JPH02265491A

JPH02265491A - Ｓｄ配列

Info

Publication number: JPH02265491A
Application number: JP8451489A
Authority: JP
Inventors: Miki Kubo; 幹久保; Toshio Miyake; 三宅　俊男; Hirohito Higo; 肥後　裕仁
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-04-03
Filing date: 1989-04-03
Publication date: 1990-10-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野１この発明は、新規なＳＤ配列に関する。

［従来の技術］今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することが可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多（の種類の宿主系が確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することが可能となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら３重の構
造を有するため、分泌されるタンパク質も莢膜と内膜の
間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため、蓄積
される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプラズム
層に蓄積されたタンパク質な取り出す場合、菌体を物理
的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常に複雑
な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機械的障
害又は酵素的障害を受は活性を失う右それがあり、必ず
しも高い回収率は達成できない。

また、動物由来のタンパク質（例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等）を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し１発現を行なわせた場合、多くの場合
そのタンパク質は細胞質中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない、また、大腸菌以外のタンパク質の発現であるた
め動物中では可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内で
は不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため、
活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用い
て再構築しなければならない、それら一連の方法は非常
に煩雑であり、実用上は不向きである。また、他の微生
物（例えば枯草菌、酵母、カビ等）を用い生産物を菌体
外に分泌させ、活性型として取り出す方法等が研究され
ているが、発現量が低いとか、宿主菌によるタンパク質
分解酵素により分解され失活するといった問題点を有し
ている。また、動物細胞による分泌発現の系も多く研究
されているが微生物に比べ増殖能が非常に低く、大量に
タンパク質を必要とする場合不向きである。

しかも、現在の技術では、宿主の種類等により、適当な
ＳＤ配列を選択して使用しなければならないという問題
点を有している。このことは即ち、目的物の生産を種々
の宿主で実現する場合には、それら宿主内で働く種々の
ＳＤ配列を準備し、プラスミドを構築しなければならな
いことを意味している。

上記従来技術における問題点に鑑み、もし、所望のタン
パク質を種々の宿主に効率的に生産させることができる
ＳＤ配列が存在すれば、そのような所望のタンパク質の
生産に大いに貢献することは明らかである。

［発明が解決しようとする課題］従って、この発明の目的は、所望のタンパク質の遺伝子
工学的な分泌生産に用いることができる、高効率なＳＤ
配列を提供することである。

［課題を解決するための手段］本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少なくともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で働＜ＳＤ配列を見出し、かつ、これを含む
プラスミドを構築し、これを用いて所望のタンパク質を
生産させることに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で働＜ＳＤ配列を提供する。

［発明の効果］本発明により、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌に
所望のタンパク質を生産させることができるＳＤ配列が
提供された。この発明のＳＤ配列は、高活性であり、従
って、これを利用してタンパク質を生産すると、高効率
に所望のタンパク質な生産させることができる。さらに
、本発明のＳＤ配列は、後述の実施例で明らかになるよ
うに、所望のタンパク質を菌体外分泌生産させるために
用いることも可能であり、この場合には該タンパク質が
菌体外に分泌されるので、国体を破砕する必要がな（な
り、その結果、タンパク質が障害を受けることがな（な
る、また、生産された所望のタンパク質の精製も容易で
ある。

［発明の詳細な説明］本発明のＳＤ配列は少なくともバチルス属細菌及び大腸
菌内の両方において機能するものであり、このようなＳ
Ｄ配列は初めて見出された。このようなＳＤ配列は、バ
チルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼのＳＤ配列に見
出すことができ、下記実施例においてはバチルス・ステ
アロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ旺すのＳ
Ｄ配列を採用しているがこれに限定されるものではない
、好ましいＳＤ配列の例としてＧＡＡＡＡＧＧを挙げる
ことができる。

本発明のＳＤ配列は、常法により化学合成することによ
っても調製することができるし、本発明のＳＤ配列を含
む天然の染色体ＤＮＡから切り出してくることもできる
。後述の実施例においては、本発明のＳＤ配列は、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２株（微工研
菌寄第９６４５号）の染色体ＤＮＡから得られたもので
ある。

