシアラビリタル１．５　ビスフォスフエイトＩＥ −１４６ペプシン　ペプスタチン　ｌ０Ｅ−９ カルモジユリン　メリチン（Ｍｃｌｉｌｌｉｎ）　３Ｅ−９７カルモジユリン　 種々のペプチド　０．２Ｅ−９７コレステロール・エステラーゼポリニック酸　 ０．１Ｅ−９８炭酸脱水酵素ＩＩ　サルファニルアミド　４．６Ｂ−７３炭酸脱 水酵素１１　Ａｃｅｊａｚｏｌａｍｉｄｅ　６Ｅ−１０３Ｅは、１０の負の指数 である。

表２の中で引用された参考文献 １、　Ｃｈａ　ｃｊ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍ、、　２ ４．２１８７−２１９７゜２、　Ａｇａｒｖａｌ　Ｃ（ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍ、、　２６．３５４−３６７　（１９７７）。

３、　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｐ、Ｖ、　ｃｊ　ａｌ、＄　９．２６３８　（１９７０ ）。

４、　Ｃｈａ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍ、、　３ ０．１５０７−１５１５　（１９８１）。

５、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｊ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒ ｍ、、　２９．５８９−５９５　（１９８０）。

６、　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｊ、、　Ｔｏｌｂｅｒｔ、　Ｎ、Ｅ、、　Ｂａｒｋｅｒ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９：９３４−９４２　（１９８O） ７、　Ｄｅｇｒａｄｏ　ｅｊ　ａｌ、、　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、　２９．８３−９３　（１９８９）。

８、５ｕＨｏｎ　ｅｊ　ａｌ、、　ＢＢＲＣ，１３４，３８６−３９２（１９８ ６）。

他の適当な結合蛋白質として含まれるものには、Ｈａｎａｄａ他によって説明さ れるように、ρ−ガラクトシダーゼ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３ ニア１８１　（１９８８））　：　５ｔａｈｌ他によって説明されるようにフラ ジェリン蛋白；　（米国特許Ｎｏ、４，８０１，５２６　（１９８９年１月３１ 日発行））；ユビキチン（Ｙ００他Ｊ、Ｂｉｏｌ、、Ｃｈｅｍ、　２６４：１７ ０７８　（１９８９）　ニブロチインＡ　Ｈ，Ｎｉ１ｌｓｏｎ他、ＥＭＢＯＪｏ ｕｎａｌ　（４：１０７５（１９８５））　；ストレプタヴイシン、Ｍｃａｄｅ 他。ＰＣＴ／ＬＩＳ　８５１０１９０１　（１９８６）　；フラグ・ペプチド（ Ｋ、）　ｌ１ａｋｕｒａ他。＄４’ｉ”１９Ｂ＋１０５６（１９７７））がある 。これらは参考として本明細書に取り入れらでいる シングルあるいはマルチコピー融合蛋白に対する、細胞間結合あるいは細胞内結 合ペプチドの選択は、切断酵素及び生成物ペプチド配列の選択に依存する。

一般に、細胞間結合ペプチド配列によって、表１に示されるもののような、非常 に特異的な切断酵素と、あるいは、非常に特異的な化学試薬切断あるいはそれら の化合物によって、特有の反応をする任意のペプチド配列が構成される。細胞間 あるいは細胞内結合ペプチドは、Ｎ端及び／又はＣ末端α−炭素反応基に結合し 、生体保護付加基として働く。

一般に、細胞間結合ペプチドと細胞内結合ペプチド・フラグメントとは異なるア ミノ酸配列を持ち、同時的にというよりむしろ順次的に切断が行なわれる。

この切断配列が生成物ペプチドのアミノ酸配列を複製しないように、アミノ酸配 列を選ぶこともできる。あるいはその代わりに、本発明の方法の中で示されてい るように、ペプチドの切断用特定アミノ酸を切断反応からブロックあるいは保護 することもできる。これらのペプチド及び／又はアミノ酸結合フラグメントを、 同じグループのアミノ酸単位配列（たとえば、表１にリストした配列）から選ん でもよい。これらのペプチド結合フラグメントを選ぶ際に検討する要因は、他の 生体保護基の選択のための要因と類似したのものであり、以下のようのなものが 含まれる。

ａ）生成物ペプチドのアミノ酸配列； ｂ）ポリペプチドが、シングルコピーポリペプチドであるかあるいはマルチコピ ーポリペプチドであるか。

Ｃ）シングルあるいはマルチ切断部位が所望のものであるかどうか；ｄ）酵素に よる切断が望ましいかあるいは、化学薬品による切断が所望ましいか； Ｃ）可変融合ペプチドの遺伝子配列に多様性が与えられるように、細胞内及び細 胞間結合ペプチドと、それらをコードする遺伝子フラグメントが、配置され、変 形されているか。この多様性によって、小ペプチドの複数の単位の効果的な形質 発現が可能になる。連続的に反復する遺伝配列が、遺伝子組換えが行なわれる前 に、宿主生物によって、しばしば再配置されたり、削除されたりすることがしば しばあることが発見された。

Ｎ末端及び／又はＣ末端生体付加保護基をもつ、組換えにより生成されるシング ルあるいはマルチコピーポリペプチドは、標準組換ＤＮＡ法によって生成される 。シングルあるいはマルチコピーポリペプチドの遺伝子と、転写翻訳制御領域を 持つ所望の生体保護基をコード化する遺伝子とを結合させることによって、形質 発現カセットを形成することもできる。たとえば、融合蛋白をコード化する組換 型遺伝子には、結合蛋白質、細胞間結合ペプチド、及び、シングルあるいはマル チコピーポリペプチドをコード化する３つのＤＮＡ断片が取り込まれる。これら の断片は、結合蛋白質遺伝子フラグメントとシングルまたはマルチコピーポリペ プチドフラグメントとのうちのどちらかが最初に読み込まれるように配置される 。結合蛋白質遺伝子フラグメントが先に読み込まれるように融合蛋白遺伝子を構 成することが望ましい。自然のソースから、遺伝子断片を合成あるいは誘導して もよい。融合蛋白遺伝子を転写翻訳制御領域と結合させて、形質発現カセットを 形成する。

形質発現カセットを含む発現ベクターによって、原核細胞あるいは真核細胞にお いて、生体保護シングルあるいはマルチコピーポリペプチドの形質発我が行なわ れる。発現生成物の、翻訳、転写、現象型、−・過型あるいは他の形質発現制御 、ＲＮＡ結合及び形質発現後操作のための調節ＤＮＡ配列のような、シングルあ るいはマルチコピーポリペプチド遺伝子及び塩基ベクター断片が、発現ベクター によって取り込まれる。プロモーター、オペレーター、調節配列、及び、転写終 了シグナルのような構造上の特徴が発現ベクターには一般に含まれる。宿主細胞 あるいはより高次の生体と適合性を持つ塩基ベクターから、発現ベクターを合成 することもでき、前述の特徴が示される。発現ベクターの調節配列は、特異的適 合性を持つか、あるいは、原核あるいは真核宿主細胞あるいはより高次の生体と 適合性を持つように適応する何らかの形をとっている。形質発現後調節配列は、 溶解蛋白の分泌に引き起こすものであるが、真核な発現ベクターに含めてもよい 。宿主の通常の生体合成の形質発現と比べて、融合蛋白を過剰生成するように、 発現ベクターが宿主細胞やより高次の生体に対して刺激を与える効果を示すこと は、特に望ましい。

ベクターの構成のための１つの推奨スキームにおいて、結合蛋白質のＤＮＡ断片 、たとえばカルボニックアンヒドラーゼＩＩに対するヒト遺伝子（結合蛋白質遺 伝子）は、形質転換を行なう宿主細胞と適合性を持つ塩基プラスミド中に挿入さ れる。塩基プラスミドには、下流に配置された遺伝子の高水準形質発現のために 必要な調節配列が含まれる。

次いで、細胞間結合ペプチドに対する合成りＮＡ配列コード付けは、結合蛋白質 遺伝子の３°炭素原子末端近くに挿入される。結合蛋白質遺伝子の３゛炭素原子 末端の近くの制限酵素部位は、細胞間結合ペプチドのこのＤＮＡ配列の挿入が可 能になるように存在していなければならない。また、可変融合ポリペプチドに対 するＤＮＡ断片・コード付けを正しい解読枠の中に後で挿入することができるよ うに、少くとも１つの便宜的な制限酵素部位（中間ベクター制限部位）を、細胞 間結合ペプチドの合成りＮＡ配列中に設計しなければならない。もし、そのよう な部位がすでに存在する場合には、それらを、Ｓａｍｂｒｏｏｏｋ　Ｊ、　Ｆｒ ｉ＋ｓｃｈ　Ｅ、Ｐ、及びＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａ＋ｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ@Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、 Ｙ、　（１９８９））が説明しているような標準処理を行なった後、部位特異的 突然変異誘発によってスキームのこの時点で導入してもよい。この開示は、参考 として本明細書に取り入れらでいる。

この結果生じるベクター構成は、より大きいベクター中に組み込まれた融合蛋白 遺伝子の生体内現位置構成を表わす中間体塩基ベクターである。シングルあるい はマルチコピーポリペプチドをコード化する任意の天然あるいは合成りＮＡ配列 を、中間ベクター制限部位中に挿入して、発現ベクター中に組み込まれた融合蛋 白遺伝子を得ることもできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他において説明されている方法 によって、結合蛋白質遺伝子と可変融合ポリペプチドのＤＮＡ配列との間の結合 領域の配列決定のような公知の技術によって、適当な挿入と解読枠アラインメン トを検査してもよい。

第２の代替例において、任意の２つの隣接ＤＮＡ断片を一緒に連結反応させた後 、結果として生ずる中間遺伝子を、上述の制限連結法によって塩基ベクターへ転 移させてもよい。適当な制限部位の構成、また必要であれば、上記の連結処理を 含むＳａｍｂｒｏｏｋ手法に従って、この第３ＤＮＡ断片（すなわち、結合蛋白 質遺伝子すなわち可変融合ポリペプチド遺伝子）を中間遺伝子を運搬する塩基ベ クター中に挿入してもよい。制限、挿入、連結、その他のためのすべてのプロト コルは、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋによって説明されたような標酵的処理に従う。

推奨塩基ベクターには、特別の宿主と適合性を持ち、その宿主の中で安定してお り、カリ、形質変換を行なった宿主を確実に選択できる任意のプラスミドが含ま れる。そのようなベクターにふくまれるものとしては、たとえば、Ｐ、Ｈ。

Ｐｏｕｗｃｌｓ、　Ｂ、Ｅ、　Ｅｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ、及びＷ、Ｊ、　Ｂｒａｎ ｉｍｅｒ、　Ｃ１ｏｎｉｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｅｌｓｅｖ奄モ■ Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂ、　（１９８５））　において特徴づけられ、説明され ている、ｐＴＺ１８／１９Ｌｌ／ＲやｐＰＬ−ラムダがあるが、これは、参考ど して本明細書に取り入れらでいる適当なプロモーター、リポソーム結合部の配列 コード付け、選択のための表現型遺伝子、転写、翻訳のための、及び、結果とし て生ずる生体保護シングルあるいはマルチコピーポリペプチドの、翻訳後の細胞 内操作のための調節領域が、最終的な組換型発現ベクターによって担持される。

燐酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション（ｅｌｃｃ＋ｒｏｐｏｒａｔｉ ｏｎ）　、微注入法のような標準的方法によって、この発現ベクターは原核ある いは真核宿主細胞中に導入される。

表現型あるいは設計されて組換型ベクター中に入っている他の形質を選択するこ とによって、最終的な組換型発現ベクターで形質転換した宿主細胞の分離は行な われる。一般に、そのような選択形質には、宿主中の、抗生物質耐性や欠陥機能 の相補性が含まれる。本発明の組換型ベクターの推奨表現型遺伝子には、抗生物 質耐性を持つ表現型、必須アミノ酸表現型、及び他の必須化合物表現型が含まれ る。

選択され、形質変換した宿主細胞が、初期から中期対数期まで増殖し、誘導化合 物で処理されて、ノングルあるいはマルチコピー生体保護ポリペプチドの生成が 引起こされるように、誘導形質発現システムを使用することが望ましい。通常、 最大数時間の間（各シングルあるいはポリペプチドのための最も適当な培養時間 は、異なる時刻のサンプリングによって決定される）培養が続けられ、その時点 で細胞は収集され、溶解される。もし形質転換した宿主細胞が、生体保護シング ルあるいはマルチコピーポリペプチドを分泌するように設計されていれば、その 培養物は増殖し、ついには、ポリペプチドの適当な及び／又は所望の濃縮物が培 地中に存在するようになる。もし宿主細胞がその細胞原形質中に溶けたポリペプ チドを含む場合、最適の成熟に達するまで、その培養物は増殖する。次いで、成 熟した培養物は適当な作用物質で溶解されて、ポリペプチドが遊離される。もし 、ポリペプチドすなわち融合蛋白が、溶解しない顆粒として宿主細胞中に沈積す れば、成熟した細胞培養物が溶解され、その遊離非溶解顆粒は、カオトロピック 作動物質中で溶かされる。この培養、増殖、溶解プロセスは、バッチすなわち連 続法で行なうことができる。

形質転換した細胞は、細胞によって自然に形質発現した分子量のもっと大きな蛋 白まで、多重コピーポリペプチドを含むポリペプチドを形質発現することができ る。原核細胞について言えば、通常形質発現される組換型蛋白のサイズは、約５ ００，０００のダルトンより小さいことをこれは意味する。　Ｂ、Ｌｅｗｉｎ　 （Ｇｅｎｅｓ。

４ｆｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　ｐａｇｅｓ　６０６−６０７．０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９９０））によ■■ 開示されているように、これは、例えば太股直によって天然生成されるある種の 酵素のサイズである。この開示は、参考として本明細書に取り入れらでいる。

真核細胞では、約５００，０（Ｘｌダルトン以上のより大きいサイズの蛋白が利 用されるが、通１：（、それらのより大きい蛋白はサブユニットとして形質発現 され、そのような細胞中で形質発現後の操作によってアセンブルされる。そのよ うなより大きい蛋白の例として、ヘモグロビン抗体が含まれる。本発明を限定す る意図は少しもないが、非常に大きい蛋白（５００，０００個のダルトン以上） の形質発現は、非常に大きい蛋白の合成中の５０％に接近する誤読頻度によって 制限されると、巴われる。

また、他の要因が、組換型発現ベクターで形質転換した細胞の融合蛋白の形質発 現の制御と範囲に影響している可能性もある。組換型発現ベクターがこれらの要 因を使用して構成されれば、マルチコピー形質発現カセットあるいはベクターの 最適な形質発現を達成することができる。

その第１要因とは、マルチコピー蛋白の遺伝子配列が遺伝子配列中に変種を持た なければならないということである。この変種によって、遺伝子配列と蛋白配列 に沿う高度な反復が回避される。細胞がこの反復配列を認識し、その配列すなわ ち蛋白を除去したり同化したりするので、このような反復は、遺伝子と形質発現 した融合蛋白の両方を危険にさらすものである。

第２の要因は、結合蛋白質遺伝子断片が酵素に見合うサイズを持たなければなら ないということである。所望の蛋白に必要な遺伝子断片の変動による翻訳効率の 変動をこのサイズによって最小にしたり、妨げたりできる。上述の理由よって、 後者の遺伝子断片変動は重要である。リーダー配列が短い場合、細胞は、蛋白の 形質発現効率を低下させるシグナルとしてテール配列の変異を認識する。

第３の要因は、マルチコピー代替ポリペプチド中に存在するある種のポリペプチ ドのほうが、他のポリペプチドより収量効率が大きく増加するということである 。この効率は、所望の蛋白の重量に対する結合蛋白質の重量比に左右される。あ る数取上のコピーを行なうと、収量効率は、２５０，０００ダルトン以上の全分 子世については、顕著な増加を示さな（なる。

第４の要因は、形質発現した蛋白は、可溶性を持つか、形質転換細胞の細胞質中 に顆粒（封入体）を形成しなければならないということである。この融合蛋白が 可溶性を持つか、顆粒を形成する場合、融合蛋白の純化及び形質発現後操作を、 より容易に行なうことができる。

第５の要因は、強い結合インヒビター／酵素連結が用いられ、融合蛋白の分離と 純化が行なわれるということである。この目標を達成するために、融合蛋白は、 インヒビター中の遊離酵素によって示されるものと本質的に同じ結合定数を酵素 とそのインヒビターとの間で維持しなければならないということである。

