JP5806897B2 - ポリペプチド及び組換え微生物 - Google Patents
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Description
本発明は、目的タンパク質の生産に有用なポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする塩基配列を導入した組換え微生物、及び当該組換え微生物を用いた目的タンパク質の製造方法に関する。
微生物による有用物質の工業的生産は、食品、医薬、洗剤、化粧品等の原料、各種化成品原料に至るまで、幅広い分野で行われている。有用タンパク質やポリペプチドの工業的生産では、精製・単離の簡便さから、体内で生産した目的タンパク質等を菌体外へ分泌する能力を持った微生物がよく用いられる。また、より高い生産性を求めて、菌体外分泌・輸送能を有するシグナル配列を目的タンパク質に付加することも行われている。このようなシグナル配列は、通常、分泌タンパク質の成熟領域の上流に見られる。シグナル配列が連結された目的タンパク質は、細胞内で融合タンパク質として合成された後、細胞外へ分泌され、シグナル配列が切断されて成熟タンパクとなる。そのため、培養液から容易に目的タンパク質を精製・回収することができる。
このような利点から、種々の微生物でシグナル配列の同定や機能解析が行われている。枯草菌では、アミラーゼをコードする遺伝子をクローニングしてシグナル配列及びプロ配列の切断点を決定し、当該アミラーゼのシグナル配列を目的タンパク質等と融合して、菌体外分泌により目的物質を生産することが試みられている（特許文献１〜３、非特許文献１、２）。例えば、非特許文献３、４、７、８では目的生産物として大腸菌由来βラクタマーゼを、非特許文献５、６ではマウス由来インターフェロンβを、特許文献４ではインターロイキン２を、非特許文献９ではヒト肝炎ウイルス由来ＰｒｅＳ２を、それぞれ融合し、菌体外分泌による物質生産性を検討している。また、上記枯草菌アミラーゼのシグナル配列を人為的に改変して、分泌効率を向上させることも行われている（特許文献５）。
また、分泌タンパク質の前駆体は、シグナル配列の他にプロ配列を有していることがある。プロ配列は、通常、シグナル配列と同様に成熟タンパク質領域の上流に存在し、細胞内でのタンパク質合成時には付加されているが、細胞外に分泌後には酵素により切断される。プロ配列は、アミノ酸配列の長いタイプ（通常は６０〜２００アミノ酸程度）と短いタイプ（通常は〜６０アミノ酸程度）とに大別され、長いタイプは自身の構造のコンフォメーションを助ける働きをすることが知られているが、短いタイプの機能については未だ不明点が多い。
近年、ラクトコックス・ラクティスを宿主として、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）を生産する際に、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）のもつ１７残基のプロ配列が、分泌性向上に有効であることが報告されている（非特許文献１０）。また、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ生産において、９残基の合成アミノ酸配列を付加することにより分泌性が向上することも報告されている。（非特許文献１０〜１３）。また、枯草菌を宿主として、ヒトインターフェロンを生産する際に、枯草菌のアミラーゼＡｍｙＥの有するプロ配列の付加が分泌量の向上に寄与することが報告されている（非特許文献１４）。
近年、ラクトコックス・ラクティスを宿主として、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）を生産する際に、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）のもつ１７残基のプロ配列が、分泌性向上に有効であることが報告されている（非特許文献１０）。また、スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ生産において、９残基の合成アミノ酸配列を付加することにより分泌性が向上することも報告されている。（非特許文献１０〜１３）。また、枯草菌を宿主として、ヒトインターフェロンを生産する際に、枯草菌のアミラーゼＡｍｙＥの有するプロ配列の付加が分泌量の向上に寄与することが報告されている（非特許文献１４）。
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本発明は、優れた分泌能を有するポリペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は当該ポリペプチドをコードする塩基配列を導入した組換え微生物を提供することを課題とする。さらに、本発明は当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
本発明者等は上記課題に鑑み、優れた分泌能を有するシグナル配列（シグナルペプチド）について鋭意検討を行った。その結果、配列番号１に示すアミノ酸配列中の少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列が、シグナルペプチドとして機能し優れた細胞外分泌能を有すること、このアミノ酸配列の下流に目的タンパク質を結合することで、当該目的タンパク質の分泌生産性が向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
本発明は、下記（Ａ）のアミノ酸配列が、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側に結合されてなるポリペプチドに関する。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列
また、本発明は、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列に関する。
また、本発明は、宿主微生物に、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入した組換え微生物に関する。
さらに、本発明は当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上方法に関する。
なお、本発明において、上記（Ａ）のアミノ酸配列を「ペプチド付加プレプロ配列」とも称する。
本発明は、下記（Ａ）のアミノ酸配列が、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側に結合されてなるポリペプチドに関する。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列
また、本発明は、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列に関する。
また、本発明は、宿主微生物に、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入した組換え微生物に関する。
さらに、本発明は当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上方法に関する。
なお、本発明において、上記（Ａ）のアミノ酸配列を「ペプチド付加プレプロ配列」とも称する。
本発明のポリペプチドは、Ｎ末端側に細胞外への分泌能に優れたアミノ酸配列領域（ペプチド付加プレプロ配列）を有し、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく細胞外に分泌させることができる。本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を導入した微生物では、当該ペプチド付加プレプロ配列の働きによって目的タンパク質又はポリペプチドの分泌生産性が向上する。当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法は、培養物から容易に目的タンパク質等を回収することができ、製造工程の簡便化と高い生産性とが得られる。しかも、当該製造方法により生産された組換えタンパク質又はポリペプチドは、野生型と同等の活性を維持でき、各種用途に好適に用いることができる。
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列（ペプチド付加プレプロ配列）と、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列とを含んでなる。ペプチド付加プレプロ配列は、目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の上流、すなわちＮ末端（アミノ末端）側に結合し、目的タンパク質又はポリペプチドを細胞外へ輸送・分泌するシグナルペプチドとして機能する。
［ペプチド付加プレプロ配列］
本発明のポリペプチドが有するペプチド付加プレプロ配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列は、枯草菌のα−アミラーゼAmyE由来のシグナル配列、プロ配列、及び成熟領域のＮ末端側の一部分からなるアミノ酸配列である。AmyEは、枯草菌体内でシグナル配列、プロ配列及び成熟領域が連結した前駆体として合成され、菌体外に分泌時にシグナル配列が、分泌後にプロ配列がそれぞれ切断されて成熟酵素となる。配列番号１において、１位〜３３位のアミノ酸配列がAmyEのシグナル配列に、３４位〜４１位のアミノ酸配列がAmyEのプロ配列に、４２位〜５９位のアミノ酸配列がAmyEの成熟タンパク質領域の上流１８アミノ酸に相当する。