本発明のＳＤ配列は、従来と同様の態様により、所望の
ポリペプチドを高効率に生産するために用いることがで
きる。すなわち、本発明のＳＤ配列及びその下流に位置
する所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子、さら
にはＳＤ配列の上流に位置するプロモーター、前記構造
遺伝子の下流に位置するターミネータ−１宿主細胞内で
複製するための複製開始点及び好ましくは形質転換株を
選択するための、薬剤耐性や栄養要求性のような選択マ
ーカーを有するプラスミドを構築し、このプラスミドで
枯草菌のようなバチルス属細菌や大腸菌を常法により形
質転換し、形質転換株を培養し、培養物又は菌体から所
望のポリペプチドを回収することにより、所望のポリペ
プチドを生産することができる。このようなプラスミド
は、例えばｐＵＢｌｌｏ及びｐＴＢ５３のような市販の
発現ベクターに本発明のＳＤ配列及び所望のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を常法により組み込むことに
より得ることができ、このような方法は例えばＴ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ、　　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａビ（１９
８２１，Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒや、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　６８巻
、１９７９に詳しく記載されている。

本発明のＳＤ配列は、所望のポリペプチドの菌体内生産
のために利用することもできるが、生産されたポリペプ
チドを菌体外に分泌させる機能を有するシグナルペプチ
ドをコードする配列（以下シグナル配列と言う）及び特
に所望のポリペプチドがタンパク質分解酵素である場合
等のような必要な場合にはその下流にいわゆるプロ構造
をコードする配列を存在させることにより所望のポリペ
プチドを菌体外に分泌させることができる。

下記実施例では、バチルス・ステアロサーモフィルスＵ
Ｋ−２３２株由来のシグナル配列及びプロ構造コード配
列を利用して、枯草菌及び大腸菌において分泌生産を行
なっている。

以下、この発明を実施例に基づきより具体的に説明する
。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な塩基
配列やアミノ酸配列が示されているが、一般に、プロモ
ーター配列やＳＤ配列のような特定の機能を有する塩基
配列は、その塩基配列を構成する塩基のうち少数の塩基
が置換され、欠失し又は少数の塩基が付加された場合で
あっても実質的に同一の機能を果たす場合があることは
当業者において広（認識されているところである。従っ
て、下記実施例において具体的に示される塩基配列やと
は少数の塩基が置換され、欠失し又は付加されている点
において異なるが実質的に同一の機能を果たすものは下
記実施例において具体的に開示された塩基配列と実質的
に同一のものであると解釈すべきである。

叉Ｊ【例」１（１１ＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡの調製耐熱性中性プ
ロテアーゼｎＪ！ｊｍＭ　（同一出願人による特願昭６
２−２５３７４９号に記載）を含むバチルス・ステアロ
サーモフィルスＭＫ−２３２株（Ｍｏｔｏｋｉにｕｂｏ
、　Ｋｅｉｉｃｈｉ　Ｍｕｒａｙａｍａ、　Ｋｏｊｉ　
５ｅｔｏ及びＴａｄａｙｕｋｉ　Ｉｍａｎａｋａ、Ｊ、
　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　６６巻、１
号、ｐｐ、１３−１７　１９８８、”ＨｉｇｈｌｙＴｈ
ｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　　Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐｒｏｔ
ｅａｓｅ　　ｆｒｏｍ　　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、微工研菌寄第９６４５号
）を１００　ｍｌのし培地を含む５００　ｍｌ容量フラ
スコ中で一夜５５℃で培養した。遠心集菌後、２０ｍ１
のＴＥ緩衝液（１０ａ＋ＩＪトリス、ｌ　ｍＷ　ＥＤＴ
Ａ、　ｐＨ８，５１で洗浄し１次いで６ｍｌの１５％シ
ヨ糖−５０ｗ＋Ｍトリス（ｐＨ８，５１−５０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ−１ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸濁し、水中で３０
分間静置した。これに６ｍｌの２％ザルコシルー５０ｓ
ｌ）リス（ｐＨ８，５１−５０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加し
、室温で約１５分間放置して完全に溶菌させた０次いで
５０ｍ１容量フラスコにＣｓＣ１１１ｇを入れ、さらに
前記溶菌液１２＋ｍｌを加えた。その後１０　■ｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイド液０．６　ｍｌを加えた。こ
の液を２本の遠心管に分注し、ＰＲ６５７０−ター（日
立製作新製）で超遠心場で分離した。超遠心終了後、Ｄ
ＮＡ画分を注射針で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽
出を繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。この
ＤＮＡ試料を１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５１−０，Ｉ　
ＤＩＭ　ＥＤＴＡ中で透析し、４℃で保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
ｐＴＢ５３　　（文献：命中ら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１４６巻、１０９１頁、１９
８１年；命中ら、ＪＧｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　
１３０巻、１３９９頁、１９８４年）を常法により調製
した。このｐＴＢ５３及び上記のようにして調製したバ
チルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２株染色体
ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩでそれぞれ完全分解した・０
反応条件は次のとおりであった。