組換え生成されたシングルあるいはマルチコピー融合蛋白について説明してきた が、上記の手法は、また、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドのＮ端及 び／又はＣ末端端部に対する生体付加保護基として異なるポリペプチド、ペプチ ド及び／又はアミノ酸を加えるために使用することもできる。たとえば、上述の 方法において、結合蛋白質が除去された場合、細胞間結合ペプチドは、生体付加 保護基としてそれ自身で十分である。もう１つの例では、この生体付加保護基を 、シングルコピーポリペプチドのＮ端及び／又はＣ末端アミノ酸に加えたシング ルアミノ酸と同じくらい単純にすることができる。

代替バージョンとして、このシングルあるいはマルチコピーポリペプチドを、所 望のポリペプチドのアミノ酸配列部のみを持つ端を切り取ったポリペプチドとし て、組換えによりに生成することもできる。この組換え生成した端を切り取った シングルあるいはマルチコピーポリペプチドは、分子のＮ末端又はＣ末端におい て約１から約１０個アミノ酸が欠けているものであることが望ましい。この端を 切り取ったシングルあるいはマルチコピーポリペプチドの遺伝子は、自動合成に よって合成することもできるし、あるいは、最高１０個のアミノ酸のコード配列 を除去できるように、全遺伝子配列の制限エンドヌクレアーゼ切断によって得る こともできる。この端を切り取った遺伝子を、結合蛋白質と細胞間結合ペプチド 、あるいは、本明細書で説明したような他の任意の生体付加保護基の遺伝子配列 と結合させてもよい。この端を切り取ったシングルあるいはマルチコピーポリペ プチドから欠けているアミノ酸は、後に修飾反応によって置換される。

本発明のＣ末端及び／又はＮ−末端選択的修飾方法のための推奨開始材料は、縦 列に（＋ａｎｄｏｍｌいを連鎖し、結合蛋白質と、ペプチドを介して相互結合し 、また、アミノ酸を介して相互結合しているポリペプチドのいくつかのコピーを 持つマルチコピー融合蛋白である。推奨マルチコピー融合蛋白の一例は、ヒトカ ルボニックアンヒドラーゼ１１結合蛋白質で構成され、この蛋白質は、メチオニ ン２４０をロイシン、イソロイシンへ変換することよって、修飾される。このロ イシンとイソロイシンはニレテロキナーゼ認識部位、あるいは、シアノアン臭化 物とヒドロキシルアミン認識部位によって、マルチコピーポリペプチドからなる Ｎ末端α−アミンに相互結合している。そしてこのマルチコピーポリペプチドは ３つの縦列に（ｔａｎｄｏｍｌｙ）連鎖したポリペプチドマストパラン（アミノ 酸°アルギニンと相互結合）のコピーを有し、また、Ｃ末端アルギニンを有して いる。分離と純化でのその有用性が終わると、このヒトカルボニックアンヒドラ ーゼＩＩ結合蛋白質オプションによって、結合蛋白質の除去が可能になる。この オプションによって、所望の最終ポリペプチド部を形成しない結合蛋白質配列の 化学的処理が不要になる。この利点の中には、半融合蛋白の溶解性の増大、後続 処理における半融合蛋白の処理の容易さの増大、半融合蛋白の分離と純化を行な う能力の増大、及び最終生成物に現れないペプチド配列の初期脱離が含まれるが 、利点はこれらに限られるものではない。ヒトカルボニックアンヒドラーゼマス トパラン融合蛋白の形質発現カセットは、以下のように形成される。ヒトカルボ ニックアンヒドラーゼＩＩ結合蛋白質の特に推奨される遺伝子は、係属中の出願 Ｎｏ０７１５５２゜８１０に説明されているようにして得られる。ｃＡＩＩ遺伝 子を用いる場合、少くとも酵素の官能基フラグメントを表わす部分は、次に述べ る通り、修飾される＝（ａ）ｈｃＡＩＩアスパラギン−グリシン・ペプチド配列 は、変えられる；アスパラギンがグルタミンに変えられるか、もしくは、グリシ ンがアラニンに変えられる：（ｂ）　最後の３つの末端アミノ酸の配列は削除さ れる。オプションとして、このｈｃＡＩＩはさらに修飾され、メチオニン２４０ がロイシン、イソロイシンあるいはセリンへ変換される。（ミニ修飾ｈｃＡ１１ ）。

この修飾されたｈｃＡ１１遺伝子配列を大ｍ菌と適合性を持つ発現ベクター中に 挿入することもできる。平滑断端あるいは粘性断端連結による遺伝子に先立つベ クターの調節部分から下流にある部位でのＤＮＡ配列の切断によって、組換型ベ クターが形成される。この挿入は、宿主細胞での形質発現を行なうプロモーター 配列から下流で行なわれる。推奨プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。Ｔ ７プロモーターは、イソプロピルチオガラクトシドによって誘発された染色体に コード化されたＴ７ＲＮＡによって認識される。

細胞間結合ペプチドの短いＤＮＡフラグメントコードが、生あるいは部分ｈＣＡ 遺伝子の３゛あるいは５′炭素原子末端近くに挿入される。（細胞内ペプチドに ついては以下に論述する）。推奨バージョンとして、ニレテロキナーゼによって 認識されるペプチド配列および臭化シアン（Ｍｅｔ）あるいはヒドロキシルアミ ン（Ａｓｎ）によって認識される配列ペプチドがカルボニックアンヒドラーゼの ３゛炭素原子末端に挿入される。この配列が以下を読み込むように、Ｇｌｙで、 化学薬品による認識配列がスペースされる・Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎカルボニッ クアンヒドラーゼＩＩ−エンテロキナーゼ認識部位構成上へ融合された遺伝子は 、アルギニン残基によって切り離されたマストパラン配列の３つのコピーがコー ド化される。（Ｃ末端アルギニンを含む４５個のアミノ酸）マストパランのアミ ノ酸配列は、Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ ｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｃｕ　（ＳＥＯＩ Ｄ　Ｎｏ：　７）である。この遺伝子は、Ｓ、　Ｂｅａｕｃａｇｃ他（Ｔｃｌｒ ａ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２１：８５９　（１９８１））によって説明される ような、複数の相補的オリゴヌクレオチド合成法によって、合成調製される。そ してこれは、太１１の最適コドン用法を利用して設Ｊ１され、特有の有用な制限 エンドヌクレアーゼ部位が含まれる。この合成遺伝子は、標準組換ＤＮＡ法によ って、ニレテロキナーゼ認識部位から下流の発現ベクター中に直ちに挿入される 。

人Ｍ細胞は、発現ベクターで形質転換され、形質転換細胞が選択される。

細胞中の蛋白の形質発現は、イソプロピルチオガラクトシドで誘導される。一旦 、十分な蛋白が蓄積されると、細胞は溶解され、融合蛋白が純化される。

４　シングルあるいはマルチコピー融合蛋白の純化融合蛋白として生成された組 換型シングルあるいはマルチコピーポリペプチドは、アフィニティークロマトグ ラフィーにより容易な純化を可能にする。形質転換した細胞に生成されたこの融 合蛋白は細胞可溶であり、封入体中では溶解しない。可溶融合蛋白は、形質転換 した細胞の細胞溶解によって得られ、生細胞溶解産物が形成される。この生細胞 溶解産物は、アフィニティークロマトグラフィーによって純化される＋ｉｉｆに 、限外濾過及びイオン交換クロマトグラフィーを含む方法によってさらに純化さ れる。封入体の非溶解融合蛋白も、同様の方法によって純化される。

親和性純化を行なうために、天然のままの材料混合液を、結合蛋白質の固定化リ ガンドと化合させる。結合蛋白質の例として、対応するリガンド及び解離定数を 表２に示す。推奨カルボニックアンヒドラーゼ酵素、あるいは、推奨修飾カルボ ニックアンヒドラーゼ酵素あるいはミニ修飾カルボニックアンヒドラーゼ酵素に 対して、そのリガンドは、サルファニルアミドあるいはベンゼン・スルフォンア ミド誘導体である。固体担体上のリガンドの固定化は、Ｗの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｓｆ、　３４．２８８−２９４　（１９７４）；　Ｓ、　Ｍａｒｃｕｓ、　Ｍｅ ｔｈｏｄ＋す浜位工虹、、　３４．３７７−３８５（１９７４）；　Ａ、　Ｍａ ｔｓｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　３４．３ ０３−４　（１９７４）；　ＲCＢａｒｋｅｒ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　３１７−３２８　（１９７４）；　ｒ、 　Ｍａｊｓｕｍｏｊｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌA、　３４゜ ３２４−３４１　（１９７４）、　Ｊ、　Ｊｏｈａｎｓｅｎ、　Ｃａｒｌｓｂｅ ｒ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４７３　（１９７６）@ａｎｄ Ｇ、　Ｓ、　Ｂｅｔｈｃｌｌ　ｃ＋　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 、　２５４．２５７２−２５７４　（１９７９））によってsな うことが可能である。この開示は、参考として本明細書に取り入れらでいる。リ ガンドに対する結合蛋白質の可逆的親和性によって、融合蛋白は固定化リガンド に結合する。次いで、天然のままの材料混合液の残り成分とデブリを洗浄あるい は同様の技術によって除去してもよい。

この融合蛋白のなおいっそうの純化のために、２つのルートを使ってもよい。第 １ルートによって、シングルあるいはマルチコピー融合蛋白は、強い競合リガン ド溶液を用いた洗浄によって固定化リガンドから生のまま解離される。例として 、シアン化物、並びに、チオシアニド（ｔｈｉｏｃｙａｎｉｄｅｓ）　、過塩素 酸塩（ｐｃｒｃｈｌｏｒａ＋ｅｓ）　、ハロゲン化物及び強ルイス塩基のような 偽シアン化合物（ｐｓｅｕｄｏｃｙａｎｉｄｅｓ）が挙げられる０第２ルートに よって、固定化シングルあるいはマルチコピー融合蛋白を直接切断試薬で接触さ せ、シングルあるいは、マルチコピーポリペプチドを遊離させる。第２ルートで 、シングルあるいはマルチコピーポリペプチドを分離させるためには、よい切断 酵素をもつその混合液を、分子量選択手段（例えば、分配クロマトグラフィー潅 流、分子の大きさに基づく濾過、あるいは、「粒子除外」塩基に対する高圧液体 クロマトグラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフィー）と組み合わせて、 高い分子景切断酵素を遊離可変融合ペプチドから切り離すようにする。あるいは 、この混合液を、切断酵素のための固定化親和性材料と組合せてもよい。

選ばれた切断酵素は、選ばれた細胞間結合ペプチドに依存する。切断酵素とその 切断部位の例を表１に示す。

上述の純化法によって、本発明の方法に用いる開始材料が得られる。すなわち、 シングルコピー融合蛋白、マルチコピー融合蛋白、シングルコピーポリペプチド 、マルチコピーポリペプチド、あるいは端を切り取ったシングルあるいは、マル チコピーポリペプチド。推奨実施例において、シングル及びマルチコピーポリペ プチドは、融合蛋白から組換えによりに生成される。シングルコピー及びマルチ コピーポリペプチドの両方を、結合蛋白質あるいは細胞間結合ペプチドの存在な しで、分子のＮ−末端及び／又はＣ末端端部に追加残基を用いて組換え生成する こともできる。

推奨バージョンとして、ヒトカルボニックアンヒドラーゼ、修飾あるいはミニ修 飾した７ヒト力ルポニツクアンヒドラーゼマルチコピーマストパラン融合蛋白は 、イオン交換クロマトグラフィーに先立って、限外濾過により形質転換した大腸 菌細胞溶解産物から分離される。次いで、その細胞溶解産物材料は、サルファニ ルアミドを含む親和性カラム上へ乗せられる。次いで、この結合された融合蛋白 は、チオシアン酸塩カリウムで洗浄することによって親和性カラムから遊離され る。カルボニックアンヒドラーゼ、修飾カルボニックアンヒドラーゼ、あるいは 、ミニ修飾カルボニックアンヒドラーゼが使用される場合、純化された融合材料 は、ニレテロキナーゼで消化され、マルチコピーポリペプチドは限外濾過によっ てカルボニックアンヒドラーゼ結合蛋白質から純化される。この純化されたマル チコピーポリペプチドは、アルギニン残基によって細胞内結合したマストバラン の３つのコピーから成り、Ｃ末端アルギニン残基と非保護Ｎ末端α−アミンと他 の側鎖基を有する。このカルボニックアンヒドラーゼ結合蛋白質がミニ修飾変形 部である場合、純化された融合材料は、まず、臭化シアンで消化され、カルボニ ックアンヒドラーゼ残基が融合蛋白の残りから切断される。この結果化じる半融 合蛋白は、アルギニン残基によって細胞内結合したマストパランの３つのコピー から成る純化されたマルチコピーポリペプチドであり、Ｃ末端アルギニン残基と 、Ｎ−末端Ａｓｐ＃　Ｌｙｓ配列、あるいは、Ｎ末端α−アミンを保護している Ｂ、　間然および出発物質の化学保護剤による反応所定の組換えポリペプチドを Ｎ−および／またはＣ−末端α炭素反応性基で選択的に修飾するために、他の反 応性側鎖は３種までの化学保護剤による反応によって保護される。Ｎ−および／ またはＣ−末端α炭素で生物学的に添加された保護基は間然して、修飾に利用で きる非保護の反応性Ｎ−および／またはＣ−末端α炭素基を生成する。

間然および反応段階の数および順序は出発物質および修飾法によって変わり得る 。反応体系は先ず出発物質を化学保護剤と反応させ、次いでＮ−および／または Ｃ−末端生物学的保護基に特異的な間然試薬により間然することによって実施さ れる場合がある。例えば、出発物質がＮ−末端アミノ酸で修飾される場合または 生物学的添加保護基の間然部位が所定のポリペプチド中に存在する場合、出発物 質は先ず保護され、次いで間然される。その他の場合、出発物質は先ず間然され 、次いで３種までの化学保護剤と反応させる。例えば、Ｃ−末端アミノ酸で修飾 するためには、出発物質は先ず間然され、次いで化学保護剤と反応させる。

間然および反応段階の数および順序について他の変法も可能である。反応体系は 第３表に示された要因に従って選択することがでる。

可ユ青 出発物質 ！丙　中の存在　立法 １、生物学的保護基の間然認識配列　はい　化学保護剤と反応、次いで開がポリ ペプチドのアミノ酸配列　烈。

中に存在するか。

いいえ　いずれの方法でも可。

２．８−末端アミノ酸が修飾される　はい　化学保護剤と反応、次いで開のか。

　烈。

いいえ　間然、次いで化学保護剤と反 応。

３、出発物質は多重コピー融合蛋白　はい　２段階の間然が必要。

質か。　相互および内部結合ペプチド での間然。

４、Ｎ−およびＣ−末端アミノ酸の　はい　余分の間然（ｃｌｅａｖａｇ両りが 修飾されるのか。　Ｃ）および修飾段階が必要。

５、修飾反応は反応性側鎖基の保護　はい　修飾前に化学保護剤と反応さを必要 とするか。　せる。

いいえ　間然、次いで修飾。化学保護 剤による反応は不必要。

特イ■の出発物質が選択され形成されると、反応体系の各段階は第３表の要因に 従って選択することができる。

例えば、好適な多重コピー融合蛋白質のＮ−末端修飾については、次の反応体系 が選択される。好適な多重コピー融合蛋白質は、アルギニン残基によって内部結 合され、エンテロキナーゼ識別ペプチドにより炭酸脱水酵素に相互結合され、Ｃ −末端アルギニン残基を有するマストペランポリペプチドの３つのコピーか、ま たはメチオニン・グリシン・アスパラギン残基によって２４０位にセリン、イソ ロイシンまたはロイシンを有する最小修飾炭酸脱水酵素に相互結合された３つの 内部結合マストペランコピーである。このデミツージョン蛋白前駆物質もまたＣ −末端アルギニン残基を有する。相互−または内部結合ペプチドの配列のいずれ も単独コピーポリペプチド中に見出されていないので、反応体系はいずれの方法 でも進行する。しかし、Ｎ−末端修飾が望れるから、多重コピー融合蛋白質は化 学保護剤と反応した後間然される。出発物質は多重コピー融合蛋白質であるから 、間然は、この場合異なる相互結合ペプチドおよび内部結合ペプチドに特異的な 間然酵素による反応である。デミツージョン蛋白前駆物質を使用する場合、相互 結合ペプチドのメチオニンは先ず臭化シアンで間然されてＮ−末端生物学的保護 基を生成する。この多重コピーデミツージョン蛋白質は化学保護剤と反応した後 、第二の間然で数個のコピーおよび遊離Ｎ−末端アミンを遊離させる。Ｎ−末端 α−炭素のみが修飾されるから、間然後は追加の間然または修飾反応は必要では ない。修飾反応はＮ−末端アセチル化反応または反応性側鎖基の保護を必要とす る合成有機アシル化慧によるアシル化反応である。最終産物はＮ−末端アセチル 基またはＮ−末端合成有機アシル基を有するマストペランである。この反応体系 は次のように／１４ずことができる。

