JPH01108978A - 中性プロテアーゼ遺伝子の分子クローニングおよび発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、中性プロテアーゼ遺伝子の分離およびクロー
ニングおよびグラム陰性菌中のクロ一二ングした遺伝子
の発現に関する。さらに詳しくは、中性プロテアーゼの
遺伝情報を指定する遺伝子をクローニングおよび発現し
て、クローンは活性な中性プロテアーゼ酵素を合成およ
び分泌することが確証された。

そのゲノム中に中性プロテアーゼのための１種または２
種以上の遺伝子を含有するヴィブリオ・１０テオリチク
ス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅ。

Ｉｙｔｉｃｕｓ）［アエロモナス・プロテオリチ力（Ａ
ｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）］を
同定しそして培養した。グリッツイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ
）ら、「アエロモナス・プロテオリチ力からのプロテア
−ゼのいくっがの物理的特性（Ｓｏｍｅ　　Ｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　　ｏｆ　
　ａ　　Ｐｒｏｔ、ｅｉｎａｓｅ　　ｆｒｏｍ　　Ａｅ
ｒｏｍｏｎａｓ　　Ｂ−ｒｏｔｅｏｌ　　ｔｉｃａ）」
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　、Ｖｏ　１．２４５．１３４８−５６ペ
ージ（１９７６）、 は、アエロモナス・プロテオリチ力（ＡｅｒＯｍｏｎａ
ｓ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）の培養物のろ液から
分離したプロテア−ゼを記載している。バイリス（Ｂａ
ｙｌｉｓｓ）ら、アーチーブス・オブ・バイオケミスト
リー・アンド・バイオロジカル（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　
ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃｓ）、２０４：２１４−２１９、（１９
８０）は、アエロモナス・プロテオリチ力（Ａｅｒｏｍ
ｏｎａｓ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）から中性プロ
テアーゼを分離しかつ同定した。中性プロテアーゼは、
また、米国特許第３．７９６，６３５号中に教示されて
いるように、種々のバチルス（Ｂｅｉ　１１ｕｓ）菌株
を培養することによってｉＩｌ製された。

工業的に使用するための酵素の精製は、天然に産出する
分離物によって産生された典型的には低いレベルの酵素
によって拘束される。遺伝子工学を使用して、問題の酵
素の遺伝情報を指定する遺伝子を操作して、その遺伝子
を酵素の実験室の開発および工業的産生の両者のために
他の有機体中に再配置することができる。その天然の環
境における産生に関連する欠点は、これによって回避す
ることができる。

大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）中の関連する１０テアーゼ
酵素をクローニングする従来の試みは、変化する結果を
与えた０例えば、ヤマダら、「大腸菌の外膜を通るセラ
チア・マルセセンスのと区別の分泌（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
　　Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆ　　５ｅｒｒａｔｉａ　　
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　　ｔｈｒ
ｏｕｇｈ　　ｔｈｅＯｕｔｅｒ　　Ｍｅｎｂｒａｎｅ　
　ｏｆ　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）」、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、　　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１６６：９３７−４４　（１９
８６）は、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）微生物セラチア・マルセセンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からの
セリンプロテアーゼＤＮＡ断片の大腸菌（Ｅ、　　ｃｏ
ｌｔ）中のクローニングを開示しており、ここで細胞外
培地中のプロテアーゼの特別の分泌が存在した。対照的
に、ナカハマら、「セラチアプロテアーゼ遺伝子のクロ
ーニングおよび配列決定（Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ａｎｄ　
　Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ　　ｏｆ　　５ｅｒｒａｔｉａ　
　Ｐｒ。

ｔｅａｓｅ　　Ｇｅｎｅ）Ｊ、核酸の研究（ＮｕｃＩｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ）、１４：　５
８４３−５５　（１９８６）は、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種Ｅ−１
５ａｌ胞外メタロプロテイナーゼ遺伝子のクローニング
のとき分泌を発見しなかったが、遺伝子をセラチア（Ｓ
ｅｒｒａｔｉａ）中にクローニングしもどすときの培地
中のプロテアーゼの分泌を報告した。

本発明において、中性プロテアーゼ遺伝子をグラム陰性
微生物中でクローニングおよび発現する。

宿主中の発現産生物は、活性な機能的中性プロテアーゼ
酵素として同定された。

本発明の主な目的は、中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｅｕ
ｔｒａｌ　　ｐｒｏｔｅａｓｅ　　ｇｅｎｅＳ）を有す
ることが知られている微生物のゲノムから中性プロテア
ーゼ遺伝子を分離すること、および前記遺伝子をグラム
陰性宿主、例えば、大腸菌（以後、Ｅ、ｃｏｌｉと呼ぶ
）中に再配置し、ここで遺伝子を発現することである。

関連する目的は、活性な中性１０テアーゼ酵素を合成す
る宿主中で遺伝子を捜し出すことである。

なお他の目的は、それ以上の研究および開発のために容
易に操作できる形態で、中性プロテアーゼ遺伝子を提供
することである０分離された中性プロテアーゼ遺伝子は
、部位特異的突然変異などによって、−層容易に強力な
プロモーターと関連付け、変更することができる。よく
特徴づけられた宿主、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ、は、所望
の遺伝子操作を大きく促進するであろう。

本発明の追加の目的は、とくに成熟酵素の産生のための
、中性プロテアーゼ酵素の産生のための新規な方法を提
供することである。すなわち、本発明は、それらの環境
の外部で中性プロテアーゼ遺伝子の発現を可能とするこ
とを意図する。

