JPH02268688A - ターミネーター配列 - Google Patents
ターミネーター配列Info
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- JPH02268688A JPH02268688A JP8941489A JP8941489A JPH02268688A JP H02268688 A JPH02268688 A JP H02268688A JP 8941489 A JP8941489 A JP 8941489A JP 8941489 A JP8941489 A JP 8941489A JP H02268688 A JPH02268688 A JP H02268688A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
この発明は、新規なターミネータ−配列に関する。
[従来の技術]
3、発明の詳細な説明
[従来の技術]
今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することか可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系か確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することか可脂となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら3重のJ
iII造を有するため1分泌されるタンパク質も莢膜と
内膜の間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため
、蓄積される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプ
ラズム層に蓄積されたタンパク質な取り出す場合、菌体
を物理的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常
に複雑な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機
械的障害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれかあり
、必ずしも高い回収率は達成できない。
良くまた多量に生産することか可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系か確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することか可脂となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら3重のJ
iII造を有するため1分泌されるタンパク質も莢膜と
内膜の間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため
、蓄積される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプ
ラズム層に蓄積されたタンパク質な取り出す場合、菌体
を物理的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常
に複雑な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機
械的障害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれかあり
、必ずしも高い回収率は達成できない。
また、動物由来のタンパク質(例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等)を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し1発現を行なわせた場合、多くの場合
そのタンパク質は細胞真中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない。また、大腸菌以外のタンパク質の発現′Cある
ため動物中ては可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内
ては不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため
、活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用
いて再構築しなければならない。それら一連の方法は非
常に煩雑てあり、実用りは不向きである。また、他の微
生物(例えば枯草菌、酵母、カビ等)を用い生産物を菌
体外に分泌させ、活性型として取り出す方法等か研究さ
れているか、発現績か低いとか、宿主菌によるタンパク
質分解酵素により分解され失活するといった問題点を有
している。また、動物細胞による分泌発現の系も多く研
究されているが微生物に比べ増殖能か非常に低く、大量
にタンパク質を必要とする場合不向きである。
、ヒト成長ホルモン等)を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し1発現を行なわせた場合、多くの場合
そのタンパク質は細胞真中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない。また、大腸菌以外のタンパク質の発現′Cある
ため動物中ては可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内
ては不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため
、活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用
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常に煩雑てあり、実用りは不向きである。また、他の微
生物(例えば枯草菌、酵母、カビ等)を用い生産物を菌
体外に分泌させ、活性型として取り出す方法等か研究さ
れているか、発現績か低いとか、宿主菌によるタンパク
質分解酵素により分解され失活するといった問題点を有
している。また、動物細胞による分泌発現の系も多く研
究されているが微生物に比べ増殖能か非常に低く、大量
にタンパク質を必要とする場合不向きである。
しかも、現在の技術ては、宿主の種類等により、適当な
ターミネータ−配列を選択して使用しなければならない
という問題点を有している。このことは即ち、目的物の
生産を種々の宿主て実現する場合には、それら宿主内で
働く種々のターミネータ−配列を準備し、プラスミドを
構築しなければならないことを意味している。
ターミネータ−配列を選択して使用しなければならない
という問題点を有している。このことは即ち、目的物の
生産を種々の宿主て実現する場合には、それら宿主内で
働く種々のターミネータ−配列を準備し、プラスミドを
構築しなければならないことを意味している。
上記従来技術における問題点に鑑み、もし、種々の宿主
内で機ス駈するターミネータ−配列か存在すれば、その
ような所望のタンパク質の生産に大いに1tff&する
ことは明らかである。
内で機ス駈するターミネータ−配列か存在すれば、その
ような所望のタンパク質の生産に大いに1tff&する
ことは明らかである。
[発明が解決しようとする課題]
この発明の目的は、複数種の微生物を宿主とする、所望
のタンパク質の遺伝子工学的な生産に用いることかてき
るターミネータ−配列を提供することである。
のタンパク質の遺伝子工学的な生産に用いることかてき
るターミネータ−配列を提供することである。
[課題を解決するための手段]
本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少なくともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で働くターミネータ−配列を見出し、かつ、
これを含むプラスミドを構築し、これを用いて所望のタ
ンパク質を生産させることに成功し、本発明を完成した
。
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少なくともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で働くターミネータ−配列を見出し、かつ、
これを含むプラスミドを構築し、これを用いて所望のタ
ンパク質を生産させることに成功し、本発明を完成した
。
すなわち、本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で働くターミネータ−配列を提供する。
大腸菌内で働くターミネータ−配列を提供する。
[発明の効果]
本発明により、少なくともバチルス属細菌及び大I1g
菌に所望のタンパク質を生産させることができるターミ
ネータ−配列か提供された0本発明のターミネータ−配
列は、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌内で機能す
るものであり、従って、これらの宿主内て所望のタンパ
ク質を生産さゼる際に、それぞれの宿主内で41!能す
るターミネータ−配列をそれぞれ調製する必要かなく有
利である。また、ターミネータ−配列の活性は、構造遺
伝子の発現効率に影響を与えることが知られている。下
記実施例において具体的に示されるように、本発明の好
ましい態様のターミネータ−配列は高活性であり、従っ
て、これを利用してタンパク質を生産すると、高効率に
所望のタンパク質を生産さゼることかてきる。
菌に所望のタンパク質を生産させることができるターミ
ネータ−配列か提供された0本発明のターミネータ−配
列は、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌内で機能す
るものであり、従って、これらの宿主内て所望のタンパ
ク質を生産さゼる際に、それぞれの宿主内で41!能す
るターミネータ−配列をそれぞれ調製する必要かなく有
利である。また、ターミネータ−配列の活性は、構造遺
伝子の発現効率に影響を与えることが知られている。下
記実施例において具体的に示されるように、本発明の好
ましい態様のターミネータ−配列は高活性であり、従っ
て、これを利用してタンパク質を生産すると、高効率に
所望のタンパク質を生産さゼることかてきる。
[発IJIの具体的説IJIコ
本発明のターミネータ−配列は少なくともバチルス属細
菌及び大腸菌内の両方において機能するものであり、こ
のようなターミネータ−配列は初めて見出された。この
ようなターミネータ−配列は、バチルス属細菌の耐熱性
中性プロテアーゼのターミネータ−配列に見出すことか
てき、下記実施例においてはバチルス・ステアロサーモ
フィルスの耐熱性中性プロプアーゼnprMのターミネ
ータ−配列を採用しているかこれに限定されるものては
ない、好ましいターミネータ−配列の例としてCATC
AGTGGGGGATTTTTTCCTCCACTGA
TGを挙げることかできる。
菌及び大腸菌内の両方において機能するものであり、こ
のようなターミネータ−配列は初めて見出された。この
ようなターミネータ−配列は、バチルス属細菌の耐熱性
中性プロテアーゼのターミネータ−配列に見出すことか
てき、下記実施例においてはバチルス・ステアロサーモ
フィルスの耐熱性中性プロプアーゼnprMのターミネ