多重コピー融合蛋白質 ↓　（１）化学保護剤と反応 側鎖が保護された 多重コピー融合蛋白質 １　（２）内部結合ペプチドに特異的な↓　間然試薬による間然 側鎖が保護された 単独コピーポリペプチド １　（３）相互結合ペプチドに特異的な↓　間然試薬による間然 側鎖が保護された Ｊｌ−保護Ｎ−末端α−アミンを有する単独コピーポリペプチド ↓　（４）修飾 側鎖が保護された 修飾単独コピーポリペプチド ↓　（５）脱保護 Ｎ−末端修飾 単独コピーポリペプチド １、　反応性側鎖基の化学保護剤による保護。

精製単独または多重コピー融合伍白質並びに単独または多重コピーポリペプチド もまたε−アミン、ヒドロキシル、カルボキシルおよびチオールのような反応性 基を有する側鎖を持つアミノ酸を含有する。さらに、末端アミノ酸α−炭素反応 性基の一つもまた非保護にすることができる。Ｎ−末端ａ−アミンおよび／また はＣ−末端ａ−カルボキシル基で選択修飾する皐値のために、これら他の反応性 基は修飾剤との反応に利用されないように保護される。

精製単独または多重コピー融合蛋白質並びに単独または多重コピーポリペプチド は３種までの化学保護剤と反応させる。保護剤は、記載したように特有の種類の 側鎖反応性基において保護基を形成する能力によって選択される。単独コピーポ リペプチド中に存在する種々の種類の側鎖反応性基によって、一つを超える種類 の保護剤を使用することができる。

好適には、単独コピーポリペプチドが選択されるには一部には、種々の側鎖反応 性基の数が制限されていて使用する化学保護剤の数を最小にするからである。

例えば、好適には、単独コピーポリペプチドは反応性側鎖基としてε−アミンお よびヒドロキシル基を含有するマストペランである。

ａ、アミン保護 少なくとも１つの反応性アミン基を有する単独または多重コピー組換えポリペプ チドは化学保護剤と反応してアミン特異性保護基を生成する。好適には、単独ま たは多重コピーポリペプチドのみ一アミノ反応性側鎖基を含有する。第二の保護 剤はα−アミン並びにリジンに見出される様なε−アミン側鎖基に作用して安定 であるが可逆性の結合を生成する。

アミン基と保護基との間に生成した結合は、化学修飾反応条件に耐えるほど十分 安定であるが、また容易に可逆的であって元のアミン基の脱保護および再生を可 能にする。アミン保護基を生成する適切な化学保護剤は、Ｃ−末端アミノ酸のカ ルボキシルまたはＮ−末端α−アミンで生成される結合の安定性と比較して、非 保護基とより低い安定性の結合を形成する保護剤を確認することによって選択す ることができる。化学保護剤は、非保護アミンまたはヒドロキシル基で低い安定 性の結合を形成し、典型的にポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸であるＮ −および／またはＣ−末端で生物学的保護基と相違する。本発明を限定するもの ではないが、保護基は、Ｃ−末端ａ−カルボキシル基に生成するカルボニウムイ オンに対して保護基上のカルボニウムイオンの形成を安定化する保護置換基を確 認することによって選択することができる。芳香ｈＪＡ、酸素、窒素、不飽和基 、芳香族アセチル基、カルバメートおよび環状無水物を含有する置換基は、「リ ービング保護基」」二のカルボニウムイオンを安定化するように作用し、安定で あるがアミンと可逆的な結合を形成するように作用することができる基である。

適切な化学保護剤には、アルキル、アルコキシまたはアリールカルバメート化剤 、アルキルまたはアリール置換アシル化剤並びにアルキル、アルコキシまたはア リール置換無水物およびアリールまたは不飽和環状無水物が含まれる。これの保 護基の好適性順序は次の通りである。即ち、アリールまたは不飽和環状無水物〉 カルバメート〉安定化単独酸。

アミン保護基の特殊な実例には、Ｎ−トリクロロアセチル、Ｎ−トリフルオロア セチル、Ｎ−ｏ−ニトロフェニルアセチル、Ｎ−ｏ−ニトロフェノキシアセチル 、Ｎ−アセトアセチル、Ｎ−３−フェニルプロピオニル、Ｎ−３−（ｐ−ヒドロ キシフェニル）プロピオニル、Ｎ−２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ） プロピオニル、Ｎ−２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロピオ ニル、Ｎ−４−クロロブチリル、Ｎ−ｏ−ニトロシンナモイル、Ｎ−ピコリノイ ル、Ｎ−（Ｎ−−アセチルメチオニル）、Ｎ−ベンゾイル、Ｎ−フタロイル、お よびＮ−ジチアスクシノイルが含まれる。

カルバメート保護基（アミンを含む）の適切な実例には、メチルカルバメート、 Ｎ−フルオレニルメチルカルバメート、２．２．２−）リクロロエチルヵルバメ ート、２−トリメチルシリルエチルカルバメート、１．１−ジメチルプロピニル カルバメート、■−メチルー１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１ −（４−ビフェニリル）エチルカルバメート、■−ジメチルー２−ハロエチルカ ルバメート、１．エージメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｔ−ブチルカ ルバメート、シクロブチルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート 、１−アダマンチルカルバメート、ビニルカルバメート、アリルカルバメート、 シナミルカルバメート、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニ ルカルバメート、４．５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、ベンジル カルバメート、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニ トロベンジルカルバメート、２．４−ノクロロペンジル力ルバメート、３−ベン ズイソオキサプリルメチルカルバメート、９−アントリルメチルカルバメート、 ジフェニルメチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、Ｓ−ベンジルカ ルバメートおよびＮ−（Ｉ’Ｉ−フェニルアミノチオカルボニル）誘導体が含ま れる。

他のアミン保護基には、Ｎ−アリル、Ｎ−フェナシル、Ｎ−３−アセトキシプロ ピル、第四アンモニウム塩（ｑｕａｔｃｒｎａｒｙ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　５ａＩ ｔｓ）、Ｎ−メトキシメチル、Ｎ−ベンジルオキシメチル、Ｎ−ビバロイルオキ シメチル、Ｎ−テトラヒドロピラニル、Ｎ−２，４−ジニトロフェニル、Ｎ−ベ ンジル、Ｎ−ｏ−ニトロベンジル、Ｎ−ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、Ｎ −トリフェニルメチル、Ｎ−（ｐ−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、Ｎ− ジフェニル−４−ピリジルメチル、Ｎ−２−ピコリル−Ｎ−一オキシド、Ｎ。

Ｎ゛−イソプロピリジン、Ｎ−ベンジリデン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデン、Ｎ −サリチリジン、Ｎ−”（５，５−ツメチル−３−オキソ−１−シクロへキセニ ル）、Ｎ−ニトロ、Ｎ−オキシド、Ｎ−ジフェニルホスフィニル、Ｎ−ジメチル チオホスフィニル、Ｎ−ベンゼンスルフェニル、Ｎ−０−ニトロベンゼンスルフ ェニル、Ｎ−２，４，６−ドリメチルベンゼンスルフエニル、Ｎ−トルエンスル ホニル（Ｎ−１ｏｌｕｅｎｃｓｕＩｆｏｎｙｌ）、Ｎ−ベンジルスルホニル、Ｎ −トリフルオロメチルスルホニル（Ｎ−ＬｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅＬｙｌｓｕｌｆ ｏｎｙｌ）およびＮ−フェナシルスルホニルが含まれる。

本発明の特に好適な保護剤は無水マレイン酸または無水シトラコン酸である。

典型的には、アミン基は次に示すようにアミノ基と酸無水物との反応によるアミ ド結合の生成によって保護することができる。

塩基性ｐＨ ＲＮＨ＋　ＲＯＣＯＣＯＲ−−→　ＲＮＨＣＯＲ＋　Ｃ０ＯＲこの反応は、好適 にはＮ末端アミノ酸の非保護α−アミノ基およびリジンのε−アミノ基おいて可 逆的で安定なアミド結合が生成するのに有利な条件下で実施される。典鰺ｚ的に は、アルギニンおよびヒスチジンはノー常に反応性が低い。

カルバメートによるアミン保護は、次のようにアミン基の反応によって進行する 。

ＮａＯＨ，２５℃ ＲＮＨ＋　（ＣＩ　）　Ｃｏｃｏ　Ｃｏ　（ＣＨ３）３−−→ＲＮＨＣＯＯＣ（ ＣＨ３）３ また、反応条件は、非保護Ｎ−末端αアミンおよびリジンε−アミン基が保護さ れる様に選択される。典型的には、アルギニンおよびヒスチジンは比較的非反応 的である。

また、ポリペプチドアミン基はＮ−アルキル化またはアリル化を含む他の種類の 基の添加によっても保護することができる。例えば、三フッ化ホウ素の存在でア ミンとジアゾ化合物との反応の結果、アミン基がＮ−アルキル化される。

反応条件の選択は、ポリペプチドアミノ酸組成、添加した保護基の種類および選 択した修飾剤に依存する。アミン基に保護基を添加する特殊な条件および試薬に ついては、［有機化学における保護基Ｊ　（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐ ｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｔ、グリーン編、ジョンウ ィリー　アンド　サンズ社発行、１９８８年に記載されている。それをここに参 考として取り込む。

ｂ、ヒドロキシル側鎖を存するアミノ酸の保護本発明の方法に有用である好適な 単独または多重コピー組換えポリペプチドまたは融合蛋白質は１つまたは２つの 異なった種類の反応性側鎖基を有し、それにはヒドロキシル側鎖を何するアミノ 酸が含まれる。例えば、ポリペプチドは反応性基としてα−アミン、ε−アミン およびヒドロキシルを含有することができる。

本発明の方法にはアミンおよびヒドロキシル反応性側鎖基の保護法が用意されて いる。

単独または多重コピーポリペプチドのヒドロキシル基は、アミン保護について＆ ！戟したようにポリペプチドと化学保護剤との反応によって保護される。化学保 護剤は、アミン保護についての記載と同一の方法で側鎖ヒドキシル基において安 定で可逆的な結合を生成する。ヒドロキシル基と保護基との間に生成した結合は 化学修飾反応条件に耐えるだけ十分安定であるが、また容易に可逆して元のヒド ロキシル基の脱保護および再生を可能にする。

適切な第二の保護剤はアミン保護について記載したのと同一であり、アルキル、 アルコキシまたはアリールカーボネート化剤、アルキルまたはアリール置換アシ ル化剤、アルキル、アルコキシまたはアリール置換無水物、アリールまたは不飽 和環状無水物が含まれる。安定であるが容易に可逆的である結合を生成する好適 な保護基（ヒドロキシル酸素を含む）は、好適性の順序に従って、アリールまた は不飽和環状無水物、次いでカルバメート、次いで安定化単独酸である。

保護基の特殊な実例はアミン保護の節に記載されている。高度に好適なアミンお よびヒドロキシル保護剤は無水マレイン酸である。

その他、ヒドロキシル基保護は、ヒドロキシル側鎖基においてエーテルまたはエ ステル結合を生成する保護剤と出発物質とを反応させることによって実施するこ とができる。生成したエーテルまたはエステル結合は修飾条件に対して安定であ るが、充分に可逆的であって元のヒドロキシル基を再生する。

ヒドロキシル保護基の特殊な実例には次のエーテルが含まれる。即ち、メチルエ ーテル、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）　、メチルチオメチルエーテル（Ｍ ＴＭ）　、２−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ビス（２−クロロ エトキシ）メチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）、テトラ ヒドロチオピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロピラニルエーテル、４ −メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル 、テトラヒドロチオフラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、１−メチ ル−１−メトキシエチルエーテル、■−（フェニルセレニル）エチルエーテル、 ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテル、ベンジルエーテル、０−ニトロベンジル エーテル、トリフェニルメチルエーテル、α−ナフチルジフェニルメチルエーテ ル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチルエーテル、９−（９−フェニル−１ ０−オキソ）アントリルエーテル（トリタイロン（Ｔｒ　ｉ　Ｌｙ　１ｏｎｅ） ）　、トリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）　、イソプロピルジメチルシリルエ ーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）　、ｔ−ブチルジフ ェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテルおよびトリイソプロピルシ リルエーテル。

ヒドロキシル保護基の特殊な実例には次のエステルが含まれる。即ち、ホルメー トエステル、アセテートエステル、トリクロロアセテートエステル、フェノキシ アセテートエステル、インブチレートエステル、ビバロエートエステル、アダマ ントエートエステル、ベンゾエートエステル、２．４．６−トリメチルベンゾエ ート（メシトエート）エステル、メチルカーボネート、２．２．２−トリクロロ エチルカーボネート、アリルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、 ベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカ ーボネート、Ｎ−フェニルカルバメート、ニトレートエステルおよび２．４−ジ ニトロフェニルスルホネートエステル。

ａ、β−カルボキシル基またはγ−カルボキシル基の保護単コピーポリペプチド もしくはマルチコピーペプチドまたは融合タンパク質は、β−カルボキシル側鎖 またはγ−カルボキシル側鎖を含むアミノ酸も何することができる。β−カルボ キシル側鎖またはγ−カルボキシル側鎖は、カルボキシル基と反応して安定で可 逆的な結合をする化学保護剤で保護することができる。β−カルボキシル基また はγ−カルボキシル基の間で形成された結合は十分に安定しているのでα−カル ボキシル基の化学的修飾条件を維持できるが、容易に可逆反応を起こし元のβ− カルボキシル基またはγ−カルボキシル基を脱保護化し再生することができる。

カルボキシル基を保護する保護条件も、アミン保護基およびヒドロキシル保護基 あるいはその一方に悪影響を与えないように選択される。

カルボキシル基を保護する適切な保護剤には、０−ニトロフェノールエステル、 アルキルエステルまたはベンジルエステル、ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール エステル、アルキルクロロカルボネート、アジド、ヒドラジドなどがある。カル ボキシル基を保護するのに特に好ましい薬剤は、０−ニトロフェノールである。

カルボキシル基の具体的な例としては、以下のエステル、アミド。

ヒドラジドなどがある。すなわち、メチルエステル、メトキシメチルエステル、 メチルチオメチルエステル、テトラヒドロピラニルエステル、ベンジルオキシメ チルエステル、フェナシルエステル、Ｎ−フタルイミドメチルエステル、２．２ ．２−トリクロロエチルエステル、２−ハロエチルエステル、２−　（ｐ−トル エンスルホニル）エチルエステル。

【−ブチルエステル、シンナミルエステル、ベンジルエステル、トリフェニルメ チルエステル、ビス（０−ニトロフェニルメチルエステル）、９−アントリルメ チルエステル、２−　＋９．１０−ジオキソ）アントリルメチルエステル、ビペ ロニルエステル、トリメトルシリルエステル、Ｌ−ブチルジメチルシリルエステ ル、５−ｔ−ブチルエステル、２−アルキル−１゜３−オキサシリン、Ｎ、Ｎ− ジメチルアミド、Ｎ−７−ニトロインドイルアミド、ヒドラジド、Ｎ−フェニル ヒドラジド、Ｎ、　Ｎ’−ジイソプロピルヒドラジドなどである。

好ましいα−カルボキシル保護剤は、α−カルボキシル基の他。

β−カルボキシル基、γ−カルボキシル基で作用し、活性エステルを形成する。

α−カルボキシル基のアミド化のような選択的修飾は、２つの方法のうちの１つ で達成することができる。β−カルボキシル基またはα−カルボキシル基の保護 は、第一の保護剤を用いた単コピーポリペプチドまたはマルチコピーポリペプチ ドの反応後、別のステップとして起こり得る。あるいは、β−カルボキシル基ま たはα−カルボキシル基の保護は、修飾ステップ中に起こることもある。