中性プロテアーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、
本発明の基礎を形成する。所望の遺伝子を分離し、適当
なベクター中に結合し、そしてグラム陰性菌中にクロー
ニングし、最初に、このような宿主は゛ヴイプリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）およびバチルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ）から異
質中性プロテアーゼ酵素の発現に使用された。下に記載
する実施例において、グラム陰性宿主はＥ、ｃｏｌｉで
あった。そのうえ、酵素は細菌の宿主から分泌されるか
、あるいは宿主細胞の溶菌のとき解放される。

この説明において、用語「活性」または°「機能的」は
本発明に従って調製された、発現された中性プロテアー
ゼを記載するために使用する。これは、活性の酵素の組
成物であると信じられていないプレープロー酵素（ｐ　
ｒ　ｅ　−ｐ　ｒ　ｏ　−ｅ　ｎ　ｚ　ｙｍｅ）と対照
的である。この酵素は、後述するアッセイの１つ、例え
ば、ミルク透明化アッセイ（ｍｉｌに−ｃｌｅａｒｉｎ
ｇ　　ａｓｓａｙ）によって活性形態であることが決定
された。

本発明によってクローニングされた中性プロテアーゼ遺
伝子は、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ
　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）［アエロモナス・プ
ロテオリチ力（Ａｅｒｏｍ。

ｎａｓ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）］またはバチル
ス（Ｂｃｉ　ｌ　１ｕｓ）菌株、例えば、バチルス・ス
テアロテルモフィリス（Ｂｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ）、バチルス・スブチリス（
Ｂｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉＩｔｉｓ）およびバチル
ス・サーモプロテオリチクス（Ｂｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈ
ｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）がら分離し、こ
れらの菌株はすべて中性プロテアーゼ酵素を産生するこ
とが知られている。特定の菌株は文献において同定され
てきているが、本発明は、菌株が１種または２種以上の
中性プロテアーゼ遺伝子を収容するかぎり、特定のヴィ
ブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔ
ｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ
）菌株に限定されない。バチルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ）菌
株は培養物の収集物から広く入手可能であり、菌株がプ
ロテアーゼ陰性であるか、そのようにされないかぎり、
はとんどのバチルス（Ｂｃｉ　ｌ　１ｕｓ）菌株は適当
な１種または２種以上の中性プロテアーゼ遺伝子を含有
することが期待される。同様に、ヴィブリオ・プロテオ
リチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅ。

Ｉｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５３５５９は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション＜Ａｍｅｒｉｃａｎ
　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔ、ｕｒｅ　　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　
　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ　　２０８５２）から入手可能であり、そして１種
または２種以上の中性プロテアーゼ遺伝子を含有するこ
とが知られている。

本発明によれば、中性１０テアーゼ酵素を合成すること
が決定されている源の細胞［前述のヴィブリオ（Ｖｉｂ
ｒｉｏ）またはバチルス（Ｂｃｉｌ　１ｕｓ）細胞］の
ＤＮＡを使用して、遺伝子ライブラリーを調製する。中
性プロテアーゼ酵素の存在についてのアッセイは、この
分野において知られており、そして下に記載する。染色
体のＤＮＡを、既知の方法によって、源の細胞から抽出
しそして制限酵素で消化してＤＮＡを大きい断片に切断
する。Ｓａｕ　　３Ａを使用する部分的消化は好ましい
が、他の制限酵素（例えば、Ｍｂｏ　　Ｉ、Ｂａｎ　　
Ｈｌなど）を使用できる。Ｉｔ伝子ライブラリーの構成
のための正確な手順および技術はよく知られており、そ
してここで詳しく説明する必要はないが、追加の詳細は
実施例中に与えられている。

ＤＮＡ断片を、中性１０テアーゼ酵素を発現するクロー
ンの分離を可能とするのに適当なベクター中に結合する
０本発明の好ましい実施態様において、Ｂａｎ　　Ｈ１
制限酵素による切断後、コスミドベクターｐＨＣ７９を
使用する０次いで、組み換えベクター（この実施態様に
おいて、ｐＨ０７９コスミドは中性プロテアーゼ含有ゲ
ノムからのＤＮＡ断片を含有する）バクテリオファージ
粒子、好ましくはバクテリオファーシラ゛ムダ中にパッ
ケージし、これによってバクテリオファージラムダ粒子
中で遺伝子ライブラリーを産生ずる。バクテリオファー
ジ中の遺伝子ライブラリーの産生のため、コスミドベク
ターまたはラムダベクターを使用する。他の場合におい
て、プラスミドベクターを使用できる。３ｆｉ伝子を宿
主細胞中に挿入する精確な方法は臨界的でなく、そして
この分野において実施されている任意の方法は適当であ
ろう。

こうして、組み換えバクテリオファージ粒子を使用して
、所望のグラム陰性宿主細胞中に挿入する。好ましい実
施態様において、組み換えバクテリオファージ粒子を使
用してＥ、ｃｏｌｉをトランスフェクションする。下の
実施例において、菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩを記
載するが、Ｅ。

ｃｏｌｔの他の菌株を必要に応じて使用できる。

Ｅ、ｃｏｌｉ菌株は細胞外中性プロテアーゼ酵素を自然
に合成しないので、Ｅ、ｃｏｌｉクローンは、後述する
アッセイ、とくにミルク透明化アッセイによって、中性
プロテアーゼ遺伝子の存在および発現について評価する
ことができる。

中性プロテアーゼ遺伝子が発現されているかどうかを決
定するために使用できる、ある数の標準のアッセイが存
在する０例えば、ＰＡＧＥ分析による確認は、比較のた
め精製した中性プロテアーゼ酵素を使用して実施できる
。あるいは、中性プロテアーゼ遺伝子を含有する組み換
えクローンは、ミルク寒天平板上の透明化のゾーンを生
成する、それらの能力によって同定することができる。