本発明においては、AmyEのシグナル配列及びプロ配列をまとめてプレプロ配列と呼び、当該配列にAmyEの成熟領域の１部分が付加されているのでペプチド付加プレプロ配列と称した。
AmyEのシグナル配列のアミノ酸配列を配列番号２に、プロ配列のアミノ酸配列を配列番号３に、成熟タンパク質領域のアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。また、AmyEのシグナル配列、プロ配列、及び成熟タンパク質領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号５に示す。
本発明のポリペプチドが有するペプチド付加プレプロ配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列は、枯草菌のα−アミラーゼAmyE由来のシグナル配列、プロ配列、及び成熟領域のＮ末端側の一部分からなるアミノ酸配列である。AmyEは、枯草菌体内でシグナル配列、プロ配列及び成熟領域が連結した前駆体として合成され、菌体外に分泌時にシグナル配列が、分泌後にプロ配列がそれぞれ切断されて成熟酵素となる。配列番号１において、１位〜３３位のアミノ酸配列がAmyEのシグナル配列に、３４位〜４１位のアミノ酸配列がAmyEのプロ配列に、４２位〜５９位のアミノ酸配列がAmyEの成熟タンパク質領域の上流１８アミノ酸に相当する。
本発明においては、AmyEのシグナル配列及びプロ配列をまとめてプレプロ配列と呼び、当該配列にAmyEの成熟領域の１部分が付加されているのでペプチド付加プレプロ配列と称した。
AmyEのシグナル配列のアミノ酸配列を配列番号２に、プロ配列のアミノ酸配列を配列番号３に、成熟タンパク質領域のアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。また、AmyEのシグナル配列、プロ配列、及び成熟タンパク質領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号５に示す。
本発明で用いるペプチド付加プレプロ配列は、少なくとも配列番号１において１位〜４４位までのアミノ酸配列を含む。すなわち、AmyEのシグナル配列及びプロ配列をこの順で有し、さらに、プロ配列の後ろに成熟タンパク質領域のＮ末端側から少なくとも３アミノ酸以上最大で１８アミノ酸までが付加されてなることを特徴とする。プロ配列の下流に成熟タンパク質のＮ末端側の３〜１８アミノ酸を付加することで、後述の実施例で実証されているように、分泌効率が向上する。
AmyEのシグナル配列及びプロ配列については、これを付加した融合タンパク質において菌体外への分泌性が向上することも報告されている（前記非特許文献１４）。また、枯草菌α−アミラーゼのシグナル配列と成熟領域の間に人為的にアミノ酸配列を付加して生産性の効果を検証した報告がある（Itoh Y, Kanoh K, Nakamura K, Takase K, Yamane K. (1990) Artificial insertion of peptides between signal peptide and mature protein: effect on secretion and processing of hybrid thermostable alpha-amylases in Bacillus subtilis and Escherichia coli cells. J Gen Microbiol. 136(8):1551-1558.）。しかしながら、本発明者らが検討したところ、付加されているアミノ酸配列は任意に選択されたものであり、AmyEの成熟タンパク質領域のアミノ酸配列とは全く異なるものであった。
また、α−アミラーゼの成熟体領域に目的タンパク質を融合した融合タンパク質の生産性を評価した報告もある（Honda K, Fujieda H, Ogawa K, Imai M, Yamamoto H, Ikeda T, Yamane K. (1993) Extracellular production of human hepatitis B virus preS2 antigen as hybrid proteins with Bacillus subtilis alpha-amylases in high-salt-concentration media. Appl Microbiol Biotechnol. 40(2-3):341-347.）。しかしながら、付加している成熟体領域が長く本発明のペプチド付加プレプロ配列とは異なり、GSTをキャリアとして使用したタンパク質生産と同じ効果、すなわち発現量の増加や可溶化しやすくする効果を目的として付加されていると考えられ、その効果は本発明とは異なるものである。また、タンパク質生産が特殊な培養・分泌条件下で行われている点においても本発明の製造方法とは異なる。
また、α−アミラーゼの成熟体領域に目的タンパク質を融合した融合タンパク質の生産性を評価した報告もある（Honda K, Fujieda H, Ogawa K, Imai M, Yamamoto H, Ikeda T, Yamane K. (1993) Extracellular production of human hepatitis B virus preS2 antigen as hybrid proteins with Bacillus subtilis alpha-amylases in high-salt-concentration media. Appl Microbiol Biotechnol. 40(2-3):341-347.）。しかしながら、付加している成熟体領域が長く本発明のペプチド付加プレプロ配列とは異なり、GSTをキャリアとして使用したタンパク質生産と同じ効果、すなわち発現量の増加や可溶化しやすくする効果を目的として付加されていると考えられ、その効果は本発明とは異なるものである。また、タンパク質生産が特殊な培養・分泌条件下で行われている点においても本発明の製造方法とは異なる。
分泌生産性向上の観点から、ペプチド付加プレプロ配列として好ましくは、AmyEのシグナル配列及びプロ配列の下流にAmyEの成熟領域のＮ末端側３〜１０アミノ酸を付加したアミノ酸配列（配列番号１において１位〜４４位から１位〜５１位までの各アミノ酸配列）であり、より好ましくはプロ配列の後ろにＮ末端側８〜１０アミノ酸を付加したアミノ酸配列（配列番号１の１位〜４９位から１位〜５１位までの各アミノ酸配列）であり、さらに好ましくはプロ配列の後ろにＮ末端側８又は１０アミノ酸を付加したアミノ酸配列（配列番号１の１位〜４９位のアミノ酸配列又は１位〜５１位までのアミノ酸配列）であり、特に好ましくはプロ配列の後ろにＮ末端側８アミノ酸を付加したアミノ酸配列（配列番号１の１位〜４９位のアミノ酸配列）である。
［目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列］
本発明のポリペプチドは、前述のペプチド付加プレプロ配列のＣ末端側に、目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列が結合してなる。本発明において、当該目的タンパク質又はポリペプチドとは、枯草菌のAmyEタンパク質以外のタンパク質又はポリペプチドである。前述のように、AmyEとは枯草菌のα−アミラーゼであり、その成熟タンパク質領域のアミノ酸配列は配列番号４で示される。
目的タンパク質又はポリペプチド（以下、目的タンパク質等ともいう）としては、枯草菌のタンパク質AmyE以外であれば特に制限されず、例えば、インターロイキン、上皮成長因子、ケモカイン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、インシュリン、インターフェロン等が挙げられる。なかでも、本発明では目的タンパク質等としてインターフェロンを用いることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、前述のペプチド付加プレプロ配列のＣ末端側に、目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列が結合してなる。本発明において、当該目的タンパク質又はポリペプチドとは、枯草菌のAmyEタンパク質以外のタンパク質又はポリペプチドである。前述のように、AmyEとは枯草菌のα−アミラーゼであり、その成熟タンパク質領域のアミノ酸配列は配列番号４で示される。
目的タンパク質又はポリペプチド（以下、目的タンパク質等ともいう）としては、枯草菌のタンパク質AmyE以外であれば特に制限されず、例えば、インターロイキン、上皮成長因子、ケモカイン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、インシュリン、インターフェロン等が挙げられる。なかでも、本発明では目的タンパク質等としてインターフェロンを用いることが好ましい。
