JPH02268687A

JPH02268687A - プラスミド

Info

Publication number: JPH02268687A
Application number: JP8941389A
Authority: JP
Inventors: Miki Kubo; 幹久保; Toshio Miyake; 三宅　俊男; Hirohito Higo; 肥後　裕仁
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-04-09
Filing date: 1989-04-09
Publication date: 1990-11-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野］この発明は、新規なプラスミドに関する。

［従来の技術］今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することが可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系が確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することが可能となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら３重の構
造を有するため、分泌されるタンパク質も莢膜と内膜の
間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため、蓄積
される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプラズム
層に蓄積されたタンパク質を取り出す場合、菌体を物理
的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常に複雑
な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機械的障
害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれがあり、必ず
しも高い回収率は達成できない。

また、動物由来のタンパク質（例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等）を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し、発現を行なわせた場合、多（の場合
そのタンパク質は細胞質中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない、また、大腸菌以外のタンパク質の発現であるた
め動物中では可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内で
は不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため、
活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用い
て再構築しなければならない、それら一連の方法は非常
に煩雑であり、実用−ヒは不向きである。また、他の微
生物（例えば枯草菌、酵母、カビ等）を用い生産物を菌
体外に分泌させ、活性型として取り出す方法等が研究さ
れているが、発現量が低いとか、宿主菌によるタンパク
質分解酵素により分解され失活するといった問題点を有
している。また、動物細胞による分泌発現の系も多く研
究されているが微生物に比べ増殖能が非常に低く、大量
にタンパク質を必要とする場合不向きである。

しかも、現在の技術では、宿主の種類により、適当なプ
ロモーター配列、ＳＤ配列、シグナル配列等を選択して
使用しなければならないという問題点を有している。こ
のことはすなわち、目的物の生産を種々の宿主で実現す
る場合には、それら宿主内で働（これらの配列を有する
プラスミドをそれぞれ構築しなければならないことを意
味している。

［発明が解決しようとする課題］この発明の目的は、バチルス属細菌及び大腸菌に、活性
型の所望のタンパク質を菌体外に分泌生産させるために
用いることができるプラスミドを提供することである。

［課題を解決するための手段］本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、と９わけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、バチルス属細菌内及び大腸菌内
゛で働く高活性プロモーター及び高活性ＳＤ配列を見出
し、また、菌体内で生産されたタンパク質を菌体外に効
率良く分泌させるシグナルペプチド及びこれをコードす
るＤＮＡ配列を見出し、上記プロモーター、ＳＤ配列及
びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するプ
ラスミドを構築し、これを用いて所望のタンパク質を菌
体外分泌させることに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で働くプロモーター配列と。

該プロモーター配列の下流に位置し、少な（ともバチル
ス属細菌内及び大腸菌内で働＜ＳＤ配列と、該ＳＤ配列
の下流に位置し、少なくともバチルス属細菌内及び大腸
菌内で生産されたタンパク質を菌体外へ分泌させるシグ
ナルペプチドをコードする配列と、該シグナルペプチド
コード配列の下流に位置する構造遺伝子を有するプラス
ミドを提供する。

［発明の効果］本発明により、少なくともバチルス属細菌又は大腸菌に
所望のタンパク質を分泌生産させることができるプラス
ミドが提供された。この発明のプラスミドを用いてタン
パク質を生産すると、該タンパク質が菌体外に分泌され
るので、菌体を破砕する必要がなくなり、その結果、タ
ンパク質が障害を受けることがなくなる。また、生産さ
れた所望のタンパク質の精製も容易である。