ータ−配列を採用しているかこれに限定されるものては
ない、好ましいターミネータ−配列の例としてCATC
AGTGGGGGATTTTTTCCTCCACTGA
TGを挙げることかできる。
未発11のターミネータ−配列は、常法により化学合成
することによっても調製することがてきるし、本発明の
ターミネータ−配列を含む天然の染色体DNAから切り
出してくることもてきる。
することによっても調製することがてきるし、本発明の
ターミネータ−配列を含む天然の染色体DNAから切り
出してくることもてきる。
後述の実施例においては、本92す1のターミネータ−
配列は、バチルス・ステアロサーモフィルスMK−23
2株(e 、IT M 菌8 第9645 号) ノS
包体D N Aから得られたものである。
配列は、バチルス・ステアロサーモフィルスMK−23
2株(e 、IT M 菌8 第9645 号) ノS
包体D N Aから得られたものである。
本発明のターミネータ−配列は、従来と同様のg様によ
り、jM rのポリペブチl−を高効率に生産するため
に用いることかてきる。すなわち、本発明のターミネー
タ−配列の1−流に位置する、所望のポリペプチドをニ
ー1−する構造遺伝子、そのL流に位置するSD配列及
びその−hmに位置するプロモーター配列並びに宿主細
胞内で複製するための複製開始点蓮びに好ましくは形質
転換株を選択するための、薬剤耐性や栄養要求性のよう
な選択マーカーをイ1するプラスミドを構築し、このプ
ラスミドて枯草菌のようなバチルス属細菌や大腸菌を常
法により形質転換し、形質転換株を培養し、培、B物又
は菌体から所望のポリペプチドを回収することにより、
所望のポリペプチドを生産することかできる。このよう
なプラスミドは1例えばpUBllo及びpTR53の
ような市販の発現ベクターに本発明のターミネータ−配
列及び所望のポリペプチドをニー1−するDNA配列を
常法により組み込むことにより()ることかてき、この
ような方法は例えばT、 Maniatis、ら、”M
olecularCloning。
り、jM rのポリペブチl−を高効率に生産するため
に用いることかてきる。すなわち、本発明のターミネー
タ−配列の1−流に位置する、所望のポリペプチドをニ
ー1−する構造遺伝子、そのL流に位置するSD配列及
びその−hmに位置するプロモーター配列並びに宿主細
胞内で複製するための複製開始点蓮びに好ましくは形質
転換株を選択するための、薬剤耐性や栄養要求性のよう
な選択マーカーをイ1するプラスミドを構築し、このプ
ラスミドて枯草菌のようなバチルス属細菌や大腸菌を常
法により形質転換し、形質転換株を培養し、培、B物又
は菌体から所望のポリペプチドを回収することにより、
所望のポリペプチドを生産することかできる。このよう
なプラスミドは1例えばpUBllo及びpTR53の
ような市販の発現ベクターに本発明のターミネータ−配
列及び所望のポリペプチドをニー1−するDNA配列を
常法により組み込むことにより()ることかてき、この
ような方法は例えばT、 Maniatis、ら、”M
olecularCloning。
A Laboratory Manuaビ(1982)
、 Co1d Springllarborや、 M
ethods in Enzymology、 68
巻、1979に詳しく2佐されている。
、 Co1d Springllarborや、 M
ethods in Enzymology、 68
巻、1979に詳しく2佐されている。
本発明のターミネータ−配列は、所望のポリペプチドの
菌体内生産のために利用することもできるか、生産され
たポリペブチl−を菌体外に分泌させる機能を有するシ
グナル配列チ1へをコードする配列(以下シグナル配列
と言う)及び特に所望のポリペプチドかタンパク賀分解
酵素である場合等のような必要な場合にはそのT流にい
わゆるプロ構造をコートする配列を存在さゼることによ
り所望のポリペプチドを菌体外に分泌させることかてき
る。下記実施例ては、バチルス・ステアロサーモフィル
スMK−212株由来のシグナル配列及びプロ構造ニー
)−配列を利用して、枯草菌及び大腸菌において公認生
産を行なっている。
菌体内生産のために利用することもできるか、生産され
たポリペブチl−を菌体外に分泌させる機能を有するシ
グナル配列チ1へをコードする配列(以下シグナル配列
と言う)及び特に所望のポリペプチドかタンパク賀分解
酵素である場合等のような必要な場合にはそのT流にい
わゆるプロ構造をコートする配列を存在さゼることによ
り所望のポリペプチドを菌体外に分泌させることかてき
る。下記実施例ては、バチルス・ステアロサーモフィル
スMK−212株由来のシグナル配列及びプロ構造ニー
)−配列を利用して、枯草菌及び大腸菌において公認生
産を行なっている。
以Y、この発明を実施例に基づきより具体的に説IJI
する。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な
塩基配列やアミノ酸配列か示されているか、一般に、プ
ロモーター配列やターミネータ−配列のような特定の機
1七を有する塩基配列は、その塩基配列を構成する塩基
のうち少数の塩基かt摸され、欠失し又は少数の塩基か
付加された場合であっても実質的に同一の機能を果たす
場合かあることは当業者において広く認識されていると
ころである。従って、下記実施例において具体的に示さ
れる塩基配列やとは少数の塩基か置換され、欠失し又は
付加されている点において異なるか実質的に回−の機膏
を果たすものは下記実施例において具体的に、開示され
た塩基配列と実質的に同一のものであると解釈すべきで
ある。
する。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な
塩基配列やアミノ酸配列か示されているか、一般に、プ
