JPH02268688A - ターミネーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規なターミネータ−配列に関する。

［従来の技術］ ３、発明の詳細な説明 ［従来の技術］ 今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することか可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系か確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することか可脂となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら３重のＪ
ｉＩＩ造を有するため１分泌されるタンパク質も莢膜と
内膜の間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため
、蓄積される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプ
ラズム層に蓄積されたタンパク質な取り出す場合、菌体
を物理的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常
に複雑な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機
械的障害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれかあり
、必ずしも高い回収率は達成できない。

また、動物由来のタンパク質（例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等）を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し１発現を行なわせた場合、多くの場合
そのタンパク質は細胞真中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない。また、大腸菌以外のタンパク質の発現′Ｃある
ため動物中ては可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内
ては不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため
、活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用
いて再構築しなければならない。それら一連の方法は非
常に煩雑てあり、実用りは不向きである。また、他の微
生物（例えば枯草菌、酵母、カビ等）を用い生産物を菌
体外に分泌させ、活性型として取り出す方法等か研究さ
れているか、発現績か低いとか、宿主菌によるタンパク
質分解酵素により分解され失活するといった問題点を有
している。また、動物細胞による分泌発現の系も多く研
究されているが微生物に比べ増殖能か非常に低く、大量
にタンパク質を必要とする場合不向きである。

しかも、現在の技術ては、宿主の種類等により、適当な
ターミネータ−配列を選択して使用しなければならない
という問題点を有している。このことは即ち、目的物の
生産を種々の宿主て実現する場合には、それら宿主内で
働く種々のターミネータ−配列を準備し、プラスミドを
構築しなければならないことを意味している。

上記従来技術における問題点に鑑み、もし、種々の宿主
内で機ス駈するターミネータ−配列か存在すれば、その
ような所望のタンパク質の生産に大いに１ｔｆｆ＆する
ことは明らかである。

［発明が解決しようとする課題］ この発明の目的は、複数種の微生物を宿主とする、所望
のタンパク質の遺伝子工学的な生産に用いることかてき
るターミネータ−配列を提供することである。

［課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少なくともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で働くターミネータ−配列を見出し、かつ、
これを含むプラスミドを構築し、これを用いて所望のタ
ンパク質を生産させることに成功し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で働くターミネータ−配列を提供する。

［発明の効果］ 本発明により、少なくともバチルス属細菌及び大Ｉ１ｇ
菌に所望のタンパク質を生産させることができるターミ
ネータ−配列か提供された０本発明のターミネータ−配
列は、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌内で機能す
るものであり、従って、これらの宿主内て所望のタンパ
ク質を生産さゼる際に、それぞれの宿主内で４１！能す
るターミネータ−配列をそれぞれ調製する必要かなく有
利である。また、ターミネータ−配列の活性は、構造遺
伝子の発現効率に影響を与えることが知られている。下
記実施例において具体的に示されるように、本発明の好
ましい態様のターミネータ−配列は高活性であり、従っ
て、これを利用してタンパク質を生産すると、高効率に
所望のタンパク質を生産さゼることかてきる。

［発ＩＪＩの具体的説ＩＪＩコ 本発明のターミネータ−配列は少なくともバチルス属細
菌及び大腸菌内の両方において機能するものであり、こ
のようなターミネータ−配列は初めて見出された。この
ようなターミネータ−配列は、バチルス属細菌の耐熱性
中性プロテアーゼのターミネータ−配列に見出すことか
てき、下記実施例においてはバチルス・ステアロサーモ
フィルスの耐熱性中性プロプアーゼｎｐｒＭのターミネ
ータ−配列を採用しているかこれに限定されるものては
ない、好ましいターミネータ−配列の例としてＣＡＴＣ
ＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡ
ＴＧを挙げることかできる。

未発１１のターミネータ−配列は、常法により化学合成
することによっても調製することがてきるし、本発明の
ターミネータ−配列を含む天然の染色体ＤＮＡから切り
出してくることもてきる。

