WO2022065052A1 - 捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法 - Google Patents

捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法 Download PDF

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WO2022065052A1
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WO
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antibody
phase carrier
substance
solid phase
detected
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PCT/JP2021/033154
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雅之 小野
誠 糸長
勝恵 堀越
達矢 川上
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株式会社Ｊｖｃケンウッド
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a measurement kit and a measurement method for a capture antibody, a solid phase carrier, a detection antibody, solid phase carrier particles, and a substance to be detected.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-160026 and Japanese Patent Application No. 2020-160038 filed in Japan on September 24, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • an immunochemical measurement method such as a sandwich immunoassay
  • a capture antibody that specifically binds to a detection target substance is immobilized on a solid phase carrier such as a well plate, and the capture antibody captures the detection target substance.
  • the detection target substance is detected by binding a labeled antibody that specifically binds to the detection target substance and detecting the label.
  • non-specific binding causes a false signal and is required to be reduced.
  • FIG. 1A As a means for reducing non-specific binding to the surface of the solid phase carrier, a method of blocking the surface of the solid phase carrier with a protein (casein, albumin, etc.) that does not affect the substance to be detected is adopted (FIG. 1A). reference).
  • a protein casein, albumin, etc.
  • Patent Document 1 a detection antibody that specifically binds to the substance to be detected is immobilized on the solid phase carrier particles, and even when the detection antibody captures the substance to be detected, the detection antibody is bound to the surface of the solid phase carrier particles. Non-specific binding of antigens and labels to antibodies may be detected as false signals.
  • F (ab') 2 obtained by cleaving the Fc region with a proteolytic enzyme such as pepsin is used as the capture antibody and the detection antibody.
  • a proteolytic enzyme such as pepsin
  • Non-specific binding to the capture antibody and the detection antibody becomes a problem especially when the substance to be detected has a low concentration.
  • a method for easily reducing the capture antibody and the specific binding to the detection antibody is required.
  • a capture antibody with reduced non-specific binding, a solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized, a detection antibody with reduced non-specific binding, and the detection antibody are immobilized. It is an object of the present invention to provide a solid phase carrier particle, and a measurement kit and a measurement method for a substance to be detected using the solid phase carrier or the solid phase carrier particle.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a capture antibody that is fixed to a solid phase carrier and used to capture a substance to be detected, and at least a part of the functional groups of the first antibody having specific binding activity to the substance to be detected is described above.
  • a detection antibody used for detecting a substance to be detected by immobilizing it on solid phase carrier particles, and at least a part of the functional group of the second antibody having specific binding activity to the substance to be detected is present.
  • a detection antibody that is blocked by a compound capable of binding to the functional group [5] The detection antibody according to [4], wherein the functional group is an amino group. [6] Solid phase carrier particles on which the detection antibody according to [4] or [5] is immobilized. [7] A measurement kit for a substance to be detected, which comprises the solid phase carrier according to [3] and a detection antibody having a specific binding activity to the substance to be detected. [8] The measurement kit for a substance to be detected according to [7], wherein the detection antibody is the detection antibody according to [4] or [5]. [9] The measurement kit for the substance to be detected according to [8], which comprises the solid phase carrier particles according to [6].
  • the step (ii) is a step of contacting the solid phase carrier particles according to [6] with the capture antibody to which the sample is contacted, and the solid phase carrier particles captured by the solid phase carrier.
  • the method for measuring a substance to be detected according to [10] which comprises a step of measuring the substance to be detected captured on the solid phase carrier by measuring the above-mentioned substance.
  • a capture antibody with reduced non-specific binding, a solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized, a detection antibody with reduced non-specific binding, and the detection antibody are immobilized.
  • a measurement kit and a measurement method for the solid phase carrier particles and the substance to be detected using the solid phase carrier or the solid phase carrier particles are provided.
  • FIG. 3 is an enlarged schematic view showing a state in which solid phase carrier particles are captured on the analysis substrate of FIG. 3.
  • FIG. 3 is an enlarged schematic view showing a state in which solid phase carrier particles are specifically bound to a substance to be detected on the analysis substrate of FIG. 3.
  • amino group blocking CD9 antibody amino group blocking CD63 antibody
  • untreated capture antibodies untreated CD9 antibody, untreated CD63 antibody
  • isotype control IgG antibody is shown.
  • Antibody means an immunoglobulin having antigen-binding activity.
  • the antibody does not have to be an intact antibody as long as it has antigen-binding activity, and may be an antigen-binding fragment.
  • the term "antibody” includes antigen-binding fragments.
  • An "antigen-binding fragment” is a polypeptide containing a part of an antibody, which maintains the antigen-binding property of the original antibody.
  • the antigen-binding fragment preferably contains all six complementarity determining regions (CDRs) of the original antibody. That is, it is preferable to include CDR1, CDR2, CDR3 of the heavy chain variable region, and CDR1, CDR2, CDR3 of the light chain variable region.
  • antigen-binding fragment examples include Fab, Fab', F (ab') 2 , variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single-chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , and the like.
  • the antibody may be derived from any organism. Examples of organisms from which the antibody is derived include, but are not limited to, mammals (humans, mice, rats, rabbits, horses, cows, pigs, monkeys, dogs, etc.), birds (chickens, ostriches, etc.) and the like.
  • the antibody may be in any class or subclass of immunoglobulin.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable.
  • the antibody can be produced by a known method such as an immunological method, a hybridoma method, or a phage display method.
  • the term “comprise” means that components other than the target component may be included.
  • the term “consist of” means that it does not include any component other than the target component.
  • the term “consentually of” does not include components other than the target component in a mode that exerts a special function (such as a mode in which the effect of the invention is completely lost). means.
  • the term “comprise” includes a "consist of" mode and a “consentially of” mode.
  • Proteins (including antibodies) and cells can be isolated. "Isolated” means a state isolated from the natural state.
  • the proteins and cells described herein can be isolated proteins and isolated cells.
  • the present invention provides a capture antibody that is immobilized on a solid phase carrier and used to capture a substance to be detected.
  • the capture antibody of the present embodiment at least a part of the functional group of the first antibody having a specific binding activity to the detection target substance is blocked by a compound capable of binding to the functional group.
  • Capture antibody is an antibody used to capture a substance to be detected in a sample in an immunochemical measurement method.
  • the "immunochemical measurement method” is a method for measuring a substance to be detected in a sample by utilizing an antigen-antibody reaction between an antibody and an antigen.
  • the capture antibody is used by immobilizing it on a solid phase carrier. When a sample containing the detection target substance is brought into contact with the capture antibody immobilized on the solid phase carrier, the detection target substance binds to the capture antibody, and the detection target substance becomes the solid phase carrier via the capture antibody. Be captured.
  • the solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized is not particularly limited, and any solid phase carrier usually used for immunochemical measurement methods can be used. Examples of the solid phase carrier include well plates, beads, substrates, membranes, reaction chambers attached to immunochemical measuring devices, and the like.
  • the solid phase carrier may be the solid phase carrier particles described later.
  • first antibody The antibody used for the capture antibody (hereinafter referred to as “first antibody”) is an antibody having specific binding activity to the substance to be detected. "Having a specific binding activity to a substance to be detected” means having a high binding activity to the substance to be detected and almost no binding activity to other substances.
  • Detection target substance means a substance to be measured by an immunochemical measurement method.
  • the substance to be detected is not particularly limited as long as it is a substance that causes an antigen-antibody reaction.
  • Examples of the substance to be detected include, but are not limited to, proteins, peptides, sugar chains, lipids, cells expressing the above-mentioned biological substances, viruses, extracellular vesicles, and the like.
  • Extracellular vesicles are vesicles released by cells. The size of extracellular vesicles is about 30 nm to 1 ⁇ m in diameter. Examples of extracellular vesicles include exosomes, apoptotic bodies, microvesicles and the like.
  • the first antibody may be an antibody that specifically binds to the pan-extracellular vesicle membrane protein.
  • the pan-cellular vesicle membrane protein refers to a membrane protein possessed by extracellular vesicles in ubiquitous.
  • the pancellular vesicle membrane protein may be a membrane protein possessed by ubiquitous in all extracellular vesicles such as exosomes, extracellular vesicles, and microvesicles, and may be any of exosomes, extracellular vesicles, and microvesicles. It may be a membrane protein that is normally expressed.
  • pan-extracellular vesicle membrane protein can be a membrane protein possessed by exosomes in ubiquitous (hereinafter, also referred to as “pan-exosome membrane protein”).
  • Extracellular vesicles have in ubiquitous means that a wide variety of extracellular vesicles have.
  • Exosomes have in ubiquitous means that a wide variety of exosomes have.
  • pan-exosome membrane proteins include CD9, CD63, CD81 and the like.
  • the first antibody may be an antibody having specific binding activity to CD9, CD63, or CD81.
  • the first antibody when the substance to be detected is an extracellular vesicle, the first antibody has specific binding activity to a membrane protein specifically expressed in the extracellular vesicle to be detected. May be.
  • the substance to be detected is an extracellular vesicle derived from a cancer cell, the first antibody has a specific binding activity to a membrane protein specifically expressed by the extracellular vesicle. May be good.
  • the first antibody preferably has a small number of amino acid residues having a functional group to be blocked, which will be described later, in the antigen-binding region (for example, CDR).
  • the first antibody preferably has a small number of lysine residues in the side chain having a primary amino group in the CDR.
  • the number of lysine residues in the CDR is not particularly limited, but for example, 0 to 10, 0 to 9, 0 to 8, 0 to 7, 0 to 6, and 0 to 5 in all 6 CDRs. , 0 to 4, 0 to 3, 0 to 2, 0 to 1, or 0.
  • the capture antibody of the present embodiment is one in which at least a part of the functional groups of the first antibody is blocked. "The functional group is blocked” means that the blocking agent is bound to the functional group and the reactivity is lost.
  • the "blocking agent” is a compound capable of binding to a functional group, and a compound capable of forming a substituent having a reduced non-specific bond in a state of being bound to the functional group is preferable.
  • the blocking agent is preferably a compound that does not change the tertiary structure of the first antibody and does not change the antigen binding property of the first antibody. Therefore, the blocking agent is preferably a relatively small molecule compound.
  • Examples of the molecular weight of the blocking agent include 1000 or less.