ロモーター配列やターミネータ−配列のような特定の機
1七を有する塩基配列は、その塩基配列を構成する塩基
のうち少数の塩基かt摸され、欠失し又は少数の塩基か
付加された場合であっても実質的に同一の機能を果たす
場合かあることは当業者において広く認識されていると
ころである。従って、下記実施例において具体的に示さ
れる塩基配列やとは少数の塩基か置換され、欠失し又は
付加されている点において異なるか実質的に回−の機膏
を果たすものは下記実施例において具体的に、開示され
た塩基配列と実質的に同一のものであると解釈すべきで
ある。
実施例1
(+) MK−232株染色体DNAの調製耐熱性中性
プロテアーゼニー(同一出願人による特願昭62〜25
3749号に記りを含むバチルス・ステアロサーモフィ
ルスMK−232株(MotokiKubo、Kcii
chi Murayasa、Koji 5cto及びT
adayuki Imanaka、 J、 Fc
rment、 Tect+no1. 66巻、1号、
pp、 N−17、+988、Hi g h I yT
hersostablc Neutral Prot
ease from Bacillusstearo
thernophilus、 e工研菌寄第9545号
)を1001のし培地を含む500 ml容量フラスコ
中で一夜55°Cて培養した。遠心集菌後、2o1のT
E緩衝液(]OmMトリス、1 mM EDTA、 p
H8,5)で洗浄し、次いて61の15%シヨ糖−50
mM トソス(pH8,5)−50mMEDTA−1+
*g/mlリゾチームニ懸濁し、水中で30分間静置し
た。これに61の2%fル’:3 シJl/−50ml
ト!J ス(ptl 8.5)−5011M EDTA
を添加し、室温で約15分間放コして完全に溶菌させた
。次いて50m1容量フラスコにCsCl 11 gを
入れ、さらに前記溶菌液12m1を加えた。その後IO
■g/slのエチジウムブロマイド液0.61を加えた
。この液を2本の遠心管に分注し、PH6STローター
(日ケ製作所製)て超遠心場で分離した。a遠心終了後
、DNA画分を注射針て抜き取り、n−フタノールで3
回抽出を繰り返してエチシウムブロマイトを除去した。
プロテアーゼニー(同一出願人による特願昭62〜25
3749号に記りを含むバチルス・ステアロサーモフィ
ルスMK−232株(MotokiKubo、Kcii
chi Murayasa、Koji 5cto及びT
adayuki Imanaka、 J、 Fc
rment、 Tect+no1. 66巻、1号、
pp、 N−17、+988、Hi g h I yT
hersostablc Neutral Prot
ease from Bacillusstearo
thernophilus、 e工研菌寄第9545号
)を1001のし培地を含む500 ml容量フラスコ
中で一夜55°Cて培養した。遠心集菌後、2o1のT
E緩衝液(]OmMトリス、1 mM EDTA、 p
H8,5)で洗浄し、次いて61の15%シヨ糖−50
mM トソス(pH8,5)−50mMEDTA−1+
*g/mlリゾチームニ懸濁し、水中で30分間静置し
た。これに61の2%fル’:3 シJl/−50ml
ト!J ス(ptl 8.5)−5011M EDTA
を添加し、室温で約15分間放コして完全に溶菌させた
。次いて50m1容量フラスコにCsCl 11 gを
入れ、さらに前記溶菌液12m1を加えた。その後IO
■g/slのエチジウムブロマイド液0.61を加えた
。この液を2本の遠心管に分注し、PH6STローター
(日ケ製作所製)て超遠心場で分離した。a遠心終了後
、DNA画分を注射針て抜き取り、n−フタノールで3
回抽出を繰り返してエチシウムブロマイトを除去した。
このDNA試料を10m閘トリス(pfl 7.5)−
0,1sM EDTA中て透析し、4℃て保存した。
0,1sM EDTA中て透析し、4℃て保存した。
(2)制限酵素処理・リガーゼ処理
枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
pTB53 (文献:今生ら、J6Bacjerio
1.146巻、1091頁、1981年:今生ら、J。
pTB53 (文献:今生ら、J6Bacjerio
1.146巻、1091頁、1981年:今生ら、J。
Gen、 Mierobiol、 130 巻、13
99頁、 1984年)を常法により調製した。この
pTB53及び上記のようにして調製したバチルス・ス
テアロサーモフィルスMK−2:12株染色体DNAを
制限酵素Pst Iでそれぞれ完全分解した8反応条件
は次のとおりてあった。
99頁、 1984年)を常法により調製した。この
pTB53及び上記のようにして調製したバチルス・ス
テアロサーモフィルスMK−2:12株染色体DNAを
制限酵素Pst Iでそれぞれ完全分解した8反応条件
は次のとおりてあった。
PSt1wt衝液(10mMトリス(pH7,4) −
10ybMMgC12−50sM Na(:l −1m
−ジチオスレイトール)の10倍濃縮液を使用する(1
0 x Pstl緩衝液)。
10ybMMgC12−50sM Na(:l −1m
−ジチオスレイトール)の10倍濃縮液を使用する(1
0 x Pstl緩衝液)。
) MK−212DNA
10 g 110 x Pstl M衝液
10 μmウシ血清アルブミン(5■g/
ml) 2 gl蒸留水 56 ル1 2 μm 1i) pT[35320、j。
10 g 110 x Pstl M衝液
10 μmウシ血清アルブミン(5■g/
ml) 2 gl蒸留水 56 ル1 2 μm 1i) pT[35320、j。
IOx Pstl緩衝液 10鉢1ウシ
血清アルフミン(5mg/sl) 2 井1蒸
留水 56 μ1Pstl
2 g11反応3
