JPH062074B2 - オリゴペプチドの製法 - Google Patents

オリゴペプチドの製法

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JPH062074B2
JPH062074B2 JP59156562A JP15656284A JPH062074B2 JP H062074 B2 JPH062074 B2 JP H062074B2 JP 59156562 A JP59156562 A JP 59156562A JP 15656284 A JP15656284 A JP 15656284A JP H062074 B2 JPH062074 B2 JP H062074B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子操作技術を利用したオリゴペプチドの製
法に関し、詳しくは該オリゴペプチドを菌体外へ分泌産
生させるオリゴペプチドの製法に関するものである。
〔従来の技術及び問題点〕
従来よりオリゴペプチドを生産する方法としては、合成
法、あるいは遺伝子操作技術を利用した生化学的方法が
知られている。
しかし、前者の合成法においては、一般に原料アミノ酸
のアミノ基又はカルボキシル基に保護基を導入してから
反応が行われているので、最終的にはこの保護基を除く
必要がある。しかしペプチド結合鎖が長くなるにつれ
て、この保護基の全てをはずすのが困難になる。そのた
め、目的のオリゴペプチドと前記の保護基の残つたオリ
ゴペプチドが共存した生成物が得られる。このため、目
的のオリゴペプチドの精製が難しい。又、一般に、この
ような合成法は反応収率も低い。
後者の生化学的方法としては、主として、大腸菌を利用
した方法が知られているが、いずれも産生したオリゴペ
プチドが菌体外へ分泌されない。従つて該オリゴペプチ
ドを採取するためには菌体を破さいする必要があるが、
この場合非常に多種類のペプチドとの混合物となつてし
まうためやはり精製が複雑で難しい。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は、従来技術のこのような問題を解決するた
めに、鋭意検討した結果、本発明に到達したものであ
る。
即ち、本発明は、枯草菌から得られたリーダー遺伝子と
Ｎ末端側から少なくとも436分子のアミノ酸をコードす
るα−アミラーゼ構造遺伝子をもつプラスミドであるｐ
ＴＵＢ４の、該α−アミラーゼ構造遺伝子下流側に、多
くとも10個までのアミノ酸配列をもつオリゴペプチドを
コードするＤＮＡを挿入し、これを枯草菌に導入して形
質転換した枯草菌を培養し、この形質転換した枯草菌が
産生するα−アミラーゼとオリゴペプチドを含む融合タ
ンパク質を菌体外へ分泌させ、得られた融合タンパク質
から目的のオリゴペプチドを分離することを特徴とする
オリゴペプチドの製法である。
本発明のオリゴペプチドをコードするＤＮＡは、生物細
胞から分離するか、固相トリエステル法等により合成す
る等公知の方法により得ることができる。
このオリゴペプチドには例えば、アンジオテンシンＩ、
ブラジキニン、ソマトスタチン、インシユリン、黄体ホ
ルモン刺激ホルモン等のホルモン、グラミシジンＡ、ミ
コバチリン等の抗菌性ペプチド等がある。
本発明に使用するプラスミドは、通常、遺伝子操作に用
いられるプラスミドを制限酵素により切断、開環し、そ
の開環部に常法により、α−アミラーゼ遺伝子を接続
し、閉環させることにより得られるα−アミラーゼ遺伝
子を含む創成されたプラスミドが用いられるが、α−ア
ミラーゼ遺伝子を持つものであれば生物細胞から分離さ
れたものでも利用できる。
α−アミラーゼの遺伝子とは、α−アミラーゼ構造遺伝
子とリーダー遺伝子を含むものを意味する。ここでα−
アミラーゼ構造遺伝子とはα−アミラーゼ蛋白質をコー
ドする遺伝子であり、リーダー遺伝子とはα−アミラー
ゼの菌体外分泌のためのシグナルペプチドをコードする
遺伝子である。
一方、発明者らの他の実験によると、α−アミラーゼ蛋
白質はＮ末端側から少くとも436分子のアミノ酸の結合
が保たれていると、α−アミラーゼ活性が保たれる事が