中性プロテアーゼを合成するヴィブリオ（Ｖｉｂｒｔｏ
）またはバチルス（Ｂｃｔｌｌｕｓ）のコロニーはこの
ようなゾーンを生成しないことが知られている。非組み
換えＥ、ｃｏｌｉコロニーは１０テアーゼを分泌しない
か、あるいは他の宿主はプロテアーゼを分泌しない、し
たがって、中性プロテアーゼ遺伝子を含有する本発明の
クローンはこのアッセイによって容易に同定される。こ
のミルク透明化アッセイは、Ｅ、ｃｏｌｔおよび細胞外
中性プロテアーゼを自然に産生じない他の宿主菌株とと
もに使用するために、好ましい、他のグラム陰性菌株を
宿主として使用できる０例えば、セラチア（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ）クローンを調製できるが、セラチア（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ）はそれ自身の中性プロテアーゼの分泌のため
、ミルクを自然に透明化することを期待できるので、ヴ
ィブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）またはバチルス（Ｂｃ　ｉ　
Ｉ　１１１８）の中性プロテアーゼ遺伝子の存在および
発現についての評価は多少より複雑となるであろう。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）について、後述するＦＡ
ＡＰＡアッセイまたは任意の定量的酵素アッセイを使用
できる。もちろん、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ　ｉ　ａ）
の中性プロテアーゼ陰性菌株を使用する場合、定量的ミ
ルク透明化アッセイは適当であろう。

他のプロテアーゼアッセイを使用することによって、確
証を実施できる４例えば、クローンの発酵ブロスが基質
、例えば、ハイデバウダーアズア（Ｈｉｄｅ　　ｐｏｗ
ｄｅｒ　　ａｚｕｒｅ）、アズコル（ａｚｃｏ　Ｉ　１
　）またはＮ−［３−（２−フリル）アクリロイル］−
Ｌ−アラニル−フェニルアラニンアミド（ＦＡＡＰＡ）
を加水分解できることを立証することによって、クロー
ンをプロテアーゼ酵素の発現について確証することがで
きる。あるいは、これらのアッセイは最初の場合におい
て中性プロテアーゼ遺伝子含有クローンを同定するため
に使用できる。

Ｅ、ｃｏｌｉおよび他の「非分泌性」宿主（すなわち、
中性プロテアーゼを自然に分泌しない宿主）中の中性プ
ロテアーゼ遺伝子の発現は、ミルク寒天平板上の透明化
のゾーンとして検出することができることは、２つの面
において、意味がある。第１に、これは活性の機能的酵
素がグラム陰性宿主によって合成されていることの証拠
である。

第２に、ミルク寒天平板上の中性プロテアーゼの細胞外
の存在は、分泌あるいは細胞の溶菌のいずれかによって
、酵素がある方法で外面化されていることの証拠である
。Ｆ、、ｃｏｌｉおよびある他のグラム陰性菌は常態で
有意の量のプロテアーゼを培地中に分泌するので、これ
はこれらの非分泌性宿主中のヴィブリオ・プロテオリチ
クス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）
またはバチルス（Ｂｃｉ　１１ｕｓ）の中性プロテアー
ゼ遺伝子の発現の結果として、産生される中性プロテア
ーゼ酵素を回収する能力において重要である。

１種または２種以上の異質中性プロテアーゼ遺伝子を含
有する組み換えグラム陰性クローンを、種々の方法で使
用できる。前述のように、これらのクローンは研究およ
び開発の道具として大きい価値をもつ、中性プロテアー
ゼ遺伝子はとくにＥ。

ｃｏｌｉ中で容易に操作される。この形態において、遺
伝子は強力なプロモーターなどと、中性プロテアーゼ酵
素の過剰産生について関連付けることができる。また、
部位特異的突然変異は可能である。

遺伝子の実験室の操作を促進するために本発明のクロー
ンを使用することに加えて、本発明は酵素自体の産生の
ための別の手段を提供する。グラム陰性微生物中のヴィ
ブリオ（Ｖｔｂｒｉｏ）またはバチルス（Ｂｃｉ　Ｉ　
Ｉｕｓ）の中性プロテアーゼ酵素は、本発明にとって独
特である。活性酵素が産生されるので、それ以上の操作
または取り扱いは、機能的中性１０テアーゼを生成する
ために不必要である。

以下の実施例は、例示を目的として与えられ、そしてこ
こに記載する本発明を限定することを意味しない１次の
略号を本発明の説明を通じて使用した： ℃　　　　セ氏度 ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 ｇ　　　　グラム ｋ　ｂ　　　　キロ塩基 ｍｇ　　　　ミリグラム ｍｌ　　　　ミリリットル ノｔｇ　　　　マイクログラム μｌ　　　マイクロリットル Ｎ　　　　規定 ＯＤ　　　　光学密度 ｒｐｍ　　　回転７分 ＳＤＳ　　　ドデシル硫酸ナトリウム ＰＡＧＥ　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動 夫１匠Ｌ （ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ。

ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の中性プロテアーゼのク
ローニング） Ａ、　　　のｒ）ＮＡの　　−染色体のＤＮＡはフル（
Ｈｕ　Ｉ　１　）ら、感染および免疫性（Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｎ’ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、３３゜９３３−
９．３８　（１９８１）に記載されるようにして調製し
た。ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　
ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｔｃｕｓ）ＡＴＣＣ５３５５９を得
た。この菌株の生存能力のある培養は、最終的にＡＴＣ
Ｃ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　
Ｃｏ１１ｅｃｔ　ｉ　ｏｎ、１２３０１　　Ｐａｒｋｌ
ａｗｎ　　ＤＲｏｃｋｖｉ　Ｉ　ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ　　２０８５２）コに受託された。公衆へのこの菌株
の入手可能性へのすべての制限は、この菌株を特徴とす
る特許が許されたとき、最終的に除去されるであろう、
培養物は２６℃において穏やかに撹拌しながら、１１に
つき次の成分を含有する培地中でインキュベーションし
た：２０ｇのポリペプトン（ＰＭ）ペプトン［ＢＢＬ　
　マイクロバイオロジー・システムス（Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ）］、］２０の海塩［ア
クラリラム・システムス（Ａｑｕａｒｉｕｍ　　Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）］０．４ｇのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４、Ｐ　Ｈ８、
３にＩＯＮのＮａＯＨで調節されている。培養物を、８
．２の光学密度（６４０ｎｍにおいて）に到達した後、
１８時間収穫した。細胞を１０．ＯＯＯｒｐｍで５分間
遠心した。細胞を再び２５ｍ１のＴＦ、５（５０ミリモ
ルのトリスｐ）Ｉｓ、Ｏ１５ミリモルのＥＤＴＡ、５０
ミリモルのＮａＣ１）中に再懸濁し、次いで前のように
収穫した。細胞を１．６ｍｌのＴＥ／スクロース（２５
％のスクロース、５０ミリモルのトリスｐＨ８，０，１
ミリモルのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、そしてｌＸ３−１
／２インチのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心管に
移した０次いで、０．４ｍｌの１００ｍｇのリゾチーム
［シグマ（ｓ　ｉｇｍａ）］を含有するＴＥ／スクロー
スの溶液を添加し、そして管を水浴中に１５分間に移し
た０次に、ＴＥ／入／スクロース中０ｍｇ／ｍｌのプロ
テアーゼＫ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｌａｂｏｌａｔｏ
ｒｉｅｓ）］の溶液の１０μｌを添加し、次いで゛氷上
で１５分間インキュベーションした。この時点において
、０．４ｍｌの０．５モルのＥＤＴＡおよび０．２５ｍ
１のＮ−ラウロイルサルコシンの溶液を添加し、そして
管をパラフィルム（Ｐｒａｆ　ｉ　１ｍ）ｒＭ」（ＴＭ
）実験室フィルム［アメリカン・カン・カンパニー（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｃａｎ　　Ｃｏ、）］でふたをし、
そして６５℃で１８時間インキュベーションした。

このインキュベーション後、５０ｍｇ／ｍｌのフェニル
メチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）［カルビオ
ゲム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）］およびＣｓＣ１を１．
２６ｇのＣｓＣ１対１．０ｍｌのＴＥＳ／ＰＭＳＦを含
有するＴＥＳの３３ｍ１を注意して添加した０次いで、
管の上部にパラフィン油を充填し、密閉し、そして１５
℃および４０．ＯＯＯｒｐｍにおいて２０時間遠心した
。

遠心後、管の上部を１６ゲージの針で通気し、そして管
の底に挿入した１６ゲージの針から分画を集めた。染色
体のＤＮＡを含有する粘性分画を、４８時間にわたって
２１のＴＥ（１０ミリモルのトリスｐＨ８，０，１ミリ
モルのＥＤＴＡ）の４回の交換に対して透析した。透析
後、回収したＤＮＡは光学密度（２６０ｎｍにおいて）
に基づいて３８０μｇ　／　ｍ　１の濃度で見いだされ
た。

Ｂ、　　プローアーゼ　−　の　ローニン　−この実施
例の工程Ａにおいてヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖ
ｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）から分離
した染色体のＤＮＡを使用して、コスミドクローニング
の技術によって、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の中性プロ
テアーゼ遺伝子のクローニングを達成した。制限酵素５
ａｕ３Ａで消化してコスミドのクローニングに適当な断
片をえるために、光学的条件を決定した。

８．９μｇの実施例１において分離した染色体のＤＮＡ
、０，８単位のＳａｕ　　３Ａ［ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｃｈ　　Ｌ
ａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）］、６ミリモルのトリスＰＨ
７，５，６ミリモルのＭｇＣ１２，６ミリモルのＮａＣ
ｌおよび１０ｇｇ　／　ｍ　Ｉウシ血清アルブミンを含
有する２μｌの合計体積中で、２２℃において試験の消
化を実施した。０〜６０分の時点において、１ノ１１の
０゜５モルのＥＤＴＡを添加し、そして１０分間加熱す
ることによって、反応を停止した０次いで、各時点にお
けるアリコートを、ＴＡＥ（４０ミリモルのトリス−ア
セテート、２ミリモルのＥＤＴＡ）中の０．４％のアガ
ロースゲルの電気泳動によって分析した。エチジウムプ
ロミドでゲルを着色した後、ＤＮＡを紫外線バクテリオ
ファージラムダの粒子中にパッケージすることのできる
、３３−４５ｋｂの間の大きさの分画でほとんどのＤＮ
Ａを与える条件として、６０分の時間を選択した。

コスミドのクローニングのために十分なりＮＡを得るた
めに、反応の規模を大きくした。試験の消化に同一の５
本の管を構成し、そして反応を６０分で停止した。５つ
の試料をプールし、そして染色体のＤＮＡを仔ウシアル
カリ性ホスファターゼ［ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｌａｂ
ｏｌａｔ。

ｒｉｅｓ）］の２単位の添加によって脱リン酸化し、そ
して３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで
、７０℃で１０分間インキュベーションすることによっ
て、ホスファターゼを不活性化した０次いで、試料を等
体積の１＝１のフェノール：クロロホルムを含有する混
合物で抽出した。