ｈす緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７，４１−１０ｍｌ
ＪＭｇＣｌ、　−５０ｍＭ　ＮａＣ１−１ｍＭジチオス
レイトール）の１０倍濃縮液を使用する（１０　ｘ　Ｐ
ｓｔＩ緩衝液）。

ｉｌ　　ＭＫ−２３２ＤＮＡ　　　　　　　　　　　３
０　　ｕ　１１０　ｘ　ＰｓｔＩ緩衝液　　　　　　　
　１０ｕｌウシ血清アルブミン（５ｍｇ／＋＊ｌｌ　　
　　２　　μｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　　５６
ｕｌ田１　　　　　　　　　　　　　２　μ１ｉｉ）ｐＴＢｓ３　　　　　　　　　　　　　２０　　ｕｌｌ
ｏ　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　　１０μｍウシ
血清アルブミン（５１１ｇ７ｍｌ）２　　μｌ蒸留水　
　　　　　　　　　　　　６６　　μ１ＰｓｔＩ　　　
　　　　　　　　　　　　２　　ｕ１反応は３７℃で９
０分間行なった。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールを０．４５　ｍｌ加えて１０〜１５分、
２０℃放置後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノー
ルで洗って脱水、脱塩し、デシケーク−で乾燥した。乾
燥物に１０　ｘ　　リガーゼ緩衝液（ｆｉ６Ｇ　ｍＭ　
）リス（ｐＨ７，６）　　６６　ｍ１４１ｇＣ１＊）　
　５μｌ　、１００−Ｍジチオスレイトール５μｌ　、
　１０　ｍｕ　ＡＴＰ　ｓμｔ　、蒸留水３４ｕｌを加
えて混合した後、ＤＮＡリガーゼｌｕｌを加え、４℃、
１６時間保った。これを次の形質転換に用いた。

（３）コンピテントセルの調製バチルス・サチルスＭＴ−２株（文献：藤井ら、Ｊ、　
８ａｃｔｅｒｉｏ１．１５４巻、８３１頁、　１９８３
年）をＬ培地で３７℃、−後培養した培養液を、ＴＦ−
１（Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　ｘ　１０　（Ｎ
Ｈ４）ＳＯ４２％、Ｋ、ＨＰＯ。

１４％、Ｋ）１．Ｐｏ、　６％、クエン酸ナトリウム１
％）２ｍ１．２％カザミノ酸０．２　ｍｌ、　１　ｍｇ
／ｍｌアミノ酸液１　ｍｌ、蒸留水１４．８　ｍｌ　％
５％グルコース＋０．２％Ｍｇ３０．２　ｎ１ｌ）に植
え、３時間４５分振盪培養し、　ＴＦ−２（１０ｘ　Ｓ
ｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　３．６　ｍｌ　、　２
％カザミノ酸０．１８　ｍｌ　、蒸留水２８．４４　ｍ
ｌ、５％グルコース＋０．２１　Ｍｇ５Ｏ，３，６１１
１１に植え、１時間３０分振盪培養し、コンピテントセ
ルを得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニング前記（２
）のＤＮＡ溶液４０ｕＬとｌａ＋１のコンピテントセル
を混合し、３７℃％３０分激しく撹拌した。これを遠心
後、３ｍｌのし培地を加え、３７℃、２時間穏やかに攪
拌した。その０．１＋ｓｌを１％カゼインと共にテトラ
サイクリン（２０μｌ／＋ｍｌ）又はカナマイシン（５
μｌ／ｍｌ）を含むＬＡプレートにまいた。このプレー
トを１６時間、３７℃に保ち、ハローを形成するコロニ
ーを取得した。このようにして得られた形質転換株をバ
チルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２と命名した。