  • Examples of the molecular weight of the blocking agent include 900 or less, 800 or less, 700 or less, 600 or less, 500 or less, and the like.
  • the lower limit of the molecular weight of the blocking agent is not particularly limited, and examples thereof include 30 or more, 50 or more, and the like.
  • the functional group blocked by the blocking agent is a functional group contained in the side chain of the amino acid residue constituting the antibody, or a functional group at the end of the polypeptide chain.
  • the functional group include an amino group, a thiol group, a carboxy group and the like. These functional groups react with substances or labels in the sample and cause non-specific binding. By blocking these functional groups with a blocking agent, non-specific binding can be reduced when immunochemical measurements are performed as compared to the original first antibody.
  • the functional groups possessed by the first antibody examples of the functional group contributing to non-specific binding include an amino group (particularly, a primary amino group (-NH 2 )). Therefore, the functional group blocked by the blocking agent preferably contains an amino group.
  • the functional group to be blocked may be one kind or two or more kinds.
  • amino acid residues having an amino group in the side chain include lysine residues.
  • the position of the amino group to be blocked is not particularly limited and depends on the amino acid sequence of the first antibody.
  • the positions of the blocked amino groups include the N-terminal amino group of the polypeptide chain and the amino group of the side chain of the lysine residue.
  • the position of the amino group may be a heavy chain, a light chain, a variable region, or a constant region. From the viewpoint of not affecting the binding property, the position of the amino group is preferably a constant region or a framework region, and more preferably a constant region (see FIG. 2).
  • the capture antibody of this embodiment at least a part of the functional group to be blocked may be blocked. If at least some of the functional groups are blocked, non-specific binding is reduced as compared to the original first antibody.
  • 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% of the functional groups to be blocked may be blocked.
  • the "functional group to be blocked” is a functional group to which the blocking agent used can be bound. For example, when the functional group to be blocked is an amino group, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% of the amino groups contained in the first antibody is blocked. It may be an antibody.
  • the blocking agent can be appropriately selected depending on the type of functional group to be blocked.
  • the blocking agent is, for example, a compound having a functional group capable of binding to the functional group to be blocked.
  • the functional group to be blocked is an amino group
  • a known blocking agent for the amino group can be used without particular limitation.
  • the blocking agent for the amino group include compounds having a carboxy group.
  • the compound having a carboxy group include a carboxylic acid, a resin having a carboxy group at the end of the main chain, and the like.
  • the number of carboxy groups contained in the blocking agent is not particularly limited, but is preferably one from the viewpoint of reducing non-specific bonds.
  • the blocking agent for the amino group preferably has no reactive functional group other than the carboxy group, and particularly preferably has no amino group.
  • carboxylic acid that can be used as a blocking agent monocarboxylic acid is preferable, and for example, saturated fatty acids (galic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, etc.) and unsaturated fatty acids (acrylic acid, methacrylic acid, sorbin) are preferable. Acids, oleic acids, etc.), hydroxycarboxylic acids (lactic acid, etc.), aromatic carboxylic acids (benzoic acid, salicylic acid, etc.), saturated aliphatic carboxylic acids (cholic acid, deoxycholic acid, biotin, etc.), etc. Not limited to.
  • the carboxylic acid used as the blocking agent may be a carboxylic acid other than biotin.
  • the carboxylic acid used as the blocking agent one or more of the above-exemplified carboxylic acids may be excluded.
  • the resin containing a carboxy group at the end of the main chain that can be used as a blocking agent include those having a carboxy group added to the end of the main chain of various resins such as polyether, polystyrene and polyolefin, and polyester and the like. However, it is not limited to these.
  • the molecular weight means a number average molecular weight in terms of standard polystyrene as measured by size exclusion chromatography.
  • the method of blocking the functional group of the first antibody with a blocking agent can be appropriately selected depending on the type of the functional group and the blocking agent.
  • the functional group is an amino group and the blocking agent is a compound having a carboxy group
  • the first antibody and the blocking agent are mixed and an amide bond forming reaction is carried out in the presence of a suitable condensing agent such as carbodiimide. ..
  • a suitable condensing agent such as carbodiimide. ..
  • the capture antibody according to the present embodiment Since the capture antibody according to the present embodiment has a functional group blocked, it is possible to reduce non-specific binding to the capture antibody in the immunochemical measurement method. Further, the capture antibody according to the present embodiment can be prepared by a simple method of reacting with a blocking agent. Furthermore, since the capture antibody of the present embodiment can reduce non-specific binding even if it contains an Fc region, it is not necessary to perform Fc removal treatment in order to reduce non-specific binding.
  • the invention provides a solid phase carrier on which the capture antibody of said embodiment is immobilized.
  • the solid phase carrier is not particularly limited, and a solid phase carrier generally used for immunochemical measurement methods can be used without particular limitation.
  • the solid phase carrier may be, for example, a well plate, beads, a substrate, a membrane, a reaction chamber attached to an immunochemical measuring device, or the like.
  • the material of the solid phase carrier is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the type of the solid phase carrier.
  • the material of the solid phase carrier include polystyrene, polyolefin (polyethylene, polypropylene, etc.), cycloolefin polymer, resin such as polycarbonate; glass; metal such as gold, iron, zirconia, metal oxide, and the like. Not limited.
  • Immobilization of the capture antibody on the solid phase carrier can be performed by using a known method depending on the type of the solid phase carrier.
  • the surface on which the capture antibody is immobilized may be surface-treated so that the protein is physically adsorbed by a surface hydrophobic interaction.
  • the solid phase carrier of this embodiment can be used to capture the substance to be detected in the sample in the immunochemical measurement method.
  • immobilizing the capture antibody of the above embodiment on the solid phase carrier it is possible to provide a solid phase carrier with reduced non-specific binding to the capture antibody.
  • the present invention provides a measurement kit for a substance to be detected.
  • the measurement kit of the present embodiment includes the solid phase carrier of the embodiment and a detection antibody having specific binding activity to the substance to be detected.
  • the measurement kit of this embodiment can be used to measure the detected substance in the sample by the immunochemical measurement method.
  • the measurement kit of this embodiment can be used, for example, as a kit for sandwich immunoassay.
  • Solid phase carrier As the solid phase carrier, the solid phase carrier of the above-described embodiment can be used.
  • the “capture antibody” is an antibody used for detecting a substance to be detected in a sample in an immunochemical measurement method.
  • the detection antibody is used, for example, by binding a labeling substance.
  • the detection antibody binds to the detection target substance.
  • the detection target substance can be detected via the labeling substance.
  • a reaction may be carried out in which the labeling substance-containing compound is bound to the detection antibody.
  • the detection antibody may be immobilized on the solid phase carrier particles described below.
  • the detection antibody includes a second antibody.
  • the second antibody is an antibody having specific binding activity to the substance to be detected.
  • the second antibody may be the same as or different from the first antibody, but is preferably different.
  • the second antibody is used as a detection antibody for detecting the substance to be detected.
  • the substance to be detected is a compound such as a protein, peptide, sugar chain, or lipid
  • the second antibody has an epitope (second epitope) different from that of the first antibody (first epitope). Therefore, it may be an antibody that specifically binds to the substance to be detected.
  • the second antibody is a membrane protein (second membrane protein) different from the membrane protein (first membrane protein) to which the first antibody binds. It may be an antibody that specifically binds to the membrane protein).
  • the first antibody has specific binding activity to any of the pan-exosome membrane proteins (first pan-exosome membrane protein), and the second antibody has a specific binding activity. It may have a specific binding activity to a pan-exosome membrane protein (second pan-exosome membrane protein) different from the first pan-exosome membrane protein.
  • the first antibody has specific binding activity to any of the pan-exosome membrane proteins, and the second antibody is specific to the membrane protein specifically expressed in the exosome to be detected. It may have a binding activity.
  • the first antibody has specific binding activity to a membrane protein specifically expressed in the exosome to be detected, and the second antibody is specific to any of the pan-exosome membrane proteins. It may have a target binding activity.
  • the second antibody may have a functional group blocked in the same manner as the first antibody.
  • the functional group to be blocked include the same as those of the first antibody.
  • the functional group to be blocked preferably contains an amino group (particularly a primary amino group).
  • the blocking agent the same one as the first antibody can be used. By blocking the functional group of the second antibody, non-specific binding to the second antibody can be reduced.
  • the second antibody may be one to which a labeling substance is bound.
  • the labeling substance is not particularly limited, and a labeling substance usually used for immunochemical measurement can be used without particular limitation.
  • the labeling substance include solid phase carrier particles (resin beads such as polystyrene and glycidyl methacrylate; magnetic beads; metal nanoparticles and the like), peroxidase (eg, western wasabi peroxidase), and enzyme labeling such as alkaline phosphatase; carboxyfluorescein (FAM).
  • the measurement kit of the present embodiment may include any configuration in addition to the above configuration.
  • Optional configurations include, for example, reagents for processing samples (eg, diluents and the like), cleaning solutions, blocking solutions, various reagents such as buffer solutions, instruction manuals and the like.
  • the measurement kit of this embodiment may further include a third antibody that specifically binds to the second antibody.
  • the third antibody may be, for example, an antibody that binds to the Fc region of the second antibody.
  • the first antibody, the second antibody, and the third antibody are antibodies derived from different organisms.
  • the third antibody one labeled with a labeling substance can be used. Examples of the labeling substance include the same substances as those mentioned as the labeling substance of the second antibody.
  • the third antibody may have a functional group blocked in the same manner as the first antibody.
  • the functional group to be blocked include the same as those of the first antibody.
  • the functional group to be blocked preferably contains an amino group (particularly a primary amino group).
  • the blocking agent the same one as the first antibody can be used.
  • the measurement kit of the present embodiment may contain a detection reagent for detecting the labeling substance.
  • a detection reagent a known reagent can be used depending on the type of the labeling substance.
  • the measurement kit of this embodiment may include a standard reagent.
  • the standard reagent is a reagent for preparing a calibration curve of a substance to be detected.
  • a purified substance of the same type as the substance to be detected can be used.
  • the measurement kit of the present embodiment contains the solid phase carrier of the above embodiment, non-specific binding to the capture antibody can be reduced when the immunochemical measurement method is carried out. Therefore, even when the substance to be detected has a low concentration, high-precision measurement can be performed.