［発明の詳細な説明］」二連のように、本発明のブうスミドは、プロモーター
配列を有する。このプロモーター配列は少なくともバチ
ルス属細菌内及び大腸菌内の両方において機能するもの
であり、このようなプロモーター配列は初めて見出され
た。このようなプロモーター配列は、バチルス属細菌の
耐熱性中性プロテアーゼのプロモーター配列に見出すこ
とができ、下記実施例においてはバチルス・ステアロサ
ーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ旺１（同一出願
人による特願昭６２−２５３７４９号に記載）のプロモ
ーター配列を採用しているがこれに限定されるものでは
ない、好ましいプロモルタ−は、その−３５領域がＴＴ
ＴＴＣＣ５−ｉｏ領領域ＴＡＴＴＧＴである。ここで、
「−３５領域」及び「−１０領域」とは、転写開始点の
上流３５塩基目及び１０塩基目の塩基配列を示すが、枯
草菌では大腸菌の場合と異なり、丁度−３５及び−１Ｏ
の位置ではなく、２．３塩基のずれがある。なお、プロ
モーター配列は大腸菌で十分研究された結果、−３５領
域と一１０領域に特徴があることがわかっている。下記
実施例において得られたプロモーター配列の全塩基配列
並びに−３５領域及び−１０領域の位置が図１に示され
ている。また、−３５領域と一１０領域との間の塩基数
は、特に限定されないが、図１に示すように１８塩基で
あることが好ましい。

プロモーター配列の下流にはＳＤ配列が存在する１本発
明におけるＳＤ配列は少なくともバチルス属細菌及び大
腸菌内の両方において機能するものであり、このような
ＳＤ配列は初めて見出された。このよりなＳＤ配列は、
バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼのＳＤ配列に
見出すことができ、下記実施例においてはバチルス・ス
テアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ旺すの
ＳＤ配列を採用しているがこれに限定されるものではな
い、好ましいＳＤ配列の例としてＧＡＡＡＡＧＧを挙げ
ることができる。なお、ＳＤ配列は、必ずしもプロモー
ター配列の直下流に位置する必要はなく、プロモーター
配列とＳＤ配列の間に他の塩基配列が介在していてもよ
い。

ＳＤ配列の下流には、シグナルペプチドをコードする配
列（以下、簡単のため、シグナル配列と言う）が存在す
る。シグナルペプチドは菌体内で産生されたタンパク質
を菌体外に分泌する機能を有し、従来より種々のものが
知られている。

本発明におけるシグナルペプチドは、少なくともバチル
ス属細菌及び大腸菌の両方において機能するものである
。このようなシグナル配列は、バチルス属細菌の耐熱性
中性プロテアーゼのシグナル配列に見出すことができ、
下記実施例においてはバチルス・ステアロづ一モフィル
スの耐熱性中性プロテアーゼ旺１のシグナル配列を採用
しているがこれに限定されるものではない、好ましいシ
グナルペプチドの例としてＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｇ　
ｌｙ−１−ｅｕＡｌａを挙げることができ、これをコー
ドする配列としてＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡ
ＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＧＴＧＴＴ
ＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＣＧを挙げることができる
。シグナル配列もＳＤ配列の直下流に位置する必要はな
く、その間に他の塩基配列が介在していてもよい。

シグナル配列の下流には、所望のタンパク質をコードす
る構造遺伝子が存在する。構造遺伝子は、いかなる所望
のタンパク質をコードするものであってもよく、その由
来もヒトその伯の動植物及び微生物等いずれのものであ
ってもよい、原核生物由来の構造遺伝子は染色体ＤＮＡ
から直接分離したものをそのまま用いることができるが
、真核生物の構造遺伝子は介在配列を有するので、先ず
ｍＲＮＡを回収し、それと相補的なｃＤＮＡを調製して
用いることが好ましい、下記実施例においては、この構
造遺伝子は、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の
耐熱性中性プロテアーゼ旺す又はヒトウロキナーゼであ
るが、これらに限定されるものでないことは言うまでも
ない。

上記シグナル配列と構造遺伝子とは直接つなかっていて
もよいが、その間にいわゆるプロ構造をコードする配列
（以下プロ構造コード配列と言う）が存在することが好
ましい、プロ構造は、その明確な機能は明らかにはなっ
ていないが、従来よりタンパク質、特にタンパク質分解
酵素の分泌に関係することが知られており、いくつかの
タンパク質分解酵素のプロ構造が知られている０本発明
のプラスミドにおけるプロ構造は、特に限定されないが
、バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ由来のもの
であってよく、下記実施例のプラスミドは、バチルス・
ステアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼエＭ
由来のプロ構造コード配列を有する。プロ構造及びプロ
構造コード配列の一例が図１に示されている。