明らかとなっている。従つて、α−アミラーゼ活性が保
たれる大きさの蛋白質組成を保つ様にし、この蛋白質に
オリゴペプチドを結合させた蛋白質（この様な蛋白質を
融合蛋白質という）はアミラーゼ活性をもつ事となる。
従つて、α−アミラーゼ遺伝子中へ目的とするオリゴペ
プチドをコードするＤＮＡを導入するにあたつては、上
記の観点から、α−アミラーゼ活性を維持した融合蛋白
質を得るべく研究を進めた。
以下、本発明を具体例を用いて詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。良く知られている
Staphylococcus属由来のプラスミドpUB １１０にα−ア
ミラーゼの遺伝子を導入することによりプラスミドpTUB
4が得られる。
この場合α−アミラーゼ遺伝子のリーダー遺伝子の部分
は、例えば本発明者等が先願（特願昭５９−０４３８２
６）にに記載した方法により得ることができる。
このプラスミドpTUB 4はpUB １１０に由来するカナマイ
シン耐圧の遺伝情報とα−アミラーゼの遺伝情報をもつ
ものであり、このプラスミドをクローニングした菌株の
選定が容易になる。
こプラスミドpTUB 4に目的のオリゴペプチドをコードす
るＤＮＡを導入する方法について以下に説明する。
プラスミドpTUB 4の制限酵素Ava Iによる切断点は、７
ケ所存在する。そのうち５ケ所はα−アミラーゼの構造
遺伝子中に存在する事が明らかとなつている。さらに、
２ケ所はα−アミラーゼ構造遺伝子の下流側にあるた
め、下流側のAvaII切断点を利用すると、α−アミラー
ゼ活性を有する融合蛋白質を得る事が出来る。
pTUB 4を制限酵素Ava Iにより部分消化させること
により、種々のＤＮＡ断片が得られるが、α−アミラー
ゼの構造遺伝子の上流側から１５３１番目の塩基配列に
存在するAva II切断点により開環したプラスミドを用
い、オリゴペプチドをコードするＤＮＡを連結する。こ
の様にして得たベクターを枯草菌（例えば、Bacillussa
btilis ＮＡ６４株、微工研寄託、FERMBP-４２３）に
クロニーングする事により、菌体外にα−アミラーゼと
オリゴペプチドの融合蛋白質を分泌させる事が出来る。
即ち融合蛋白質はα−アミラーゼのシグナルペプチドに
より、菌体外へ分泌されるため、菌体との分離は極めて
容易である。菌体を分離した後、α−アミラーゼを精製
する従来技術により、融合蛋白質を精製することが出来
る。この様にして得た融合蛋白質を適当な処理により、
オリゴペプチドの断片を得る。オリゴペプチドの精製は
目的とするオリゴペプチドの性質を適宜利用する事によ
り容易に行なえる。
〔実施例〕
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例 プラスミドpUB １１０を制限酵素BamHI により処理し、
開環したプラスミドにB.subtilis ＮＡ６４株より得た
α−アミラーゼの遺伝子を挿入し、プラスミドpTUB 4を
得た。pTUB 4を制限酵素Ava IIにより部分消化した後、
電気泳動法により、下式に示した(1)の点で開環してい
るプラスミドをとり出した。
Ava IIの切断点(1)の附近の塩基配列は下式に示すとお
りである。
Ava IIにより切断し、その切断点にHind IIIリンカーを
接続する。Hind IIIリンカーを接続したＤＮＡ配列は次
式の通りである。
一方、固相トリエステル法により、人のホルモンとして
知られているアンジオテンシンＩをコードするＤＮＡを
合成した。この合成ＤＮＡは次に示すアミノ酸配配列に
対応するものであつた。
メチオニンは後の操作に述べる様にアンジオテンシンＩ
をCNBr処理により取り出しやすくするために入れたもの
である。また、合成DNAではロイシンをコードする塩基
配列の下流側に終止コドンを接続させた。さらに、合成
ＤＮＡの上流側及び下流側にHind IIIサイトを接続し
た。この様にして得た合成ＤＮＡを、先に述べたpTUB 4
にHind IIIリンカーを接続したプラスミドをHind IIIに
より処理し、開環させた所に接続した。その塩基配列の
一例が次の式の様になる。