  • the present invention provides a detection antibody that is immobilized on solid phase carrier particles and used to detect a substance to be detected.
  • the detection antibody of the present embodiment at least a part of the functional group of the second antibody having a specific binding activity to the detection target substance is blocked by a compound capable of binding to the functional group.
  • Examples of the second antibody used for the detection antibody of the present embodiment include the same as those mentioned above.
  • Examples of the functional group to be blocked and the blocking agent include the same as described above.
  • the present invention provides solid phase carrier particles on which the detection antibody of the embodiment is immobilized.
  • Examples of the material of the solid phase carrier particles include the same materials as those of the solid phase carrier. Immobilization of the detection antibody on the solid phase carrier particles can be performed by using a known method depending on the type of the solid phase carrier particles. For example, a method using physical adsorption, a method using an avidin-biotin bond, and the like can be mentioned.
  • the particle size of the solid phase carrier particles is, for example, preferably 1000 nm or less, more preferably 1 to 500 nm, still more preferably 10 to 300 nm, and particularly preferably 10 to 200 nm.
  • the solid phase carrier particles are preferably nanoparticles having a nano-sized (1 to 1000 nm) particle size.
  • the present invention provides a method for measuring a substance to be detected.
  • the measuring method of the present embodiment includes a step of contacting the sample with the capture antibody immobilized on the solid phase carrier of the embodiment (hereinafter referred to as “step (i)”) and the capture antibody. It includes a step of measuring the substance to be detected (hereinafter referred to as “step (ii)”).
  • step (i) In step (i), the sample is brought into contact with the capture antibody immobilized on the solid phase carrier of the embodiment.
  • the sample is not particularly limited, and any sample can be used.
  • the sample may be a liquid sample presumed to contain the substance to be detected.
  • the sample is, for example, a body fluid sample (blood, serum, plasma, saliva, urine, tears, sweat, milk, nasal discharge, semen, pleural effusion, gastrointestinal secretion, cerebrospinal fluid, intertissue fluid, lymph fluid, etc.), cell culture. Examples include, but are not limited to, liquids, cell extracts, and the like.
  • the method of contacting the sample with the capture antibody immobilized on the solid phase carrier is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of the solid phase carrier.
  • the sample may be fed onto the surface of a solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized and incubated for a predetermined time.
  • the incubation time may be sufficient for the substance to be detected in the sample to bind to the capture antibody. Examples of the incubation time include 30 minutes or more, 1 hour or more, 2 hours or more, and the like.
  • the upper limit of the incubation time is not particularly limited, but may be, for example, 10 hours or less, 6 hours or less, 4 hours or less, 3 hours or less, and the like.
  • the incubation temperature may be any temperature as long as the binding reaction of the substance to be detected to the capture antibody proceeds. Examples of the incubation temperature include 10 to 40 ° C., 20 to 40 ° C., 30 to 40 ° C., and the like.
  • the solid phase carrier may be gently shaken during the incubation to improve the reaction efficiency between the capture antibody and the substance to be detected.
  • the substance to be detected in the sample binds to the capture antibody and is captured on the solid phase carrier.
  • substances other than the substance to be detected are not captured on the solid phase carrier because they do not bind to the capture antibody.
  • the solid phase carrier may be washed with a washing solution as appropriate. By washing the solid phase carrier, substances that are not bound to the capture antibody can be removed.
  • the cleaning solution is not particularly limited, and a cleaning solution generally used in immunochemical measurement methods can be used without particular limitation. Examples of the cleaning solution include, but are not limited to, a buffer solution such as PBS, Tris buffer solution, HEPES buffer solution; a buffer solution to which a surfactant such as Tween 20 is added; and pure water.
  • step (ii) In step (ii), the substance to be detected captured by the capture antibody is measured.
  • the method for measuring the substance to be detected captured by the capture antibody is not particularly limited, and a method generally used for immunochemical measurement can be used without particular limitation.
  • the measurement of the substance to be detected may be performed using, for example, the second antibody as the detection antibody.
  • the detection target substance can be measured by detecting the signal of the labeling substance.
  • the third antibody to which the labeling substance is bound may be used.
  • the substance to be detected can be measured by detecting the signal of the labeling substance.
  • the signal of the labeling substance can be detected by a known method depending on the type of the labeling substance.
  • the labeling substance is an enzyme label
  • the color-developing substrate of the enzyme label is added to carry out a color development reaction.
  • the substance to be detected can be measured by measuring the absorbance of the reaction solution and the like.
  • the labeling substance is a fluorescent label
  • the substance to be detected can be measured by measuring the fluorescence intensity.
  • the labeling substance is a solid phase carrier particle
  • the substance to be detected can be measured by counting the number of solid phase carrier particles captured on the solid phase carrier by a particle counter, microscopic observation, or the like.
  • the second antibody When the second antibody is used as the detection antibody, the second antibody is brought into contact with the detection target substance bound to the capture antibody.
  • a solution containing the second antibody may be supplied onto the surface of the solid phase carrier on which the substance to be detected is captured and incubated for a predetermined time.
  • the incubation time may be sufficient for the second antibody to bind to the substance to be detected.
  • Examples of the incubation time and incubation temperature include the same as those mentioned in step (i).
  • the solid phase carrier may be gently shaken during the incubation.
  • the solid phase carrier After contacting the second antibody with the substance to be detected, the solid phase carrier may be washed with a washing solution as appropriate. By washing the solid phase carrier, the second antibody that is not bound to the substance to be detected can be removed.
  • the cleaning liquid include those similar to those mentioned in step (i).
  • the third antibody When using the third antibody, the third antibody is brought into contact with the second antibody bound to the substance to be detected.
  • a solution containing the third antibody may be supplied onto the surface of the solid phase carrier on which the second antibody has been captured and incubated for a predetermined time.
  • the incubation time may be sufficient for the third antibody to bind to the second antibody.
  • Examples of the incubation time and incubation temperature include those described in step (i).
  • the solid phase carrier may be gently shaken during the incubation to improve the reaction efficiency of the third antibody with the second antibody.
  • the solid phase carrier After contacting the second antibody with the third antibody, the solid phase carrier may be washed with a washing solution as appropriate. By washing the solid phase carrier, the third antibody that is not bound to the second antibody can be removed.
  • the cleaning liquid include those similar to those mentioned in step (i).
  • the solid-phase carrier particles on which the second antibody is immobilized are brought into contact with the capture antibody to which the sample is contacted, and the solid-phase carrier particles captured by the solid-phase carrier are measured.
  • the step of measuring the substance to be detected captured by the solid phase carrier may be included.
  • the second antibody and the third antibody which may be used in the step (ii) may be those in which at least a part of the functional group is blocked by a compound capable of binding to the functional group.
  • the measuring method of the present embodiment may include any step in addition to the above steps.
  • a blocking step can be mentioned.
  • the measuring method of the present embodiment may include a blocking step before the step (i).
  • the blocking step is a step of performing a blocking treatment on the solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized. By performing the blocking treatment, non-specific binding to the solid phase carrier can be suppressed.
  • the blocking treatment can be performed by contacting the blocking solution with a solid phase carrier on which a capture antibody is immobilized.
  • the blocking solution is not particularly limited, and those generally used for immunochemical measurement can be used without particular limitation.
  • Examples of the blocking solution include skim milk of about 1 to 5%, a buffer solution containing bovine serum albumin (BSA), and the like.
  • the buffer solution for the blocking solution is not particularly limited, and examples thereof include PBS, PBS-T, Tris buffer solution, and HEPES buffer solution.
  • the solid phase carrier of the above embodiment since the solid phase carrier of the above embodiment is used, non-specific binding to the capture antibody can be reduced. Therefore, even if the detection target substance in the sample has a low concentration, the detection target substance can be measured with high accuracy.
  • a second antibody in which at least a part of the functional group is blocked by a compound capable of binding to the functional group is used as the detection antibody, non-specific binding to the detection antibody can also be reduced. Therefore, even if the detection target substance in the sample has a low concentration, the detection target substance can be measured with high accuracy.
  • FIG. 3 shows an example of a solid phase carrier used in a measuring device for a substance to be detected.
  • the measuring device uses solid-phase carrier particles as a labeling substance, and has a function of counting the number of solid-phase carrier particles trapped on the solid-phase carrier.
  • FIG. 3 is an example of an analytical substrate 1 used as a solid phase carrier in the above-mentioned measuring device.
  • the analysis substrate 1 has a disk shape equivalent to that of an optical disc such as a Blu-ray disc (BD), a DVD, or a compact disc (CD).
  • a positioning hole 2 is formed in the center of the analysis substrate 1.
  • the analysis substrate 1 is made of, for example, a resin material such as a polycarbonate resin or a cycloolefin polymer generally used for an optical disc.
  • the analysis substrate 1 is not limited to the above-mentioned optical disc, but may have other forms, and an optical disc conforming to a predetermined standard may be used.
  • a track region 5 in which convex portions 3 and concave portions 4 are alternately arranged in the radial direction is formed on the surface of the analysis substrate 1.
  • the convex portion 3 and the concave portion 4 are formed in a spiral shape from the inner peripheral portion to the outer peripheral portion of the analysis substrate 1.
  • the track pitch W4 which is the radial pitch of the concave portion 4 (convex portion 3), is, for example, 320 nm.
  • a reaction region 10 is formed in the track region 5 of the analysis substrate 1. A method of forming the reaction region 10 will be described with reference to FIG.
  • the capture antibody 12 having specific binding activity to the substance to be detected 11 is fixed in a predetermined region (region in which the reaction region 10 is formed) on the track region 5.
  • the buffer solution containing the capture antibody 12 is reacted with the analysis substrate 1.
  • the analysis substrate 1 is washed and dried to fix the capture antibody 12 on the track region 5.
  • the substance to be detected 11 is specifically bound to the capture antibody 12 immobilized on the track region 5.
  • the sample solution containing the detection target substance 11 is reacted with the capture antibody 12.
  • the analysis substrate 1 is washed and dried to capture the substance to be detected 11 in the recess 4 of the track region 5.
  • the outer diameter is, for example, about 100 nm.
  • the detection target substance 11 may not be contained, but for the sake of clarity, the case where the detection target substance 11 is contained in the sample liquid will be described below.
  • the solid phase carrier particles 20 are specifically bound to the detection target substance 11 captured on the track region 5.