この発明の好ましい態様においては、上記構造遺伝子の
下流にはターミネータ−配列が存在する０本発明におけ
るターミネータ−配列は少なくともバチルス属細菌及び
大腸菌内の両方において機能するものである。このよう
なターミネータ−配列は、バチルス属細菌の耐熱性中性
ブロテアゼのターミネータ−配列に見出すことができ、
下記実施例においてはバチルス・ステアロサーモフィル
スの耐熱性中性プロテアーゼ旺１のターミネータ−配列
を採用しているがこれに限定されるものではない、好ま
しいターミネータ−配列の例としてＣＡＴＣＡＧＴＧＧ
ＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧを挙げ
ることができる。

本発明のプラスミドは、タンパク質を生産するための従
来のプラスミドと同様、宿主細胞内で自律的に複製する
ことができるものであり、従って、当該宿主細胞内で複
製するための複製開始点を有する。さらに、構造遺伝子
の下流には転写を停止するためのターミネータ−を有す
ることが好ましい、また、プラスミドで形質転換された
閑を選択することを容易にするために１例えば薬剤耐性
や栄養要求性のような適当な選択マーカーを有すること
が好ましい、このような複製開始点。

ターミネータ−及び選択マーカーを有するプラスミドベ
クターは従来より多数知られており、市販されており１
例えばｐＵＢｌｌｏ及びｐＴＢ５３を挙げることができ
る０本発明のプラスミドは、上記した各配列をこのよう
な公知のプラスミドに組み込んだものであってもよい。

本発明のプラスミドは、下記実施例における耐熱性中性
プロテアーゼのように、プロモーター配列等の由来と同
一の由来のタンパク質を産生するものであってもよいが
、下記実施例におけるヒトウロキナーゼのように、所望
の異種タンパク質を産生ずる組換え体プラスミドであっ
てもよい。

後者の態様では、あらゆる所望のタンパク質を生産する
ことができるので、産業上非常に有利である。

本発明のプラスミドは１例えば、上記各配列を有する天
然のプラスミドから上記各配列を切り出し、これを適当
なベクタープラスミドに組み入れ、さらに所望の構造遺
伝子を組み込むことにより得ることができる。各配列は
別々の供給源からのものであってもよく、また、化学合
成されたものであってもよい、各配列の切出しや組み込
み等は、制限酵素やりガーゼを用いた周知の方法により
行なうことができ、これらは例えばＴ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ”　　ｆ１
９８２１．　　Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｔｎｇＨａｒｂｏｒ
や、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　
　６８　巻、１９７９に詳しく記載されている。

本発明のプラスミドは、例＾ばコンピテントセル（Ａｎ
ａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｃ及びＪ、　５ｐｉｚ
ｉｚｅｎ、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８１巻、７４１゜１９６１　）
を用いる方法やプロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ、　Ｓ及
びＳ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ。

Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１６８巻、　１
１１．１９７９１のような周知の方法により、宿主細胞
を形質転換し、構造遺伝子がコードする所望のタンパク
質を宿主細胞に生産させることができる。宿主としては
、例えば枯草菌及びバチルス・ステアロサーモフィルス
のようなバチルス属細菌や大腸菌、又は場合１こよって
は放線菌等を採用することができる。＠記構造遺伝子が
プロテアーゼ遺伝子である場合には、例えば枯草菌ＮＡ
−１ｆＲ，Ｎａｋａｊｉａｍａら、ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　１６９巻、４０４．１９８５１のようなプロテ
アーゼ遺伝子を欠失させたもの、又はプロテアーゼ活性
が低下したものが好ましい。

形質転換株の選択は、プラスミドが選択マーカーを有す
る場合には、そのマーカーに基づいて選択した後、マー
カーを有さない場合にはそのような選択を行なうことな
く、所望のタンパク質を生産しているか否かをチエツク
することにより行なうことができる。前記構造遺伝子が
プロテアーゼである場合には、宿主としてプロテアーゼ
欠損株を用いた場合にはカゼイン含有プレート上でハロ
ーを形成する株を選択すればよ（、宿主細胞がプロテア
ーゼ欠損株でない場合には同様にカゼイン含有プレート
上でハローが大きくなった株を選択すればよい。

形質転換株の培養は、従来と同様に行なうことができ、
また、生産されたタンパク質の回収も公知の方法、例＾
ば、遠心分離等の方法で菌体を除去した後、ゲルろ過等
のタンパク質精製法に従って精製することができる。