インターフェロン（Interferon、ＩＦＮとも略記する）は、多くの動物細胞にみられるタンパク質で、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つのタイプに大別される。本発明の目的タンパク質等として用いられるのは、Ｉ型インターフェロンが好ましい。Ｉ型インターフェロンとしては、ＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α１，２，４，５，６，７，８，１０，１３，１４，１６，１７，２１の１３種類）、ＩＦＮ−β（ＩＦＮ−β１）、ＩＦＮ−ω（ＩＦＮ−ω１）、ＩＦＮ−ε（ＩＦＮ−ε１）、ＩＦＮ−κ（ＩＦＮ−κ）が挙げられる。Ｉ型インターフェロンのなかでも、ヒトＩ型インターフェロンがより好ましく、ヒトＩ型インターフェロン−α（ｈＩＦＮ−α２ａ、ｈＩＦＮ−α２ｂなど）及びβ（ｈＩＦＮ−β１、ｈＩＦＮ−β２ｂなど）がさらに好ましく、ヒトＩ型インターフェロン−αが特に好ましい。
上記インターフェロンのアミノ酸配列情報、及びインターフェロン遺伝子の塩基配列情報は、DDBJ、EMBL、GenBank等の公共の塩基配列データバンク等から得ることができる。一例として、ヒトインターフェロン−α２ｂの成熟領域のアミノ酸配列を配列番号６に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号１７にそれぞれ示す。
上記インターフェロンのアミノ酸配列情報、及びインターフェロン遺伝子の塩基配列情報は、DDBJ、EMBL、GenBank等の公共の塩基配列データバンク等から得ることができる。一例として、ヒトインターフェロン−α２ｂの成熟領域のアミノ酸配列を配列番号６に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号１７にそれぞれ示す。
本発明のポリペプチドに含まれる目的タンパク質等のアミノ酸配列は、当該タンパク質等の成熟領域のみでもよく、当該タンパク質の機能に影響を与えない範囲で他の配列を有していてもよく、例えば、当該アミノ酸配列の合成・調製の際や宿主微生物への導入の際などに人為的に付加した配列（例えば、リンカー配列、アダプター配列など）を適宜有していてもよい。また、成熟領域のＮ末端側又はＣ末端側にヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグやｍｙｃタグといったアフィニティタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）といったキャリアタンパク質の配列等を有するものであってもよい。
［ポリペプチド］
本発明のポリペプチドは、上述したペプチド付加プレプロ配列が、目的タンパク質等のアミノ酸配列のＮ末端側に結合されたものである。本発明のポリペプチドにおいては、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等とが細胞内で融合タンパク質として発現するように連結されていればよい。ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域のアミノ酸配列とが直接結合している場合はもちろん、前述のように、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等のアミノ酸配列とがリンカーを介して結合していてもよいし、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域との間に、制限酵素に由来するアミノ酸、各種のタグや小ＤＮＡ断片に由来するアミノ酸等の配列を有していてもよい。
本発明のポリペプチドは、上述したペプチド付加プレプロ配列が、目的タンパク質等のアミノ酸配列のＮ末端側に結合されたものである。本発明のポリペプチドにおいては、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等とが細胞内で融合タンパク質として発現するように連結されていればよい。ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域のアミノ酸配列とが直接結合している場合はもちろん、前述のように、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等のアミノ酸配列とがリンカーを介して結合していてもよいし、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域との間に、制限酵素に由来するアミノ酸、各種のタグや小ＤＮＡ断片に由来するアミノ酸等の配列を有していてもよい。
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列情報、及び目的タンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、通常の遺伝子工学的手法により作製できる。具体的には、化学合成による方法、ＰＣＲ反応による方法、該当配列を含むＤＮＡ断片やプラスミドより得る方法などが挙げられる。
本発明のポリペプチドは、目的タンパク質等のアミノ酸配列のＮ末端側にペプチド付加プレプロ配列が結合した構造により、これを発現した微生物では菌体内でペプチド付加プレプロ配列が付加した融合タンパク質が合成され、分泌シグナルの働きにより菌体外に分泌される。ペプチド付加プレプロ配列は、優れた分泌能を有しており、目的タンパク質等を効率よく菌体外に分泌することができる。そのため、ペプチド付加プレプロ配列を結合することにより、菌体内での目的タンパク質前駆体の蓄積が減少する。さらに、菌体外に分泌されたタンパク質は、野生型と同等の生理活性を維持することができる。
［ポリペプチドをコードする塩基配列］
本発明の塩基配列は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもので、ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列の下流に、目的タンパク質等をコードする塩基配列が結合した塩基配列である。上述した本発明のポリペプチドと同様、細胞内で融合タンパク質として発現するよう配列番号１のペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列と目的タンパク質等コードする塩基配列とが連結されていればよく、リンカー配列等を含むものであってもよい。
ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号５の塩基配列において１位〜１３２位から１位〜１７７位までの領域の各塩基配列が挙げられる。目的タンパク質等をコードする塩基配列として、例えば、配列番号１７（ｈＩＦＮ−α２ｂ）の塩基配列が挙げられる。
本発明の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、目的タンパク質等をコードする塩基配列の情報をもとに、通常の手法により調製することができる。例えば、塩基配列情報をもとに適当なプライマーを設計し、枯草菌の染色体ＤＮＡや目的タンパク質等の遺伝子を有する生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ鋳型として、ＰＣＲ反応により合成することができる。また、塩基配列情報をもとに化学合成することもできる。
本発明の塩基配列は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもので、ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列の下流に、目的タンパク質等をコードする塩基配列が結合した塩基配列である。上述した本発明のポリペプチドと同様、細胞内で融合タンパク質として発現するよう配列番号１のペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列と目的タンパク質等コードする塩基配列とが連結されていればよく、リンカー配列等を含むものであってもよい。
ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号５の塩基配列において１位〜１３２位から１位〜１７７位までの領域の各塩基配列が挙げられる。目的タンパク質等をコードする塩基配列として、例えば、配列番号１７（ｈＩＦＮ−α２ｂ）の塩基配列が挙げられる。
本発明の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、目的タンパク質等をコードする塩基配列の情報をもとに、通常の手法により調製することができる。例えば、塩基配列情報をもとに適当なプライマーを設計し、枯草菌の染色体ＤＮＡや目的タンパク質等の遺伝子を有する生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ鋳型として、ＰＣＲ反応により合成することができる。また、塩基配列情報をもとに化学合成することもできる。
［組換え微生物］
本発明の組換え微生物は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（遺伝子）を、宿主微生物に導入したものである。