7℃て90分間行なった。
血清アルフミン(5mg/sl) 2 井1蒸
留水 56 μ1Pstl
2 g11反応3
7℃て90分間行なった。
2種のDNAを混合し、5M酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールをQ、45 ml加えて10〜15分、
20°C放ご後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノ
ールて洗って脱水、脱塩し、デシケータ−て乾燥した。
の後エタノールをQ、45 ml加えて10〜15分、
20°C放ご後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノ
ールて洗って脱水、脱塩し、デシケータ−て乾燥した。
乾燥物に10 x リガーゼ緩衝液(660mM)リ
ス(pfl 7.6) 、 66 mMMgc+2)
5μm、10口lジチオスレイ1−−ル5AL! 、
10 d ATP 5gl 、蒸留水34uLlを加
えて混合した後、DNAリガーゼ1ル1を加え、4’C
,16時間保った。これを次の形質転換に用いた。
ス(pfl 7.6) 、 66 mMMgc+2)
5μm、10口lジチオスレイ1−−ル5AL! 、
10 d ATP 5gl 、蒸留水34uLlを加
えて混合した後、DNAリガーゼ1ル1を加え、4’C
,16時間保った。これを次の形質転換に用いた。
(3)コンピテントセルの調製
バチルス・サチルスMT−2株(文献、藤井らJ、 B
acteriol、 154巻、831頁、1983年
)をL培地て37°C1−後培養した培養液を、TF(
Spizigen’s 5alt x 10
(Ntl、)Son 2L K、1lPO414駕
、K112P0.6%、’;tエン酸ナトナトリウム1
%1.2%カザミノ酸0.2 ml、1 mg/ml
アミノ酸液1−F、蒸留水14.8 ml 、 5%グ
ルコース0.2$ Mg5o、 2 N)ニ植え、3時
間45分振盪培養し、 TF−2(10x Spiz
igen s 5alt 3.6 ml 、
2 %カザミノ酸0.18 ml 、蒸留水2
8.44 ml、 5%グル:I−ス◆0.2Z M
g5O,1,6ml) ニ植え、1時間30分振盪培養
し、コンピテントセルな得た。
acteriol、 154巻、831頁、1983年
)をL培地て37°C1−後培養した培養液を、TF(
Spizigen’s 5alt x 10
(Ntl、)Son 2L K、1lPO414駕
、K112P0.6%、’;tエン酸ナトナトリウム1
%1.2%カザミノ酸0.2 ml、1 mg/ml
アミノ酸液1−F、蒸留水14.8 ml 、 5%グ
ルコース0.2$ Mg5o、 2 N)ニ植え、3時
間45分振盪培養し、 TF−2(10x Spiz
igen s 5alt 3.6 ml 、
2 %カザミノ酸0.18 ml 、蒸留水2
8.44 ml、 5%グル:I−ス◆0.2Z M
g5O,1,6ml) ニ植え、1時間30分振盪培養
し、コンピテントセルな得た。
(4)耐熱性中性プロテアーゼのクローニンク前記(2
)のDNA溶液40p1と11のコンピテントセルを混
合し、37℃、30分激しく攪拌した。これを遠心後、
31のL培地を加え、37℃、2時間穏やかに攪拌した
。その0.111を1%カゼインと共にテトラサイクリ
ン(20μ、1/ml)又はカナマイシン(5g!/■
I)を含むLAプレートにまいた。このプレートを16
時fi11.37°Cに保ち、ハローを形成するコロニ
ーを取得した。このようにして得られた形質転換株をバ
チルス・サチルスHT−2/pT1232と命名した。
)のDNA溶液40p1と11のコンピテントセルを混
合し、37℃、30分激しく攪拌した。これを遠心後、
31のL培地を加え、37℃、2時間穏やかに攪拌した
。その0.111を1%カゼインと共にテトラサイクリ
ン(20μ、1/ml)又はカナマイシン(5g!/■
I)を含むLAプレートにまいた。このプレートを16
時fi11.37°Cに保ち、ハローを形成するコロニ
ーを取得した。このようにして得られた形質転換株をバ
チルス・サチルスHT−2/pT1232と命名した。
バチルス・サチルスMT−2/pT1232は昭和61
年9月30日付て全工研に微工研菌1S第8982号と
して寄託されている。バチルス・サチルスMT−2/p
TZ232を培五して常法によりプラスミドD N A
、 pT72:12を得た。このプラスミドの制限酵
素開裂部位を図2に示す。
年9月30日付て全工研に微工研菌1S第8982号と
して寄託されている。バチルス・サチルスMT−2/p
TZ232を培五して常法によりプラスミドD N A
、 pT72:12を得た。このプラスミドの制限酵
素開裂部位を図2に示す。
(5)耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定 プラスミドI)TZ2ゴ2から旧ndm−Pstl断片
を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列を決定
した。結果を図1に示す。
塩基配列の決定 プラスミドI)TZ2ゴ2から旧ndm−Pstl断片
を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列を決定
した。結果を図1に示す。
(5)プロモーター配列の同定
プラスミドpTZ232の転写開始点をSLマツピンク
法により同定した。すなわち、プラスミドpTZ232
から旧ndm−8a園旧断片を公知の方法て分離し、B
am1ll 5’末端なT4−ポリヌクレオチトキナー
ゼを用い2 [γ−ff2P]八TPてラベルした。こ
の断片と、公知の方法で分離した止り遺伝子のml?N
Aを含むRNA画分をハイブリダイズした。