以下、この発明を実施例に基づきより具体的に説明する
。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な塩基
配列やアミノ酸配列が示されているが、一般に、プロモ
ーター配列やＳＤ配列のような特定の機能を有する塩基
配列は、その塩基配列を構成する塩基のうち少数の塩基
が置換され、欠失し又は少数の塩基が付加された場合で
あっても実質的に同一の機能を果たす場合があることは
当業者において広く認識されているところである。また
、同様に、生理活性を有するポリペプチドにおいて、少
数のアミノ酸が置換され、欠失し又は付加された場合で
あっても、そのポリペプチドの生理活性が実質的に影響
を受けない場合があることも当業者にいおいて広（認識
されているところである。従って、下記実施例において
具体的に示される塩基配列やアミノ酸配列とは少数の塩
基又はアミノ酸が置換され、欠失し又は付加されている
点において異なるが実質的に同一の機能を果たすものは
下記実施例において具体的に開示された塩基配列と実質
的に同一のものであると解釈すべきであり、このような
具体的な配列が記載された特許請求の範囲もそのような
実施的に同一の配列を包含するものと解釈する。

ＸＪＬｆＬ↓ （１１ＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡの調製耐熱性中性プ
ロテアーゼ呼び（同一出願人による特願昭６２−２５３
７４９号に記載）を含むバチルス−ス＋７０サーモ７　
イルスＵＫ−２３２株（ＭｏｔｏｋｉＫｕｂｏ、Ｋｅｉ
ｉｃｈｉ　Ｍｕｒａｙａｗ＋ａ、にｏｊｉ　５ｅｔｏ及
びＴａｄａｙｕｋｉ　Ｉｍａｎａｋａ、　Ｊ、　Ｆｅｒ
ｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　６６巻、１号、ｐｐ
、　１３−１７　、１９８８、”ＨｉｇｈｌｙＴｈｅｒ
ｍｏｓｔａｂｌｅ　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ
　ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋
ｍｏｐｈｉｌｕｓ、微工研菌寄第９６４５号）を１００
　ｍｌのし培地を含ｔ５５００ｍｌ容量フラスコ中で一
夜５５℃で培養した。遠心集菌後、２０１１１のＴＥ緩
衝液（１０ｍＭ）リス、１１１１Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ
８，５）で洗浄し、次いで６ｍｌの１５％シヨｔＰ！−
５０ｍ１Ｊ）−リス（ｐＨ８，５１−５０ｍＭ　Ｅ［１
ＴＡ−１ｍｇ／１ｍｌリゾチームに懸濁し、水中で３０
分間静置した。これに６１の２％ザルコシルー５０ｍ１
トリス（ｐＨ８，５１−５０＋ｎＭ　ＥＤＴＡを添加し
、室温で約１５分間放置して完全に溶菌させた１次いで
５０＋ｍｌ容量フラスコにＣｓＣ１１１ｇを入れ、さら
に前記溶菌液１２ｍ１を加えた。その後１０　　Ｂ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイド液０．６　ｍｌを加えた。こ
の液を２本の遠心管に分注し、ＰＲ６５Ｔローター（日
立製作新製）で超遠心場で分ｌした。超遠心終了後、Ｄ
ＮＡ画分を注射針で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽
出を繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。この
ＤＮＡ試料を１１０１１Ｉトリス（ｐＨ７，５ｉ０．１
　＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ中で透析し、４℃で保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
ｐＴＢ５３　　（文献：今中ら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１４６巻、　１０９１頁、　
　１９８１年：今中ら、ＪＧｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　１３０巻、１３９９頁、　１．９８４年）を常法
により調製した。このｐＴＢ５３及び上記のようにして
調製したバチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩでそれぞれ完全分
解した０反応条件は次のとおりであった。

ＰｓｔＩ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）　　−
１０ｍ１４ＭｇＣ１，−５０ｍＭ　ＮａＣ１−１ｍＭジ
チオスレイトール）の１０イ８濃縮液を使用する（ｔｏ
　ｘ　ＰｓｔＩ緩衝液）。