バｆ　ルス・”ｊ　ｆ　）ｔｔ　スＭＴ−２／ｐＴＺ２
３２は昭和６１年９月３０日付で微工研に微工研菌寄第
８９８２号として寄託されている。バチルス・サチルス
ＩＴ−２／ｐＴＺ２３２を培養して常法によりプラスミ
ドＤ　Ｎ　Ａ　、　ｐＴＺ２３２を得た。このプラスミ
ドの制限酵素開裂部位を図２に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定プラスミドｐＴＺ２３２から旧ｎｄＩＩＩ　−ＰｓｔＩ
断片を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列を
決定した。結果を図１に示す。

（６）プロモーター配列の同定プラスミドｐＴＺ２３２の転写開始点をＳｌマツピング
法により同定した。すなわち、プラスミドｐＴＺ２：１
２からＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｂａ１ｌ旧断片を公知の方法
で分離し、ＢａｍＨＩ　５°末端をＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼを用い、［γ−”Ｐ］ＡＴＰでラベルした
。この断片と、公知の方法で分離した旺す遺伝子のｍＲ
ＮＡを含むＲＮＡ画分をハイブリダイズした。

これをＳｌヌクレアーゼ処理し、ＧｉｌｍａｎとＣｈａ
ｍｂｅｒｌｉｎ　（Ｃｅｌｌ　３５巻、ｐｐ、　２８５
−２９３．１９８３１記載の方法に従い、転写開始点を
決定した。その結果、図１に示すＴ（−１ｏ領域から１
１塩基対下流）から転写されることが明らかとなった。

従って、この転写開始点より上流がプロモーター配列で
あり、検索を行なったところ、工Ｔ　（Ｊ　−Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　１６３巻、ｐｐ、　８２４−８３１．１
９８５１と非常によ（似たプロモーター配列を見出すこ
とができた。図１に示されるように、このプロモーター
の一３５領域はＴＴＴＴＣＣｌ−１０領域はＴＡＴＴＧ
Ｔであり、その間の塩基数は１８塩基であった。

（７１ＳＤ配列の同定（６）で決定した転写開始点の下流で、かつＡＴＧ（Ｍ
ｅｔ）以下のオーブンリーディングフレームの上流で、
ＳＤ配列の検索を行なったところ、ＧＡＡＡＡＧＧから
成るＳＤ配列が見出された。なお、ＳＤ配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るＳＤ配列の比較により行なった。

（８）シグナルペプチドコード配列の同定図１に示す塩
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリーディングフレームが見出された。その結果、
図１に示すように、ＡＴＧ（Ｍｅｔｌから１９アミノ酸
から成るシグナル配列が見出された。なお、シグナルペ
プチドのアミノ酸配列は種によって太き（異なるが、般
的に、 ↓ Ｍｅｔ−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ａｌａ　−
Ａｌａ（又はＡｌａ　−Ｘ−Ａｌａ）　（↓は切断点を
示す）で表わされる約２０アミノ酸から成ることがわか
っている。

（９）プロ構造配列の同定バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロテアーゼ肚すヲ、ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３００
０Ｓ胃及びＴＳＫ　ｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷ　　（東ソ
ー株式会社製ゲルろ適用担体）によるクロマトグラフィ
ーにより精製した。その精製したタンパク質をエドマン
分解し、全自動シークエンサーによりそのＮ末端部分の
アミノ酸配列を同定した。その結果、ｌ１ｅ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３ｅｒが同定され、Ｉｌｅ以降が成熟
タンパク領域であり、それ以前がシグナル配列までプロ
構造であることが同定された。