法により同定した。すなわち、プラスミドpTZ232
から旧ndm−8a園旧断片を公知の方法て分離し、B
am1ll 5’末端なT4−ポリヌクレオチトキナー
ゼを用い2 [γ−ff2P]八TPてラベルした。こ
の断片と、公知の方法で分離した止り遺伝子のml?N
Aを含むRNA画分をハイブリダイズした。
これをS1ヌクレアーゼ処理し、G11sa+iとCh
a+*berlin (Cell 35巻、pp、 2
85−29:l、 1983)記載の方法に従い、転写
開始点を決定した。その結果1図1に示すT(−10領
域から11塩基対下y!、)から転写されることか明ら
かとなった。従って、この転写開始点より上流かプロモ
ーター配列てあり、検索を行なったところ、nprT
(J。
a+*berlin (Cell 35巻、pp、 2
85−29:l、 1983)記載の方法に従い、転写
開始点を決定した。その結果1図1に示すT(−10領
域から11塩基対下y!、)から転写されることか明ら
かとなった。従って、この転写開始点より上流かプロモ
ーター配列てあり、検索を行なったところ、nprT
(J。
Bacteriol、 +6:l@、pp、 824−
811.1985)と非常によく似たプロモーター配列
を見出すことかできた0図1に示されるように、このプ
ロモーターの=35領域は丁子丁TCC,−10領誠は
TATTGTてあった。
811.1985)と非常によく似たプロモーター配列
を見出すことかできた0図1に示されるように、このプ
ロモーターの=35領域は丁子丁TCC,−10領誠は
TATTGTてあった。
(7)SD配列の同定
(6)で決定した転写開始点の下流て、かつATG(M
et)以下のオーブンリープインクフレームの上流で、
SD配列の検索を行なったところ、GAAAAGGから
成るSD配列か見出された。なお、SD配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るSD配列の比較により行なった。
et)以下のオーブンリープインクフレームの上流で、
SD配列の検索を行なったところ、GAAAAGGから
成るSD配列か見出された。なお、SD配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るSD配列の比較により行なった。
(8)シクナルベブチトコート配列の同定図1に示す塩
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリープインクフレームか見出された。その結果、
図1に示すように、ATG (Net)から19アミノ
酸から成るシグナル配列か見出された。なお、シグナル
ベブチトのアミノ酸配夕qは種によって大きく異なるか
、射的に、 ↓ Net−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ala −
Ala↓ (又はAla −X−Ala) (↓は切断点を示す)
で表わされる約20アミノ酸から成ることかわかってい
る。
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリープインクフレームか見出された。その結果、
図1に示すように、ATG (Net)から19アミノ
酸から成るシグナル配列か見出された。なお、シグナル
ベブチトのアミノ酸配夕qは種によって大きく異なるか
、射的に、 ↓ Net−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ala −
Ala↓ (又はAla −X−Ala) (↓は切断点を示す)
で表わされる約20アミノ酸から成ることかわかってい
る。
(9)プロ構造配列の同定
バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロテアーゼnprMを、TSKge 1−G
3000SW及びTSK gel−G2000SW
(東ソー株式会社製ゲルろ適用担体)によるクロマトグ
ラフィーにより精製した。その精製したタンパク質をエ
ドマン分解し、全自動シークエンサーによりそのN末端
部分のアミノ酸配列を同定した。その結果、I 1e−
Thr−G Iy−Thr−8erか同定され、Ile
以降か成熟タンパク領域てあり、それ以前かシグナル配
列まてプロ構造であることか同定された。
る耐熱性プロテアーゼnprMを、TSKge 1−G
3000SW及びTSK gel−G2000SW
(東ソー株式会社製ゲルろ適用担体)によるクロマトグ
ラフィーにより精製した。その精製したタンパク質をエ
ドマン分解し、全自動シークエンサーによりそのN末端
部分のアミノ酸配列を同定した。その結果、I 1e−
Thr−G Iy−Thr−8erか同定され、Ile
以降か成熟タンパク領域てあり、それ以前かシグナル配
列まてプロ構造であることか同定された。
(]0)ターミネータ−配列の同定
ターミネータ−配列は、一般にTのクラスターな有し、
中央に数塩基を挾んで逆方向反復塩基配列を持ち、さら
にこの逆方向反復塩基配列はGCに富む数塩基から十数
塩基から成ることか知られている。構造遺伝子の下流で
このような配列を検索したところ1図1に下線を引いた
配列か同定された。
中央に数塩基を挾んで逆方向反復塩基配列を持ち、さら
にこの逆方向反復塩基配列はGCに富む数塩基から十数
塩基から成ることか知られている。構造遺伝子の下流で
このような配列を検索したところ1図1に下線を引いた
配列か同定された。
実施例2
耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化 上記(4)で得られたプラスミドpTZ232を20ユ
ニツトの制限酵素Bgl IIで切断後1%アガロース
電気泳動にかけ分子量の大きいハントのゲルを切り取っ