ｉｆ　　ＭＫ−２３２ＤＮＡ　　　　　　　　　　　３
０　　ｕ　１１０　ｘ　ＰｓｔＩ緩衝液　　　　　　　
　１０μｍウシ血清アルブミンｆ５　ｍｇ／ａｌｌ　　
　　２　　μｍ蒸留水　　　　　　　　　　　　　５６
１ＬＩＰｓｔＩ　　　　　　　　　　　　　　　２　　
＋ｔ１ｐＴＢ５３　　　　　　　　　　　　　２０　　
μｍ１０　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　　１０ｕ
１ウシ血清アルブミン（５ｍｇ＃ａｌｌ　　　　２　　
ＬＬ］蒸留水　　　　　　　　　　　　　６６　　μｍ
ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　２　μｍ反応は３７
℃で９０分間行なった。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールを０．４５　ｍＭ加えて１０〜１５分、
２０℃放置後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノー
ルで洗って脱水、脱塩し、デシケータ−で乾燥した。乾
燥物に１０　ｘ　　リガーゼ緩衝液（６６０ａＭ　トリ
ス（ｐＨ７，６１、６６ｍＭＭｇＣｌ、）　　５　ｕ　
ｌ　、　１００　ｍＷジチオスレイトール５ｕ１．１０
　ｍＭ　ＡＴＰ　５　ｕ　ｌ　、蒸留水３４μｍを加え
て混合した後、ＤＮＡリガーゼ１μｌを加λ、４℃、１
６時間保った。これを次の形質転換に用いた。

（３）コンピテントセルの調製バチルス・サチルスＭＴ−２株（文献：藤井ら、Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４巻、８３１頁、１９８３
年）を■−培地で３７℃、−後培養した培養液を、ＴＦ
−１［Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　ｘ　ｔｏ　（
ＮＨ＝ｌＳＯ＋　２％、にｌＨＰＯ４１４％、ＫＨｚＰ
Ｏ＋　６％、クエン酸ナトリウム１％）２ｍｌ、２％カ
ザミノ酸０．２１１、ｌ　Ｂ／Ｉｌｌアミノ酸液ｌ履１
、蒸留水１４．８　ｍｌ　、　５％グルコース　＋０．
２％Ｍｇ３０．２　ａｌｌに植え、３時間４５分振盪培
養し、ＴＦ−２（１０ｘ　Ｓｐｉｚｉｇｅｎ”ｓ　５ａ
ｌｔ　３．６　ｍｌ　、　　２％カザミノ酸０．１８　
ｍｌ　、蒸留水２８．４４　ｍｌ、５％グルコース　＋
０．２％Ｍｇ５Ｏ，３，６ｍｌ）に植＾、１時間３０分
振盪培養し、コンピテントセルを得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニング前記（２
）のＤＮＡ溶液４０μｌと１ｍｌのコンピテントセルを
混合し、３７℃、３０分激しく撹拌した。これを遠心後
、３ｍｌのし培地を加え、３７℃、２時間穏やかに攪拌
した。そのＯ，１Ｉ１１を１％カゼインと共にテトラサ
イクリン（２０μｌ／ｍｌ）又はカナマイシン（５ＬＬ
ｌ／ｍｌ）を含むＬＡプレートにまいた。このプレート
を１６時間、３７℃に保ち、ハローを形成するコロニー
を取得した。このようにして得られた形質転換株をバチ
ルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２と命名した。バ
チルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２は昭和６１年
９月３０日付で微工研に微工研菌寄第８９８２号として
寄託されている。バチルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ
２３２を培養して常法によりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　、
　ｐＴＺ２３２を得た。このプラスミドの制限酵素開裂
部位を図２に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定プラスミドｐＴＺ２３２からＨｉｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ
Ｉ断片を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列
を決定した。結果を図１に示す。

（６）プロモーター配列の同定プラスミドｐＴＺ２３２の転写開始点をＳｔマツピンク
法により同定した。すなわち、プラスミドｐＴＺ２３２
からＨｉｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩ断片を公知の方法で
分離し、　ＢａｍＨＩ　５’末端をＴ４−ポリヌクレオ
ヂドキナーゼを用い、［γ−”ＰＩＡＴＰでラベルした
。この断片と、公知の方法で分離した■す遺伝子のｍＲ
ＮＡを含むＲＮＡ画分をハイブリダイズした。