（フェノールは０．１％の８−ヒドロキシキノリンを含
有し、そして０．１モルのトリスｐ　Ｈ８。

０と平衡化した；クロロホルムは４％のイソアミルアル
コールを含有した。）次いで、脱リン酸化した染色体の
ＤＮＡを１体積の４モルの酢酸アンモニウムを添加し、
次いで２体積のエタノールを添加し、そしてドライアイ
ス−エタノール洛中で１０分間インキュベーションした
。ＤＮＡを遠心によって回収し、そして冷７０％のエタ
ノールで洗浄した。ＤＮＡの沈澱を簡単に真空下に乾燥
し、そして５μｌのＴＲ中に再懸濁した。

Ｅ、ｃｏｌｉコスミドベクターｐＨＣ７９［ホーン（Ｈ
ｏｈｎ）、Ｂ、およびコリンズ（Ｃｏ１１ｉｎｓ）、Ｊ
、、遺伝子（’Ｇｅｎｅ）、１１：２９１　＜１９８０
）を、次のように、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖ
ｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅ。

１ｙｔｉｃｕｓ）のＳａｕ　　３Ａで部分的に消化し、
脱リン酸化した染色体のＤＮＡへの結合のために調製し
た。まず、１０マイクログラムのｐＨ０７９［ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ
５ｅａｃｈ　　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｔｅｓ＞１を、酵素
を供給した消化１ｉ液を使用して、３０μＩの合計の体
積中で５単位のＢａｍＨｌ［ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｌ
ａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）］で完全に消化した。制限酵
素をＳａｕ　　３Ａについて記載したように不活性化し
、そして試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈澱させ、そしてＴＥの２５μｌの合計の体積
中に再懸濁した。

結合反応は、４μｌのＢａｍ　　Ｈ１消化したｐＨ０７
９，４μｍのＳａｕ　　３ＡＩＬ、脱リン酸化したヴィ
ブリオ・プロテオリチクス（Ｖ　ｉ　ｂ　ｒ　ｉ　。

ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）染色体のＤＮＡ、０．５
＠位の７４　　ＤＮＡ　　ＩＪ！／−−１４（ベセスダ
ーリサーチ・ラボラトリ−（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｃｈ　　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）］および２μｌ
の５×結合ｗｔ［ｒ原液ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｌａｂ
ｏｌａｔｏｒｉｅｓ）］からなっていた、１０℃におい
てｉ５時間後、パッケージしたＤＮＡの試料の最終体積
は５００μｌであった。Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩの
受容細胞［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｃｈ　　ＬａｂｏｌａｔｏｒＬｅ
ｓ）］を、２２０ｍのＹＥＴ−マルトース（１１につき
、５ｍｇのバクトー酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ＞、５ｇの
ＮａＣ１，１０ｇのバクトートリプトファン（Ｄｉ　ｒ
’ｃｏ）、５ｇのマルトース］中で、震盪しながら３７
℃において一夜増殖させることによって調製した１次い
で、この培養物の０．１ｍｌを２０ｍ１の新鮮なＹＥＴ
−マルトース中に接種し、そして１．０の光学密度（６
４０ｎｍ）に到達するまで、インキ２ベーシヨンした。

細胞を遠心によって収穫し、そして１０ｍ１のラムダ希
釈剤（１１につき、５．８ｇのＮａＣ１，２ｇのＭｇＳ
　’Ｏ４・７　Ｈｔ　Ｏ１５０ｍｌの１モルのトリス（
ｐＨ７，５）、５ｍｌの２の％のゼラチン）中に再懸濁
した。

ＨＢｌｏｌの１００μｌのアリコートを、１０μｌのパ
ッケージしたＤＮＡ試料とともに３７℃において１０分
間インキュベーションした０次いで、１．０ｍｌの予備
加温したＹＥＴグロスを添加し、そして試料を３７℃に
おいて３０分間インキュベーションした。細胞を１分間
遠心によって沈澱させ、Ｏ，１ｍｌのＴＥＴ中に再懸濁
し、５０ｇｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンおよび１５の
バクトースキムミルク（Ｄｔｆｃｏ）を含有するＹＦ、
Ｔ寒天平板上に配置した。コスミドｐＨＣ７９は、アン
ピシリン抵抗性を付与する遺伝子を含有する。

培地へアンピシリンを添加すると、コスミドを含有しな
いバクテリアの増殖を防止する。平板を３７℃で４８時
間インキュベーションし、そして透明化のゾーンで囲ま
れたコロニーをそれ以上の分析のために選択した。スキ
ミムーミルク平板上で透明化のゾーンを産生ずるこれら
の菌株の能力を、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキュラー・クローニング（Ｍｏ、１ｅｃｕｌａｒ　
　Ｃ１゜ｎ　ｉ　ｎｇ）、（１９８２）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、に記載されているように、これらの菌株がらプラスミ
ドを分離し、プラスミドを受容ＨＢ　１０１中に形質転
換もどし、そしてアンピシリン抵抗性形質転換体が再び
スキミムーミルク寒天平板上で透明化のゾーンを産生ず
ることができることを立証することによって、決定した
プラスミドであることを示した。