た。コノゲル中のDNAをGENE CLEAN(フナ
コシ)を用いて回収するとBgl II断片か得られた
。
化 上記(4)で得られたプラスミドpTZ232を20ユ
ニツトの制限酵素Bgl IIで切断後1%アガロース
電気泳動にかけ分子量の大きいハントのゲルを切り取っ
た。コノゲル中のDNAをGENE CLEAN(フナ
コシ)を用いて回収するとBgl II断片か得られた
。
得られたRgl II断片をL記(2)の方法によりD
NAリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドpTZ232を小型化した(図3)。得られたプラス
ミドをプラスミドpTZ2328gと命名した。
NAリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドpTZ232を小型化した(図3)。得られたプラス
ミドをプラスミドpTZ2328gと命名した。
pTIZ32の制限酵素地図を図4に示す。
上記(3)で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドpTZ232Bgを用いてバチルス・サチルスM
L〜2を形質転換した。このプラスミドを持つMt−z
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良く行なった。
スミドpTZ232Bgを用いてバチルス・サチルスM
L〜2を形質転換した。このプラスミドを持つMt−z
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良く行なった。
実施例3
バチルス属細菌中で働くプロモーターの強さの測定
実施例1のプラスミドに含まれるプロモーターの(−3
5領域:TTTTCCl−i。
5領域:TTTTCCl−i。
領域 TATTGT)とnprTのプロモーター配列(
−35領域:TTTTCC,−10領域TATT T
T ) (J、 Bacteriol、 +6:1巻
、 824−8:11.1985)の強さを比較するた
め、同一コピー数プラスミドベクター及び同一宿主菌を
用い、酵素活性を比較することによりプロモーターの強
さを比べた。
−35領域:TTTTCC,−10領域TATT T
T ) (J、 Bacteriol、 +6:1巻
、 824−8:11.1985)の強さを比較するた
め、同一コピー数プラスミドベクター及び同一宿主菌を
用い、酵素活性を比較することによりプロモーターの強
さを比べた。
すなわち、呼シをコートするpNP22 (J。
Bacteriol、 l[i:1巻、pp、 8
24−831. 1985)をBgl 11、Hi n
d mて切断したもの(pTB53)と、公知の発現
ベクターpTR53をBgI rl、Hi n d m
て切断したものとをT4リガーゼにより連結し、pTN
T53を4!)た(図5)。実施例2で作製したpT2
2328g及びこのpT)IT5]の両プラスミドで、
それぞれバチルス・サチルスMT−2株を形質転換した
。得られた形質転換株をL培地を用いてJ8養し、プロ
テアーゼ活性と生育を調べた。結果を図6に示す6図6
中、丸はプロテアーゼ活性(カゼイン消化法により測定
)、四角は菌の生育状態(培養液の650 n@での吸
光度)を示す。
24−831. 1985)をBgl 11、Hi n
d mて切断したもの(pTB53)と、公知の発現
ベクターpTR53をBgI rl、Hi n d m
て切断したものとをT4リガーゼにより連結し、pTN
T53を4!)た(図5)。実施例2で作製したpT2
2328g及びこのpT)IT5]の両プラスミドで、
それぞれバチルス・サチルスMT−2株を形質転換した
。得られた形質転換株をL培地を用いてJ8養し、プロ
テアーゼ活性と生育を調べた。結果を図6に示す6図6
中、丸はプロテアーゼ活性(カゼイン消化法により測定
)、四角は菌の生育状態(培養液の650 n@での吸
光度)を示す。
図6より明らかなように、両者共生育は同程度であるの
に、p T Z 232 It gをイ1する形質転換
体は約400011/1の醇、(;活性を小したか、p
TNT53を治するものは約20011/1てあった。
に、p T Z 232 It gをイ1する形質転換
体は約400011/1の醇、(;活性を小したか、p
TNT53を治するものは約20011/1てあった。
実施例4
大1賜菌における発現
図2に示した、プロモーター配列を含む5alt−Ps
tl 断片の大きい方を実施例2で示した方法により回
収した。大腸菌中て複袈可能なプラスミドpUcI9を
5alt及びpsTIて切断後、上記5all−PSL
IFJ片を実施例1(2)て示した方法により連結した
。該組換えプラスミ1−を大Il!菌J旧09コンピテ
ントセル(宝酒造(株))に常法により形質転換した。
tl 断片の大きい方を実施例2で示した方法により回
収した。大腸菌中て複袈可能なプラスミドpUcI9を
5alt及びpsTIて切断後、上記5all−PSL
IFJ片を実施例1(2)て示した方法により連結した
。該組換えプラスミ1−を大Il!菌J旧09コンピテ
ントセル(宝酒造(株))に常法により形質転換した。
得られた形質転換株をL培地て37°C116時間培養
した。菌体を集菌後、培地中のプロテアーゼ活性を測定
したところ、500 U/mlのプロテアーゼ活性か培
地中に分泌されていた。このように本発明におけるター
ミネータ−配列は枯草菌のみならず大腸菌中ても効率良
く機能した。
した。菌体を集菌後、培地中のプロテアーゼ活性を測定
したところ、500 U/mlのプロテアーゼ活性か培
地中に分泌されていた。このように本発明におけるター
ミネータ−配列は枯草菌のみならず大腸菌中ても効率良
く機能した。
実施例5
ヒトウロキナーゼの分泌生産