宿主微生物としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれを用いてもよいが、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点からグラム陽性菌が好ましい。グラム陽性菌の中でもバチルス(Bacillus)属細菌がより好ましく、具体的には、枯草菌(Bacillus subtilis)、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus thuringiensis、Bacillus subtilis nattoなどが好ましく用いられる。特に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点から、枯草菌を宿主とすることが好ましい。
本発明の組換え微生物は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（遺伝子）を、宿主微生物に導入したものである。
宿主微生物としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれを用いてもよいが、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点からグラム陽性菌が好ましい。グラム陽性菌の中でもバチルス(Bacillus)属細菌がより好ましく、具体的には、枯草菌(Bacillus subtilis)、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus thuringiensis、Bacillus subtilis nattoなどが好ましく用いられる。特に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点から、枯草菌を宿主とすることが好ましい。
宿主に導入する塩基配列は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、その調製方法も前述のとおりである。
本発明の組換え微生物には、本発明のポリペプチド配列をコードする塩基配列の他に、発現制御のために有用な塩基配列が適宜導入されていてもよい。例えば、転写、翻訳に関わる制御領域として、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位（ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列等）及び開始コドンを含む翻訳開始領域、ターミネーター等を、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列と適正な形で結合し導入してもよい。また、選択マーカー等を導入してもよい。
本発明の組換え微生物には、本発明のポリペプチド配列をコードする塩基配列の他に、発現制御のために有用な塩基配列が適宜導入されていてもよい。例えば、転写、翻訳に関わる制御領域として、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位（ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列等）及び開始コドンを含む翻訳開始領域、ターミネーター等を、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列と適正な形で結合し導入してもよい。また、選択マーカー等を導入してもよい。
宿主微生物への塩基配列の導入は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて行うことができる。例えば、ポリペプチド配列をコードする塩基配列をベクターに組み込んで、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませて導入してもよいし、塩基配列に宿主微生物ゲノムの相同領域を結合したＤＮＡ断片を用いて、相同組換えにより宿主微生物ゲノムに直接組み込んでもよい。
ベクターを用いる場合、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有する発現ベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。具体的には、ｐＨＹ３００、ｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４等のベクターを挙げることができる。
プロモーターやターミネーター、選択マーカー等の種類も特に限定されず、通常使用されるものを適宜選択して用いることができる。プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌプロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられる。選択マーカーとしては、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
目的塩基配列のベクターへの組み込みは、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法により行うことができる。
プロモーターやターミネーター、選択マーカー等の種類も特に限定されず、通常使用されるものを適宜選択して用いることができる。プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌプロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられる。選択マーカーとしては、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
目的塩基配列のベクターへの組み込みは、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法により行うことができる。
次いで、構築した組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列が導入された組換え微生物を作製する。形質転換方法は特に限定されず、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol．Lett．55，135（1990））、LP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等通常の方法を用いることができる。
目的の塩基配列が導入されたことの確認は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
目的の塩基配列が導入されたことの確認は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
［目的タンパク質等の製造］
得られた組換え微生物を用いて、目的タンパク質等を製造する。例えば、組換え微生物を適切な培地を用いて適切な条件下にて培養して、目的タンパク質を産生させ、培養物から目的タンパク質を精製・回収すればよい。本発明では、菌体内で合成された目的タンパク質等が効率よく菌体外に分泌されるので、培養液から目的タンパク質等を回収することができ、精製・単離作業を容易に行うことができる。
得られた組換え微生物を用いて、目的タンパク質等を製造する。例えば、組換え微生物を適切な培地を用いて適切な条件下にて培養して、目的タンパク質を産生させ、培養物から目的タンパク質を精製・回収すればよい。本発明では、菌体内で合成された目的タンパク質等が効率よく菌体外に分泌されるので、培養液から目的タンパク質等を回収することができ、精製・単離作業を容易に行うことができる。
組換え微生物の培養条件は、宿主の種類に応じて適宜好ましい培養条件を採用することができる。また、用いるベクターやプロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現誘導を適宜行ってもよい。例えば、宿主として枯草菌を用いた場合は、２×Ｌ培地（実施例参照）を用い、３０℃前後で培養を行えばよい。
培養物から目的タンパク質等を精製・単離する方法は特に限定されず、例えば、カラム精製、硫安沈殿、組換えタンパクにタグを付加した場合はタグを用いた精製、透析、フィルター精製等の方法で行うことができる。
培養物から目的タンパク質等を精製・単離する方法は特に限定されず、例えば、カラム精製、硫安沈殿、組換えタンパクにタグを付加した場合はタグを用いた精製、透析、フィルター精製等の方法で行うことができる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
下記の手法によって、本発明のペプチド付加プレプロ配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を導入した組換え微生物を構築し、目的タンパク質の発現を行った。目的タンパク質として、ヒトインターフェロンα（ｈＩＦＮ‐α）を用いた。
下記の手法によって、本発明のペプチド付加プレプロ配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を導入した組換え微生物を構築し、目的タンパク質の発現を行った。目的タンパク質として、ヒトインターフェロンα（ｈＩＦＮ‐α）を用いた。
［使用菌株、プラスミドベクター及び培地］
（１）使用菌株
大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株（タカラバイオ）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ）
枯草菌１６８株