第一の方法では、β−カルボキシル基またはα−カルボキシル基の保護は、別の ステップで行われ、一般には、アミン基およびヒドロキシル基が第一の化学保護 剤で保護された後に行われる。単コピーペプチドまたはマルチコピーペプチドは 、アルギニンなどの付加的なＣ−末端アミノ酸を有する。付加的なＣ−末端アミ ノ酸残基は、末位から２番目のα−カルボキシル基を保護する作用がある。Ｃ− 末端アルギニン残基で保護された単コピーポリペプチドまたはマルチコピーポリ ペプチドは、第２の薬剤と反応し、保護基をβ−カルボキシル基またはγ−カル ボキシル基の他、アルギニンのα−カルボキシル基に付加する。アルギニン基は 、カルボキシペプチダーゼＢによる消化によって除去されるが、保護されたβ− カルボキシル基もしくはγ−カルボＡシル基と保護されていないＣ−末端α−カ ルボキシル基とを有する単フビーペプチドまたはマルチコピーペプチドは残され る。保護されていないＣ−末端α−カルボキシル基は、化学的アミド化剤で選択 的にアミド化される。

第二の方法では、β−カルボキシル基、γ−カルボキシル基、α−カルボキシル 基は、修飾反応時に保護される。選択的α−カルボキシル修飾は、β−カルボキ シル基またはγ−カルボキシル基に比べて１反応が大きいａ−カルボキシル基に 有利な条件を選択することによって起こる。たとえば、カルボキシル基が活性エ ステルを形成することによって保護される場合、ｐｉ（６からｐＨ７までの理論 量のアンモニアを添加するこによってα−カルボキシル基では１選択的アミド化 が起こる０本発明を制限する意図は一切ないが、α−エステルおよびβ−エステ ルまたはγ−エステルの間のｐＫａ値の差異によって、α−カルボキシル基の選 択的アミド化が起こる。

ｄ、チオール保護 少な（とも一つの反応側鎖チオール基を有する単コピー組換えポリペプチドまた はマルチコピー組換えポリペプチドを化学保護剤に反応させ、チオール特異保護 基を形成する。チオール基と保護基との間に成された結合は、化学的修飾条件を 維持するのに十分に安定であるが、容易に可逆反応を起こし元のチオール基を脱 保護化し再生することができる。

チオール保護基の具体例には、Ｓ−ベンジルチオエーテル、５−ｐ−メトキシベ ンジルチオエーテル、５−ｐ−ニトロベンジルチオエーテル、５−４−ピコリル チオエーテル、５−２−ピコリル−Ｎ−オキシドチオエーテル、５−９−アント リルメチルチオエーテル、Ｓ−ジフェニルメチルチオエーテル、Ｓ〜ジ（ｐ−メ トキシフェニル）メチルチオエーテル、ｓ−トリフェニルエチルチオエーテル、 Ｓ−２，４−ジニトロフェニルチオエーテル。

５−ｔ−ブチルチオエーテル、Ｓ−イソブトジメチルへミチオアセクール。

５−２−テトラヒドロピラニルへミチオアセクール、Ｓ−ア七ドアミドメチルア ミノチオアセクール、Ｓ−シアノメチルチオエーテル、５−２−二トローｌ−フ ェニルエチルチオエーテル、Ｓ−２，２−ビス（カルボエトキシ）エチルチオエ ーテル、Ｓ−ベンゾイル誘導体、Ｓ−（Ｎ−エチルカルバメート）、Ｓ−メチル ジスルフィドなどがある。

好ましいチオール保護剤は、炭酸水素カリウム中の無水酢酸（ＣＨｓ（：０ａｌ Ｏ／ＫＨＣＯｉである。

一般に、チオール基は、以下のようなチオエーテル結合の形成によってＣ呆護す ることができる。

ｆｌｌｃｙｓ−Ｓｈ　＋　ＣＪｓＣ１１２ＣＩ　−−−−−−−−−−−Ｃ３’ ５ＳＣ１１２Ｃ６Ｈ９または ＣＦ、Ｃ０Ｊ ｆ２１ｃｙｓｓＨ＋　ｆｃｓＨｓｌｚ　ＣＨＯＩＩ　−−−−−−−−−−−＊ ＣｙｓＳＣＨＩＣｂＨ８）＊２５℃、１５分 この反応は、可逆的で安定なチオエーテル結合の形成に有利な条件下で行われる 。一般に、メチオニンはこのような条件では反応しなし１゜ あるいは、チオール基は、以下のようなチオエーテル結合の形成によって保護す ることができる。

単コピーポリペプチドまたはマルチコピーポリペプチドは、必要に応じてジメチ ルホルムアミドなどの有機溶媒に転移することができる。その他の反応側鎖基は 、このような反応条件によって悪影響を受けない。

反応条件の選択は、準コピーポリペプチドアミノ酸組成、付加された保護基のタ イプ、選択された修飾剤に依存する。チオール基に保護基を付加する具体的な条 件および試薬は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕ　ｓｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｌ、Ｔ、Ｇｒｅｅｎｅ、ｅｄｉｔｏｒ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　ａｎｄ　５ｏｎｓ＋１９８８１に記載されており、本文の参照として取り入れ た。

２・パ−側−の 生物学的保護基を切除して保護されていないＮ−末端またはＣ−末端のα−炭素 反応基を生成する。切除ステップは、化学保護剤を含む出発原料の反応前または 後に行われる。好ましい態様では、切除は側鎖保護基を保護剤で保護した後に起 こる。切除ステップには、２つ以上の切除試薬が必要であり、保護されていない Ｎ−末端またはＣ−末端のα−炭素反応基を生成する。保護されていないＣ−末 端またはＮ−末端のα−炭素反応基は、修飾に利用できる。

切除試薬は、相ｑ接続しているペプチドもしくは内部接続しているペプチドの認 識配列で切除する酵素または化学試薬が、Ｎ−末端もしくはＣ−末端の終端から 内部接続しているアミノ酸を除去する酵素または化学試薬である。相互接続また は内部接続しているペプチドに特異的な酵素および化学切除試薬の具体例は１表 １の通りである。

Ｃ−末端終端からアミノ酸残基を除去する酵素はカルボキシペプチダーゼであり 、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダ ーゼＹ、カルボキシペプチダーゼになどがある。ト末端終端から残基を除去する 酵素は、アミノペプチドであり、ロイシンアミノペプチダーゼ、アミノペプチダ ーゼＭ、アエロモナスアミノペプチダーゼ、Ｘ−プロビルジベブチジルアミノペ プチダーゼなどのほか１表１に記載の酵素がある。

切除試薬は一つで十分であるが、保護されていないＮ−末端またはＣ−末端のａ −炭素反応基を用意するには複数の切除試薬が必要な場合もある。相互接続また は内部接続しているペプチドには、切除部位がＪｌ数ある場合があり、少なくと も一つの酵素切除部位と一つの化学的切除部位がある。部位特異切除では、相互 接続または内部接続のペプチドのアミノ酸残基が、Ｎ−末端またはＣ−末端の終 端に留まる場合があり、カルボキシペプチダーゼ酵素消化またはアミノペプチダ ーゼ酵素に消化よって除去しなければならない場合がある。

複数の切除試薬およびステップも、出発原料の選択によっては必要となる。たと えば、出発原料がマルチコピー融合タンパク質である場合、相互接続および内部 接続しているペプチドに特異的な切除試薬を用いて切除すると、単コピーポリペ プチドの混合物を生成する。好ましくは、相互接続および内部接続のペプチドは 、同じ切除試薬によって認識される配列を有しているので、単コピーポリペプチ ドを一つの切除試薬だけを用いて一回だけのステップで生成することができる。

内部接続ペプチドおよび相互接続ペプチドが異なる場合、２つの異なる切除開票 を一緒に使用し、連続的に単コピーポリペプチドを生成することができる。単コ ピーポリペプチドの混合物は、Ｃ−末端終端で内部接続するペプチドを有する単 コピーポリペプチドを含む、修飾がＣ−末端α−カルボキシル基で行われた場合 。

混合物もカルボキシペプチダーゼで切除されて、Ｃ−末端終端の内部接続ペプチ ドが除去される。

Ｎ−末端およびＣ−末端のａ−炭素反応基を修飾する場合、複数の切除ステップ が必要になることがある。たとえば、生物学的保護基でＮ−末端およびＣ−末端 において保護された組換え単コピーポリペプチドは、連続的に切除される。一般 に、Ｎ−末端の生物学的保護基は除去された後、Ｎ−末端のａ−アミン基が修飾 される。次に、Ｃ−末端保護基が除去された後、Ｃ−末端α−炭素基が修飾され る。この場合、Ｎ−末端およびＣ−末端の生物学的保護基は、切除試薬が連続的 に切除できるように異なる認識配列を含む。

好ましい変更態様では、アルギニン残基によって内部接続されかつエンテロキナ ーゼ認識ペプチド配列によって無水炭酸に相互接続されるかまたはメチオニング リシンアスパラギンペプチド配列にょってＣ−末端アルギニンを用いてミニ修飾 された無水炭酸に内部接続された一ａｓｔｏｐａｒａｎポリペプチドの３つのコ ピーを有する組換えマルチコピー融合タンパク質を連続的に切除して、単コピー ポリペプチドを形成する。マルチコピー融合タンパク質は、エンテロキナーゼを 用いて切除するか、ミニ修飾された無水炭酸の場合には、（：ＮＢｒを用いて切 除し、無水炭酸配列を除去し、マルチコピーポリペプチドまたは半融合マルチコ ピーポリペプチドをそれぞれ生成する０次に、マルチコピーポリペプチドは、保 護基をｌ１ａｓｔｏｐａｒａｎポリペプチド存在下のリジンに含まれる保護され ていないＣ−アミノ基に付加する無水マレイン酸に反応させる。続いて半融合タ ンパク質をヒドロキシルアミンを用いて切除し、Ｎ−末端生物学的保護基（内部 接続ペプチド残基）を除去する。その後、マルチコピーポリペプチドまたはヒド ロキシルアミン処理の半融合マルチコピーポリペプチドをトリプシンで切除し、 単コピーポリペプチドの混合物を生成する。保護されたリジン基は、認識されず 、トリプシンでは切除されない。単コピーポリペプチドの混合物は、保護されて いないＮ−末端αアミン基を有する単コピーポリペプチドとＣ−末端α−カルボ キシル基で内部接続するペプチドとを含む。Ｃ−末端ａ−カルボキシル基を修飾 すべき場合は、保護されていないＮ−末端α−アミンを無水マレイン酸などの化 学保護剤と反応させて処理することによって保護し、Ｃ−末端内部接続ペプチド 残基をカルボキシペプチダーゼを用いて切除して除去する。生成される保護され ていないＣ−末端αカルボキシルを有する側鎖保Ｎ済みの単コピーポリペプチド を修飾することができる。

Ｃ，Ｎ−末端α−アミンおよびＣ−末端α−カルボキシル基あるいはのｍ−の　 が 組換えポリペプチドまたは組換えペプチドは、種々の有機成分を付加することに よってＮ−末端またはＣ−末端のα−炭素反応基において選択的に修飾すること ができる。本発明を制限する意図は一切ないが、Ｃ−末端のα−カルボキシル基 またはＮ−末端のａ−アミン基における修飾反応は請求核置換によって実施され る反応である請求核置換は、＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　ＣＩ＋ｅ＋＋ １ｓｔｒ　、　Ｃｈａｐｔｅｒ　１０．３ｒｄ、ｅｄ、、　Ｊｏｈｎ　Ｗｊｌｅ ｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　ｅｄｉｔｏｒ、　ＮＹ　ｆＪ、　Ｍａｒｃｈ　１９８ ４１に記載されており、本文に参照として取り入れた。Ｎ−末端およびＣ−末端 あるいはその一方のａ−炭素反応基は安定であり、側鎖基を再生するのに用いら れる脱保護化条件下では一般に不可逆的である。ポリペプチドは、同一の修飾ま たは異なる修飾によってＮ−末端およびＣ−末端のａ−炭素反応基で連続的に修 飾することができる。

具体的には、Ｄ−アミノ酸を付加したり、末端アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換し たりすることであり、Ｄ−アミノ酸は、ペプチド、Ｌ−アミノ酸ペプチド、アミ ノ酸類似体またはアミノ酸誘導体などをアミド結合の形成による組換えポリペプ チドの一端または両端に含む。本発明に係る方法の好ましい変更態様は、選択的 なＣ−末端α−カルボキシルアミド化反応または合成有機基を用いて選択された Ｎ−末端α−アミン反応である。

Ｎ−末端およびＣ−末端あるいはその一方のα−炭素反応基に成される修飾を複 数の因子に基づいて選択することができる。末端修飾を選択する際に考慮すべき 要因は、単コピーポリペプチドのアミノ酸配列と、単コピーポリペプチドのサイ ズと、単コピーポリペプチドの生物活性における変化と、修飾された単コピーポ リペプチドの用途と、修飾されたＮ−末端およびＣ−末端あるいはその一方のα −炭素に於（ブるラセミ化の阻止である。単コピーポリペプチドのアミノ酸配列 は、約１つまたは２つの異なる反応側鎖基を有することが好ましい。たとえば、 ε−アミン側鎖基およびヒドロキシル側鎖基を有するポリペプチドは、上述した アミン保護剤を用いる一回のステップだけで保護することができる。修飾、条件 、薬剤は、Ｃ−アミン基およびヒドロキシル基が修飾反応中に脱保護化されず、 悪影響を受けないように選択される。対照的に、ε−アミン基、ヒドロキシル基 、β−カルボキシル基またはγ−カルボキシル基と地オール基の両方を有する単 コピーポリペプチドでは、３つの異なる保護剤を用いて反応させ、ε−アミン基 、ヒドロキシル基、β−カルボキシル基またはγ−カルボキシル基の側鎖を保護 しなければならない。

修飾条件および修飾反応は、側鎖保護基を完全な状態に維持し悪影響を受けない ように選択される。

アミン保護基、カルボキシル保護基およびチオール保護基を脱保護化する条件は 、匡吐匹■坦二二二り組皿匡と二二二旦ユニ、　Ｔ、Ｇｒｅｅｎ、　ｅｄｉｔｏ ｒ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　ｆ１９８８）に記載されてい る。このような条件は、修飾プロセス中避けることが望ましく、このため、修飾 反応条件を選択し上述の側鎖反応基の脱保護化を阻止することが望ましい。

単コピーポリペプチドのサイズは、アミノ酸基的１０−５０個分である。

本発明に係る選択的修飾方法は、比較的大型のポリペプチドに対して実施され、 保護基および修飾基を付加する反応条件は、ポリペプチドの不可逆的に変性しな いように選択される。アミノ酸を５０個より多く含むポリペプチドは、約ｐＨ２ −１０の水溶液内で５０’Ｃ未満の温度で保護され修飾される。

ポリペプチドに対する修飾によって、ポリペプチドの生物活性は変化する。たと えば＝　ｌ１ａＳＬＯｐａｒａｎやヒトガストリン放出ペプチドなど、多くの小 型ペプチドのＣ−末端のアミド化によって、このようなペプチドの生物活性が高 まる。さらに、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のペプチド配列の付加によって 、特定の細胞タイプにポリペプチドの攻撃目標を定め、ペプチドの分解速度およ びクリアランス速度を低減し、生物学的効力を高め、その他の生物活性をポリペ プチドに付与することができる。Ｄ−アミノ酸またはアミノ酸を含むペプチドも しくは誘導体によって、アンタゴニストを形成することもできる。修飾方法は、 ペプチドの生物活性の所望の変化によって選択される。修飾反応および修飾条件 を選択する際に考慮すべき第４の因子は、修飾された産物の用途である。

ポリペプチドをｉｌ　ｖｉｖｏで使用すべき場合は１選択された修飾方法はポリ ペプチドの生物活性を高める方法、ｉｌ的にする方法、拡張する方法、または、 阻害する方法のうちの一つである。ポリペプチドが診断テストに使用するために 修飾されている場合は、生物活性よりもポリペプチドの構造に対する修飾の影響 が試験される９診断テストに使用するには、修飾されたポリペプチドは、抗体に よって、または、標的分子への特異的結合によって依然として認識される。