図2に示す、シグナル配列を含む断片であるBiol1
−Hindm断片及びAaローPstl断片を抽出した
。ウロキナーゼ構造遺伝子はBgI H−Aat+(^
grie、 Biol、 Chew、、 52
巻、:129−3:15.1988)として抽出した。
−Hindm断片及びAaローPstl断片を抽出した
。ウロキナーゼ構造遺伝子はBgI H−Aat+(^
grie、 Biol、 Chew、、 52
巻、:129−3:15.1988)として抽出した。
これらの断片とベクターとして1)TB53の川1、I
t i n d mで切断したものとを実施例1(2)
に示した方法により連結した(図7)、このようにして
得られた組換えプラスミドを実施例1(3)で示した方
法により形質転換した。得られた組換え菌をL培地て3
7°C124時間培養した。菌体を集菌後、培地中のウ
ロキナーゼ活性を測定した。その結果、培#!11当た
り:1000 II/mlの酵素活性を示した(ウロキ
ナーゼの活性測定はS−2444合成基質活性測定法(
1−1ayashi 、 SらThro*b、 Rcs
、 22巻、57:l−578,1981に従い測定し
た。
t i n d mで切断したものとを実施例1(2)
に示した方法により連結した(図7)、このようにして
得られた組換えプラスミドを実施例1(3)で示した方
法により形質転換した。得られた組換え菌をL培地て3
7°C124時間培養した。菌体を集菌後、培地中のウ
ロキナーゼ活性を測定した。その結果、培#!11当た
り:1000 II/mlの酵素活性を示した(ウロキ
ナーゼの活性測定はS−2444合成基質活性測定法(
1−1ayashi 、 SらThro*b、 Rcs
、 22巻、57:l−578,1981に従い測定し
た。
図1は本発明の1実施例のターミネータ−配列を含むプ
ラスミドのプロモーター配列、SD配列、シグナルペプ
チドコート配列及びプロ構造コート配列並びに#熱性中
性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域の1′!!基配列
及びそれによってコートされるアミノ酸配列を示す図 図2は本発明の1実施例のターミネータ−を含むプラス
ミドであるpTZ232の制限酵素地図、図3はpT1
232を小型化してp722328gを作製する工程を
示す図、 図4はpTZ2:12Bgの制限酵素地図図5は比較実
験に用いた、耐熱性中性プロテアーゼnprTを有する
プラスミドpTNT53を作製する工程を示す図、 図6は本発明のプラスミドpT22128g及び比較の
ためのプラスミドpTNT5:lて形質転換された形質
転換株の生育状態及びプロテアーゼ活性を示す図 図7は、ヒトウロキナーゼをコートする本発明の1実施
例のプラスミドpMK4の制限酵素地図である。
ラスミドのプロモーター配列、SD配列、シグナルペプ
チドコート配列及びプロ構造コート配列並びに#熱性中
性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域の1′!!基配列
及びそれによってコートされるアミノ酸配列を示す図 図2は本発明の1実施例のターミネータ−を含むプラス
ミドであるpTZ232の制限酵素地図、図3はpT1
232を小型化してp722328gを作製する工程を
示す図、 図4はpTZ2:12Bgの制限酵素地図図5は比較実
験に用いた、耐熱性中性プロテアーゼnprTを有する
プラスミドpTNT53を作製する工程を示す図、 図6は本発明のプラスミドpT22128g及び比較の
ためのプラスミドpTNT5:lて形質転換された形質
転換株の生育状態及びプロテアーゼ活性を示す図 図7は、ヒトウロキナーゼをコートする本発明の1実施
例のプラスミドpMK4の制限酵素地図である。
Claims (3)
- (1)少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働く
ターミネーター配列。 - (2)バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子
由来のものである請求項1記載のターミネーター配列。 - (3)【遺伝子配列があります】である請求項1記載の
ターミネーター配列。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8941489A JPH02268688A (ja) | 1989-04-09 | 1989-04-09 | ターミネーター配列 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8941489A JPH02268688A (ja) | 1989-04-09 | 1989-04-09 | ターミネーター配列 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02268688A true JPH02268688A (ja) | 1990-11-02 |
Family
ID=13969991
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8941489A Pending JPH02268688A (ja) | 1989-04-09 | 1989-04-09 | ターミネーター配列 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02268688A (ja) |
-
1989
- 1989-04-09 JP JP8941489A patent/JPH02268688A/ja active Pending
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