これをＳｌヌクレアーゼ処理し、　ＧｉｌｍａｎとＣｈ
ａｍｂｅｒｌｉｎ　（Ｃｅｌｆ　３５巻、ｐｐ、　２８
５−２９３．１９８３）記載の方法に従い、転写開始点
を決定した。その結果、図１に示すＴ（−１０領域から
１１塩基対下流）から転写されることが明らかとなった
。従って、この転写開始点より上流がプロモーター配列
であり、検索を行なったところ、　工Ｔ　（Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１６３巻、ｐｐ、　８２４−１
１３１．１９１１５１と非常によく似たプロモーター配
列を見出すことができた１図１に示されるように、この
プロモーターの一３５領域はＴＴＴＴＣＣｌ−１０領域
はＴＡＴＴＧＴであった。

［７）ＳＤ配列の同定（６）で決定した転写開始点の下流で、かつＡＴＧ（ｌ
Ｊｅｔｌ以下のオーブンリーディングフレームの上流で
、ＳＤ配列の検索を行なったところ、ＧＡＡＡＡＧＧか
ら成るＳＤ配列が見出された。なお、ＳＤ配列の検索は
、常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されて
いるＳＤ配列の比較により行なった。

（８）　シグナルペプチドコード配列の同定図１に示す
塩基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一の
オーブンリーディングフレームが見出された。その結果
、図１に示すように、ＡＴＧ（Ｍｅｔｌか６１９アミノ
酸から成るシグナル配列が見出された。なお、シグナル
ペプチドのアミノ酸配列は種によって大きく異なるが。

射的に、Ｍｅｔ−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ａｌａ　−
Ａｌａ↓ （又はＡｌａ　−Ｘ−Ａｌａｌ　（↓は切断点を示す）
で表わされる約２０アミノ酸から成ることがわかってい
る。

（９）プロ構造配列の同定バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロテアーゼ工Ｍを、ＴＳＸｇｅｌ−Ｇ３（１
０１）ＳＷ及び丁ＳＫ　ｇｅｌ−Ｇ２００ＤＳ胃　（東
ソー株式会社製ゲルろ適用担体）によるクロマトグラフ
ィーにより精製した。その精製したタンパク質をエドマ
ン分解し、全自動シークエンサーによりそのＮ末端部分
のアミノ酸配列を同定した。その結果、　１ｉｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３ｅｒが同定され、Ｉｌｅ以降が
成熟タンパク領域であり、それ以前がシグナル配列まで
プロ構造であることが同定された。

（１０）ターミネータ−配列の同定ターミネータ−配列は、一般にＴのクラスターを有し、
中央に数塩基を挟んで逆方向反復塩基配列を持ち、さら
にこの逆方向反復塩基配列はＧＣに富む数塩基から十数
塩基から成ることが知られている。構造遺伝子の下流で
このような配列を検索したところ、図１に下線を引いた
配列が同定された。

叉ＪＬＩ汁ｌ耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化上記（４）　で得られたプラスミドｐＴ２２３２を２０
ユニツトの制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで切断後１％アガロー
ス電気泳動にがけ分子Ｉの大きいバンドのゲルを切す取
ツタ、コノケル中（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲＧＥＮＥ　Ｃ
ＬＥＡＮ（フナコシ）を用いて回収するとＢｇｌ　ＩＩ
断片が得られた。

得られたＢｇｌ　ＩＩ断片を上記（２）の方法によりＤ
ＮＡリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドｐＴ２２３２を小型化した（図３）、得られたプラス
ミドをプラスミドｐＴＺ２３２Ｂｇと命名した。

ｐＴＺ２３２の制限酵素地図を図４に示す。

上記（３）で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドｐＴ２２３２８ｇを用いてバチルス・サヂルスＭ
ｔ−２を形質転換した。このプラスミドを持っＭｔ−２
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良く行なった。

及五Ｍユバチルス属細菌中で働くプロモーターの強さの測定実施例１のプラスミドに含まれるプロモーターの（−３
５領域：　ＴＴＴＴＣＣｌ−１０領域：　ＴＡＴＴＧＴ
）とＷのプロモーター配列（−３５領域：　ＴＴＴＴＣ
Ｃｌ−１０領域ＴＡＴＴ　Ｔ　Ｔ　）　　（Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３巻、８２４−８３１゜１９８
５１　の強さを比較するため、同一コピー数プラスミド
ベクター及び同一宿主菌を用い、酵素活性を比較するこ
とによりプロモーターの強さを比べた。