枯草菌Ｄｐｒ８株（８種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株（Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprE）；Kodamaら, "Effect of Bacillus subtilis spo0A mutation on cell wall lytic enzymes and extracellular proteases, and prevention of cell lysis", J. Biosci. Bioeng., 2007, 103, p.13-21参照）
（２）プラスミド
ｐＷＨ１５２０；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、MoBiTec社製
ｐＨＫＫ３１００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列）
ｐＨＫＫ３１０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、及びｈＩＦＮ‐α２ｂの成熟体領域の配列）
ｐＨＫＫ３２００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列及びプロ配列）
ｐＨＫＫ３２０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列及びプロ配列、及びｈＩＦＮ‐α２ｂの成熟体領域の配列）
（３）培地
Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)１％、イーストエクスラクト(Difco)０．５％、NaCl（和光）０．５％
２×Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)２％、イーストエクスラクト(Difco)１％、NaCl（和光）１％
（１）使用菌株
大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株（タカラバイオ）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ）
枯草菌１６８株
枯草菌Ｄｐｒ８株（８種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株（Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprE）；Kodamaら, "Effect of Bacillus subtilis spo0A mutation on cell wall lytic enzymes and extracellular proteases, and prevention of cell lysis", J. Biosci. Bioeng., 2007, 103, p.13-21参照）
（２）プラスミド
ｐＷＨ１５２０；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、MoBiTec社製
ｐＨＫＫ３１００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列）
ｐＨＫＫ３１０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、及びｈＩＦＮ‐α２ｂの成熟体領域の配列）
ｐＨＫＫ３２００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列及びプロ配列）
ｐＨＫＫ３２０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入配列（枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列及びプロ配列、及びｈＩＦＮ‐α２ｂの成熟体領域の配列）
（３）培地
Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)１％、イーストエクスラクト(Difco)０．５％、NaCl（和光）０．５％
２×Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)２％、イーストエクスラクト(Difco)１％、NaCl（和光）１％
１．異種タンパク質ｈＩＦＮ−α発現用ベクターの構築
枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列（配列番号２）及びプロ配列（配列番号３）をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ基本ベクターｐＨＫＫ３２００を、特開2008-271956号公報の実施例２の記載に従って構築した。枯草菌１６８株の染色体を鋳型に、プライマーａｍｙＥＳＦ−１(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa（配列番号７）、大文字がＳｐｅＩ）及びａｍｙＥＳＲ−２(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc（配列番号８）、大文字がＫｐｎＩ）を用いてＰＣＲ法で増幅したａｍｙＥ遺伝子のＳＤ配列、シグナル配列及びプロ配列を、ｐＷＨ１５２０のマルチクローニングサイトのＳｐｅＩ−ＫｐｎＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２００を構築した（Kakeshita et al. 2011 Aｐｐｌ Mｉｃｒｏｂｉｏｌ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８９:１５０９−１５１７参照）。
次いで、ｐＯＲＦ５−ｈＩＦＮＡ２ｂ（インビボジェン製、ｈＩＦＮ−α２ｂ）を鋳型に、プライマーｉｆｎａＦ（ggccGGTACCtgtgatctgcctcaaacc（配列番号９）、大文字がＫｐｎＩ）及びｉｆｎａＲ(ggccGGATCCttttcattccttacttct（配列番号１０）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲ法で増幅したインターフェロンα遺伝子の成熟体領域（配列番号１７）を、ｐＨＫＫ３２００のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入し、インターフェロンα発現用ベクターｐＨＫＫ３２０１を構築した（図１）。
同様の手法で、枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ基本ベクターｐＨＫＫ３１００を構築した。ｐＨＫＫ３１００に、上記と同様の方法でインターフェロンα遺伝子の成熟体領域を組み込み、インターフェロンα発現用ベクターｐＨＫＫ３１０１を作成した（図１）（Kakeshita et al. 2011 Appl Microbiol Biotechnol 89:1509-1517参照）。
枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列（配列番号２）及びプロ配列（配列番号３）をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ基本ベクターｐＨＫＫ３２００を、特開2008-271956号公報の実施例２の記載に従って構築した。枯草菌１６８株の染色体を鋳型に、プライマーａｍｙＥＳＦ−１(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa（配列番号７）、大文字がＳｐｅＩ）及びａｍｙＥＳＲ−２(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc（配列番号８）、大文字がＫｐｎＩ）を用いてＰＣＲ法で増幅したａｍｙＥ遺伝子のＳＤ配列、シグナル配列及びプロ配列を、ｐＷＨ１５２０のマルチクローニングサイトのＳｐｅＩ−ＫｐｎＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２００を構築した（Kakeshita et al. 2011 Aｐｐｌ Mｉｃｒｏｂｉｏｌ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８９:１５０９−１５１７参照）。
次いで、ｐＯＲＦ５−ｈＩＦＮＡ２ｂ（インビボジェン製、ｈＩＦＮ−α２ｂ）を鋳型に、プライマーｉｆｎａＦ（ggccGGTACCtgtgatctgcctcaaacc（配列番号９）、大文字がＫｐｎＩ）及びｉｆｎａＲ(ggccGGATCCttttcattccttacttct（配列番号１０）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲ法で増幅したインターフェロンα遺伝子の成熟体領域（配列番号１７）を、ｐＨＫＫ３２００のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入し、インターフェロンα発現用ベクターｐＨＫＫ３２０１を構築した（図１）。
同様の手法で、枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ基本ベクターｐＨＫＫ３１００を構築した。ｐＨＫＫ３１００に、上記と同様の方法でインターフェロンα遺伝子の成熟体領域を組み込み、インターフェロンα発現用ベクターｐＨＫＫ３１０１を作成した（図１）（Kakeshita et al. 2011 Appl Microbiol Biotechnol 89:1509-1517参照）。