後述の実施例においては、本９２す１のターミネータ−
配列は、バチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２株（ｅ　、ＩＴ　Ｍ　菌８　第９６４５　号）　ノＳ
　包体Ｄ　Ｎ　Ａから得られたものである。

本発明のターミネータ−配列は、従来と同様のｇ様によ
り、ｊＭ　ｒのポリペブチｌ−を高効率に生産するため
に用いることかてきる。すなわち、本発明のターミネー
タ−配列の１−流に位置する、所望のポリペプチドをニ
ー１−する構造遺伝子、そのＬ流に位置するＳＤ配列及
びその−ｈｍに位置するプロモーター配列並びに宿主細
胞内で複製するための複製開始点蓮びに好ましくは形質
転換株を選択するための、薬剤耐性や栄養要求性のよう
な選択マーカーをイ１するプラスミドを構築し、このプ
ラスミドて枯草菌のようなバチルス属細菌や大腸菌を常
法により形質転換し、形質転換株を培養し、培、Ｂ物又
は菌体から所望のポリペプチドを回収することにより、
所望のポリペプチドを生産することかできる。このよう
なプラスミドは１例えばｐＵＢｌｌｏ及びｐＴＲ５３の
ような市販の発現ベクターに本発明のターミネータ−配
列及び所望のポリペプチドをニー１−するＤＮＡ配列を
常法により組み込むことにより（）ることかてき、この
ような方法は例えばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、ら、”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａビ（１９８２）
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒや、　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　６８
巻、１９７９に詳しく２佐されている。

本発明のターミネータ−配列は、所望のポリペプチドの
菌体内生産のために利用することもできるか、生産され
たポリペブチｌ−を菌体外に分泌させる機能を有するシ
グナル配列チ１へをコードする配列（以下シグナル配列
と言う）及び特に所望のポリペプチドかタンパク賀分解
酵素である場合等のような必要な場合にはそのＴ流にい
わゆるプロ構造をコートする配列を存在さゼることによ
り所望のポリペプチドを菌体外に分泌させることかてき
る。下記実施例ては、バチルス・ステアロサーモフィル
スＭＫ−２１２株由来のシグナル配列及びプロ構造ニー
）−配列を利用して、枯草菌及び大腸菌において公認生
産を行なっている。

以Ｙ、この発明を実施例に基づきより具体的に説ＩＪＩ
する。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な
塩基配列やアミノ酸配列か示されているか、一般に、プ
ロモーター配列やターミネータ−配列のような特定の機
１七を有する塩基配列は、その塩基配列を構成する塩基
のうち少数の塩基かｔ摸され、欠失し又は少数の塩基か
付加された場合であっても実質的に同一の機能を果たす
場合かあることは当業者において広く認識されていると
ころである。従って、下記実施例において具体的に示さ
れる塩基配列やとは少数の塩基か置換され、欠失し又は
付加されている点において異なるか実質的に回−の機膏
を果たすものは下記実施例において具体的に、開示され
た塩基配列と実質的に同一のものであると解釈すべきで
ある。