叉」１九呈耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化上記（４）で得られたプラスミドｐＴＺ２３２を２０ユ
ニツトの制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで切断後１％アガロース
電気泳動にかけ分子量の大きいバンドのゲルを切り取っ
た。このゲル中のＤＮＡをＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ（フナ
コシ）を用いて回収するとＢｇｌ　ＩＩ断片が得られた
。

得られたＢｇｌ　Ｉｆ断片を上記（２）の方法によりＤ
ＮＡリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドｐＴＺ２３２を小型化した（図３）、得られたプラス
ミドをプラスミドｐＴ２２３２Ｂｇと命名した。

ｐＴＺ２３２の制限酵素地図を図４に示す。

上記（３）で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドｐＴＺ２３２Ｂｇを用いてバチルス・サチルスＭ
ｔ−２を形質転換した。このプラスミドを持つＭｔ−２
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良（行なった。

Ｘ立五１大腸菌における発現図２に示した、プロモーター配列を含む５ａｉｌ−Ｐｓ
ｔｌ断片の大きい方を実施例２で示した方法により回収
した。大腸菌中で複製可能なプラスミドｐＵｃ１９を凪
■及びｐｓＴＩで切断後、上記虱Ｉ−Ｐｓｔｌ断片を実
施例１（２）で示した方法により連結したａＶｋ組換え
プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒
造（株））に常法により形質転換した。得られた形質転
換株をＬ培地で３７℃、１６時間培養した。菌体を集菌
後、培地中のプロテアーゼ活性を測定したところ、５０
０　Ｕ　／ｍｌのプロテアーゼ活性が培地中に分泌され
ていた。このように本発明のＳＤ配列は枯草菌のみなら
ず大腸菌中でも効率良く異種タンパク質を分泌生産した
。

叉ＪＪＬ丘ヒトウロキナーゼの分泌生産図２に示す、シグナル配列を含む断片であるＢａｗ＋Ｈ
Ｉ−ＨｉｎｄｌＩＩ断片及びＡａｔＩ−ＰｓｔＩ断片を
抽出した。ウロキナーゼ構造遺伝子はｌ■−Ａａｔ　Ｉ
（Ａｇｒｉｃ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、、　５２
巻、３２９−３３６．　１９８８）として抽出した。こ
れらの断片とベクターとしてｐＴＢ５３の那■、Ｈｉｎ
ｄｌＩ［で切断したものとを実施例１（２）に示した方
法により連結した（図５）、このようにして得られた組
換えプラスミドを実施例１（３）で示した方法により形
質転換した。得られた組換え菌をＬ培地で３７℃、２４
時間培養した。１１体を集菌後、培地中のウロキナーゼ
活性を測定した。その結果、培地１■１当たり３０００
　Ｕ／ｍｌの酵素活性を示した（ウロキナーゼの活性測
定はＳ−２４４４合成基質活性測定法（Ｈａｙａｓｈｉ
、　Ｓら、Ｔｈｒｏａ＋ｂ、　Ｒｅｓ、　２２巻、５７
３−５７８．１９１１１に従い測定した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のＳＤ配列並びにプロモーター配列、シグ
ナルペプチドコード配列、プロ構造コード配列及び耐熱
性中性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域の塩基配列並
びにそれによってコードされるアミノ酸配列を示す図、図２は本発明のＳＤ配列の１実施例を含むプラスミドで
あるＪ）ＴＺ２３２の制限酵素地図。図３はｐＴＺ２３２を小型化してｐＴＺ２３２Ｂｇを作
製する工程を示す図、図４はｐ７２２３２８ｇ（７）制限ｕ　ｉ　地図、図５
は、ヒトウロキナーゼをコードする、本発明の１実施例
のＳＤ配列を含むプラスミドｐＭＫ４の制限酵素地図で
ある。図１（その２）図１（そのｌ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働く
ＳＤ配列。
（２）バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子
由来のものである請求項１項記載のＳＤ配列。
（３）バチルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性中性
プロテアーゼ遺伝子由来のものである請求項２記載のＳ
Ｄ配列。
（４）ＧＡＡＡＡＧＧの配列を有する請求項１ないし３
のいずれか１項に記載のＳＤ配列。