修飾反応および修飾条件を選択する際に考慮すべき第５の因子は。

修飾された単コピーポリペプチドのラセミ混合物の形成を阻止することである。

ある種の修飾反応は、ラセミ混合物を生成することが知られているので２本発明 に係る方法には適切ではない。

修飾反応および修飾条件の具体例は以下の通りである。

１、カルボキシ末端アミノ酸の Ｕ庇ヱ亙上北 保護されていないＣ−末端α−カルボキシル基を有する保護型コピーペプチドを 標準的な方法によって化学アミド化剤に反応させるが、コレニつイ”ＣＬｔ、Ｂ ｏｄｎａｓｚｋｙ、Ｌ区亘ｅ　Ｃｈ↓上但Ｌ工し　Ｐｒ匹■姐Ｉ　Ｔｅｘｔｂｏ ｏｋ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖａｒｌａｇ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　ｆ１９８８ １に記載されており、本文に参照として取り入れた。適切な化学アミド化剤は、 ｌ−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）エチルカルボジイミドおよ びアンモニアと、ジシクロヘキシルおよびアンモニアと、混合無水物およびアン モニアと、メタノール性塩酸およびアンモニアと、０−ニトロフェニルエステル およびアンモニアと、１−ヒドロキシベンゾトラゾールおよびアンモニアのエス テルおよびアンモニアなとがある。

一般に、保護ポリペプチドは、カルボジイミドや０−ニトロフェノールなどの化 学アミド化剤と反応し、以下のように活性エステルを形成する。

（Ｉｔ　ＲＣＯＯＨ＋　Ｃａ１１５ＣＮＣＣ＊Ｉｌｓ　＋　Ｃｓ１１４０ＨＮＯ ｉ　−−−−−＝ＲＣＯＯＣ；５ＨｎＮＯ２１２１ＲＣＯＯＣｓＨＪ（ｈ　＋　 Ｎｌｌ、−−−−−＝　ＲＣＯＮＩＩ２　＋　Ｃｓｌ＋４０８ＮＯｉアミド化は 、アンモニアまたはアンモニアソースな活性エステルに添加する際に生じる。ポ リペプチドに存在する他のカルボキシル側鎖や酸性側鎖は、既に保護されていな い場合は、活性エステルを形成する。選択的にσ−カルボキシルＣ−末端をアミ ド化するには１反応条件なβ−カルボキシル側鎖またはγ−カルボキシル側鎖に 比べてより反応的なａ−カルボキシルにおけるアミド化に有利になるように選択 する。たとえば、理論量のアンモニアを約ｐ１（６で添加すると、α−カルボキ シル基におけるアミド形成に有利になる。カルボキシルの活性条件およびアミド 化条件は、アミンヒドロキシル基の脱保護化が起きないことなどである。

アミド化の別の方法は、保護されていないＣ−末端α−カルボキシル基を光求核 性０−ニトロフェノールーグリシンアミドに反応させることである。光求核は、 カルボキシル基をアミドに変換するよう作用する。

反応条件は、ポリペプチドのアミノ酸組成、使用される保護基のタイプ、選択さ れる化学アミド化削によって選択される。たとえば。

ポリペプチドがβ−カルボキシル基またはγ−カルボキシル基を含まない場合、 ａ−カルボキシルのアミド化に有利な条件を用いる必要はない。

好ましい側鎖保護ｍａｓＬｏｐａｒａｎポリペプチドを、ｌ−エチル−３−（３ −ジメチル−アミノプロピル）エチルカルボジイミド塩酸塩に過剰なＮＨ４０１ １の（７在下で反応させ、Ｃ−末端アミド化保護ｍａｓｔｏｐａｒａｎポリペプ チドを形成する。＋ｅａｓＬｏｐａｒａｎは、アスパラギン酸またはグルタミン 酸を含まないので、反応条件はα−カルボキシル基のアミド化に有利になるよう 調整されない。その後、Ｃ−末端アミド化保護ポリペプチドは、脱保護化され、 精製される。

２、０−アミノ酸またはペプチド、Ｌ−アミノ酸ペプチドおよびアミノ酸誘導体 を用いてのＮ−末端アミノ酸およびＣ−ゴ　アミノ　の Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはその組み合わせを含むペ プチドを、アミド基転移またはセグメント縮合反応によって保護型コピーポリペ プチドのＮ−末端およびＣ−末端あるいはその一方のａ−炭素反応基に結合する ことができる。また、Ｄ−アミノ酸。

Ｌ−アミノ酸、アミノ酸誘導体またはその混合物を含むペプチドは。

Ｎ−末端またはＣ−末端のアミノ酸または側鎖保護組換え単コピーポリペプチド の一部のアミノ酸の代わることができる。

一般に、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドは、よく 知られる液相または固相のペプチド合成によって付加することができるが、これ については、銃ｌｉｄ匡肛二ム匹夏７ｓｉｓ、２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊ、Ｍ 、Ｓｔｅｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、Ｙｏｕｎｇ、ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｐｉｅｒｃ ｅ　ＣｈｅｌＩｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌＬｉ１９８４１記 載されており１本文に参照として取り入れた。このような反応の一例は、ウレタ ン遮断アミノ酸をカルボジイミド、混合無水物または活性エステルの存在下で側 鎖保護型コピーポリペプチドの遊離Ｎ−末端α−アミンに結合させるものであ。

反応図を以下に示す。

カルボジイミド ｆｃｌＩ　９１　ｓ（：０ＯＮＨ−ＣＩＩＲ−ＣＯＯＩＩ＋ＮＨ２Ｒ’　−−− −−−−−−−＝　ｆｃＨｓｌ　ｓ　Ｃ００ＮＨＣＨＲＣＯmＨＲ’　１ 有情溶媒 別の合成方法は、セグメント縮合方法であり、小型のペプチドをト末端α−アミ ン基にカップリングする場合に使用することが好ましいが、これについては、Ｆ 、Ｆｉｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　３ｒｄ、　ｅｄ。

Ｎｅｕｒａｔｈ　ａｎｄ　Ｈｉｌｌ、　ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　Ｖｏｌ、２．　ｐｐ、１０５−２５３　ｆ１９７６１． に記載されており、本文に参照として取り入れた。

Ｎ−末端アミノ酸の置換は、Ｎ−末端のアミノ酸を除去するか１表１に記載した ような化学切除試薬または酵素切除試薬を用いるかまたはアミノペプチダーゼも しくはカルボペプチダーゼを用いる切除によるアミノ酸を除去することによって 、達成される。あるいは１組換え生成された単コピーポリペプチドを、遺伝子配 列がＮ−末端またはＣ−末端のアミノ酸に対するコドンが無くなるように生成す ることができる。保護単コピーポリペプチドは、約１０個までＮ−末端アミノ酸 を欠損していることが好ましいが、上述のようにＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、 アミノ酸誘導体またはその混合物を含むペプチドを付加することによって修飾す ることができる。

具体例は、ジペプチドＴｙｒ−Ｄ−＾１ａを有するヒツジβ−エンドルフィンの ２つのＮ−末端アミノ酸の置換などである。自然に存在するヒツジβ−エンドル フィンは、３１個のアミノ酸を有する０組換え生成ペプチドに用いる出発原料は 、アルギニンによって内部接続された切端β−エンドルフィン（アミノ酸３−３ １個）のマルチコピーを含むマルチコピーポリペプチド融合タンパク質である。

＋１１保護　（２）切除 ＢＰ−Ａｒｇ−８，−１＋−＾ｒｇ−Ｂｓ−ｔ＋−＾ｒｇ−ｍｓ−１１−Ａｒｇ −−−−−−’　−−−−−−１無水　トリプシンを マレイン酸　使用 （３）　セグメント縮合 ＮＨｉ−Ｂｔ−ｔ＋−Ａｒｇ　＋　ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−ＣＯＯＩＩ 　−−−−一−−−−−−−４カルボジイミド （４）脱保護化 ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ−Ｄ−＾１ａ−ａｓ−ｓ＋−＾ｒｇ　−−−−−−−−−−− −１１ａｌｐＨ・２　約２時間 ｔｂ＋カルボキシペプチダーゼ Ｔｙｒ−Ｄ−＾１ａ−Ｂｔ−ｔ＋ ＢＰ−＾ｒｇ−Ｂｓ−ｓ＋−＾ｒｇ−Ｂｓ−１＋−Ａｒｇ−ｍｓ−ｓ＋−＾ｒｇ ＝アルギニンによる切端β−エンドルフィンｆＢｓ−月）の複数のコピーにＡｒ ｇによって相互接続された結合クンバク質から成るマルチコピー融合クンバク質 Ｎｌ２−Ｂｖ−ｓビ＾ｒ（＜＝　Ｃ−末端アルギニンおよび保護されていないＮ −末端α−アミンを有する単コピー切端ヒツジβ−エンドルフィン ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ＝　ＦＭＯＣを有するＮ−末端で保護されたジペ プチド（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ−Ｄ−＾ １ａ−Ｂｓ−９＋−＾ｒｇ＝　Ｎ−末端修飾保護β−エンドルフィン Ｔｙｒ−Ｄ−＾１ａ−Ｂ＋−５１＝　Ｎ−末端修飾β−エンドルフィン 生物活性ペプチドに成される修飾のタイプの具体例には、Ｌ−Ｎ１２−才キソビ ペリジン−６−イルカルボニル１−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−チアゾリジン−４−カ ルボキサミドをチロリベリン（ＴＲＦＩに付加すること、３−メチルヒスチジン をＴＲＦに付加すること、修飾Ｃ−末端のデス−Ｇｌｙ”−Ｐｒｏ’−Ｎ−エチ ルアミドを横体形成ホルモン放出因子（ＬＲＦ）に付加すること、＾ｃ−Ｄ−Ｐ ｈｅ’およびＰ（：１−Ｄ−Ｐｈｅ’あるいはその一方を有するＬＲＦの修飾Ｎ −末端をリドリンに付加すること、Ｎ−末端ピログルクミル残基を付加すること 、Ｄ−アラニンをエンケファリンの２−の位置に付加すること、ａ−エンドルフ ィンアミドおよびγ−エンドルフィンアミドを付加することを含む、生物活性ペ プチドのその他の類似体は、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｎ＋ｅｒ　Ｃｅ＋＋＋１ｃａｌ　 Ｅｎｃ　ｃｌｏ　ｅｄｉａ、　１２：６０３−６１７に記載されており。

本文に参照として取り入れた。好ましい修飾は、保護単コピーポリペプチドのＣ −末端またはＮ−末端の終端にＤ−アミノ酸を付加することである。

末端アミノ酸に付加するかまたは代わることができるアミノ酸誘導体の具体例に は、ピログルクミル残基、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチ ジン、ヒドロキシリジン、デスモシン。

Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリンなどがある。

３、Ｎ−アセ　ル　のり 自然に存在するポリペプチドおよび類似体は、Ｎ−末端アセチル基またはＮ−末 端オリゴペプチドの先頭の配列またはＮ−末端合成有機成分を有し得る。Ｎ−末 端アセチル基またはＮ−末端オリゴペプチド先頭配列またはＮ−末端合成有機成 分を供給する修飾反応は、保護単コピーポリペプチドを以下のようにアセトアニ リドまたはオリゴペプチド先頭のもしくは合成有機の成分を有する保護されてい ないＮ−末端α−アミン基に反応させることも含む。

ａｌ　Ｎ１ｈＣＲ＋Ｃ００Ｒｚ　＋　ｆｃＩＩｓｃＯｌ　２０−−−−−”Ｃｌ ＩＣ０ＮＩＩＣＲ＋ＣＯＯＲ２＋　Ｃｌｌ１ＣＯＯ１ｌｂｌ　Ｎｌ１ｉＣＲＩＣ ＯＯＲｓ　”　（Ａ＾）３ＮＩＩＣＲ＋ＣＯＯ１ｌ　−−−−−→（＾Ａｌ　、 Ｎ１１ＣＨＲ亨Ｃ０ＮＨＣＲ＋ＧＯＯＲ２＋　Ｈ２０ｃｌ　Ｎ１ｂＣＲ１ＣＯＯ Ｒｔ　＋　Ｒ５Ｃ００）１　−−−−−＝Ｒ）ｌｃＯＮＨｃＲ＋ｃＯＯＲ２÷　 Ｈ’０アセチル化されたＮ−末端アミノ酸を有する類似体の例は、ＬＲＦアンク ゴニストである。

旦、−一説ｌｉｔ化 次に、側鎖保Ｘ％修飾ポリペプチドは、関連する特定の保護基によって異なる種 々の条件を用いて脱保護化される。脱保護化には、保護基の除去および元の反応 基を望ましくない反応を行わずに再生することが必要である。

選択される脱保護化条件は、保護基のタイプによって決まる。たとえば、アミド 保護基およびカルバメート保護基を約ｐ旧−４までの酸化条件下でインキュベー トすることができる。アミン脱保護基およびヒドロキシル脱保護基を望ましくな い反応をさせずに除去できるその他の条件は、上述のＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇ ｒｏｕ　ｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　ＣｈｅｎＩｉｓｔｒに記載されている。

アミン保護基およびヒドロキシル保護基の具体例には、以下の反応などがある。

カルパメー　の　２、 ＣＦＩＣＯＯＩＩ／Ｐｈ５Ｈ １１ＲＮ）ＩＣＯＯ＋Ｃｌ１ｓｌｖ　Ｃ００Ｃ（Ｃｌｌ＊ｈ　−−−−−−−− −−−−→ＲＮＩｈ２５℃　１時間 ピペリジン　２５℃ ２１　ＲＮＨ−９−フルオレニルー−−−−−−−−−−−−ＲＮｌｈｌＯ分 ｐＨ２−３ ３１ＲＮＩ（ＣＯＣＨ＝　ＣｌＩＣ０ＯＨ−−−−−−−−−−−−−ＲＮｌｈ ２時間 カルボキシル保護基は、約８−１１の高いｐＨでインキュベートすることによっ て除去することができる。望ましくない併発反応をさせずにカルボキシ保護基を 除去するためのその他の条件は、上述の二匹区二匹■肚り江Ｊユと旦匹肚虹旦■ に記載されている。カルボキシル保護基の切除の具体例には、以下の反応などが ある。

ＣＦ、Ｃ００Ｈ ＲＣＯＯＯＣＩｌ、５Ｃ１１，−−−−−−−−−−−−−ＲＣＩｌｏｏｌｌ、 　８０−９０％２５℃、１５分 ＫＯＨ／１８−クラウン−６、ＰｂＭｅ＾ｒｃＯｏ−Ｔ−Ｂｕ　−−−−−−− −−−−−−ＡＲＣＯＯＩ１１００℃、５時間、９４％ チオール保護基は、ＮａおよびＮＨｓの存在下で除去すること力≦できる。

チオール保護基を除去するその他の条（牛ｌよ、上述の江吐匹■二二匹ｕＳ１ｎ Ｏｒ８旧ｉｔ二３己載されてし＼る。

千オール保護基切除の具体例にｔよ、以下の反応など力呪ある。

Ｎａ／Ｎｉ＋。

Ｉｔ　ＣｙｓＳＣＩＩｚＣ＊１ｌｑ−−−−−−−−−−−−−ＣｙｓＳＨＩＯ 分 ０．２ＮａＯＩＩ１２ ２１　ＣｙｓＳＣＯＣｌ＋＋−−−−−−−−−−−−−ＣｙｓＳＩＩ２０℃ さらに、修飾側鎖保護ペプチドは、内部を妾続ペプチドタ１基をＣ−末端終端ま たはＮ−末端終端に有する場合もある。内部接続残基力≦反応図の初期の段階で 除去されなｌ、Ｘ場合、カルボキシペプチダーゼやアミノペプチダーゼなどの切 除酵素を用し１てそれら残基をＦｔ！ｌ（ヒし除去することができる。

側鎖保護線コビーボリベブチドカ９．アミド保護基およびブ＞／し４ζキシル保 護基など、−１類よりも多く存在する（呆護基を有する場合、保護基が連続的に 除去されるように脱保護化することができる。

たとえば、アミン保護基およびヒドロキシル保護基を約ｐＨ２で２時間インキュ ベートすることによって除去することができる９次に、カルボキシル保護基を約 ｐｕｓ　−１１で２時間インキュベートすることによって除去することができる や　脱保護化条件のその他の組み合わせを用いて、保護基を反応側鎖基から除去 して元の反応基を再生することができる。