次に、枯草菌アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列、及び成熟領域のＮ末端側のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を組み込んだインターフェロンα発現用ベクターｐＨＫＫ３２２１〜ｐＨＫＫ３２２６を構築した。枯草菌１６８株の染色体を鋳型に、プライマーａｍｙＥＳＦ−１(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa（配列番号７）、大文字がＳｐｅＩ）と、ａｍｙＥＳ２−５Ｒ(ggccGGTACCtgctgtaagctcattcgatttg（配列番号１１）、大文字がＫｐｎＩ）、ａｍｙＥＳ３Ｒ(gaagaatGGTACCgcttttgatcgacgg（配列番号１２）、大文字がＫｐｎＩ）、ａｍｙＥＳ４Ｒ(ggccGGTACCcgaccaattccatgcatgaa（配列番号１３）、大文字がＫｐｎＩ）、ａｍｙＥＳ５Ｒ(ggccGGTACCtgtatatcctgcatcatgaa（配列番号１４）、大文字がＫｐｎＩ）、ａｍｙＥＳ６Ｒ(ggccGGTACCctgatacagccagtaccag（配列番号１５）、大文字がＫｐｎＩ）、又はａｍｙＥＳ７Ｒ(aaattcttgttcGGTACCtaagtaacgg（配列番号１６）、大文字がＫｐｎＩ）を用いてＰＣＲ法で増幅した各ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＫｐｎＩで切断した後、上記で構築したｐＨＫＫ３２０１のＳｐｅＩ−ＫｐｎＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２２１（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側３アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）、ｐＨＫＫ３２２２（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側８アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）、ｐＨＫＫ３２２３（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側１８アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）、ｐＨＫＫ３２２４（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側３５アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）、ｐＨＫＫ３２２５（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側６３アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）、及びｐＨＫＫ３２２６（挿入配列；アミラーゼＡｍｙＥのシグナル配列、プロ配列及びＡｍｙＥの成熟領域のアミノ末端側７４アミノ残基と、ＩＦＮα成熟体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列）をそれぞれ構築した（図１）。各プラスミドベクターは、ＡｍｙＥ成熟領域をコードする配列とＩＦＮα成熟体領域をコードする配列との間にリンカー配列（Gly-Thr配列）を有する。
なお、上記ベクター構築時の宿主には、大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株及びＪＭ１０９株（ともにタカラバイオ）を使用した。プラスミド構築時の大腸菌の培養及び枯草菌の前培養時には、Ｌ培地を用いた。
なお、上記ベクター構築時の宿主には、大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株及びＪＭ１０９株（ともにタカラバイオ）を使用した。プラスミド構築時の大腸菌の培養及び枯草菌の前培養時には、Ｌ培地を用いた。
２．異種タンパク質発現ベクター導入株の作製
上記１．で作成した各インターフェロンα発現ベクターを、形質転換法によって枯草菌変異株Ｄｐｒ８株を形質転換して、インターフェロンα発現ベクター導入株を得た。形質転換は、ＳＰＩ培地及びＳＰＩＩ培地を用いてコンピテント法により行い、１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に生育した菌株を形質転換体として選択した。
上記１．で作成した各インターフェロンα発現ベクターを、形質転換法によって枯草菌変異株Ｄｐｒ８株を形質転換して、インターフェロンα発現ベクター導入株を得た。形質転換は、ＳＰＩ培地及びＳＰＩＩ培地を用いてコンピテント法により行い、１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に生育した菌株を形質転換体として選択した。
３．分泌タンパク質の生産性評価
得られた各インターフェロンα発現ベクター導入株について、インターフェロンの生産性をウエスタンブロッティング解析、ELISA解析、及び生理活性測定により評価した。
導入株の培養には、２×Ｌ培地を用いた。抗生物質は、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬの濃度で適時使用した。ｐＷＨ１５２０のもつキシロースプロモーターの誘導のため、インターフェロンα導入株には、キシロース終濃度０．６％を添加した。培養は、特開2008-271956号公報の実施例２に記載の方法に従い、前培養液を２％植菌し、３０℃にて細胞増殖期中期（ＯＤ６６０＝０．３）まで培養後、キシロースを最終濃度０．６％添加し、培養した。培養開始後２４時間後で集菌し、培養液を得た。
得られた各インターフェロンα発現ベクター導入株について、インターフェロンの生産性をウエスタンブロッティング解析、ELISA解析、及び生理活性測定により評価した。
導入株の培養には、２×Ｌ培地を用いた。抗生物質は、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬの濃度で適時使用した。ｐＷＨ１５２０のもつキシロースプロモーターの誘導のため、インターフェロンα導入株には、キシロース終濃度０．６％を添加した。培養は、特開2008-271956号公報の実施例２に記載の方法に従い、前培養液を２％植菌し、３０℃にて細胞増殖期中期（ＯＤ６６０＝０．３）まで培養後、キシロースを最終濃度０．６％添加し、培養した。培養開始後２４時間後で集菌し、培養液を得た。
（１）ウエスタンブロッティング
得られた培養液から、下記「Medium」及び「Lysate」をそれぞれ調製し、ウエスタンブロッティング用サンプルとして用いた。
「Medium」：培養液を遠心して集菌し、得られた上清液をmediumとした。SDS-PAGEにて展開する際には、等量のサンプルバッファを加えて加熱処理してサンプルとした。
「Lysate」：培養液を遠心して集菌したもの（ペレットの状態）をリゾチーム処理後、バッファ(Tris-HCL)に懸濁し、等量のサンプルバッファを加えて加熱処理した。その後、遠心して得られた上清をサンプルとした。
得られた培養液から、下記「Medium」及び「Lysate」をそれぞれ調製し、ウエスタンブロッティング用サンプルとして用いた。
「Medium」：培養液を遠心して集菌し、得られた上清液をmediumとした。SDS-PAGEにて展開する際には、等量のサンプルバッファを加えて加熱処理してサンプルとした。
「Lysate」：培養液を遠心して集菌したもの（ペレットの状態）をリゾチーム処理後、バッファ(Tris-HCL)に懸濁し、等量のサンプルバッファを加えて加熱処理した。その後、遠心して得られた上清をサンプルとした。
ウエスタンブロッティングは、セミドライシステム（バイオラッド）を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロンＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。タンパク質の検出は、イムノスターＬＤ検出システム（商品名、和光純薬工業株式会社製）を用いた。抗インターフェロンα抗体は、（PeproTech EC LTD）のものを、ＨＲＰ標識二次抗体は、GEヘルスケアのものを使用して検出した。
インターフェロンの分泌量及び細胞内蓄積量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡を、ＩｍａｇｅＪ(National Institutes of Health, USA)により数値化することで行った。
インターフェロンの分泌量及び細胞内蓄積量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡を、ＩｍａｇｅＪ(National Institutes of Health, USA)により数値化することで行った。
（１−１）インターフェロン分泌量の測定