実施例１ （＋）　ＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡの調製耐熱性中性
プロテアーゼニー（同一出願人による特願昭６２〜２５
３７４９号に記りを含むバチルス・ステアロサーモフィ
ルスＭＫ−２３２株（ＭｏｔｏｋｉＫｕｂｏ、Ｋｃｉｉ
ｃｈｉ　Ｍｕｒａｙａｓａ、Ｋｏｊｉ　５ｃｔｏ及びＴ
ａｄａｙｕｋｉ　　Ｉｍａｎａｋａ、　　Ｊ、　　Ｆｃ
ｒｍｅｎｔ、　　Ｔｅｃｔ＋ｎｏ１．　６６巻、１号、
ｐｐ、　Ｎ−１７、＋９８８、Ｈｉ　ｇ　ｈ　Ｉ　ｙＴ
ｈｅｒｓｏｓｔａｂｌｃ　Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐｒｏｔ
ｅａｓｅ　　ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｎｏｐｈｉｌｕｓ、　ｅ工研菌寄第９５４５号
）を１００１のし培地を含む５００　ｍｌ容量フラスコ
中で一夜５５°Ｃて培養した。遠心集菌後、２ｏ１のＴ
Ｅ緩衝液（］ＯｍＭトリス、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐ
Ｈ８，５）で洗浄し、次いて６１の１５％シヨ糖−５０
ｍＭ　トソス（ｐＨ８，５）−５０ｍＭＥＤＴＡ−１＋
＊ｇ／ｍｌリゾチームニ懸濁し、水中で３０分間静置し
た。これに６１の２％ｆル’：３　シＪｌ／−５０ｍｌ
ト！Ｊ　ス（ｐｔｌ　８．５）−５０１１Ｍ　ＥＤＴＡ
を添加し、室温で約１５分間放コして完全に溶菌させた
。次いて５０ｍ１容量フラスコにＣｓＣｌ　１１　ｇを
入れ、さらに前記溶菌液１２ｍ１を加えた。その後ＩＯ
■ｇ／ｓｌのエチジウムブロマイド液０．６１を加えた
。この液を２本の遠心管に分注し、ＰＨ６ＳＴローター
（日ケ製作所製）て超遠心場で分離した。ａ遠心終了後
、ＤＮＡ画分を注射針て抜き取り、ｎ−フタノールで３
回抽出を繰り返してエチシウムブロマイトを除去した。

このＤＮＡ試料を１０ｍ閘トリス（ｐｆｌ　７．５）−
０，１ｓＭ　ＥＤＴＡ中て透析し、４℃て保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理 枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
ｐＴＢ５３　　（文献：今生ら、Ｊ６Ｂａｃｊｅｒｉｏ
１．１４６巻、１０９１頁、１９８１年：今生ら、Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　　１３０　巻、１３
９９頁、　　１９８４年）を常法により調製した。この
ｐＴＢ５３及び上記のようにして調製したバチルス・ス
テアロサーモフィルスＭＫ−２：１２株染色体ＤＮＡを
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉでそれぞれ完全分解した８反応条件
は次のとおりてあった。

ＰＳｔ１ｗｔ衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）　−
１０ｙｂＭＭｇＣ１２−５０ｓＭ　Ｎａ（：ｌ　−１ｍ
−ジチオスレイトール）の１０倍濃縮液を使用する（１
０　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液）。

）　　ＭＫ−２１２ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　
　　１０　　ｇ　１１０　ｘ　Ｐｓｔｌ　Ｍ衝液　　　
　　　　　１０　　μｍウシ血清アルブミン（５■ｇ／
ｍｌ）　　　　２　　ｇｌ蒸留水 ５６　　ル１ ２　　μｍ １ｉ） ｐＴ［３５３２０、ｊ。

ＩＯｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　　１０鉢１ウシ
血清アルフミン（５ｍｇ／ｓｌ）　　　　２　　井１蒸
留水　　　　　　　　　　　　　５６　　μ１Ｐｓｔｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　２　　ｇ１１反応３
７℃て９０分間行なった。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールをＱ、４５　ｍｌ加えて１０〜１５分、
２０°Ｃ放ご後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノ
ールて洗って脱水、脱塩し、デシケータ−て乾燥した。

乾燥物に１０　ｘ　　リガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ）リ
ス（ｐｆｌ　７．６）　、　６６　ｍＭＭｇｃ＋２）　
　５μｍ、１０口ｌジチオスレイ１−−ル５ＡＬ！　、
　１０　ｄ　ＡＴＰ　５ｇｌ　、蒸留水３４ｕＬｌを加
えて混合した後、ＤＮＡリガーゼ１ル１を加え、４’Ｃ
，１６時間保った。これを次の形質転換に用いた。