脱保護化後の最終生成物は修飾されたＣ−末端およびＮ−末端あるいその一方の アミノ酸を有する単フビーボリベブチドである。この最終生成物は、サイズ排除 クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト グラフィーなどの標準的な方法によって精製することができる。好ましい変更態 様では、−ａｓｔｏｌｌａｒａｎなどの小型ペプチドは、サイズ排除カラムクロ マトグラフィーまたはＩＩＰＬ（：クロマトグラフイーによって精製することが できる。

本発明を種々の具体的で好ましい実施例および技術について述べてきた。しかし ながら、多くの変更および修正を本発明に係る精神および範囲を逸脱せずに成し 得ることは理解できよう。

Ｌ Ｃ−末端アルギニン基を有する組換えマルチコピー融合タンパク質からのＣ−末 端αアミドボーペプチドの５ マルチコピー融合クンバク質をコードする組換え遺伝子を有する発現ベクターは 、Ｉｊｌ準的な組換えＤＮＡ方法によって形成される。

すなわち、ヒト無水炭酸に対する遺伝子は、３つのＣ−末端アミノ酸に対応する ヌクレオチド配列の除去によって修飾される。あるいは、ミニ修飾されたヒト無 水炭酸に対する遺伝子は、メチオニン２４０をロイシンまたはセリンに変換する か、または、３つのＣ−末端アミノ酸に対するヌクレオチド配列を除去すること によって修飾される。アルギニン残基によって内部接続されたｍａｓｔｏｐａｒ ａｎの３つのコピーを含みＣ＝末端アルギニンを有するマルチコピーポリペプチ ドをコードする遺伝子は、自動化された技術によって合成される。自動化された 技術は、Ｓ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌによるＴｅｔｒａ、　Ｌｅｔｔｅ ｒｓ、　２２１：８５９　（１９８１）に記載されており１本文に参照として取 り入れた。

Ｃ−末端アルギニンを有するマルチコピーｍａｓｔｏｐａｒａｎポリペプチド（ アミノｗ１４５個分）の合成は、大腸菌に対する最適コドン使用法を用いて行わ れ、萄用な制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチコピーポリペプチドが生 成される。エンテロキナーゼ認識配列（Ｖａｌ−＾ｓｐ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙ ｓ）　（配列番号、８）を含む相互接続ペプチドは、上述の自動化された方法に よって合成される。あるいは、相互接続ペプチドＤＮＡ配列は、ミニ修飾された ヒト無水炭酸とともに用いるためのメチオニングリシンアスパラギングリシン配 列であっても良い。この遺伝子は、上述の自動化された方法によって合成するこ とができる。

ヒト無水炭酸に対する遺伝子は、当業者らに一般に知られる方法で、プラスミド 下流にＴ７ブロモータから挿入されるが、これについては、上述のＳａｍｂｒｏ ｏｋらの文献に記載されている。相互接続ペプチドに対するＤＮＡ配列は、無水 炭酸遺伝子から下流に挿入される。

ｍａｓｔｏｐａｒａｎポリペプチドの複数のコピーをコードする遺伝子は、相互 接続ペプチドに対する配列から直下の下流に挿入される。

一般にＤＮＡ配列は１本文に記載した制限エンドヌクレアーゼの消化および連結 によって挿入される。　０．５−２ａ＋ｇのプラスミドＤＮＡの試料は、２０ｍ １の１倍制限＆！衝液内で１−２０単位の制限酵素を用いて消化することができ る０反応混合物は、酵素供給者によって推奨されるおんどで１−１６６時間イン キュベートれる。線状化ベクターは、仔ウシの腸のホスファターゼまたは細菌ア ルカリ性ホスファターゼを用いて、供給者によって提唱されているような当業者 らに知られる条件下で脱保護化することができる。さらにその後、ＤＮＡはフェ ニル抽出やエタノール沈澱などを通常必要とする標準的な方法によって精製され る（上述のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献参照）。

次に、挿入すべきＤＮＡセグメントは、　（大型のフラグメントに対しては）３ −５倍または（短いオリゴヌクレオチドに対しては）２〇−３０倍モル余分な予 め切断したクローニングベクターに混合される。

結合は、１倍連結緩衝液内（２０ａｍ　）−リスｐＨ７，６，１０＋ａｍ塩化マ グネシウム、０．４ｍｍβ−メルカプトエタノール、０．４−１ａ＋Ａ　Ｔ　Ｐ 　）で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で、１６℃、１６時間で行われる。同じ手続 きを連続的に繰り返し、ＤＮＡセグメントを連続的に添加し、制限エンドヌクレ アーゼを選択し、新たに挿入したＤＮＡセグメントを選択的に配置する。再形成 されたベクターのアリコートを使用し、感応大ＩＩ＆ｌ閑細胞を塩化力ルシウｔ 、沈澱によって形質転換し１組換えプラスミドに関して選択する。

細菌は、プラスミドＤＮＡを用いて形質転換される。ルリアブイヨンは、細菌培 養でインキュベートされ、細胞は最適温度でｌａ＋１あたり１０’−１０’の濃 度に増殖される。培地は、約０℃で凍結され、遠心分離され、細胞が収集される 。次に細胞は、水様に冷えた５０１ｍｍの無菌溶液または塩化カルシウムとｌ０ ｍｌ１のトリス塩化物（ｐＨ８，０１中で再懸濁される。処理細胞を濃縮した懸 濁の結果、新たなベクターを容易に受容できるようになる。一般に、新たなベク ターには１選択マーカーまたはリポータ−遺伝子を含む０選択マーカー遺伝子は 、一般に抗生物質耐性をコードする。

最大の形質転換効率を得るには、細菌培養は成長の対数期にあることが好ましく 、細胞富度は塩化カルシウムを用いた処理の時点では低いことが好ましく、処理 細胞は４０℃で１２−２４時間維持されることが好ましい。ベクターを溶解する には、連結反応のアリコートを処理細胞の懸７ｉｌ液に添加する。この化合物を 混合し短時間氷上で保管する。　（１００マイクロリツトルまでの連結緩衝液ま たはＴＥに溶解された）４０−Ｊ−ノグラノ、までのＤＮＡを各形質転換に使用 することができる。次に、形質転換細胞および培養チューブを２分間４０℃の湯 に移入する。ルリアブイヨンのアリコート各チューブに添加し、細胞を３７℃で （テトラサイクリンの場合）約３０分間または（アンピシリンまたはカナマイシ ンの場合）１時間インキュベートする。この時期２細菌が回復し、抗生物質耐性 を発現することができる。細胞は１選択培地に拡散され、！適温度でインキュベ ートされる。コロニーは一夜のうちに現れることになろう（上述のＳａ＋ｍｂｒ ｏｏｋらの文献から採用）。

形質転換大腸菌は、適切な抗生物質を含むプレートを使用することによって選択 される（すなわち、耐性は導入されたプラスミドによって付与される）。一般的 な最終濃縮物は、１ｍｌあたり１００マイクログラムのアンピシリンと、１ｍｌ あたりｌＯマイクログラムクロロフェニコールと、１＋ｓｌあたり５０マイクロ グラムのカナマイシンと、Ｉａ＋１あたり２５マイクログラムのストレプトマイ シンと、１腸１あたり１５マイクログラムのテトラサイクリンである。宿主とし て大腸ｉｌｌ　ｂ１２１　ｆＤＥ３１ｐｌｙｓを使用する場合、形質転換細胞を アンピシリンおよびクロロフェニコールを上述の濃度で含む培地上で培養する。

好ましい実施例では、形質転換細胞を培養する方法は、上述のＳａａ＋ｂｒｏｏ ｋらの方法を実行する。すなわち、この方法は、形質転換され選択された細菌コ ロニー１つだけを適切な抗生物質を含む小量（３−５ａｌｌの細菌増殖培地（ル リアブイヨンなど）に移入することを含む、この培地は、３７℃（またはその他 の適切な温度）でインキュベートされ、多量になるまで増大される。

細胞は、５０ＩＩＩ１１トリス−塩酸１ｐＨ７，９１−１ａ＋１あたり１０マイ クログラムのＤＮＡ５Ｅ　Ｉを有する塩化ナトリウム１００ｍｍを含む０．５ａ ＋ｏＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む８３０ｍ１を音波処理で溶菌する。リゾチーム（：１ ０■ｇ）を添加し、溶菌液を一晩インキュベートし、細胞フラグメントを破壊す る。

組換えタンパク質を不溶性顆粒から生成するには、溶菌液を延伸分離し、デオキ シコール酸ナトリウムを用いてインキユベートし。

数回水で洗浄する。細胞溶菌液は冷凍にされ、解凍される。さらに細胞溶菌液は 、限外ろ過およびＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーによって精製される０次に １部分精製された融合タンパク質は、スルファニルアミドを含むアフィニティー カラムにかけて精製される。

部分精製された細胞溶菌液は、従来の方法によって調製されたスルファニルアミ ドセファロースのカラムを通じてボンピングされる。

結合タンパク質は、０．５Ｍトリス−硫酸塩−ｌト硫酸ナトリウム（ｐＨ７，５ １を用いて洗浄され、その他の材料を除去する。無水炭酸を含む結合マルチコピ ー融合タンパク質は、０．２Ｍチオシアン酸カリウムおよび０．５トドリス−硫 酸塩（ｐＨ７，５）を用いて溶出される。

精製マルチコピー融合タンパク質は、１０Ｉｌｉ＋ｌ−リス緩衝液（ｐＨ８，０ ）中で３７℃で１５時間かけてウシエテロキナーゼによって消化される。

エンテロキナーゼは、＾５ｐ４Ｌｙｓで相互接続ペプチドを切除し、遊離無水炭 酸酵素と遊離α−アミン基およびＣ−末端アルギニン基を有するマルチコピー融 合タンパク質とを形成する。マルチコピーポリペプチドは、限外ろ過によって無 水炭酸から精製される。あるいは、精製マルチコピー半融合タンパク質前駆対を トリス緩衝液（ｐＨ８，０１中で臭化シアンを用いて処理し、無水炭酸配列を切 除する。マルチコピー半融合ペプチドは、限外ろ過によって無水炭酸残基から精 製される。

マルチコピーポリペプチドに存在するα−アミン基、Ｃ−アミン基およびヒドロ キシル基は、無水マレイン酸などのアミン保護基を有するポリペプチドによって 保護される。マルチコピー半融合タンパク質を使用する場合、ａ−アミンはすで に生物学的保護基によって保護され、マルチコピー半融合ポリペプチドに存在す るＣ−ヒドロキシル基は、上述のように保護される。無水マレイン酸は、アミン に反応し、酸性アミド保護基な昧のＧｕｌ（ＣＩ　（ｐＨ８−８，５）存在下で 形成する。この反応の後、１にの限外ろ過による緩衝液交換を行う。

マルチコピーポリペプチドがカルボキシル基を含む場合、β−カルボキシル基ま たはγ−カルボキシル基は、メタノールやエタノールなどの活性アルコールを用 いて保護される。マルチコピーポリペプチドまたはマルチコピー半融合ポリペプ チドは、トリプシンで切除される。トリプシンは、内部接続アルギニン残基の位 置のみで切除し、アミン保護リジン残基の位置を切除しない。トリプシン消化に よさて、単コピーポリペプチドが形成されるが、その中には遊離Ｎ−末端アミン 基を有するものがてり、マルチコピー半融合ポリペプチドを使用する場合には、 すべてが遊離Ｎ−末端アミン基を有する。

次に、単コピーポリペプチドは、カルボキシペプチダーゼＢによって消化される 。カルボキシペプチダーゼＢは、アルギニン残基をＣ−末端から切除する。Ｃ− 末端アルギニン残基をα−カルボキシル基で保護する場合、カルボキシペプチダ ーゼはエステル保護基を切除し、アルギニンも除去する。

単コピーポリペプチドの混合物は、遊離α−アミン基を有するものがあるが、さ らに無水マレイン酸で処理され、トリプシンを用いた切除に生成される遊離アミ ン基を保護する。完全に保護された単コピーポリペプチドは次にジメチルホルム アミドおよび塩化メチレンから成る混合物に交換される。

保護ポリペプチドは、Ｎ−末端α−アミン基と、Ｃ−末端アルギニンの切除時に 生成され保護されていないＣ−末端α−カルボキシル基とを有する。保護ポリペ プチドをジシクロへキシルカルボジイミドおよび０−ニトロフェノールに反応さ せ、Ｃ−末端α−カルボキシル基に活性エステルを生成する。活性化された保護 ポリペプチドは、アンモニア水溶液に移され、アミンが保護されたＣ−末端α− アミドポリペプチドを形成する。

保護されたａ−アミド化ポリペプチドアミン基およびヒドロキシル基は、約ｐＨ ２，０で２時間２０℃で処理することによって脱保護化される。カルボキシル基 は、アルカリ処理によって、約ｐ）１Ｂ−１０で脱保護化される。脱保護化され たＣ−末端α−アミドポリペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって 精製される。

匠１ 組換えマルチコピータンパク質からの Ｃ−α−アミトポ１ペプチドのシ 組換えマルチコピークンバク質を例１のように形成する。組換えマルチコピータ ンパク質は、内部接続ペプチドと接続される単コピーポリペプチドの？Ｉ数のコ ピーを有する。組換えマルチコピーポリペプチドは、グルタミン酸と内部接続さ れるミオシン軽鎖キナーゼ開害剤の３つのコピーを含む。ミオシン軽鎖キナーゼ 阻害剤の配列は、Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｖａｌ　（配列番号：９）である。マルチコピータンパク質を コードするＤＮＡ配列は、自動化された方法によって合成され、例１に記載した ように調製された発現ベクトルの丁７ブロモータから下流がクローン化される。

組換えマルチコピータンパク質は、例１に記載されたように調製される組換え発 現ベクトルを有する形質転換大腸菌に発現する０組換えマルチコピークンバク質 は、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤に特異的な固定モノクローナル抗体を用いるア フィニティークロマトグラフィーによって形質転換細胞溶菌液から精製すること ができる。

複数コピーポリペプチドは、黄色ブドウ球菌ｖ８切除酵素を用いて、グルタミン 酸で切除され、複数単位の羊コピーポリペプチドの混合物を形成する。単コピー ポリペプチドの混合物は、保護されていないα−アミン基と内部接続ペプチドの 酵素切除によって生成された側鎖アミン基とを有するポリペプチドを含む。この ような保護されていないα−アミン基は無水マレイン酸を用いた反応によって保 護され、Ｃ−末端グルタミン酸残基な有する完全に保護された単フビーペプチド を形成する。Ｃ−末端グルタミン酸残基は、ｐＨ，５でカルボキシペプチダーゼ によって除去される。

Ｃ−末端グルタミン酸の除去とα−アミン基および８−アミン基の保護は、どち らを先に行っても良い。完全に保護化した単コピーポリペプチドは、ＤＭＦ／Ｄ ＣＭ中のジシクロへキシルカルボジイミドを用いて反応させた後、水酸化アンモ アを用いて反応させることによってアミド化される。アミド化は、α−カルボキ シルＣ−末端アミノ酸の位置で選択的に行われ、Ｃ−末端α−アミンを形成する 。

ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤の保護Ｃ−末端α−アミドは、ｐＨ２で約２時間か けて脱保護化される。α−アミド化ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤は、ＨＰＬＣサ イズ排除クロマトグラフィーによって精製される。

透」。

組換え単コピー融合タンパク質からの Ｃ−・　α−アミトポ１ペプ　ドのシ 組換え単コピー融合タンパク質は、無水炭酸がアルギニンによってポリペプチド 傷害治堕因子のコピー一つだけに接続することを除いて５例１に記載されたよう に形成される６　傷害治痣因子の配列は、＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−＾ １ａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｐ ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ　（配列番号：１）で ある、ペプチドをコードする遺伝子は１例１のように記載された自動化された技 術によって生成され、結合タンパク質に対する遺伝子と例１に説明した発現ベク ターの相互接続ペプチドとにを結合される。単コピー融合タンパク質は、例１に 記載したように発現され、生成される。

組換え生成融合タンパク質は、クロストリバインを用いてアルギニン相互接続ペ プチドで切除され、保護されていないα−アミン基をＮ−末端に形成する。

単コピーポリペプチドを５ＭのＧｕｌｌＣ１中で無水マレイン酸に反応させ（ｐ Ｈ８−８，５）　、単コピーポリペプチドを保護する。

保護された琳コピーポリペプチドをアミド化剤として過剰な水酸化アンモニウム 中で水溶性カルボジイミドに反応させ、Ｃ−末端α−アミドポリペプチドを形成 する。

保護されたＣ−末端α−アミドポリペプチドは、約ｐＨ２で２時間かけて脱保護 化され、Ｃ−末端でα−アミド化された傷害治疹因子は、）ＩＰＬＣサイズ排除 クロマトグラフィーによって精製される。