各導入株のMediumサンプルを用いて、菌体外に分泌されたインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した（図２（ａ））。
次いで、得られたインターフェロンのバンドの濃淡を、ＩｍａｇｅＪにより数値化し、各導入株のインターフェロン分泌量とした（図３）。なお、コントロールにはシグナル配列とプロ配列を持つｐＨＫＫ３２０１導入株を用い、ｐＨＫＫ３２０１導入株での分泌量を１００として、各導入株における分泌量を相対値（％）で示した。
各導入株のMediumサンプルを用いて、菌体外に分泌されたインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した（図２（ａ））。
次いで、得られたインターフェロンのバンドの濃淡を、ＩｍａｇｅＪにより数値化し、各導入株のインターフェロン分泌量とした（図３）。なお、コントロールにはシグナル配列とプロ配列を持つｐＨＫＫ３２０１導入株を用い、ｐＨＫＫ３２０１導入株での分泌量を１００として、各導入株における分泌量を相対値（％）で示した。
図３から明らかなように、シグナル配列とプロ配列に成熟領域の３アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２１導入株、及び８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２２導入株では、コントロールのｐＨＫＫ３２０１導入株に比べインターフェロン分泌量（生産量）が大きく上昇した。また、シグナル配列とプロ配列に１８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２３導入株でも、コントロールｐＨＫＫ３２０１導入株と同程度の生産性があった。特に、８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２２導入株では、インターフェロンの生産量が最大となり、シグナル配列のみのｐＨＫＫ３１０１導入株と比べて９．５倍、シグナル配列とプロ配列を有するｐＨＫＫ３２０１導入株と比べて２．９倍の生産性向上が確認された。
また、３５アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２４導入株は、シグナル配列のみのｐＨＫＫ３１０１導入株と比べて生産性は向上しているものの、シグナル配列とプロ配列を有するｐＨＫＫ３２０１導入株に比べると多少生産性が低下した。６３アミノ酸残基以上を付加した導入株では、インターフェロンの分泌はほとんど確認されなかった。
また、３５アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２４導入株は、シグナル配列のみのｐＨＫＫ３１０１導入株と比べて生産性は向上しているものの、シグナル配列とプロ配列を有するｐＨＫＫ３２０１導入株に比べると多少生産性が低下した。６３アミノ酸残基以上を付加した導入株では、インターフェロンの分泌はほとんど確認されなかった。
（１−２）菌体内のインターフェロン蓄積量の測定
各導入株のLysateサンプルを用いて、菌体内のインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した（図２（ｂ））。
その結果、各サンプルにおいて、菌体内に前駆体型インターフェロンと成熟型インターフェロンの両者が確認された。なお、前駆体型インターフェロンとは、シグナル配列が切断されていない状態であり、成熟型インターフェロンとは、付加したアミノ酸配列からシグナル配列が切断された状態である。
菌体外へ分泌されるタンパク質は、シグナル配列（シグナルペプチド）をアミノ末端側に持ち、これは菌体外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼよって切断される。細胞内への前駆体の蓄積は、シグナルペプチドが切断されておらず、菌体外への正常な分泌ができていないことを示している。宿主自体が持つ分泌タンパク質が菌体内に蓄積する現象は、分泌輸送経路構成因子の欠損や変異による機能不全があった場合に見られるもので、通常は観察されない。異種タンパク質発現においても、菌体内に前駆体タンパク質が蓄積していることは、分泌効率が悪いことを示している。異種タンパク質の細胞内蓄積は宿主への負荷となるため、効率的な異種タンパク質生産という点からは、蓄積が少ない状態が好ましい。
各導入株のLysateサンプルを用いて、菌体内のインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した（図２（ｂ））。
その結果、各サンプルにおいて、菌体内に前駆体型インターフェロンと成熟型インターフェロンの両者が確認された。なお、前駆体型インターフェロンとは、シグナル配列が切断されていない状態であり、成熟型インターフェロンとは、付加したアミノ酸配列からシグナル配列が切断された状態である。
菌体外へ分泌されるタンパク質は、シグナル配列（シグナルペプチド）をアミノ末端側に持ち、これは菌体外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼよって切断される。細胞内への前駆体の蓄積は、シグナルペプチドが切断されておらず、菌体外への正常な分泌ができていないことを示している。宿主自体が持つ分泌タンパク質が菌体内に蓄積する現象は、分泌輸送経路構成因子の欠損や変異による機能不全があった場合に見られるもので、通常は観察されない。異種タンパク質発現においても、菌体内に前駆体タンパク質が蓄積していることは、分泌効率が悪いことを示している。異種タンパク質の細胞内蓄積は宿主への負荷となるため、効率的な異種タンパク質生産という点からは、蓄積が少ない状態が好ましい。
次いで、得られた前駆体型インターフェロンと成熟型インターフェロンのバンドについて、濃淡をＩｍａｇｅＪにより数値化し、菌体内の前駆体型インターフェロン蓄積量及び成熟型インターフェロン蓄積量を算出した。これらをもとに、菌体内の総インターフェロン生産量（前駆体型インターフェロン蓄積量と成熟型インターフェロン蓄積量の和）に対する前駆体型インターフェロン蓄積量の比率を求め、前駆体型インターフェロン蓄積率（％）とした（図４）。
図４から明らかなように、シグナル配列とプロ配列に３アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２１導入株、８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２２導入株、１８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２３導入株では、シグナル配列とプロ配列を有するｐＨＫＫ３２０１導入株に比べて、前駆体型インターフェロンの蓄積が減少していた。前駆体の蓄積減少は、特にｐＨＫＫ３２２２導入株及びｐＨＫＫ３２２３導入株で顕著であった。
この結果から、菌体内での前駆体の蓄積解消が、インターフェロン生産量及び分泌効率の向上につながっている可能性が高いと考えられる。
この結果から、菌体内での前駆体の蓄積解消が、インターフェロン生産量及び分泌効率の向上につながっている可能性が高いと考えられる。
（１−３）インターフェロン分泌効率
前記（１−１）で得られた培養液中に分泌されたインターフェロン量、及び（１−２）で得られたライゼート中のインターフェロン総量（前駆体蓄積量＋成熟体蓄積量）から、各導入株における分泌効率を下記式により求めた。結果を図５に示す。
分泌効率（％）＝培地中に分泌されたインターフェロン量／インターフェロン総生産量 インターフェロン総生産量＝培地中に分泌されたインターフェロン量＋ライゼート中のインターフェロン総生産量（前駆体＋成熟体）
前記（１−１）で得られた培養液中に分泌されたインターフェロン量、及び（１−２）で得られたライゼート中のインターフェロン総量（前駆体蓄積量＋成熟体蓄積量）から、各導入株における分泌効率を下記式により求めた。結果を図５に示す。
分泌効率（％）＝培地中に分泌されたインターフェロン量／インターフェロン総生産量 インターフェロン総生産量＝培地中に分泌されたインターフェロン量＋ライゼート中のインターフェロン総生産量（前駆体＋成熟体）
図５から明らかなように、シグナル配列とプロ配列を有するｐＨＫＫ３２０１導入株に比べて、ｐＨＫＫ３２２１導入株、ｐＨＫＫ３２２２導入株、ｐＨＫＫ３２２３導入株では分泌効率が向上していた。特に、シグナル配列とプロ配列に８アミノ酸残基を付加したｐＨＫＫ３２２２導入株では分泌効率が約４倍と飛躍的に向上した。
（２）ＥＬＩＳＡ法による菌体外分泌されたインターフェロン量の測定
上記（１）ウエスタンブロッティングに用いた「Medium」サンプルと同様の調製手順で、ｐＨＫＫ３２０１導入株及びｐＨＫＫ３２２２導入株の培養液を遠心して集菌し、得られた上清液をＥＬＩＳＡ用サンプルとした。測定には、IFN-α Human ELISAキット（R＆Dsystems，Inc）を使用した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行われた。
ＥＬＩＳＡ法により算出された培養液上清中に含まれるインターフェロンの総量を、表１の「インターフェロン総量」欄に示した。