（３）コンピテントセルの調製 バチルス・サチルスＭＴ−２株（文献、藤井らＪ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４巻、８３１頁、１９８３年
）をＬ培地て３７°Ｃ１−後培養した培養液を、ＴＦ（
Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　　５ａｌｔ　　ｘ　　１０　　
（Ｎｔｌ、）Ｓｏｎ　　２Ｌ　　Ｋ、１ｌＰＯ４１４駕
、Ｋ１１２Ｐ０．６％、’；ｔエン酸ナトナトリウム１
％１．２％カザミノ酸０．２　ｍｌ、１　ｍｇ／ｍｌ　
アミノ酸液１−Ｆ、蒸留水１４．８　ｍｌ　、　５％グ
ルコース０．２＄　Ｍｇ５ｏ、　２　Ｎ）ニ植え、３時
間４５分振盪培養し、　ＴＦ−２（１０ｘ　　Ｓｐｉｚ
ｉｇｅｎ　　ｓ　　５ａｌｔ　　３．６　　ｍｌ　　、
　　　２　　％カザミノ酸０．１８　ｍｌ　、蒸留水２
８．４４　ｍｌ、　　５％グル：Ｉ−ス◆０．２Ｚ　Ｍ
ｇ５Ｏ，１，６ｍｌ）　ニ植え、１時間３０分振盪培養
し、コンピテントセルな得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニンク前記（２
）のＤＮＡ溶液４０ｐ１と１１のコンピテントセルを混
合し、３７℃、３０分激しく攪拌した。これを遠心後、
３１のＬ培地を加え、３７℃、２時間穏やかに攪拌した
。その０．１１１を１％カゼインと共にテトラサイクリ
ン（２０μ、１／ｍｌ）又はカナマイシン（５ｇ！／■
Ｉ）を含むＬＡプレートにまいた。このプレートを１６
時ｆｉ１１．３７°Ｃに保ち、ハローを形成するコロニ
ーを取得した。このようにして得られた形質転換株をバ
チルス・サチルスＨＴ−２／ｐＴ１２３２と命名した。

バチルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴ１２３２は昭和６１
年９月３０日付て全工研に微工研菌１Ｓ第８９８２号と
して寄託されている。バチルス・サチルスＭＴ−２／ｐ
ＴＺ２３２を培五して常法によりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
　、　ｐＴ７２：１２を得た。このプラスミドの制限酵
素開裂部位を図２に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定 プラスミドＩ）ＴＺ２ゴ２から旧ｎｄｍ−Ｐｓｔｌ断片
を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列を決定
した。結果を図１に示す。

（５）プロモーター配列の同定 プラスミドｐＴＺ２３２の転写開始点をＳＬマツピンク
法により同定した。すなわち、プラスミドｐＴＺ２３２
から旧ｎｄｍ−８ａ園旧断片を公知の方法て分離し、Ｂ
ａｍ１ｌｌ　５’末端なＴ４−ポリヌクレオチトキナー
ゼを用い２　［γ−ｆｆ２Ｐ］八ＴＰてラベルした。こ
の断片と、公知の方法で分離した止り遺伝子のｍｌ？Ｎ
Ａを含むＲＮＡ画分をハイブリダイズした。

これをＳ１ヌクレアーゼ処理し、Ｇ１１ｓａ＋ｉとＣｈ
ａ＋＊ｂｅｒｌｉｎ　（Ｃｅｌｌ　３５巻、ｐｐ、　２
８５−２９：ｌ、　１９８３）記載の方法に従い、転写
開始点を決定した。その結果１図１に示すＴ（−１０領
域から１１塩基対下ｙ！、）から転写されることか明ら
かとなった。従って、この転写開始点より上流かプロモ
ーター配列てあり、検索を行なったところ、ｎｐｒＴ　
（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　＋６：ｌ＠、ｐｐ、　８２４−
８１１．１９８５）と非常によく似たプロモーター配列
を見出すことかできた０図１に示されるように、このプ
ロモーターの＝３５領域は丁子丁ＴＣＣ，−１０領誠は
ＴＡＴＴＧＴてあった。

（７）ＳＤ配列の同定 （６）で決定した転写開始点の下流て、かつＡＴＧ（Ｍ
ｅｔ）以下のオーブンリープインクフレームの上流で、
ＳＤ配列の検索を行なったところ、ＧＡＡＡＡＧＧから
成るＳＤ配列か見出された。なお、ＳＤ配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るＳＤ配列の比較により行なった。