  • a second antibody 21 having a specific binding activity to the substance to be detected 11 is immobilized on the surface of the solid phase carrier particles 20.
  • the solid phase carrier particles 20 are captured in the recess 4 of the track region 5.
  • the substance to be detected 11 and the solid phase carrier particles 20 are captured in the recess 4 of the track region 5 of the analysis substrate 1.
  • the region in which the detection target substance 11 and the solid phase carrier particles 20 are captured is the reaction region 10 shown in FIG. In FIG. 3, eight reaction regions 10 are formed at equal intervals so that the centers of the reaction regions 10 are located on the same circumference Cb with respect to the center Ca of the analysis substrate 1, but the reaction The number and formation positions of the regions 10 are not limited to this.
  • the solid phase carrier particles 20 captured in the reaction region 10 of the analysis substrate 1 can be counted using, for example, a measuring device equipped with an optical pickup.
  • the optical pickup irradiates the laser beam toward the analysis substrate 1 and receives the reflected light from the analysis substrate 1.
  • the optical pickup detects the light receiving level of the reflected light, generates a light receiving level signal JS, and outputs the light receiving level signal JS to a control unit including a CPU or the like.
  • the control unit detects and counts the solid-phase carrier particles 20 captured in the reaction region 10 by extracting and counting the solid-phase carrier particle detection signal KS from the light-receiving level signal JS output from the optical pickup. ..
  • Examples of the measuring device provided with such a mechanism include the analyzer described in JP-A-2017-207289.
  • the substance to be detected is an exosome, ExoCounter (registered trademark) (JVC KENWOOD) or the like can be used as the measuring device.
  • Example 1 (Preparation of capture antibody)
  • a monoclonal antibody that specifically binds to CD9 or CD63 was used.
  • CD9 and CD63 are known as exosome general purpose markers.
  • an exosome monoclonal antibody Anti CD9 manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.
  • an exosome monoclonal antibody Anti CD63 manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.
  • Cholic acid was used as a compound to be bound to the amino group of the CD9 antibody or the CD63 antibody. It is considered that by binding cholic acid to the amino group of the CD9 antibody or CD63 antibody, the amino group is blocked and the non-specific binding is reduced.
  • Exosomes extracted from the culture medium (10 mL) of the colon cancer cell line HCT116 were used as a sample. Exosomes were suspended in phosphate buffered saline to prepare exosome-containing samples. In addition, an exosome-free buffer solution was used as an exosome-free sample.
  • exosome-containing sample exosome well
  • exosome-free sample blade well
  • 50 ⁇ L of an exosome-containing sample (exosome well) or an exosome-free sample (blank well) was injected into a well on which an amino group blocking CD9 antibody or an amino group blocking CD63 antibody was immobilized, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After incubation, the wells were washed with buffer. By this operation, exosomes are captured by the amino group blocking CD9 antibody or the amino group blocking CD63 antibody in the exosome well.
  • nanoparticles immobilized with the CD9 antibody was injected into the exosome well and the blank well, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. After incubation, the exosome wells and blank wells were washed and the wells were dried.
  • the exosome well a sandwich bond between the amino group blocking CD9 antibody or the amino group blocking CD63 antibody and the exosome and the CD9 antibody-bound nanoparticles is formed.
  • the blank well non-specific adsorption of nanoparticles is formed.
  • the results are shown in FIG.
  • the count value of the exosome well on which the amino group blocking CD9 antibody was immobilized was 157,750.
  • the count value of the blank well on which the amino group blocking CD9 antibody was immobilized was 7,668.
  • the count value of the exosome well on which the amino group blocking D63 antibody was immobilized was 408,672.
  • the count value of the blank well on which the amino group blocking CD63 antibody was immobilized was 7,791.
  • the results are shown in Fig. 7.
  • the count value of the exosome well on which the untreated CD9 antibody was fixed was 145,358.
  • the count value of the blank well on which the untreated CD9 antibody was fixed was 11,805.
  • the count value of the exosome well on which the untreated CD63 antibody was fixed was 415,382.
  • the count value of the blank well on which the untreated CD63 antibody was fixed was 17,499.
  • Example 1 From the results of Example 1 and Comparative Example 1, when the amino group blocking antibody was used as the capture antibody in both the CD9 antibody and the CD63 antibody (Example 1), the untreated antibody was used as the capture antibody. Compared with the case (Comparative Example 1), the count value of the blank well was reduced. This result indicates that the non-specific binding of the CD9 antibody-fixed nanoparticles to the capture antibody is reduced by using the amino group blocking antibody as the capture antibody. On the other hand, in the exosome well, no significant difference was observed in the count values between Example 1 and Comparative Example 1.
  • Example 2 Comparative Example 2
  • An amino group blocking antibody was prepared by the same method as in Example 1 except that an isotype control IgG antibody (manufactured by BioLegend) was used instead of the CD9 antibody or the CD63 antibody. This was used as the capture antibody of Example 2.
  • Comparative Example 2 An isotype control IgG antibody to which cholic acid was not bound was used as a capture antibody of Comparative Example 2.
  • Example 2 From the results of Example 2 and Comparative Example 2, the case where the amino group blocking antibody was used as the capture antibody (Example 2) was compared with the case where the untreated antibody was used as the capture antibody (Comparative Example 2). , It was confirmed that non-specific binding into the well was reduced.