匠Ａ 組換えポリペプチドのＮ−末端およびＣ−末端のアミノ酸α−炭素反応基の ｌ肚皿良１ 組換えクンコピー融合タンパク質を例３記載のように形成する。

単コピー融合タンパク質は、トロンビン認識ペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ）　（配列番号：４）を介して別のＣ−末端アルギニン残基を有する傷 害治廼因子に相互接続される結合タンパク質（Ｎ−末端α−保護基）として無水 炭酸を含む、単コピーポリペプチドは、Ｎ−末端およびＣ−末端の両方のα−炭 素反応基で保護される。

組換え単コピー融合タンパク質を、５ＭのＧｕＨＣｌ　（ｐＨ８−８，５）中で マレイン酸に反応させ、単コピーポリペプチドを保護する。無水マレイン酸は、 セリンおよびリジンの側鎖基を保護する。

次に、保護された単コピー融合タンパク質を取り除き、トロンビンを用いて切除 される。トロンビンは相互接続ペプチドで切除し、保護されていないＮ−末端α −アミン基を有する保護ポリペプチドを形成する。

保護されていないト末端ａ−アミン基を有する保護ポリペプチドを第一の修飾剤 すなわちビログルチマルアミノ酸に反応させ、カルボジイミドの伴在下でＮ−末 端アミノ酸およびビログルチマル残基との間にアミド結合でつなぐ。この反応は 、ＤＭＦなどの有機溶媒において実行され、ビログルチマルとカルボジイミドを 溶解できるようにする。これで、保護された１１＋Ｌコピーポリペプチドは、Ｎ −末端α−アミン反応基の位置で選（１セ的に修飾される。

Ｃ−末端アルギニンは、カルボキシベブチグーゼを用いて切除され、Ｎ−末端α −アミンの位置で修飾されかつ保護されていないＣ−末端カルボキシル基を何す る単コピーポリペプチドを保護する。保護されていないＣ−末端α−カルボキシ ル基を水溶性カルボジイミドおよび過剰な水酸化アンモニアに反応させて、Ｎ− 末端α−アミン修飾カルボキシルアミドとＣ−末端α−カルボキシルアミドを有 する単コピーポリペプチドを保護する。

Ｃ−末端ａ−アミドとＮ−末端ビログルチマル残基を有し保護された単コピーポ リペプチドをｐｌ＋２の酸性溶液で２時間かけて脱保護化する。

脱１８！護化の後の最終生成物は、アミド化によってＣ−末端αカルボキシルで 修飾され、かつ、さらにビログルチマル残基を有するＮ−末端σ−アミンで修飾 される傷害治應因子ペプチドである。

１旦 マルチコピー融合タンパク質から誘導されたブラジキニンのＮ−・　アミノ　の 出発原料は、ＡｓローＧｌｙによってミニ修飾無水炭酸（Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　２４ ０）に取り込まれた切端マルチコピー融合タンパク質の３つのコピーを含むマル チコピー融合タンパク質である。ミニ修飾された無水炭酸遺伝子が１例１に記載 されたように丁７プロモータの塩基ベクター下流に得られサブクローン化される 。マルチコピーポリペプチドに対する遺伝子は、自動化された合成方法によって 合成され、以下のようにマルチコピーポリペプチドのＮ−末端に相互接続された Ｍｅｔ　Ｇｌｙ八ｓへに対するコード配列と縦列リンクされるアミノ酸残基４− ９個分のブラジキニンに対するコード配列の３つのコピーを含む（配列番号＝１ ０）。

Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ− Ｇｌｙ−ＰＩ＋ｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＰＩ＋ｅ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−ＰＬ＋ｅ−Ｓ ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−八「Ｃ Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−＾ｓｎは臭化シアンおよびヒドロキシルアミンによって切除す ることができる相互接続ポリペプチドとして役立つ。内部接続ペプチドは、トリ プシンがＣ−末端アルギニンで切除するような必要はない。相互接続ペプチドを 有するマルチコピーポリペプチドをコード化する遺伝子は、例１に記載されたよ うにミニ修飾された無水炭酸から下流でクローン化される。組換えマルチコピー 結合タンパク質に対する遺伝子配列を含むベクターは１例１に記載されたような 宿主生物に導入される。組換えマルチコピー融合タンパク質は、例１のように発 現され精製される。

精製されたマルチコピー融合クンバク質は、１ｍの臭化シアンを用いてｐＨ８で ３７℃で切除され、無水炭酸フラグメントを除去し、生物学的に保護された半融 合クンバク質を形成する。スルファニルアミドカラムを用いて切除された無水炭 酸を捕捉した後、分離された半融合タンパク質のセリンヒドロキシル基は、無水 マレイン酸を用いた反応によって保護することができる。生物学保護基は、ＳＭ のＧｕｌｌＣｌに含めた２Ｍのヒドロキシルを用いて、ｐＨ８，０，３７℃で切 除され、マルチコピーポリペプチドを形成する。マルチコピーポリペプチドは、 トリプシンを用いて切除され、保護されていないＮ−末端ａ−アミン反応基を有 する切端単コピーポリペプチドを形成する。

ヒドロキシプロリン残基（ｌｌｙｐ）を含む第一の３つのアミノ酸は、固相また は液体化学によって合成される。＾ｒｇ−Ｐｒｏ−１１ｙｐペプチドは、９−フ ルオレニルメチルオギシカルボニルヒドロキシプロリンｆＦＭＯｃｌｏ　−ベン ジルエーテル誘導体（ＦＭＯＣ誘導体）を第１に形成することによって合成され る。ＦＭＯＣヒドロキシプロリン誘導体をヒドロキシドレジンに反応させて、Ｆ ＭＯＣ−１１ｙｐ−レジンを生成する。ＦＭＯＣは、ピペリジンとＤＣＭ　（ジ クロロメタン）と−緒に除去される。ジクロロヘキシカルボジイミド活性化され たＦＭＯＣ−プロリン誘導体をレジン結合ＮＨ。

−Ｉｌｙｐに反応させる。このサイクルをＦＭＯＣ−＾「ｇ−（メトキシ−２， ３，６−ドリメチルベンゼンスルポニル）について繰り返す、保護されたペプチ ドは、ジクロロメタンに含めた２５％トリフルオロ酢酸を用いて切除される。

保護されたＮ−末端トリペプチドは、＾ｒｇ−（メトキシ−２，３，６−１−リ メチルベンジンスルポニル１−Ｐｒｏ−１１ｙｐ−ＣＯＯＨであり、ジクロロメ タンおよびジメチルポルムアミド中のジシクロへキシルカルボジイミドを用いて 活性化する。活性化されたペプチドは、２倍余剰な組換え生成切端ブラジキニン （アミノ酸残基４−９）に反応させてＨｙｐ−３−ブラジキニンを生成する。余 剰な組換え生成ブラジキニン（アミノ酸残基４−９）は回収し、再度使用するこ とができる。

マルチコピー融合タンパク質から誘導されＮ−末端およびＣ−末端を修飾された Ｑ　ホルモン　”　ＧＲＦ 出発原料は、内部接続された成長ホルモン放出因子の２つのコピーを含むマルチ コピー融合タンパク質であり、無水炭酸に接続されたマルチコピーポリペプチド を形成するためのものである。相互接続ペプチドおよび内部接続ペプチドは、同 一であり、酵素切除試薬に対する認識配列と化学切除試薬に対する認識配列を含 む。相互接続ペプチドおよび内部接続ペプチドの配列は以下の通りである（配列 番号　１１）。

＾５ｎＡ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ。

＾＝ヒドロキシルアミン切除部位 ８＝ニトロンビン除部位 無水炭酸に対する遺伝子配列は、例１に記載したように１７プロモータの塩基ベ クター下流内に得られサブクローン化される。相互接続ペプチドまたは内部接続 ペプチドをＮ−末端終端に含む成長放出因子に対する遺伝子配列は、自動化され たオリゴヌクレオチド合成方法によって合成される。相互接続ペプチドを有する 遺伝子配列は、成長放出因子遺伝子の第１のコピーから部下流でサブクローン化 される。次に、ベクターは、細菌性宿主に導入され１組換えマルチコピー融合タ ンパク質は、例１に記載したように誘導される。組換えマルチコピー融合タンパ ク質は１例１のように精製される。

次に１組換えマルチコピー融合タンパク質は、ヒドロキルアミンを用いて切除さ れる。ヒドロキシルアミンは、相互接続ペプチドおよび内部接続ペブグード中の ＾５ｎ−Ｇｌｙ認識配列で切除し、Ｎ−末端Ｇｌｙ−Ｐ「０−＾「ｇペプチドと Ｃ−末端＾ｓｎ残基を有する単コピーポリペプチドを形成する。

次に、単コピーポリペプチドを無水マレイン酸に反応させ、ε−アミン基および ヒドロキシル基を保護する。β−カルボキシル基およびγ−カルボキシル基は、 これらの基の０−ニトロフェノールエステルを形成することによって保護される 。

単コピーポリペプチドを、カルボキペブチダーゼを用いて切除し。

Ｃ−末端＾ｓｎ残基を除去する。保護されていないＣ−末端α−カルボキシル基 は、保護された単コピーポリペプチドをジシクロへキシルカルボジイミドと反応 させてから、余剰のアンモニアと反応させて、アミド化される。

単コピーポリペプチドをトロンビンを用いて切除し、Ｎ−末端の生物学的保護基 −Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを除去する。次に、保護されていないＮ−末端ａ−ア ミンをウレタン遮断ピログルタミル残基に反応させ、Ｎ−末端修飾されＣ−末端 修飾された単コピーポリペプチドを保護する。

末端修飾されたｌｌｔコピーポリペプチドは、約２時間ｐ１１２で脱保護化した 後、約２時間ｐＨ９で脱保護化する。最終生成物は、ピログルタミル残基を有す るＮ−末端で修飾されアミド化によってＣ−末端で修飾された成長放出因子であ る。

配列表 ＋１１　一般情報 ｆｉｌ出願人：　５ＬｏｕＬ、　ＪａｙＷａｇｎｅｒ、　Ｆｒｅｄ　Ｗ。

Ｃｏｏｌｉｄｇｅ、　Ｔｈｏｍａｓ　Ｒ。

Ｈｏｌｍｑｕｉｓｔ、　Ｂａｒｔｏｎ （１、発明の名称・組換えポリペプチドの修飾方法（ｉｉｉｌ配列の数：１５ （１ｖ）連絡先： （＾）宛名：　Ｍｅｒｃｈａｎｔ　＆　ＧｏｕｌｄｉＢｌｓＴＲＥＥＴ　：　３ １００　ＮｏｒｗｅｓＬ　Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃ１都市名、ミネアポリス ＋Ｄｌ州名、ミネソタ ｆＥ１国名　アメリカ合衆国 （Ｆｌ郵便番号：　５５４０２ （ｖｌコンピュータ読解形式： ｆＡｌＡｌ媒体ダイブロッピーディスク（旧コンピュータ　ＩＢＭ　Ｉ”Ｃコン パチブルｆｃｌオペレーティングシステｌｉ　：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ５ ｆＤｌソフトウェア： Ｉｖｉ）現在の出願データ。

（＾）出願番号。

（Ｂｌ提出日： ｆｃ１分類：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ５（ｖｉｉｊｌ弁理士／代理人情報： （＾）氏名　Ｎｅ１ｓｏｎ、＾１ｂｉｎ　Ｊ。

ｔｅｌ登録番号：　２８．５６０ ｆｃｌ　１５　Ｎ　／事件整理番号：　８６４８．３５４０−０１ｆｉｘ）通信 先： （＾）電話：　６１２−３３２−５３００ｆＢＩ　−ｒ　Ｌ／　７クシミリ：　 ６１２−３３２−９０８１（２）配列番号、ｌに関する情報 （ｉｔ配列特性 （＾）配列の長さニアミツ９２０個分 子ｉ＋配列の型・アミノ酸 ｆｃｌ鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 ｆｉｉｌ配列の種類、ペプチド （ｉｉｉｌハイボセティカル：Ｎ０ ｆｘｉｌ配列、配列番号：ｌ： Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　 Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｐＨｅ　Ｓｅｒ＋　５　１０　１５ Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ（２）配列番号：２に関する情報 ｆｉｌ配列特性： （＾）配列の長さ・アミノ酸５個分 子Ｂ＋配列の型、アミノ酸 ｆｃｌ鎖の数・−重鎖 １Ｄ１１−ボロジー二線状 （１１）配列の！１！類：クンバク質 （ｘｉｌ配列、配列番号：２゜ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ（２）配列番号、３に関する情報 （ｉ）配９１１特性・ （＾）配列の長さ二アミノ酸４個分 ｔＢｌ配列の型、アミノ酸 ＋Ｃ＋鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　綿状 （１１）配列の種類、ペプチド （×１）配列　配列番号：３ １ｉｅ　Ｇｌｕ　ａｎｙ＾「じ （２）配列番号・４に関する情報 （１）配列特性： （＾）配列の長さ二アミノ酸４個分 （Ｂｌ配列の型二アミノ酸 （Ｃ１鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 ｆｉｉｌ配列の種類、ペプチド （ｘｉｌ配列；配列番号、４； ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　ｒ’ｒｏ　Ａｒｇ （２）配列番号：５に関する情報 （１）配列特性。

（＾）配列の長さ二アミノ酸８個分 ｔｅｌ配列の型　アミノ酸 ｉｃｌ鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｉｉｌ配列の１１類：ペプチド （ｘｉｌ配列、配列番号：５： Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｂｅ　ｌ１ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ（２）配 列番号、６に関する情報 ｆｉｔ配列特性・ （＾）配列の長さ二アミノ酸３０個分 ＋Ｂ＋配列の型二アミノ酸 （ＣＨＪＩの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、線状 （１１）配列の＋ｍ＊　ペプチド ｆｘｉｌ配列：配列番号二Ｇ。

Ｐｈｅ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａ ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｍｅｔｌ　５　１０　１５ Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ＾ｓｎ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ（２）配列番号＝７に関する情 報 ｆｉｌ配列特性： （＾）配列の長さ、アミノ酸１５１ｉ１ｉ１分（Ｂｌ配列の型二アミノ酸 Ｅｌ鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 ｆｉｉｌ配列の種類　ペプチド （ｘｉｌ配列　配列番号＝７： ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕｌ　５　１０　ｌ５ （２）配列番号＝８に関する情報 （ｉｌ配列特性。

（＾）配列の長さ　アミノ酸５個分 子Ｂｌ配列の型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉｌ配列の橋ｗ４＝ペプチド ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ ！ （２）配列番号、１２に関する情報 ｆｉｌ配列特性。

（＾）配列の長さ：１５塩基対 ＣＢ＋配列の型：核酸 １ｃｌｊｉの数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー８線状 （目）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉｌ配列：配列番号・１２： ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧ　ＡＴ＾＾＾ （２）配列番号：１３に関する情報 ｆｉｌ配列特性。

（＾）配列の長さ：１２塩基対 ＣＢ＋配列の型　核酸 ｆｃｌＭの数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー　綿状 １ｉｉ１配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）ｆｘｉｌ配列、配列番号　１３： Ａ丁ＴＧＡＡＧＧＡＡ　ＧＡ （２）配列番号　１４に関する情報 （ｉｔ配列特性： （Ａｌ配列の長さ・１２塩基対 ＣＢ＋配列の型：核酸 ｆｃｌ鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 Ｉｓ　（ｉｉｌ配列の種Ｒ：ＤＮＡＩゲノム）ｆｘｉｌ配列：配列番号＝１４ ＡＧＡＧＧＡＣＣ＾＾Ｇ＾ （２）配列番号、１５に関する情報 ｆｉｌ配列特性、 （＾）配列の長さ＝２４塩基対 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１９１００　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ （ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、Ｐ Ｔ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　クーリッジ、トーマス・アールアメリカ合衆国　０６０３１　 コネチカット、フォールズ・ヴイレッジ、ビーブ・ヒル・ロード（番地なし） （７２）発明者　ホルムクイスト、パートアメリカ合衆国　０２１５４　コネチ カット、ウォルサム、プロスペクト・ヒル・ロード