（８）シクナルベブチトコート配列の同定図１に示す塩
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリープインクフレームか見出された。その結果、
図１に示すように、ＡＴＧ　（Ｎｅｔ）から１９アミノ
酸から成るシグナル配列か見出された。なお、シグナル
ベブチトのアミノ酸配夕ｑは種によって大きく異なるか
、射的に、 ↓ Ｎｅｔ−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ａｌａ　−
Ａｌａ↓ （又はＡｌａ　−Ｘ−Ａｌａ）　（↓は切断点を示す）
で表わされる約２０アミノ酸から成ることかわかってい
る。

（９）プロ構造配列の同定 バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロテアーゼｎｐｒＭを、ＴＳＫｇｅ　１−Ｇ
３０００ＳＷ及びＴＳＫ　ｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷ　　
（東ソー株式会社製ゲルろ適用担体）によるクロマトグ
ラフィーにより精製した。その精製したタンパク質をエ
ドマン分解し、全自動シークエンサーによりそのＮ末端
部分のアミノ酸配列を同定した。その結果、Ｉ　１ｅ−
Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｈｒ−８ｅｒか同定され、Ｉｌｅ
以降か成熟タンパク領域てあり、それ以前かシグナル配
列まてプロ構造であることか同定された。

（］０）ターミネータ−配列の同定 ターミネータ−配列は、一般にＴのクラスターな有し、
中央に数塩基を挾んで逆方向反復塩基配列を持ち、さら
にこの逆方向反復塩基配列はＧＣに富む数塩基から十数
塩基から成ることか知られている。構造遺伝子の下流で
このような配列を検索したところ１図１に下線を引いた
配列か同定された。

実施例２ 耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化 上記（４）で得られたプラスミドｐＴＺ２３２を２０ユ
ニツトの制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで切断後１％アガロース
電気泳動にかけ分子量の大きいハントのゲルを切り取っ
た。コノゲル中のＤＮＡをＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ（フナ
コシ）を用いて回収するとＢｇｌ　ＩＩ断片か得られた
。

得られたＲｇｌ　ＩＩ断片をＬ記（２）の方法によりＤ
ＮＡリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドｐＴＺ２３２を小型化した（図３）。得られたプラス
ミドをプラスミドｐＴＺ２３２８ｇと命名した。

ｐＴＩＺ３２の制限酵素地図を図４に示す。

上記（３）で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドｐＴＺ２３２Ｂｇを用いてバチルス・サチルスＭ
Ｌ〜２を形質転換した。このプラスミドを持つＭｔ−ｚ
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良く行なった。

実施例３ バチルス属細菌中で働くプロモーターの強さの測定 実施例１のプラスミドに含まれるプロモーターの（−３
５領域：ＴＴＴＴＣＣｌ−ｉ。

領域　ＴＡＴＴＧＴ）とｎｐｒＴのプロモーター配列（
−３５領域：ＴＴＴＴＣＣ，−１０領域ＴＡＴＴ　Ｔ　
Ｔ　）　　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　＋６：１巻
、　８２４−８：１１．１９８５）の強さを比較するた
め、同一コピー数プラスミドベクター及び同一宿主菌を
用い、酵素活性を比較することによりプロモーターの強
さを比べた。

すなわち、呼シをコートするｐＮＰ２２　（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　ｌ［ｉ：１巻、ｐｐ、　　８
２４−８３１．　１９８５）をＢｇｌ　１１、Ｈｉ　ｎ
　ｄ　ｍて切断したもの（ｐＴＢ５３）と、公知の発現
ベクターｐＴＲ５３をＢｇＩ　ｒｌ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ
て切断したものとをＴ４リガーゼにより連結し、ｐＴＮ
Ｔ５３を４！）た（図５）。実施例２で作製したｐＴ２
２３２８ｇ及びこのｐＴ）ＩＴ５］の両プラスミドで、
それぞれバチルス・サチルスＭＴ−２株を形質転換した
。得られた形質転換株をＬ培地を用いてＪ８養し、プロ
テアーゼ活性と生育を調べた。結果を図６に示す６図６
中、丸はプロテアーゼ活性（カゼイン消化法により測定
）、四角は菌の生育状態（培養液の６５０　ｎ＠での吸
光度）を示す。