すなわち、工ＴをコードするｐＮＰ２２　（Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　　１６３巻、ｐｐ、　　８２４
−８３１．　１９８５）をＢｇｌ、　ＩＩ、Ｈｉｎｄｌ
ｌｌで切断したもの（ｐＴＢ５３１と、公知の発現ベク
ターｐＴＢ５３をＢｇｌ　ＩＩ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｎｌで
切断したものとをＴ４リガーゼにより連結し、ｐＴＮＴ
５３を得た（図５）、実施例２で作製したｐＴＺ２３２
Ｂｇ及びこのｐＴＮＴ５３の両プラスミドで、それぞれ
バチルス・サヂルスＭＴ−２株を形質転換した。得られ
た形質転換株をＬ培地を用いて培養し、プロテアーゼ活
性と生育を調べた。結果を図６に示す０図６中、丸はプ
ロテアーゼ活性（カゼイン消化法により測定）、四角は
菌の生育状態（培！Ｉ液の６６０　ｎｍでの吸光度）を
示す。

図６より明らかなように、両者共生育は同程度であるの
に、ｐＴ２２３２８ｇを有する形質転換体は約４０００
　Ｕ＃ｎｌの酵素活性を示したが、ｐＴＮＴ５３を有す
るものは約２００　Ｕ／ｍｌであった。これらの結果か
ら、本発明の実施例１で得られたベクター中に含まれる
プロモーターは、ｎＰＬＴ遺伝子のプロモーターに比べ
約２０倍高いプロモーター活性を示した。

叉Ｊｊ艷Ａ大腸菌における発現図２に示した、プロモーター配列を含む５ａｌＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片の大きい方を実施例２で示した方法により回収
した。大腸菌中で複製可能なプラスミドｐＵ（：１９を
Ｓａｔ　Ｉ及びｐｓＴＩで切断後、上記５ａｌＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片を実施例１（２）で示した方法により連結した
。該組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９コンピテント
セル（宝酒造（株））に常法により形質転換した。得ら
れた形質転換株をＬ培地で３７℃、１６時間培養した。

菌体を集菌後、培地中のプロテアーゼ活性を測定したと
ころ、５００　Ｕ　／ｍｌのプロテアーゼ活性が培地中
に分泌されていた。このように本発明におけるプロモー
ター配列は枯草菌のみならず大腸菌中でも効率良く異種
タンパク質を分泌生産した。