Ｃ１プローアーゼゝ　についてのコスミドクローンのス
　１−ニングーヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂ
ｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からの中性プ
ロテアーゼは、合成）ペプチドＦＡＡＰＡ　（Ｎ−［３
−（２−フリル）アクロイル］−Ｌ−アラニルーＬ−フ
ェニルアラニンアミド）　［バイリス（Ｂａｙｌｉｓｓ
）ら、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アン
ド・バイオロジカル（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃｓ）、２０４：２１４−２１９　（１９８０）を
加水分解できることを示した。実施例ＩＩのコスミドク
ローンによって産生されるプロテアーゼをさらに特徴づ
けるために、スキミムーミルク寒天平板上に透明化のゾ
ーンを産生する９つの別々の分離物を選択した。これら
の分離物を、対照としてＢＨＩＯＩ　（ｐＨＣ７９）と
−緒に、１５ｍ１の管中で５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有する１０ｍ１のＹＥＴブロス中で震盪しながら
３７℃で６０時間インキュベーションした。細胞を遠心
によって除去し、そしてブロスを４℃および５０００ｒ
ｍｐにおいて数時間遠心することによって１０倍濃縮し
た。

次いで、濃縮した試料を、基質としてＦＡＡＰＡ［シグ
マ・ケミカル・カンパニー（３ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　　Ｃｏ、）］を使用する酵素アッセイにおいて、
使用した。濃縮したブロスの２０ｔｔｌのアリコートを
、０．５ｍｌのＦＡＡＰＡ、０．０１モルのＨＥ、ＰＥ
Ｓ　　ｐＨ７，２、および０．０１モルのＣａＣｌ２を
含有する溶液の５００μｌに添加した。試料を室温にお
いてインキュベーションし、そしてＦＡＡＰＡの加水分
解を分光光度測定法（３３５ｎｍ）によって光学密度の
増加として観測した。すべての９つのコスミドクローン
からのブロス［および染色体のＤＮＡの調製について実
施例Ｉに記載したヴィブリオ・プロテオリチクス（ＶＬ
ｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅ。

Ｉｙｔｉｃｕｓ）］はＦＡＡＰＡ加水分解活性を含有す
ることが示されたが、対照ＨＢＩＯＩ　（ＰＨＣ７９）
からのブロスはこのような活性をもたなかった。

Ｅ、ｃｏｌｉコスミドクローンがヴィブリオ・１０テオ
リチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅ。

１ｙｔｉｃｕｓ）中性プロテアーゼを産生ずることをさ
らに確証するために、固有ポリアクリルアミドゲルの電
気泳動（ＰＡＧＥ）によって、Ｅ。

ｃｏｌｉ生成物の移動度を精製した中性プロテアーゼの
それと比較した。グリッツエン（Ｇｒｉｆｅｎ）ら、ジ
ャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
　　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）、２５４　：　１３
４８　（１９７０）に記載されているようにヴィブリオ
・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌ
ｙｔｉｃｕｓ）から精製した中性プロテアーゼは、ＰＡ
ＧＥ４こかけ、そしてファーマシア・ファスト・システ
ム（Ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｍａｃｉａ　　Ｐｈａｓｔ　　５
ｙｓｔ、ｅｍ）（商標）［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃ　ｉ　ａ）］ゲル装置で着色すると、単一の帯を与え
た０着色しないゲルの上に、１０％のバクトースキムミ
ルク、０゜７％のアガロースおよび０．０１モルのＨＦ
、　Ｐ　ＥＳＭ衝液ｐＨ７，２を含有する溶融を配置し
、そして３７℃で数時間インキュベーションしたとき、
透明化のゾーンは着色したゲル中に存在する単一の帯と
同一のＲｆにおいて生成し、その帯の同一性を立証した
。実施例ＩＩのコスミドクローンの１つの濃縮したブロ
スを、精製した中性プロテアーゼおよび濃縮したＨＢＩ
ＯＩ　（ＰＨＣ７９）ブロスと同一のゲル上で電気泳動
した。このゲルの上に、電気泳動後、スキムミルクアガ
ロース溶液を配置した。電気泳動後、コスミドクローン
からのブロスは、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からの精製
した中性プロテアーゼが生成したのと同一の位置に、オ
ーバイーレイ中に透明化のゾーンを生成したが、ＨＢＩ
ＯＩからのブロスは生成しなかった。

火」Ｕ殊工］− （ヴィブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）中性プロテアーゼ遺伝子
のサブクローニング） 中性プロテアーゼ遺伝子をさらに遺伝子的に特性づける
ために、大きいｃｓｍクローンを小さいプラスミド上に
遺伝子を除去することは便利である。コスミド（ｐＶＰ
８）を実施例Ｉにおいて調製したものから、この実施例
におけるサブクローニングのための材料源として選択し
た。このコスミドをＨＢＩＯＩ／ｐＶＰ８と表示するク
ローンから、標準アルカリ性溶菌技術によって分離した
。

このクローンの生存可能な培養物は、最終的にアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｒｎｅｒｉ
ｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ、１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　ＤＲ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２）に受
託され、そして受託番号ＡＴＣＣ６７５０１を与えられ
た。公衆へのこの菌株の入手可能性へのすべての制限は
、この菌株を特徴とする特許が許されたとき、最終的に
除去されるであろう、コスミドρＶＰ８を制限酵素Ｐｓ
ｔ■またはＨｉｎｄ　　ＩＩＩで消化した。制限断片を
、それぞれ、Ｐｓｔ、ＩまたはＨｉｎｄ　　ＩＩＩ消化
し、５°脱リン酸化したベクターｐＢＲ３２２に結合し
た。結合した物質を標準技術を使用してＨＢＩＯＩ中に
形質転換し、そして細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン（Ｈｉｎｄ　　Ｉ−ＩＩ〉または１２．５μｇ　／　
ｍ　１のテトラサイクリン（Ｐｓｔ　　Ｉ）を含有する
ＹＥＴ−スキムミルク平板上で平板培養した。中性プロ
テアーゼ遺伝子を含有するクローンを、それらを取り囲
む透明化ゾーンの形成によって同定した。プラスミドを
これらのクローンから分離し、そしてそれらの制限酵素
地図を調製した。ｐＶＰＨ２と表示するプラスミド上の
６．７ｋｂのＨｉｎｄ　　ＩＩＩ断片を、ヴィブリオ（
ＶｉｂｒＬｏ）中性プロテアーゼをエンコードする全体
のオープンリーディングフレームを含有する（第３図）
、ｐＶＰＰ４と表示するプラスミド上の２．１ｋｂのＰ
ｓｔ　　Ｉ断片は、ヴイプリオ（ＶＬｂｒｉｏ）中性プ
ロテアーゼをエンコードする遺伝子の部分を含有する。

宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ中のプラスミドｐＶＰ
Ｈ２の生存可能な培養物は、最終的にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　
Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　
　　ＤＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５
２）に受託され、そして受託番号ＡＴＣＣ６７４９９を
与えられた。公衆へのこの菌株の入手可能性へのすべて
の制限は、この菌株を特徴とする特許が許されたとき、
最終的に除去されるであろう、２つのプラスミドの制限
地図を、それぞれ、第２図および第３図に示す、菌株Ｅ
、ｃ。

１ｉ　　ＨＢＩＯＩ／ｐＶＰＨ２（ＡＴＣＣ６７４９９
）は、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　
　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の中性プロテアーゼを
合成できることが示された。これは酵素アッセイ後に推
定され、そしてこの菌株を増殖する養上澄み液のタンパ
ク質ゲルアッセイを次のように実施した。

Ａ、培Ｊシ１Ｊシ乙！１１数−菌株ＨＢ　１０１／ｐＶ
ＰＨ２［ヴイプリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）中性プロテアーゼ
遺伝子を発現すると信じられる組み換えプラスミドを含
有する］を、適当な対照ＨＢＩＯＩ／ｐＢＲ３２２（非
組み換えプラスミドを含有する）およびヴィブリオ・プ
ロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｕｓ）と−緒に、ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス中で
増殖した一夜の培養物から、２５０ｍ１の貫徹フラスコ
内の５０ｍ１の新鮮なルリアプロス中に接種した。ＨＢ
ｌｏｔ／ｐＶＰＨ２およびＨＢＩＯＩ／ＰＢＲ３２２に
ついて、培地は５０μｇ／ｍ＋のアンピシリンを含有し
た。培養物を３７℃において貫徹しながら２００ｒｐｍ
で１６時間インキュベーションした。培養物のすべては
ほぼ２．０のＯＤ＠、。

に増殖させた。細胞をブロスから遠心によって除去し、
そしてブロスの２．０ｍｌをセントオリコン（Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ）１０　（商標）ミニ−濃縮装置［アミコン
・デイビジョン（ＡｍｉｃｏｎＤｉｖｉｓｉｏｎ）、Ｗ
、Ｒ，ブレイス・アンド・カンパニー（Ｇｒａｃｅ　　
＆　　Ｃｏ、）中で濃縮し、次いで５０ミリモルのトリ
ス（ｐＨ７゜５）で洗浄して、塩類および低分子量ペプ
チドを除去した。ＨＲ１０１／ｐＶＰＨ２およびＨＢＩ
０１／ｐＢＲ３２２のブロスを３５倍濃縮し、そしてヴ
ィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）のブロスを酵素アッセイの前に
４倍濃縮した。

Ｂ、ＦＡＡＰＡ　　、アッセイ−濃縮したブロスを、実
施例■におけるように合成ペプチドを加水分解するそれ
らの能力についてアッセイした。反応条件は、０．５ミ
リモルのＦＡＡＰＡ、５０ミリモルのトリス（ｐＨ７，
４）、２５℃であり、そしてＦＡＡＰＡの加水分解をペ
ックマン２５型分光光度計で０Ｄ２３ｓで監視した。標
準曲線を１−６μｅのヴィブリオ・プロテオリチクス（
Ｖｔｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からの
４倍濃縮ブロスを使用して構成し、これは酵素の濃度に
関して直線の応答を手えた。Ｅ、ｃｏｌｉからの適当な
量のブロスを添加して、速度がこの範囲内に入るように
した。この実験の結果を表１に示す６組み換えプラスミ
ドｐＶＰＩ（２（ＨＢＩｏ　１／ｐＶＰＨ２）を有する
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢｌｏｌは、ＦＡＡＰＡの加水分解
の原因となる遺伝子をエンコードする；対照の有機体Ｈ
ＢＩＯＩ／ｐＢＲ３２２はエンコードしなかった。

表１ Ｌｌ　　　　　　　　正立ｊｊ」リド−ＬＨＢ　１０１
／ ｐＶＰＨ２３２，０単位／ｍｌ ＨＢ　１０１　／ ｐＢＲ３２２０，２単位／ｍｌ ヴィブリオ・プロテ オリチフス（Ｖ、　ｐ ｒｏｔｅｏ　ｌｙｔ　１ ｃｕｓ）　　　　　　　　１４００．０単位／ｍ１１１
単位は、単位する反応条件下にｏ、ｏｏｔ光学密度単位
／分の変化を生ずるために要求される酵素の量として定
義される。