図６より明らかなように、両者共生育は同程度であるの
に、ｐ　Ｔ　Ｚ　２３２　Ｉｔ　ｇをイ１する形質転換
体は約４０００１１／１の醇、（；活性を小したか、ｐ
ＴＮＴ５３を治するものは約２００１１／１てあった。

実施例４ 大１賜菌における発現 図２に示した、プロモーター配列を含む５ａｌｔ−Ｐｓ
ｔｌ　断片の大きい方を実施例２で示した方法により回
収した。大腸菌中て複袈可能なプラスミドｐＵｃＩ９を
５ａｌｔ及びｐｓＴＩて切断後、上記５ａｌｌ−ＰＳＬ
ＩＦＪ片を実施例１（２）て示した方法により連結した
。該組換えプラスミ１−を大Ｉｌ！菌Ｊ旧０９コンピテ
ントセル（宝酒造（株））に常法により形質転換した。

得られた形質転換株をＬ培地て３７°Ｃ１１６時間培養
した。菌体を集菌後、培地中のプロテアーゼ活性を測定
したところ、５００　Ｕ／ｍｌのプロテアーゼ活性か培
地中に分泌されていた。このように本発明におけるター
ミネータ−配列は枯草菌のみならず大腸菌中ても効率良
く機能した。

実施例５ ヒトウロキナーゼの分泌生産 図２に示す、シグナル配列を含む断片であるＢｉｏｌ１
−Ｈｉｎｄｍ断片及びＡａローＰｓｔｌ断片を抽出した
。ウロキナーゼ構造遺伝子はＢｇＩ　Ｈ−Ａａｔ＋（＾
ｇｒｉｅ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　　５２　
巻、：１２９−３：１５．１９８８）として抽出した。

これらの断片とベクターとして１）ＴＢ５３の川１、Ｉ
ｔ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍで切断したものとを実施例１（２）
に示した方法により連結した（図７）、このようにして
得られた組換えプラスミドを実施例１（３）で示した方
法により形質転換した。得られた組換え菌をＬ培地て３
７°Ｃ１２４時間培養した。菌体を集菌後、培地中のウ
ロキナーゼ活性を測定した。その結果、培＃！１１当た
り：１０００　ＩＩ／ｍｌの酵素活性を示した（ウロキ
ナーゼの活性測定はＳ−２４４４合成基質活性測定法（
１−１ａｙａｓｈｉ　、　ＳらＴｈｒｏ＊ｂ、　Ｒｃｓ
、　２２巻、５７：ｌ−５７８，１９８１に従い測定し
た。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の１実施例のターミネータ−配列を含むプ
ラスミドのプロモーター配列、ＳＤ配列、シグナルペプ
チドコート配列及びプロ構造コート配列並びに＃熱性中
性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域の１′！！基配列
及びそれによってコートされるアミノ酸配列を示す図 図２は本発明の１実施例のターミネータ−を含むプラス
ミドであるｐＴＺ２３２の制限酵素地図、図３はｐＴ１
２３２を小型化してｐ７２２３２８ｇを作製する工程を
示す図、 図４はｐＴＺ２：１２Ｂｇの制限酵素地図図５は比較実
験に用いた、耐熱性中性プロテアーゼｎｐｒＴを有する
プラスミドｐＴＮＴ５３を作製する工程を示す図、 図６は本発明のプラスミドｐＴ２２１２８ｇ及び比較の
ためのプラスミドｐＴＮＴ５：ｌて形質転換された形質
転換株の生育状態及びプロテアーゼ活性を示す図 図７は、ヒトウロキナーゼをコートする本発明の１実施
例のプラスミドｐＭＫ４の制限酵素地図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働く
   ターミネーター配列。
2. （２）バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子
   由来のものである請求項１記載のターミネーター配列。
3. （３）【遺伝子配列があります】である請求項１記載の
   ターミネーター配列。