  • the capture antibody obtained by blocking the reactive functional group such as an amino group is used to obtain the capture antibody. It was confirmed that non-specific binding can be reduced. Therefore, by using a capture antibody in which the reactive functional group is blocked, it is possible to perform highly accurate measurement.
  • a capture antibody with reduced non-specific binding, a solid phase carrier on which the capture antibody is immobilized, a detection antibody with reduced non-specific binding, and the detection antibody are immobilized.
  • a measurement kit and a measurement method for the solid phase carrier particles and the substance to be detected using the solid phase carrier or the solid phase carrier particles are provided.
  • Analytical substrate Holes 3 Convex parts 4 Concave parts 5 Track area 10 Reaction area 11 Substance to be detected

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Abstract

固相担体に固定して検出対象物質を捕捉するために用いる捕捉用抗体であって、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第１の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、捕捉用抗体。固相担体粒子に固定して検出対象物質を検出するために用いる検出用抗体であって、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第２の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、検出用抗体。また、前記捕捉用抗体及び／又は検出用抗体を含む、検出対象物質の測定キット。また前記捕捉用抗体及び／又は検出用抗体を用いた検出対象物質の測定方法。

Description

捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法
　本発明は、捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法に関する。
　本願は、２０２０年９月２４日に、日本に出願された特願２０２０－１６００２６号及び特願２０２０－１６００３８に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　サンドイッチイムノアッセイ等の免疫化学的測定法では、ウェルプレート等の固相担体に、検出対象物質に特異的に結合する捕捉用抗体を固定し、前記捕捉用抗体に検出対象物質を捕捉させる。次いで、前記検出対象物質に特異的に結合する標識抗体を結合させ、標識を検出することにより、検出対象物質を検出する。免疫化学的測定方法では、非特異的な結合は誤シグナルの要因となるため、低減することが求められる。
　固相担体表面に対する非特異的結合を低減する手段としては、検出対象物質に影響がないようなタンパク質（カゼイン、アルブミンなど）で、固相担体表面をブロッキングする方法が採用されている（図１Ａ参照）。
　近年、分析機器及び試薬などの改良により、分析の高精度化及び高感度化が進んでいる。それにより、非常に少ない量の検出対象物質の差を検出できるようになってきた（特許文献１）。そのような高精度な分析機器を使用することで、固相担体表面に結合させた捕捉用抗体に対する抗原及び標識体の非特異的結合が誤シグナルとして検出されることが明らかになってきた（図１Ｂ、１Ｃ参照）。標識抗体として、検出対象物質に特異的に結合する検出用抗体を固相担体粒子に固定し、前記検出用抗体に検出対象物質を捕捉させる場合も、固相担体粒子表面に結合させた検出用抗体に対する抗原及び標識体の非特異的結合が誤シグナルとして検出されることがある。
　捕捉用抗体及び検出用抗体に対する非特異的結合を低減する手段として、ペプシン等のタンパク質分解酵素によりＦｃ領域を切断して得られるＦ（ａｂ’）２を、捕捉用抗体及び検出用抗体として用いる方法がある。しかしながら、Ｆｃ領域の切断は、抗体の構造を大きく変化させるため、抗体の性能が低下したり、保存安定性が低下したりするなどの不具合が生じる場合がある。
特開２０１７－２０７２８９号公報
　捕捉用抗体及び検出用抗体に対する非特異的結合は、特に、検出対象物質が低濃度である場合に問題となる。低濃度の検出対象物質を高精度に分析するためには、捕捉用抗体及び検出用抗体に対する特異的結合を簡便に低減する手法が求められる。
　そこで、本発明は、非特異的結合が低減された捕捉用抗体、前記捕捉用抗体が固定された固相担体、非特異的結合が低減された検出用抗体、前記検出用抗体が固定された固相担体粒子、並びに前記固相担体又は前記固相担体粒子を用いた検出対象物質の測定キット及び測定方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］固相担体に固定して検出対象物質を捕捉するために用いる捕捉用抗体であって、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第１の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、捕捉用抗体。
［２］前記官能基がアミノ基である、［１］に記載の捕捉用抗体。
［３］［１］又は［２］に記載の捕捉用抗体が固定された固相担体。
［４］固相担体粒子に固定して検出対象物質を検出するために用いる検出用抗体であって、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第２の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、検出用抗体。
［５］前記官能基がアミノ基である、［４］に記載の検出用抗体。
［６］［４］又は［５］に記載の検出用抗体が固定された固相担体粒子。
［７］［３］に記載の固相担体と、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する検出用抗体と、を含む、検出対象物質の測定キット。
［８］前記検出用抗体が、［４］又は［５］に記載の検出用抗体である、［７］に記載の検出対象物質の測定キット。
［９］［６］に記載の固相担体粒子を含む、［８］に記載の検出対象物質の測定キット。
［１０］［３］に記載の固相担体に固定された前記捕捉用抗体に、試料を接触させる工程（ｉ）と、前記捕捉用抗体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程（ｉｉ）と、を含む、検出対象物質の測定方法。
［１１］前記工程（ｉｉ）が、前記試料を接触させた捕捉用抗体に、［６］に記載の固相担体粒子を接触させる工程と、前記固相担体に捕捉された前記固相担体粒子を測定することにより、前記固相担体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程と、を含む、［１０］に記載の検出対象物質の測定方法。
　本発明によれば、非特異的結合が低減された捕捉用抗体、前記捕捉用抗体が固定された固相担体、非特異的結合が低減された検出用抗体、前記検出用抗体が固定された固相担体粒子、並びに前記固相担体又は前記固相担体粒子を用いた検出対象物質の測定キット及び測定方法が提供される。
ブロッキング剤により固相担体に対する非特異的結合が抑制されることを説明する模式図である。 捕捉用抗体に対する試料中物質の非特異的結合を説明する模式図である。 捕捉用抗体に対する標識体の非特異的結合を説明する模式図である。 抗体の模式図を示す。 固相担体の一例である分析用基板の上面図である。 図３の分析用基板に固相担体粒子が捕獲されている状態を拡大して示す模式図である。 図３の分析用基板上で、固相担体粒子が検出対象物質と特異的に結合している状態を拡大して示す模式図である。 アミノ基をブロックした捕捉用抗体（アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体、アミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体）を用いて、エクソソームを測定した結果を示す。 アミノ基をブロックしていない未処理の捕捉用抗体（未処理ＣＤ９抗体、未処理ＣＤ６３抗体）を用いて、エクソソームを測定した結果を示す。 アイソタイプコントロールＩｇＧ抗体を捕捉用抗体として用いて、エクソソームを測定した結果を示す。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
　「抗体」とは、抗原結合活性を有する免疫グロブリンを意味する。抗体は、抗原結合活性を有していれば、インタクトな抗体である必要はなく、抗原結合断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原結合断片を包含する。「抗原結合断片」とは、抗体の一部を含むポリペプチドであって、元の抗体の抗原結合性を維持しているポリペプチドである。抗原結合断片は、元の抗体の６つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を全て含むものが好ましい。すなわち、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を全て含むことが好ましい。抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられる。
　抗体は、いずれの生物に由来するものであってもよい。抗体が由来する生物としては、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、イヌ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　抗体は、免疫グロブリンのいずれのクラス及びサブクラスであってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
　抗体は、免疫法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等の公知の方法により作製することができる。
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　タンパク質（抗体を含む）、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態から分離された状態を意味する。本明細書に記載されるタンパク質、及び細胞は、単離されたタンパク質、及び単離された細胞であり得る。
＜捕捉用抗体＞
　一実施形態において、本発明は、固相担体に固定して検出対象物質を捕捉するために用いる捕捉用抗体を提供する。本実施形態の捕捉用抗体は、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第１の抗体の官能基の少なくとも一部が、前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされているものである。
　「捕捉用抗体」とは、免疫化学的測定法において、試料中の検出対象物質を捕捉ために使用される抗体である。「免疫化学的測定法」とは、抗体と抗原との抗原抗体反応を利用して、試料中の検出対象物質を測定する方法である。捕捉用抗体は、固相担体に固定して用いられる。固相担体に固定された捕捉用抗体に、検出対象物質を含有する試料を接触させると、検出対象物質が捕捉用抗体に結合し、捕捉用抗体を介して、検出対象物質が固相担体に捕捉される。捕捉用抗体が固定される固相担体は、特に限定されず、免疫化学的測定法に通常用いられる任意の固相担体を用いることができる。固相担体としては、例えば、ウェルプレート、ビーズ、基板、メンブレン、免疫化学的測定装置に付属する反応チャンバ等が挙げられる。固相担体は、後述の固相担体粒子であってもよい。
（第１の抗体）
　捕捉用抗体に用いる抗体（以下、「第１の抗体」という）は、検出対象物質に対する特異的結合活性を有する抗体である。「検出対象物質に対する特異的結合活性を有する」とは、検出対象物質に対して高い結合活性を有し、他の物質に対してはほとんど結合活性を有しないことを意味する。
　「検出対象物質」は、免疫化学的測定法の測定対象となる物質を意味する。検出対象物質は、特に限定されず、抗原抗体反応が生じる物質であればよい。検出対象物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、並びに前記の生体物質を発現する細胞、ウイルス及び細胞外小胞等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外小胞は、細胞が放出する小胞である。細胞外小胞の大きさは直径３０ｎｍ～１μｍ程度である。細胞外小胞としては、エクソソーム、アポトーシス小体、マイクロベシクル等が挙げられる。