この様にしてpTUB 4にアンジオテンシンＩをコードす
るＤＮＡを接続したベクターを、B.subtilis ＮＡ６４
株に導入し、アミラーゼ活性を有し、且つカナマイシン
耐性を有するコロニーを選択した。さらにコロニーハイ
ブリダイゼイシヨン法によりアンジオテンシンＩの遺伝
子を確実に含むコロニーを選別した。この様にして得た
菌株を培養し、α−アミラーゼとアンジオテンシンＩの
融合蛋白質を産生させた。先に述べた様に、シグナルペ
プチドによりα−アミラーゼが菌株外へ分泌されるのと
同様に融合蛋白質も菌体外へ分泌される。菌体を分離し
た培養液に硫安を加えて蛋白質分を沈降させ、透析し、
DEAE−セルロースカラムを２回通過させる事により、融
合蛋白質を９０％以上の純度で得る事が出来た。融合蛋
白質は、CNBrにより処理する事により、メチオニンの所
で切断される。融合蛋白質はCNBr処理によりいくつかの
ペプチドに別れるが、α−アミラーゼ由来の蛋白質から
は最小単位で１７ケのアミノ酸が結合したペプチドが得
られる。一方アンジオテンシンＩは先に示した様に１０
ケのアミノ酸が結合したペプチドである。そこで、CNBr
処理により生成したペプチドの混合液から、DEAE−セル
ロースカラムで処理することにより、アンジオテンシン
Ｉを精製する事が出来た。
この様にして得たアンジオテンシンＩは、本来の生物活
性を示した。また、融合蛋白質を産生する菌株のプラス
ミドを解析した結果、先に示したＤＮＡ配列になつてい
る事が確認された。
なお、実施例で用いた記号の意義は下記に示すとおりで
ある。
Met メチオニン Asp アスパラギン酸 Arg アルギニン Val バリン Tyr チロシン Ile イソロイシン His ヒスチジン Pro プロリン Phe フエニルアラニン Leu ロイシン Ａ アデニン Ｔ チミン Ｇ グアニン Ｃ シトシン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/62 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 山崎 久人 兵庫県姫路市網干区新在家1239 ダイセル 化学工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 大村 和隆 千葉県柏市北柏３丁目３―14 (72)発明者 城座 映明 千葉県市原市辰己台東４―７ 王子コーン スターチ社宅Ｄ―402 (72)発明者 古里 孝 茨城県筑波郡谷田部町春日４―18―14 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．95，Ｎｏ. １（1984．１．１）Ｐ．87−93

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】枯草菌から得られたリーダー遺伝子とＮ末
    端側から少なくとも436分子のアミノ酸をコードするα
    −アミラーゼ構造遺伝子をもつプラスミドであるｐＴＵ
    Ｂ４の、該α−アミラーゼ構造遺伝子下流側に、多くと
    も10個までのアミノ酸配列をもつオリゴペプチドをコー
    ドするＤＮＡを挿入し、これを枯草菌に導入して形質転
    換した枯草菌を培養し、この形質転換した枯草菌が産生
    するα−アミラーゼとオリゴペプチドを含む融合タンパ
    ク質を菌体外へ分泌させ、得られた融合タンパク質から
    目的のオリゴペプチドを分離することを特徴とするオリ
    ゴペプチドの製法。
JP59156562A 1984-07-27 1984-07-27 オリゴペプチドの製法 Expired - Lifetime JPH062074B2 (ja)

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EP85108994A EP0169505B1 (en) 1984-07-27 1985-07-18 Process for preparing oligopeptide
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