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．組換え単コピーポリペプチドまたはその一部を、Ｎ−末端α−アミン、Ｃ− 末端α−カルボキシルおよびその組み合わせからなるクループから選択され修飾 された末端アミノ酸α−炭素反応基ヒ、ε−アミン基、ヒドロキシル基、β−カ ルボキシル基、γ−カルボキシル基、チオール基およびその組み合わせからなる クループから選択された反応側鎖基を用いて調製する方法において、単コビーポ リペプチドまたはその一部を、単コピーポリペプチドがＮ−末端α−アミン、Ｃ −末端α−カルボキシルおよびその組み合わせから成るクループから選択された 末端アミノ酸α−炭素反応基上で生物学的に付加された一つ以上の保護基を用い て保護するように形成し、 以下の反応ステップおよび切除ステップを順序を問わず行い、少なくとも一つの 末端アミノ酸α炭素反応基を有し側鎖保護された単コピーポリペプチドを生成し 、 組換え単コピーポリペプチドを３つまでの化学保護剤と反応させ、ε−アミン、 ヒドロキシル、β−カルボキシル、γ−カルボキシル、チオールおよびその組み 合わせから成るクループから選択された反応側鎖基を選択的に保護し、 組換え単コビーポリペプチドを、生物学的に付加された保護基に特異的な少なく とも一つの切除試薬で切除し、保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応基を 形成し、 保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応基を少なくとも化学修飾剤で修飾し 、末端を修飾し側鎖を保護した単コピーポリペプチドを形成し、 前記末端を修飾し側鎖を保護した単コピーポリペプチドを脱保護化し、末端修飾 単コピーポリペプチドを形成することを特徴とする方法。
2. ２．前記組換え単コピーポリペプチドを生物学的に付加した保護基を用いてＮ− 末端α−アミン反応側鎖基において異なるポリペプチドへのアミド結合接続によ って形成し、前記異なるポリペプチドは相互接続ペプチドまたはある相互接続ペ プチドと前記相互接続ペプチドとに接続された結合タンパク質を含み、化学試薬 または酵素試薬によって切除自在な少なくとも一つの部位を有し、かつ、前記組 換え単コビーポリペプチドヘのアミド結合接続であり、前記生物学的に付加され た保護基に特異的な前記切除試薬は、前記内部接続ペプチドで切除する酵素試薬 または化学試薬であり、前記化学修飾剤は、Ｎ−末端α−アミン基でアセチル基 を形成するよう作用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．組換え単コピーポリペプチドを、前記単コピーポリペプチドが異なるポリペ プチドに接続されるアミド結合によって第１の生物学的に付加された保護基によ ってル−末端α−アミン基において保護されるように形成し、前記異なるポリペ プチドが内部接続ペプチドまたはある内部接続ペプチドに接続された結合タンパ ク質であり、前記内部接続ペプチドが前記アミド結合であり、前記単コピーポリ ペプチドが第２の生物学的に付加された保護基によって前記Ｃ−末端α−カルボ キシル基においてアルギニンヘのアミド結合接続にさって保護され、 前記組換え単コピーポリペプチドを前記第１の生物学的に付加された保護基に特 異的な切除試薬を用いて切除し、保護されていないＮ−末端α−アミンを有する 側鎖保護単コピーポリペプチドを形成し、前記保護されていないＮ−末端α−ア ミンを前記第１の化学修飾剤で修飾し、Ｎ−末端α−アミン修飾側鎖保護単コビ ーポリペプチドを形成し、 前記Ｎ−末端α−アミン修飾側鎖保護単コピーポリペプチドを前記第２の生物学 に付加された保護基に特異的な第２の切除試薬で切除し、保護されていないＣ− 末端α−カルボキシル基を有するル−末端α一アミン修飾側鎖保護単コピーポリ ペプチドを形成し、前記保護るされていないＣ−末端α−カルボキシル基を第２ の修飾剤で修飾し、Ｎ−末端およびＣ−末端を修飾した側鎖保護単コピーポリペ プチドを形成する ことをさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．３つの縦列結合セグメントの組換え単コピー融合クンバク質の発現および精 製から得られ、第１のセグメントは結合タンパク質であり、第２のセグメントは 相互接続タンパク質であり、かつ、第３のセグメントは単コピーポリペプチドま たはその一部であるε−アミン基、ヒドロキシル基、β−カルボキシル基、γ− カルボキシル基、チオール基およびその組み合わせから成るクループから選択さ れた修飾Ｃ−末端α−カルボキシル基、Ｎ−末端α−アミン基ならびに反応側鎖 基を用いて前記組換え単コピーポリペプチドまたはその一部を調製する方法にお いて、 前記組換え単コピー融合タンパク質を前記相互接続ペプチドに特異的な切除試薬 を用いて切除し、単コピーポリペプチドまたはその一部を生成し、 前記単コピーポリペプチドまたはその一部を３つまでの化学保護剤に反応させ、 ε−アミン、ヒドロキシル、β−カルボキシル、γ−カルボキシル、チオールお よびその組み合わせから成るクループから選択された反応側鎖基を選択的に保護 し、Ｃ−末端α−カルボキシル基を有する側鎖保護単コピーポリペプチドを形成 し、前記側鎖保護単コピーポリペプチドの前記Ｃ−末端α−カルボキシル基を化 学修飾剤で修飾し、Ｃ−末端α−カルボキシル修飾側鎖保護単コピーポリペプチ ドを形成し、 前記Ｃ−末端α−カルボキシル修飾側鎖単コピーポリペプチドを脱保護化し、前 記Ｃ−末端α−カルボキシル修飾組換え単コピーポリペプチドを形成することを 特徴とする方法。
5. ５．Ｎ−末端α−アミン、Ｃ−末端α−カルボキシルおよびその組み合わせから 成るクループから選択された修飾末端アミノ酸α−炭素反応基と、ε−アミン基 、ヒドロキシル基、β−カルボキシル基、γ−カルボキシル基およびその組み合 わせから成るクループから選択された反応側鎖基とを用いて、修飾組換え単コピ ーポリペプチドまたはその一部を調製する方法において、前記単コピーポリペプ チドまたはその一部を、前記単コピーポリペプチドが１つ以上の生物学的に付加 された保護基を用いて、Ｎ−末端α−アミン、Ｃ−末端α−カルボキシルおよび その組み合わせから成るグルーブから選択された前記末端アミノ酸α−炭素反応 基上で保護するように形成し、 前記組換え単コピーポリペプチドまたはその一部を前記生物学的に付加された保 護基に特異的な少なくとも一つの切除試薬で切除し、保護るされていない末端ア ミノ酸α−炭素反応基を有する組換え単コピーポリペプチドを形成し、 前記保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応基を少なくとも一つの化学修飾 剤で修飾し、末端修飾単コピーポリペプチドを形成する ことを特徴とする方法。
6. ６．組換え単コピーポリペプチドまたはその一部を形成する前記ステップにおい て、組換え単コピーポリペプチドの一部が約１−１０の末端アミノ酸を欠いてい ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記化学保護剤がアルキル置無水物、アリール置換無水物、アルコキシ置換 無水物、ジアゾ化合物、環状無水物、アルキル置換カルバメート化剤、アリール 置換カルバメート化剤から成るグループから選択されたアミン基およびヒドロキ シル基を選択的に保護する薬剤であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の 方法。
8. ８．前記単コピーポリペプチドを３つまでの保護剤に反応させる前記ステップに おいて、前記単コピーポリペプチドをアミン基を選択的に保護する保護剤に反応 させた後、カルボキシル基を選択的に保護する保護剤に反応させることを特徴と する請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記末端修飾単コピーポリペプチドを脱保護化する前記ステップにおいて、 前記保護された単コピーポリペプチドを約ｐＨ２−４で、実質的にすべての保護 基が除去されるまで、インキュベートすることを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。
10. １０．組換え単コピーポリペプチドに対して生物学的に付加された保護基におい て、切除試薬に対する少なくとも一つの認識配列を含むペプチドまたはアミノ酸 を含むことを特徴とする生物学的に付加された保護基。
11. １１．前記ペプチドが一つより多くの切除認識配列を含むことを特徴とする請求 の範囲第１０項記載の生物学的に付加された保護る基。
12. １２．前記ペプチドが酵素切除認識部位および化学切除認識部位を含むことを特 徴とする請求項１１記載の生物学的に付加された保護基。
13. １３．前記認識配列が前記単コピーポリペプチドに存在しないことを特徴とする 請求の範囲第１０項記載の生物学的に付加された保護基。
14. １４．Ｎ−末端α−アミン、Ｃ−末端α−カルボキシルおよびその組み合わせか ら成るグルーブから選択された修飾末端アミノ酸α−炭素反応基と、ε−アミン 基、ヒドロキシル基、β−カルボキシル基、γ−カルボキシル基、チオール基お よびその組み合わせから成るクループから選択された反応側鎖基とを用いて組換 え単コピーポリペプチドまたはその一部を調製し、前記組換え単コピーポリペプ チドが組換えマルチコピーポリペプチドの発現および生成から得られ、前記組換 えマルチコピーポリペプチドが相互接続ペプチドによって接続された前記単コピ ーポリペプチドのマルチコピーを有する方法において、 前記組換えマルチコピーポリペプチドを、前記組換えマルチコピーポリペプチド が一つ以上の生物学的に付加された保護基を用いて、Ｎ−末端α−アミン、Ｃ− 末端α−カルボキシルおよびその組み合わせから成るグループから選択された末 端アミノ酸α−炭素反応基上で保護されるように形成し、 以下の反応ステップおよび切除ステップを順序を問わず実施し、少なくとも一つ の保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応基を有する側鎖保護単コピーポリ ペプチドを生成し、組換え単コピーポリペプチドまたは組換えマルチコピーポリ ペプチドを３つまでの化学保護剤に反応させ、ε−アミン、ヒドロキシル、β− カルボキシル、γ−カルボキシル、チオールおよびその組み合わせから成るクル ープから選択された反応側鎖基を選択的に保護し、 組換えマルチコピーポリペプチドを前記生物学的に付加された保護基に特異的な 少なくとも１つの切除試薬を用いて切除し、保護されていない末端アミノ酸α− 炭素反応基を形成し、保護されていないＮ−末端α−アミン基またはＣ−末端α −カルボキシル基を化学調製剤で修飾し、修飾されたＮ−末端α−アミン側鎖保 護単コビーポリペプチドまたはＣ−末端α−カルボキシル側鎖保護単コピーポリ ペプチドを形成し、 前記Ｎ−末端α−アミン修節側鎖保護単コピーポリペプチドまたはＣ−末端α− カルボキシル修飾側鎖保護単コピーポリペプチドを脱保護化し、末端修飾単コピ ーポリペプチドを形成することを特徴とする方法。
15. １５．前記組換え単コピーポリペプチドを３つまでの化学保護基に反応させ、前 記マルチコピーポリペプチドを相互接続ペプチドに特異的な切除剤で切除し単コ ピーポリペプチドを形成する前記ステップを行い、側鎖保護された単コピーポリ ペプチドを形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１４項 記載の方法。
16. １６．生物学的に付加された保護基を有する前記組換えマルチコピーポリペプチ ドを形成することを含み、２つの縦列結合セグメントを含み、第１のセグメント は結合タンパク質であり、第２のセグメントは相互接続ペプチドまたは前記相互 接続ペプチドである単縦列結合セグメントであり、前記相互接続ペプチドは前記 マルチコピーポリペプチドの末端アミノα−炭素反応基に接続され、 前記マルチコピーポリペプチドを前記相互接続ペプチドに特異的な切除試薬で切 除し、組換えマルチコピーポリペプチドを形成することをさらに含むことを特徴 とする請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記組換えマルチコピーポリペプチドを、前記組換えマルチコピーポリペ プチドをＮ−末端に生物学的に付加された保護基とＣ−末端に生物学的に付加さ れた保護基とを用いて保護するように形成し、前記組換えマルチコピーポリペプ チドをＮ−末端に生物学的に付加された保護基に特異的な切除試薬で切除し、保 護されていないＮ−末端α−アミン反応基を有する側鎖保護単コピーポリペプチ ドを形成し、 前記Ｎ−末端α−アミンを第１の修飾剤で修節し、修飾されたＮ−末端α−アミ ン側鎖保護単コピーポリペプチドを形成し、前期Ｎ−末端α−アミン修飾側鎖保 護単コピーポリペプチドを前記Ｃ−末端に生物学的に付加された保護基に特異的 な切除剤で切除し、保護されていないＣ−末端α−炭素反応基を有し修飾された Ｎ−末端α−アミン側鎖保護単コピーを形成し、 前記Ｃ−末端α−炭素反応基を修飾し、修飾Ｎ−末端α−アミン、修飾Ｃ−末端 α−カルボキシル側鎖保護単コピーポリペプチドを形成することを特徴とする請 求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．前記Ｎ−末端に生物学的に付加された保護基が、共に縦列結合された２つ のセグメントであり、第１のセグメントは結合タンパク質であり、第２のセグメ ントは相互接続ペプチドまたは前記相互接続ペプチドである一つのセグメントで あり、前記相互接続ペプチドは前記マルチコピーポリペプチドのＮ−末端アミノ 酸に接続されており、Ｃ−末端に生物学的に付加された保護基がアルギニンであ ることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．組換え単コピーポリペプチドまたはその一部を、Ｎ−末端α−アミン、Ｃ −末端α−カルボキシルおよびその組み合わせから成るクループから選択される 修飾された末端アミノ酸α−炭素と、ε−アミン基、ヒドロキシル基、β−カル ボキシル基、α−カルボキシル基、チオール基およびその組み合わせから成る反 応側鎖基とを用いて調製し、前記組換え単コピーポリペプチドまたはその一部は 組換えマルチコピーポリペプチドの発現および精製から得られ、前記組換えマル チコピーポリペプチドは共に縦列リンクされた単コピーポリペプチドまたはその 一部の複数のコピーを有する方法において、前記組換えマルチコピーを、前記組 換えマルチコピーが一つ以上の生物学的に付加された保護基を用いて、Ｎ−末端 α−アミン、Ｃ−末端α−カルボキシルおよびその組み合わせから成るグループ から選択された末端アミノ酸α−炭素反応基上で保護されるように形成し、前記 組換えマルチコピーポリペプチドを保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応 基を有する単コピーポリペプチドを形成する少なくとも一つの切除試薬で切除し 、 前記保護されていない末端α−炭素反応基を化学修飾剤で修飾し、末端修飾単コ ビーポリペプチドを形成するこヒを特徴ヒする方法。
20. ２０．前記化学保護剤は、アルキル置換無水物、アリール置換無水物、アルコキ シ置換無水物、ジアゾ化合物、環状無水物、アルキル置換カルバメート化剤、お よびアリール置換カルバメート化剤から成るクループから選択されたアミン基お よびヒドロキシル基を選択的に保護する薬剤であることを特徴とする請求の範囲 第１９項記載の方法。
21. ２１．前記単コピーポリペプチドを３つまでの保護基と反応させる前記ステップ において、前記単コピーポリペプチドまたはマルチコピーポリペプチドを選択的 にアミン基を保護する保護剤に反応させた後、カルボキシル基を選択的に保護す る保護剤に反応させることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の方法。
22. ２２．前記修飾用は、カルボジイミドおよびアンモニアと、酸クロリドおよびア ンモニアと、混合無水物およびアンモニアと、アジドおよびアンモニアと、ｏ− ニトロフェノールエステルおよびアンモニアと、１−ヒドロキベンゾトリアゾー ルおよびアンモニアから成るクループから選択されるアミド化剤であることを特 徴とする請求の範囲第１９項記載の方法。
23. ２３．末端修飾単コピーポリペプチドを脱保護化する前記ステップにおいて、実 質的にすべての保護基が除去されるまで、前記保護された単コピーポリペプチド を約ｐＨ２−４でインキュベートすることを含むことを特徴とする請求項１９記 載の方法。
24. ２４．前記相互接続ペプチドは少なくとも２つの切除部位を含み、前記結合タン パク質に最も近い前記切除部位を切除し前記生物学的に付加された保護基を前記 相互接続ペプチド残基から形成することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方 法。
25. ２５．前記相互接続ペプチドが少なくとも２つの切除部位を含み、前記結合タン パク質に最も近い前記切除部位を切除し、前記生物学的に付加された保護基を前 記相互接続ペプチド残基から形成することを特徴とする請求の範囲第２４項記載 の方法。