　検出対象物質が、細胞外小胞である場合、第１の抗体は、汎細胞外小胞膜タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよい。ここで、「汎細胞外小胞膜タンパク質」とは、細胞外小胞がユビキタスに有する膜タンパク質をいう。汎細胞外小胞膜タンパク質は、エクソソーム、アポトーシス小体、及びマイクロベシクル等の細胞外小胞全般が、ユビキタスに有する膜タンパク質であってもよく、エクソソーム、アポトーシス小体、及びマイクロベシクルのいずれかで、通常発現される膜タンパク質であってもよい。例えば、汎細胞外小胞膜タンパク質は、エクソソームがユビキタスに有する膜タンパク質（以下、「汎エクソソーム膜タンパク質」ともいう）であることができる。「細胞外小胞がユビキタスに有する」とは、広範な種類の細胞外小胞が有していることをいう。「エクソソームがユビキタスに有する」とは、広範な種類のエクソソームが有していることをいう。汎エクソソーム膜タンパク質としては、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１等が挙げられる。検出対象物質がエクソソームである場合、第１の抗体は、ＣＤ９、ＣＤ６３、又はＣＤ８１に対して特異的な結合活性を有する抗体であってもよい。
　あるいは、検出対象物質が、細胞外小胞である場合、第１の抗体は、検出対象となる細胞外小胞に特異的に発現する膜タンパク質に対して、特異的結合活性を有するものであってもよい。例えば、検出対象物質が、がん細胞由来の細胞外小胞である場合、第１の抗体は、当該細胞外小胞が特異的に発現する膜タンパク質に対する特異的結合活性を有するものであってもよい。
　第１の抗体は、抗原結合領域（例えば、ＣＤＲ）において、後述のブロック対象となる官能基を有するアミノ酸残基の数が少ないことが好ましい。例えば、第１の抗体は、第１級アミノ基を側鎖に有するリジン残基の数が、ＣＤＲにおいて少ないことが好ましい。ＣＤＲにおけるリジン残基の数は、特に限定されないが、例えば、６つのＣＤＲ全体で０～１０個、０～９個、０～８個、０～７個、０～６個、０～５個、０～４個、０～３個、０～２個、０～１個、又は０個とすることができる。
（ブロック剤：官能基に結合可能な化合物）
　本実施形態の捕捉用抗体は、第１の抗体の官能基の少なくとも一部がブロックされているものである。「官能基がブロックされている」とは、官能基にブロック剤が結合し、反応性が失われていることを意味する。「ブロック剤」は、官能基に結合可能な化合物であり、官能基に結合した状態で、非特異的結合が低減された置換基を形成可能な化合物が好ましい。また、ブロック剤は、第１の抗体の三次構造を変化させず、第１の抗体の抗原結合性を変化させない化合物が好ましい。そのため、ブロック剤は、比較的低分子の化合物であることが好ましい。ブロック剤の分子量としては、例えば、１０００以下が挙げられる。ブロック剤の分子量としては、例えば、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、又は５００以下等が挙げられる。ブロック剤の分子量の下限は、特に限定されず、例えば、３０以上、又は５０以上等が挙げられる。
　ブロック剤でブロックされる官能基は、抗体を構成するアミノ酸残基の側鎖に含まれる官能基、又はポリペプチド鎖の末端の官能基である。前記官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシ基等が挙げられる。これらの官能基は、試料中の物質又は標識体と反応し、非特異的結合の要因となる。これらの官能基をブロック剤でブロックすることにより、免疫化学的測定法を実施した場合に、元の第１の抗体と比較して、非特異的結合を低減することができる。第１の抗体が有する官能基の中でも、特に非特異的結合に寄与する官能基としては、アミノ基（特に、第１級アミノ基（－ＮＨ２））が挙げられる。そのため、ブロック剤でブロックされる官能基は、アミノ基を含むことが好ましい。ブロックされる官能基は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
　側鎖にアミノ基を有するアミノ酸残基としては、例えば、リジン残基が挙げられる。ブロックされるアミノ基の位置は、特に限定されず、第１の抗体のアミノ酸配列に依存する。ブロックされるアミノ基の位置としては、ポリペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、リジン残基の側鎖のアミノ基が挙げられる。アミノ基の位置は、重鎖でもよく、軽鎖でもよく、可変領域であってもよく、定常領域であってもよい。結合性に影響を与えない観点から、アミノ基の位置は、定常領域又はフレームワーク領域が好ましく、定常領域がより好ましい（図２参照）。
　本実施形態の捕捉用抗体では、ブロック対象となる官能基の少なくとも一部がブロックされていればよい。少なくとも一部の官能基がブロックされていれば、元の第１の抗体と比較して、非特異的結合が低減される。本実施形態の捕捉用抗体では、ブロック対象となる官能基の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％がブロックされたものであってよい。ここで、「ブロック対象の官能基」とは、使用したブロック剤が結合可能な官能基である。例えば、ブロック対象の官能基がアミノ基である場合、第１の抗体に含まれるアミノ基の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％がブロックされたものであってよい。
　ブロック剤は、ブロック対象とする官能基の種類に応じて適宜選択することができる。ブロック剤は、例えば、ブロック対象とする官能基と結合し得る官能基を有する化合物である。
　例えば、ブロック対象とする官能基がアミノ基である場合、アミノ基に対する公知のブロック剤を特に制限なく用いることができる。アミノ基に対するブロック剤としては、例えば、カルボキシ基を有する化合物が挙げられる。カルボキシ基を有する化合物としては、カルボン酸、主鎖末端にカルボキシ基を有する樹脂等が挙げられる。ブロック剤が含むカルボキシ基の数は、特に限定されないが、非特異的結合を低減する観点から、１個であることが好ましい。アミノ基に対するブロック剤は、カルボキシ基以外の反応性官能基を有さないことが好ましく、特にアミノ基を有さないことが好ましい。
　ブロック剤として使用可能なカルボン酸としては、モノカルボン酸が好ましく、例えば、飽和脂肪酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸等）、不飽和脂肪酸（アクリル酸、メタクリル酸、ソルビン酸、オレイン酸等）、ヒドロキシカルボン酸（乳酸等）、芳香族カルボン酸（安息香酸、サリチル酸等）、飽和脂肪族カルボン酸（コール酸、デオキシコール酸、ビオチン等）等が挙げられるが、これらに限定されない。ブロック剤として使用するカルボン酸は、ビオチンを除くカルボン酸であってもよい。ブロック剤として使用するカルボン酸は、前記例示したカルボン酸の１種以上が除外されてもよい。
　ブロック剤として使用可能な、カルボキシ基を主鎖末端に含む樹脂としては、例えば、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリオレフィン等の各種樹脂の主鎖末端にカルボキシ基が付加されたもの、及びポリエステル等が挙げられるが、これらに限定されない。ブロック剤が樹脂である場合、前記分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される標準ポリスチレン換算の数平均分子量を意味する。
　第１の抗体の官能基をブロック剤でブロックする方法は、官能基及びブロック剤の種類に応じて、適宜選択することができる。官能基がアミノ基であり、ブロック剤がカルボキシ基を有する化合物である場合、第１の抗体とブロック剤とを混合し、カルボジイミド等の適切な縮合剤の存在下で、アミド結合形成反応を行う。これにより、第１の抗体に含まれるアミノ基をブロックすることができる。このとき、使用するブロック剤の量を調整することにより、ブロックされるアミノ基の割合を調整することができる。
　本実施形態に係る捕捉用抗体は、官能基がブロックされているため、免疫化学的測定方法において、捕捉用抗体に対する非特異的結合を低減することができる。また、本実施形態に係る捕捉用抗体は、ブロック剤を反応させるという簡易な方法で調製することができる。さらに、本実施形態の捕捉用抗体は、Ｆｃ領域を含んでいても非特異的結合を低減できるため、非特異的結合の低減のためにＦｃ除去処理を行う必要がない。
＜固相担体＞
　一実施形態において、本発明は、前記実施形態の捕捉用抗体が固定された固相担体を提供する。
　固相担体は、特に限定されず、免疫化学的測定法に一般的に用いられる固相担体を特に制限なく使用することができる。固相担体は、例えば、ウェルプレート、ビーズ、基板、メンブレン、免疫化学的測定装置に付属する反応チャンバ等であってもよい。
　固相担体の材質は、特に限定されず、固相担体の種類に応じて適宜選択することができる。固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、シクロオレフィンポリマー、ポリカーボネート等の樹脂；ガラス；金、鉄、ジルコニア等の金属又は酸化金属等が挙げられるが、これらに限定されない。
　固相担体への捕捉用抗体の固定は、固相担体の種類に応じて、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、捕捉用抗体を固定する面を、表面疎水的相互作用によりタンパク質が物理吸着されるように表面加工してもよい。
　本実施形態の固相担体は、免疫化学的測定法において、試料中の検出対象物質を捕捉するために用いることができる。上記実施形態の捕捉用抗体を固相担体に固定することで、捕捉用抗体に対する非特異的結合が低減された固相担体を提供することができる。
＜検出対象物質の測定キット＞
　一実施形態において、本発明は、検出対象物質の測定キットを提供する。本実施形態の測定キットは、前記実施形態の固相担体と、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する検出用抗体とを含む。
　本実施形態の測定キットは、免疫化学的測定方法により、試料中の検出物質を測定するために用いることができる。本実施形態の測定キットは、例えば、サンドイッチイムノアッセイ用キットとして用いることができる。
（固相担体）
　固相担体は、前記実施形態の固相担体を用いることができる。
（検出用抗体）
　「捕捉用抗体」とは、免疫化学的測定法において、試料中の検出対象物質の検出のために使用される抗体である。検出用抗体は、例えば、標識物質を結合して用いられる。捕捉用抗体に捕捉された検出対象物質に、検出用抗体を接触させると、検出用抗体が検出対象物質に結合する。検出用抗体に標識物質が結合している場合、標識物質を介して、検出対象物質を検出することができる。検出用抗体に標識物質が結合されていない場合、検出用抗体に標識物質含有化合物を結合させる反応を行ってもよい。検出用抗体は、後述の固相担体粒子に固定されてもよい。
　検出用抗体は、第２の抗体を含む。第２の抗体は、検出対象物質に対する特異的結合活性を有する抗体である。第２の抗体は、第１の抗体と同じであってもよく、異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。第２の抗体は、検出対象物質を検出するための検出用抗体として用いられる。
　例えば、検出対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質等の化合物である場合、第２の抗体は、第１の抗体のエピトープ（第１のエピトープ）とは異なるエピトープ（第２のエピトープ）で、検出対象物質に特異的に結合する抗体であってもよい。
　例えば、検出対象物質が、細胞、ウイルス又は細胞外小胞等である場合、第２の抗体は、第１の抗体が結合する膜タンパク質（第１の膜タンパク質）とは異なる膜タンパク質（第２の膜タンパク質）に特異的に結合する抗体であってもよい。
　例えば、検出対象物質がエクソソームである場合、第１の抗体は、汎エクソソーム膜タンパク質のいずれか（第１の汎エクソソーム膜タンパク質）に対して特異的結合活性を有し、第２の抗体は、前記第１の汎エクソソーム膜タンパク質とは異なる汎エクソソーム膜タンパク質（第２の汎エクソソーム膜タンパク質）に対して特異的結合活性を有していてもよい。あるいは、第１の抗体は、汎エクソソーム膜タンパク質のいずれかに対して特異的結合活性を有し、第２の抗体は、検出対象とするエクソソームに特異的に発現する膜タンパク質に対して特異的結合活性を有していてもよい。逆に、第１の抗体は、検出対象とするエクソソームに特異的に発現する膜タンパク質に対して特異的結合活性を有し、第２の抗体は、汎エクソソーム膜タンパク質のいずれかに対して特異的結合活性を有していてもよい。
　第２の抗体は、第１の抗体と同様に、官能基がブロックされていてもよい。ブロックされる官能基としては、第１の抗体と同様のものが挙げられる。ブロックされる官能基としては、アミノ基（特に第１級アミノ基）を含むことが好ましい。ブロック剤は、第１の抗体と同様のものを用いることができる。第２の抗体の官能基をブロックすることにより、第２の抗体に対する非特異的結合を低減することができる。
　第２の抗体は、標識物質が結合したものであってもよい。標識物質は、特に限定されず、免疫化学的測定法に通常用いられる標識物質を特に制限なく用いることができる。標識物質としては、例えば、固相担体粒子（ポリスチレン、グリシジルメタクリレート等の樹脂ビーズ；磁気ビーズ；金属ナノ粒子等）、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７などの蛍光標識；ヨウ素１２５などの放射性同位体標識；ルテニウム錯体などの電気化学発光標識；ビオチン等が挙げられる。第２の抗体に対する標識物質の結合は、公知の方法により行うことができる。
（任意構成）
　本実施形態の測定キットは、上記構成に加えて、任意の構成を含んでいてもよい。任意の構成としては、例えば、試料を処理するための試薬（例えば、希釈液等）、洗浄液、ブロッキング液、緩衝液等の各種試薬類、及び使用説明書等が挙げられる。