１ＭＪ二ヒトウロキナーゼの分泌生産図２に示す、シグナル配列を含む断片であるＢａｍＨＩ
−Ｈｉｎｄｎｌ断片及びＡａｔＩ−ＰｓｔＩ断片を抽出
した。ウロキナーゼ構造遺伝子はＢ！ｊＬＸＩＩ　−Ａ
ａｔｌ（Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　
５２　巻、３２９−３３６，１９８８）として抽出した
。これらの断片とベクターとしてｐＴＢ５３のＰｓｔｌ
、　Ｈｉｎｄｌｌ＋で切断したものとを実施例１（２）
に示した方法により連結した（図７）、このようにして
得られた組換えプラスミドを実施例１（３）で示した方
法により形質転換した。得られた組換＾菌をＬ培地で３
７℃、２４時間培養した。菌体を集菌後、培地中のウロ
キナーゼ活性を測定した。その結果、培地１ｍｌ当たり
３０００　Ｕ／Ｄ１１の酵素活性を示した（ウロキナー
ゼの活性測定はＳ−２４４４合成基質活性測定法（Ｉ（
ａｙａｓｈｉ、　Ｓら、Ｔｈｒｏ＋ｍｂ−Ｒｅｓ、　２
２巻、５７３−５７８．１９８１に従い測定した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の１実施例のプラスミドのプロモーター配
列、ＳＤ配列、シグナルペプチドコード配列及びプロ構
造コード配列並びに耐熱性中性プロテアーゼ構造遺伝子
を含む領域の１Ω基配列及びそれによってコードされる
アミノ酸配列を示す図、図２は本発明のプラスミドの１実施例であるｐＴＺ２３
２の制限酵素地図、図３はｐＴ２２３２を小型化しテｐＴＺ２３２Ｂｇを作
製する工程を示す図。図４はｐＴ２２３２８ｇ］制限酵素地図、図５は比較実
験に用いた、耐熱性中性プロモ−ターＴを有するプラス
ミドｐＴＮＴ５３を作製する工程を示す図、図６は本発明のプラスミドｐＴＺ２３２Ｂｇ及び比◆の
だめのプラスミドｒ＋ＴＮＴ５３で形質転換された形や
転換株の生育状態及びプロテアーゼ活性を示１図、図７は、ヒトウロキナーゼをコードする本か明の１実施
例のプラスミドｐＭに４の制限酵素地図工ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働く
プロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に位置
し、少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働くＳ
Ｄ配列と、該ＳＤ配列の下流に位置し、少なくともバチ
ルス属細菌内及び大腸菌内で生産されたタンパク質を菌
体外へ分泌させるシグナルペプチドをコードする配列と
、該シグナルペプチドコード配列の下流に位置する構造
遺伝子を有するプラスミド。
（２）前記プロモーター配列がバチルス属細菌の耐熱性
中性プロテアーゼ遺伝子由来のものである請求項１記載
のプラスミド。
（３）前記プロモーター配列がバチルス・ステアロサー
モフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来のもの
である請求項２記載のプラスミド。
（４）前記プロモーター配列の−３５領域がＴＴＴＴＣ
Ｃ、−１０領域がＴＡＴＴＧＴである請求項１記載のプ
ラスミド。
（５）前記プロモーター配列の−３５領域と−１０領域
との間の塩基数が１８塩基である請求項４記載のプラス
ミド。
（６）前記ＳＤ配列がバチルス属細菌の耐熱性中性プロ
テアーゼ遺伝子由来のものである請求項１ないし４のい
ずれか１項に記載のプラスミド。
（７）前記ＳＤ配列が、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスの耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来のものである
請求項６記載のプラスミド。
（８）前記ＳＤ配列がＧＡＡＡＡＧＧである請求項１な
いし５のいずれか１項に記載のプラスミド。
（９）前記シグナルペプチドをコードする配列がバチル
ス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来のもので
ある請求項１ないし８のいずれか１項に記載のプラスミ
ド。
（１０）前記シグナルペプチドをコードする配列がバチ
ルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアー
ゼ遺伝子由来のものである請求項９記載のプラスミド。
（１１）前記シグナルペプチドが、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｌｅｕ−Ａｌａで表わされるアミノ酸を含む請求項１
ないし８のいずれか１項に記載のプラスミド。
（１２）前記シグナルペプチドをコードする配列が【遺
伝子配列があります】で表わされる請求項１１記載のプ
ラスミド。
（１３）前記シグナルペプチドコード配列と前記構造遺
伝子の間にプロ構造をコードする配列をさらに含む請求
項１ないし１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
（１４）前記プロ構造コード配列がバチルス・ステアロ
サーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来の
ものである請求項１３記載のプラスミド。
（１５）前記プロ構造が、【遺伝子配列があります】で表わされる請求項１ないし１２のいずれか１項に記載
のプラスミド。
（１６）前記プロ構造コード配列が【遺伝子配列があります】で表わされる請求項１４記載のプラスミド。
（１７）前記構造遺伝子は耐熱性中性プロテアーゼの構
造遺伝子である請求項１ないし１６のいずれか１項記載
のプラスミド。
（１８）前記構造遺伝子の下流に少なくともバチルス属
細菌内及び大腸菌内で働くターミネーター配列を有する
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のプラスミド
。
（１９）前記ターミネーター配列がバチルス属細菌の耐
熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来のものである請求項１
８記載のプラスミド。
（２０）前記ターミネーター配列がＣＡＴＣＡＧＴＧＧ
ＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧである
請求項１８記載のプラスミド。
（２１）組換え体プラスミドである請求項１ないし２０
記載のプラスミド。
（２２）前記構造遺伝子はヒトウロキナーゼの構造遺伝
子である請求項２１記載のプラスミド。