上記（１）ウエスタンブロッティングに用いた「Medium」サンプルと同様の調製手順で、ｐＨＫＫ３２０１導入株及びｐＨＫＫ３２２２導入株の培養液を遠心して集菌し、得られた上清液をＥＬＩＳＡ用サンプルとした。測定には、IFN-α Human ELISAキット（R＆Dsystems，Inc）を使用した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行われた。
ＥＬＩＳＡ法により算出された培養液上清中に含まれるインターフェロンの総量を、表１の「インターフェロン総量」欄に示した。
（３）インターフェロン活性測定
前記（１−１）でインターフェロン生産量が最大であったｐＨＫＫ３２２２を用いて、シグナル配列とプロ配列に８アミノ酸残基が付加された組換えインターフェロンの生理活性を測定した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行った。
上記（２）のＥＬＩＳＡ法と同様の手順で、ｐＨＫＫ３２０１導入株及びｐＨＫＫ３２２２導入株の培養上清液を調製して、測定試料とした。なお、バックグラウンドとして、インターフェロンをコードする遺伝子を有しないプラスミドを導入した株を用いて測定し、１００ＩＵ／ｍＬ以下であることを確認している。
生理活性測定は、ＦＬ細胞に対するSindbisウイルスの感染を指標として計測した。標準品には、インターフェロンＡ注射用（ｈＩＦＮα２ｂ、シェリング・プラウ株式会社（現 ＭＳＤ株式会社）製）を使用した。単位は、国際単位（ＩＵ）を使用した。
インターフェロンの生理活性は、インターフェロンに接触させたＦＬ細胞にシンドビスウイルスを感染させることによる抗ウイルス作用を指標とした生理活性測定法を用いた。無血清培地Ａ（５％ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞液を調製し、マイクロプレートに１０μＬ／ｗｅｌｌ播種した。炭酸ガスインキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で２０〜２８時間培養後、２倍段階希釈した標準品または測定試料５μＬ／ｗｅｌｌを添加した。炭酸ガスインキュベーター内でさらに２０〜２８時間培養した後、マイクロプレート内の培養液を除去し、培地Ｂ １００μＬ／ｗｅｌｌで１回洗浄後除去した。各試料に、無血清培地Ｂ（０．５％ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で適宜希釈したウイルス液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、マイクロプレートをインキュベーター内（３７℃）で１８〜２８時間培養した。マイクロプレート内のウイルス液を廃棄し、染色固定液（０．０５ｗ／ｖ％クリスタルバイオレット、１０ｖ／ｖ％エタノールを含む中性ホルマリン液）に１〜２時間浸し、水洗後、乾燥した。
得られたサンプルを、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（波長５９５ｎｍ）を測定した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌの吸光度を１００％、Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌの吸光度を０％とし、各ｗｅｌｌの吸光度％を算出した。吸光度５０％の希釈倍数を力価とし、標準品（インターフェロンＡ注射用３００（ＩＦＮ−α２ｂ）、市販品）の力価により測定試料の力価を補正し、試料のＩＦＮ力価を相対的に算出した。
上記測定により算出された培養上清液サンプル中の総インターフェロン活性を、表１の「総インターフェロン活性」欄に示した。
前記（１−１）でインターフェロン生産量が最大であったｐＨＫＫ３２２２を用いて、シグナル配列とプロ配列に８アミノ酸残基が付加された組換えインターフェロンの生理活性を測定した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行った。
上記（２）のＥＬＩＳＡ法と同様の手順で、ｐＨＫＫ３２０１導入株及びｐＨＫＫ３２２２導入株の培養上清液を調製して、測定試料とした。なお、バックグラウンドとして、インターフェロンをコードする遺伝子を有しないプラスミドを導入した株を用いて測定し、１００ＩＵ／ｍＬ以下であることを確認している。
生理活性測定は、ＦＬ細胞に対するSindbisウイルスの感染を指標として計測した。標準品には、インターフェロンＡ注射用（ｈＩＦＮα２ｂ、シェリング・プラウ株式会社（現 ＭＳＤ株式会社）製）を使用した。単位は、国際単位（ＩＵ）を使用した。
インターフェロンの生理活性は、インターフェロンに接触させたＦＬ細胞にシンドビスウイルスを感染させることによる抗ウイルス作用を指標とした生理活性測定法を用いた。無血清培地Ａ（５％ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞液を調製し、マイクロプレートに１０μＬ／ｗｅｌｌ播種した。炭酸ガスインキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で２０〜２８時間培養後、２倍段階希釈した標準品または測定試料５μＬ／ｗｅｌｌを添加した。炭酸ガスインキュベーター内でさらに２０〜２８時間培養した後、マイクロプレート内の培養液を除去し、培地Ｂ １００μＬ／ｗｅｌｌで１回洗浄後除去した。各試料に、無血清培地Ｂ（０．５％ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で適宜希釈したウイルス液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、マイクロプレートをインキュベーター内（３７℃）で１８〜２８時間培養した。マイクロプレート内のウイルス液を廃棄し、染色固定液（０．０５ｗ／ｖ％クリスタルバイオレット、１０ｖ／ｖ％エタノールを含む中性ホルマリン液）に１〜２時間浸し、水洗後、乾燥した。
得られたサンプルを、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（波長５９５ｎｍ）を測定した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌの吸光度を１００％、Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌの吸光度を０％とし、各ｗｅｌｌの吸光度％を算出した。吸光度５０％の希釈倍数を力価とし、標準品（インターフェロンＡ注射用３００（ＩＦＮ−α２ｂ）、市販品）の力価により測定試料の力価を補正し、試料のＩＦＮ力価を相対的に算出した。
上記測定により算出された培養上清液サンプル中の総インターフェロン活性を、表１の「総インターフェロン活性」欄に示した。
次いで、この培養上清中の総インターフェロン活性と、上記（２）ＥＬＩＳＡ法により算出された培養液上清中に含まれるインターフェロン総量とから、分泌された組換えインターフェロンの比活性を算出した。比活性＝総インターフェロン活性／インターフェロン総量 として算出し、結果は表１の「比活性」欄に示した。当該比活性は、同タンパク質量における組換えインターフェロンタンパク質の活性能を示している。
表１から明らかなように、「比活性」の値はｐＨＫＫ３２０１導入株を用いた系とｐＨＫＫ３２２２導入株を用いた系とで同程度であった。このことから、ｐＨＫＫ３２２２導入株（シグナル配列＋プロ配列＋８アミノ酸残基を付加）により菌体外に産出された組換えインターフェロンは、ｐＨＫＫ３２０１導入株（シグナル配列＋プロ配列を付加）により菌体外に産出された組換えインターフェロンと同等の生理活性を有することが確認された。なお、本発明者らは以前に、シグナル配列＋インターフェロン導入株（本発明のｐＨＫＫ３１０１株に相当、菌体外分泌時に当該シグナル配列は切断済み）及びシグナル配列＋プロ配列＋インターフェロン導入株（本発明のｐＨＫＫ３２０１導入株に相当）を用いて、上記（２）及び（３）と同様のインターフェロン活性測定を行っており、両導入株により菌体外に産出された組換えインターフェロンが、野生型と同等の生理活性を有することを既に確認済みである（前記非特許文献１４参照）。これらの結果から、ｐＨＫＫ３２２２導入株（シグナル配列＋プロ配列＋８アミノ酸残基を付加）により菌体外に産出された組換えインターフェロンは、野生型と同等の生理活性を保持しており、成熟領域の８アミノ酸残基を付加したことによる機能的な悪影響はないことが確認された。
Claims (5)
- インターフェロンαのアミノ酸配列のＮ末端側に、下記（Ａ）のアミノ酸配列が結合されてなるポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも１位〜４４位までの領域を含むアミノ酸配列であり、かつ、最長で配列番号１に示すアミノ酸配列の１位〜４９位までの領域のアミノ酸配列。 - 請求項１に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子。
- 宿主微生物に、請求項１に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
前記宿主が、バチルス（Bacillus）属に属する微生物である、組換え微生物。 - 請求項３に記載の組換え微生物を用いた、インターフェロンαの製造方法。
- 請求項３に記載の組換え微生物を用いた、インターフェロンαの生産性向上方法。
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