　第２の抗体が標識物質で標識化されていない場合、本実施形態の測定キットは、さらに、第２の抗体に特異的に結合する第３の抗体を含んでいてもよい。第３の抗体は、例えば、第２の抗体のＦｃ領域に結合する抗体であってもよい。第３の抗体を用いる場合、第１の抗体、第２の抗体、及び第３の抗体は、それぞれ異なる生物に由来する抗体であることが好ましい。
　第３の抗体は、標識物質で標識化されたものを用いることができる。標識物質としては、第２の抗体の標識物質として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　第３の抗体は、第１の抗体と同様に、官能基がブロックされていてもよい。ブロックされる官能基としては、第１の抗体と同様のものが挙げられる。ブロックされる官能基としては、アミノ基（特に第１級アミノ基）を含むことが好ましい。ブロック剤は、第１の抗体と同様のものを用いることができる。第３の抗体の官能基をブロックすることにより、第２の抗体に対する非特異的結合を低減することができる。
　第２の抗体又は第３の抗体が、標識物質で標識化されたものである場合、本実施形態の測定キットは、前記標識物質を検出するための検出試薬を含んでいてもよい。検出試薬は、標識物質の種類に応じて、公知のものを用いることができる。
　本実施形態の測定キットは、標準試薬を含んでいてもよい。標準試薬は、検出対象物質の検量線を作成するための試薬である。標準試薬は、例えば、検出対象物質と同種の精製物質を用いることができる。
　本実施形態の測定キットは、前記実施形態の固相担体を含むため、免疫化学的測定法を実施した場合に、捕捉用抗体に対する非特異的結合を低減することができる。そのため、検出対象物質が低濃度の場合であっても、高精度の測定を行うことができる。
＜検出用抗体＞
　一実施形態において、本発明は、固相担体粒子に固定して検出対象物質を検出するために用いる検出用抗体を提供する。本実施形態の検出用抗体は、前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第２の抗体の官能基の少なくとも一部が、前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされているものである。
　本実施形態の検出用抗体に用いる第２の抗体としては、上記で挙げたものと同様のものが挙げられる。ブロックされる官能基、及びブロック剤についても、上記と同様のものが挙げられる。
＜固相担体粒子＞
　一実施形態において、本発明は、前記実施形態の検出用抗体が固定された固相担体粒子を提供する。
　固相担体粒子の材質としては、固相担体と同様のものが挙げられる。固相担体粒子への検出用抗体の固定は、固相担体粒子の種類に応じて、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、物理吸着を利用する方法、アビジン－ビオチン結合を利用する方法等が挙げられる。固相担体粒子の粒子径は、例えば、１０００ｎｍ以下が好ましく、１～５００ｎｍがより好ましく、１０～３００ｎｍがさらに好ましく、１０～２００ｎｍが特に好ましい。固相担体粒子は、ナノサイズ（１～１０００ｎｍ）の粒径を有するナノ粒子であることが好ましい。
＜検出対象物質の測定方法＞
　一実施形態において、本発明は、検出対象物質の測定方法を提供する。本実施形態の測定方法は、前記実施形態の固相担体に固定された捕捉用抗体に、試料を接触させる工程（以下、「工程（ｉ）」という）と、前記捕捉用抗体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程（以下、「工程（ｉｉ）」という）と、を含む。
（工程（ｉ））
　工程（ｉ）では、前記実施形態の固相担体に固定された捕捉用抗体に、試料を接触させる。
　試料は、特に限定されず、任意の試料を用いることができる。試料は、検出対象物質を含有していると推定される液体試料であってもよい。試料は、例えば、体液試料（血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液等）、細胞培養液、細胞抽出液等が挙げられるが、これらに限定されない。
　固相担体に固定された捕捉用抗体に、試料を接触させる方法は、特に限定されず、固相担体の種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、捕捉用抗体が固定された固相担体の表面上に、試料を供給し、所定時間インキュベートしてもよい。インキュベート時間は、捕捉用抗体に、試料中の検出対象物質が結合するのに十分な時間であればよい。インキュベート時間としては、例えば、３０分以上、１時間以上、又は２時間以上等が挙げられる。インキュベート時間の上限は、特に限定されないが、例えば、１０時間以下、６時間以下、４時間以下、又は３時間以下等とすることができる。インキュベート温度は、捕捉用抗体に対する検出対象物質の結合反応が進行する温度であればよい。インキュベート温度としては、例えば、１０～４０℃、２０～４０℃、又は３０～４０℃等が挙げられる。捕捉用抗体と検出対象物質との反応効率を向上させるために、インキュベート中、固相担体を緩やかに振盪してもよい。
　試料を捕捉用抗体に接触させることにより、試料中の検出対象物質が、捕捉用抗体に結合して、固相担体上に捕捉される。一方、検出対象物質以外の物質は、捕捉用抗体に結合しないため、固相担体上に捕捉されない。
　捕捉用抗体に試料を接触させた後は、適宜、洗浄液を用いて固相担体の洗浄を行ってもよい。固相担体を洗浄することにより、捕捉用抗体に結合していない物質を除去することができる。洗浄液は、特に限定されず、免疫化学的測定法で一般的に使用される洗浄液を特に制限なく使用することができる。洗浄液としては、例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液；前記緩衝液にＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を添加したもの；及び純水等が挙げられるが、これらに限定されない。
（工程（ｉｉ））
　工程（ｉｉ）では、捕捉用抗体に捕捉された検出対象物質を測定する。
　捕捉用抗体に捕捉された検出対象物質の測定方法は、特に限定されず、免疫化学的測定法に一般的に用いられる方法を特に制限なく用いることができる。検出対象物質の測定は、例えば、検出用抗体として、前記第２の抗体を用いて行ってもよい。第２の抗体に標識物質が結合している場合、前記標識物質のシグナルを検出することにより、検出対象物質を測定することができる。標識物質が結合していない第２の抗体を用いる場合、標識物質が結合した第３の抗体を用いてもよい。この場合も、標識物質のシグナルを検出することにより、検出対象物質を測定することができる。標識物質のシグナルの検出は、標識物質の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。
　例えば、標識物質が酵素標識である場合、前記酵素標識の発色基質を添加して発色反応を行う。次いで、発色反応後に、反応液の吸光度等を測定することにより、検出対象物質を測定することができる。例えば、標識物質が蛍光標識である場合、蛍光強度を測定することにより、検出対象物質を測定することができる。標識物質が、固相担体粒子である場合、粒子カウンター又は顕微鏡観察等により、固相担体上に捕捉された固相担体粒子の数をカウントすることにより、検出対象物質を測定することができる。
　検出用抗体として第２の抗体を用いる場合、第２の抗体を、捕捉用抗体に結合した検出対象物質に接触させる。例えば、検出対象物質が捕捉された固相担体の表面上に、第２の抗体を含む溶液を供給し、所定時間インキュベートしてもよい。インキュベート時間は、第２の抗体が、検出対象物質に結合するのに十分な時間であればよい。インキュベート時間及びインキュベート温度としては、工程（ｉ）で挙げたものと同様のものが挙げられる。第２の抗体と検出対象物質との反応効率を向上させるために、インキュベート中、固相担体を緩やかに振盪してもよい。
　検出対象物質に第２の抗体を接触させた後は、適宜、洗浄液を用いて固相担体の洗浄を行ってもよい。固相担体を洗浄することにより、検出対象物質に結合していない第２の抗体を除去することができる。洗浄液としては、工程（ｉ）で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　第３の抗体を用いる場合、第３の抗体を、検出対象物質に結合した第２の抗体に接触させる。例えば、第２の抗体が捕捉された固相担体の表面上に、第３の抗体を含む溶液を供給し、所定時間インキュベートしてもよい。インキュベート時間は、第３の抗体が、第２の抗体に結合するのに十分な時間であればよい。インキュベート時間及びインキュベート温度としては、工程（ｉ）で記載したものと同様のものが挙げられる。第３の抗体と第２の抗体との反応効率を向上させるために、インキュベート中、固相担体を緩やかに振盪してもよい。
　第２の抗体に第３の抗体を接触させた後は、適宜、洗浄液を用いて固相担体の洗浄を行ってもよい。固相担体を洗浄することにより、第２の抗体に結合していない第３の抗体を除去することができる。洗浄液としては、工程（ｉ）で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　工程（ｉｉ）は、前記試料を接触させた捕捉用抗体に、第２の抗体が固定された固相担体粒子を接触させる工程と、前記固相担体に捕捉された前記固相担体粒子を測定することにより、前記固相担体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程とを含んでもよい。
　工程（ｉｉ）で用いてもよい第２の抗体及び第３の抗体は、官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされたものであってもよい。　
（任意工程）
　本実施形態の測定方法は、上記工程に加えて、任意の工程を含んでいてもよい。任意の工程としては、例えば、ブロッキング工程が挙げられる。
≪ブロッキング工程≫
　本実施形態の測定方法は、工程（ｉ）の前に、ブロッキング工程を含んでいてもよい。ブロッキング工程は、捕捉用抗体が固定された固相担体のブロッキング処理を行う工程である。ブロッキング処理を行うことにより、固相担体に対する非特異的結合を抑制することができる。
　ブロッキング処理は、ブロッキング液を、捕捉用抗体が固定された固相担体に接触させることにより行うことができる。ブロッキング液は、特に限定されず、免疫化学的測定法に一般的に用いられるものを、特に制限なく使用することができる。ブロッキング液としては、例えば、１～５％程度のスキムミルク又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液等が挙げられる。前記ブロッキング液用の緩衝液は、特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
　本実施形態の測定方法によれば、前記実施形態の固相担体を用いるため、捕捉用抗体に対する非特異的結合を低減することができる。そのため、試料中の検出対象物質が低濃度であっても、高精度に検出対象物質を測定することができる。
　検出用抗体として、官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている第２の抗体を用いた場合、検出用抗体に対する非特異的結合も低減することができる。そのため、試料中の検出対象物質が低濃度であっても、高精度に検出対象物質を測定することができる。
（標識物質が固相担体粒子である場合の固相担体及び測定方法の具体例）
　以下、標識物質が、固相担体粒子である場合の固相担体の具体例、及び前記固相担体を用いた検出対象物質の測定方法の具体例を記載するが、これに限定されない。
≪固相担体の具体例≫
　図３は、検出対象物質の測定装置に用いる固相担体の一例を示す。前記測定装置は、標識物質として固相担体粒子を用いるものであり、固相担体上に捕捉された固相担体粒子の数をカウントする機能を備える。図３は、前記のような測定装置に、固相担体として使用される分析用基板１の一例である。
　図３に示すように、分析用基板１は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。分析用基板１の中心部には位置決め孔２が形成されている。分析用基板１は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂やシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態であってもよく、所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。図４に示すように、分析用基板１の表面には、凸部３と凹部４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域５が形成されている。凸部３及び凹部４は、分析用基板１の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凹部４（凸部３）の半径方向のピッチであるトラックピッチＷ４は例えば３２０ｎｍである。分析用基板１のトラック領域５には反応領域１０が形成されている。図５を用いて反応領域１０の形成方法を説明する。
　検出対象物質１１に対して特異的結合活性を有する捕捉用抗体１２を、トラック領域５上の所定の領域（反応領域１０が形成される領域）に固定する。例えば、捕捉用抗体１２を含む緩衝液を分析用基板１と反応させる。反応後の緩衝液を除去した後、分析用基板１を洗浄して乾燥させることにより、捕捉用抗体１２をトラック領域５上に固定させる。
≪測定方法の具体例≫
　検出対象物質１１をトラック領域５上に固定されている捕捉用抗体１２と特異的に結合させる。例えば、検出対象物質１１を含む試料液を捕捉用抗体１２と反応させる。反応後の試料液を除去した後、分析用基板１を洗浄して乾燥させることにより、検出対象物質１１をトラック領域５の凹部４に捕捉させる。検出対象物質１１がエクソソームの場合、外径は例えば１００ｎｍ程度である。なお、試料液によっては検出対象物質１１が含まれていない場合もあるが、説明を分かりやすくするために、以下に試料液に検出対象物質１１が含まれている場合について説明する。
　検出対象物質１１を標識するために、固相担体粒子２０をトラック領域５上に捕捉されている検出対象物質１１と特異的に結合させる。固相担体粒子２０の表面には、検出対象物質１１に対する特異的結合活性を有する第２の抗体２１が固定されている。第２の抗体２１が検出対象物質１１と特異的に結合することにより、固相担体粒子２０はトラック領域５の凹部４に捕捉される。これにより、検出対象物質１１及び固相担体粒子２０は、分析用基板１のトラック領域５の凹部４に捕捉される。検出対象物質１１及び固相担体粒子２０が捕捉されている領域が図３に示す反応領域１０である。なお、図３では、分析用基板１の中心Ｃａに対して同一円周Ｃｂ上に各反応領域１０の中心がそれぞれ位置するように８つの反応領域１０が等間隔に形成されているが、反応領域１０の数や形成位置はこれに限定されるものではない。
　分析用基板１の反応領域１０に捕捉された固相担体粒子２０は、例えば、光ピックアップを備えた測定装置を用いて計数することができる。光ピックアップは、分析用基板１に向けてレーザ光を照射し、分析用基板１からの反射光を受光する。光ピックアップは、反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号ＪＳを生成し、ＣＰＵ等を備えた制御部へ出力する。制御部では、光ピックアップから出力された受光レベル信号ＪＳから固相担体粒子検出信号ＫＳを抽出してカウントすることにより、反応領域１０に捕捉されている固相担体粒子２０を検出してカウントする。このような機構を備えた測定装置としては、例えば、特開２０１７－２０７２８９号公報に記載の分析装置が挙げられる。検出対象物質がエクソソームである場合、測定装置として、ＥｘｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＪＶＣケンウッド）等を用いることができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（捕捉用抗体の調製）
　抗体として、ＣＤ９又はＣＤ６３に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた。ＣＤ９及びＣＤ６３は、エクソソーム汎用マーカーとして知られている。ＣＤ９抗体は、エクソソームモノクローナル抗体　Ａｎｔｉ　ＣＤ９（コスモ・バイオ社製）を用いた。ＣＤ６３抗体は、エクソソームモノクローナル抗体　Ａｎｔｉ　ＣＤ６３（コスモ・バイオ社製）を用いた。
　ＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体のアミノ基に結合させる化合物として、コール酸を用いた。ＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体のアミノ基にコール酸を結合させることにより、アミノ基がブロッキングされ、非特異的結合が低減されると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　５０μｇのＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体、１００μｇのコール酸、及び８００μｇの１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を、４００μＬのリン酸緩衝生理食塩水に添加して混合し、室温で、２時間インキュベートした。反応後、反応液を限外濾過フィルター（カットオフ分子量５０ｋＤａ）で濾過して未反応のＥＤＣを除去した。得られた濾物を緩衝液で洗浄した。これにより、ＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体のアミノ基ブロッキング抗体（アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体、アミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体）を得た。前記アミノ基ブロッキング抗体では、ＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体のアミノ基にコール酸が結合している。
（捕捉用抗体の固相担体への固定）
　固相担体として、ＥｘｏＣｏｕｎｔｅｒ（株式会社ＪＶＣケンウッド）に付属のカートリッジに設けられたウェルを用いた。上記で調製したアミノ基ブロッキングＣＤ９抗体及びアミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体を、捕捉用抗体としてウェルに固定した。
　アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６９ブロッキング抗体を、５μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、７０μＬをディスクのウェルに注入した。３７℃で、３０分間インキュベートし、疎水吸着によりアミノ基ブロッキングＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６９ブロッキング抗体をウェルに固定した。インキュベート後、ウェルを緩衝液で洗浄した。
（固相担体のブロッキング）
　次いで、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した１％ＢＳＡ２００μＬをウェルに注入し、３７℃で、３０分間インキュベートし、ウェル内のブロッキング処理を行った。インキュベート後、ウェルを緩衝液で洗浄した。
（エクソソームの検出）
　結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の培養液（１０ｍＬ）から抽出したエクソソームを試料として用いた。エクソソームをリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、エクソソーム含有試料とした。また、エクソソームを含まない緩衝液をエクソソーム非含有試料とした。
　アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体又はアミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体を固定したウェルに、エクソソーム含有試料（エクソソームウェル）又はエクソソーム非含有試料（ブランクウェル）を５０μＬ注入し、３７℃で、２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを緩衝液で洗浄した。この操作により、エクソソームウェルでは、アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体又はアミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体にエクソソームが捕捉される。
　次いで、エクソソームウェル及びブランクウェルに、ＣＤ９抗体を固定したナノ粒子を１μｇ注入し、３７℃で、１．５時間インキュベートした。インキュベート後、エクソソームウェル及びブランクウェルを洗浄し、ウェル内を乾燥させた。以上の操作により、エクソソームウェルでは、アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体又はアミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体とエクソソームとＣＤ９抗体結合ナノ粒子のサンドイッチ結合が形成される。一方、ブランクウェルでは、ナノ粒子の非特異的な吸着が形成される。
　次いで、カートリッジからウェルを分離し、試料分析用ディスクをＥｘｏＣｏｕｎｔｅｒで測定し、ディスク表面に結合したナノ粒子の個数をカウントした。
（結果）
　結果を図６に示す。アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体を固定したエクソソームウェルのカウント値は、１５７，７５０であった。これに対し、アミノ基ブロッキングＣＤ９抗体を固定したブランクウェルのカウント値は７，６６８であった。また、アミノ基ブロッキングＤ６３抗体を固定したエクソソームウェルのカウント値は、４０８，６７２であった。これに対し、アミノ基ブロッキングＣＤ６３抗体を固定したブランクウェルのカウント値は７，７９１であった。
［比較例１］
　コール酸を結合させていないＣＤ９抗体（未処理ＣＤ９抗体）又はＣＤ６３抗体（未処理ＣＤ６３抗体）を捕捉用抗体としてウェルに固定したこと以外は、前記実施例１と同様の方法で、エクソソームの検出を行った。
　結果を図７に示す。未処理ＣＤ９抗体を固定したエクソソームウェルのカウント値は１４５，３５８であった。これに対し、未処理ＣＤ９抗体を固定したブランクウェルのカウント値は１１，８０５であった。また、未処理ＣＤ６３抗体を固定したエクソソームウェルのカウント値は、４１５，３８２であった。これに対し、未処理ＣＤ６３抗体を固定したブランクウェルのカウント値は１７，４９９であった。
　実施例１及び比較例１の結果から、ＣＤ９抗体及びＣＤ６３抗体のいずれにおいても、アミノ基ブロッキング抗体を捕捉用抗体として用いた場合（実施例１）は、未処理抗体を捕捉用抗体として用いた場合（比較例１）と比較して、ブランクウェルのカウント値が低減された。この結果は、アミノ基ブロッキング抗体を捕捉用抗体として用いることにより、捕捉用抗体に対するＣＤ９抗体固定ナノ粒子の非特異的結合が低減されることを示す。一方、エクソソームウェルでは、実施例１と比較例１とで、カウント値に大きな差は認められなかった。
［実施例２、比較例２］
（実施例２）
　ＣＤ９抗体又はＣＤ６３抗体に替えて、アイソタイプコントロールＩｇＧ抗体（バイオレジェンド社製）を用いたこと以外は、前記実施例１と同様の方法で、アミノ基ブロッキング抗体を調製した。これを実施例２の捕捉用抗体として用いた。
（比較例２）
　コール酸を結合させていないアイソタイプコントロールＩｇＧ抗体を、比較例２の捕捉用抗体として用いた。
（捕捉用抗体の固相担体への固定）
　実施例２の捕捉用抗体及び比較例２の捕捉用抗体を、それぞれ別のウェルに注入し、前記実施例１と同様の方法で、ウェルに固定した。
（エクソソームの検出）
　前記実施例１と同様の方法で、ＥｘｏＣｏｕｎｔｅｒを用いて、ディスク表面に結合したナノ粒子の個数をカウントした。試料は、エクソソーム含有試料を用いた。
（結果）
　結果を図８に示す。アイソタイプコントロールＩｇＧ抗体には、エクソソームが特異的に結合しないため、図８に示されるシグナルは、エクソソームが非特異的にウェルに吸着していることを意味する。実施例２のアミノ基ブロッキングＩｇＧ抗体を固定したウェルのカウント値は２，３５１であった。これに対し、比較例２の未処理ＩｇＧ抗体のウェルのカウント値は１３，４７５であった。
　実施例２及び比較例２の結果から、アミノ基ブロッキング抗体を捕捉用抗体として用いた場合（実施例２）は、未処理抗体を捕捉用抗体として用いた場合（比較例２）と比較して、ウェル内への非特異的結合が低減されることが確認された。
　以上の結果から、抗原抗体反応を利用して検出対象物質の測定を行う免疫化学的測定方法において、アミノ基等の反応性官能基をブロッキング処理した捕捉用抗体を用いることで、捕捉用抗体に対する非特異的結合を低減できることが確認された。そのため、反応性官能基をブロッキング処理した捕捉用抗体を用いることにより、精度の高い測定を行うことが可能となる。
　本発明によれば、非特異的結合が低減された捕捉用抗体、前記捕捉用抗体が固定された固相担体、非特異的結合が低減された検出用抗体、前記検出用抗体が固定された固相担体粒子、並びに前記固相担体又は前記固相担体粒子を用いた検出対象物質の測定キット及び測定方法が提供される。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。
　１　　分析用基板
　２　　孔
　３　　凸部
　４　　凹部
　５　　トラック領域
　１０　反応領域
　１１　検出対象物質

Claims (11)

  1. 　固相担体に固定して検出対象物質を捕捉するために用いる捕捉用抗体であって、
    　前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第１の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、
    　捕捉用抗体。
  2. 　前記官能基がアミノ基である、請求項１に記載の捕捉用抗体。
  3. 　請求項１又は２に記載の捕捉用抗体が固定された固相担体。
  4. 　固相担体粒子に固定して検出対象物質を検出するために用いる検出用抗体であって、
    　前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する第２の抗体の官能基の少なくとも一部が前記官能基に結合可能な化合物によりブロックされている、
    　検出用抗体。
  5. 　前記官能基がアミノ基である、請求項４に記載の検出用抗体。
  6. 　請求項４又は５に記載の検出用抗体が固定された固相担体粒子。
  7. 　請求項３に記載の固相担体と、
    　前記検出対象物質に対する特異的結合活性を有する検出用抗体と、
    　を含む、検出対象物質の測定キット。
  8. 　前記検出用抗体が、請求項４又は５に記載の検出用抗体である、
    　請求項７に記載の検出対象物質の測定キット。
  9. 　請求項６に記載の固相担体粒子を含む、請求項８に記載の検出対象物質の測定キット。
  10. 　請求項３に記載の固相担体に固定された前記捕捉用抗体に、試料を接触させる工程（ｉ）と、
    　前記捕捉用抗体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程（ｉｉ）と、
    　を含む、検出対象物質の測定方法。
  11. 　前記工程（ｉｉ）が、
    　前記試料を接触させた捕捉用抗体に、請求項６に記載の固相担体粒子を接触させる工程と、
    　前記固相担体に捕捉された前記固相担体粒子を測定することにより、前記固相担体に捕捉された前記検出対象物質を測定する工程と、
    　を含む、請求項１０に記載の検出対象物質の測定方法。
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