２　単位／ｍｌは、濃縮しないブロス中に存在するであ
ろう活性について表わされる。

Ｅによる分析は、ファーマシア・ファスト・システム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｐｈａｓｔ　　５ｙｓｔｅｎ）
（商標）　［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］で
濃縮した培養ブロスを単位して実施した。試料（１，０
ｍ１）は、自然緩衝ストリップ［ファーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）　　＃１７−０５１７−０１１を使用す
る、８−２５％の勾配のゲル［ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃ　ｉ　ａ）＃５１−７０６６−００−０２）の電
気泳動にかけた。電気泳動前に、試料を６０℃において
２０分間加熱して、温度感受性プロテアーゼを不活性化
した。電気泳動後、１０％のバクトースキムミルク、０
．７％のアガロースおよび０．０１モルのＨＥＰＥＳＭ
衝液（ｐＨ７，２）を含有する溶融溶液をゲルの上にオ
ーバーレイした。オーバーレイ中の透明化のゾーンはＰ
ＡＧＥゲル中の中性プロテアーゼの位置の上に現れた。

ヴィブリオ（Ｖｔｂｒｉｏ）中性プロテアーゼの位置の
ための対照として、中性プロテアーゼの高度に精製した
試料を使用した。この実験の結果が立証するように、Ｈ
ＢＩＯＩ／ＰＶＰＨ２ブロスは真性の精製したヴィブリ
オ・プロテオリチクス（Ｖ　ｉ　ｂ　ｒｔｏ　　ｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）中性プロテアーゼとともにＰＡ
ＧＥゲル上で同時に動くプロテアーゼ活性を含有する。

このような活性は対照ＨＢ１０１／ｐＢＲ３２２のブロ
ス中に存在しなかった。

一ヴィブリオ・プロテオリチクス（ＶｉｂｒＬ。

ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）中性プロテアーゼ遺伝子
を標準ＤＮＡ配列決定プロトコルによって配列決定した
。この配列は第１図に示されている。オープンリーディ
ングフレームはほぼ塩基＃２４９−２０７８から存在し
、その中にヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）中性プロテアーゼ
をエンコードするＤＮＡ領域が存在する。

Ｋ１鮭ＩＩＩ （バチルス・ステアロサーモフィルス（ＢｃｉｌＩｌｌ
ｓ　　ｓｔ、ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）Ｂ
−３８８０中性プロテアーゼのクローニング）バチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−３８
８０は、米国特許第３，７９６．６３５号に記載されて
いる。この中性プロテアーゼを、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ
ＩＯＩ中に、実施例Ｉに記載されている方法に類似する
方法でクローニングした。染色体のＤＮＡを有機体から
抽出し、そして精製した。ＤＮＡを最適化した条件下に
Ｓａｕ　　３Ａで消化し、次いでコスミドベクターｐＨ
Ｃ７９に結合し、そしてバクテリオファージラムダ粒子
中にパッケージングした。Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩをこ
れらのファージでトランスフェクションし、次いで有機
体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＹＥＴ−
スキムミルク寒天平板上に広げた１組み換え体プロテア
ーゼ産生クローンは、３７℃で４８時間のインキュベー
ション後、透明化ゾーンによって取り囲まれていた。

これらのクローンの１つをそれ以上の研究のため選択し
た。それは、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって決定して、
サーモリシン、バチルス・サーモプロテオリチクス（Ｂ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｅｒｍ。

ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）細胞外中性プロテアーゼ
、と同一の分子量をゆうする中性プロテアーゼを産生ず
ることが示された。

バチルス・ステアロサーモフィルス（ＢｃｉｌＩｕｓ　
　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含有する
コスミドを選択したクローンから分離し、そして、実施
例ＩＩに記載する方法に類似する方法で、バチルス（Ｂ
ｃｉｌｌｕｓ）中性プロテアーゼ遺伝子をサブクローニ
ングした。もとのコスミドベクーンからの５．８ｋｂの
Ｅｃｏ　ＲＩ断片をＥｃｏ　　ＲＩ消化したｐＢＲ３２
２に結合して、プラスミド、ｐＢｓＥｌと表示する、を
形成した。このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０
１中に形質転換した。生ずるＨＢＩＯＩ／ＰＢＳＥＩコ
ロニーは、スキムミルク寒天平板上で透明化ゾーンによ
って取り囲まれていた。菌株ＨＢ１０１／ｐＢＳＥ１の
生存可能な培養物は、最終的にＡＴＣＣに受託され、そ
して受託番号ＡＴＣＣ６５００を与えられた。大衆への
この菌株の入手可能性に関するすべての制限は、この菌
株を特徴とする特許が許されたとき、最終的に除去され
るであろう。

本発明の原理、好ましい実施Ｒ様および操作の方法を以
上説明した。しかしながら、ここで保護されることを意
図する本発明は、開示された特定の形態に限定される解
釈されるべきではない、なぜなら、これらは制限的では
なく、むしろ例示的であると見なされるからである０種
々の変更および変化は、本発明の精神を逸脱しないでな
すことが可能である。

本発明の主な特徴および態様は、次の通である。

１、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｊｂｒｔｏ　　
ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチルス（Ｂ（ｉ
ｌｌｕｓ）の種の１種または２種以上の中性プロテアー
ゼ酵素の遺伝情報を指定するＤＮＡを含有するグラム陰
性微生物。

２、大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）またはセラチア（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ）の種である上記第１項記載の微生物。

３、大腸ｍ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ６７４９９、
大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ６７５００または大
腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｔ）ＡＴＣＣ６７５０１である上
記第２項記載の微生物。

４、前記ＤＮＡはヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣｏ　
　５３５５９の中性プロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定
する上記第１項記載の微生物。

５、前記ＤＮＡは第１図に示す配列によって表される上
記第４項記載の微生物。

６、活性な中性プロテアーゼ酵素を発現する上記第１項
記載の微生物。

７、工程： （ａ）ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｈｏ　
　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチルス（Ｂｃ
ｉｌｌｕｓ）の中性プロテアーゼ陽性菌株を選択し、 （ｂ）前記菌株のＤＮＡを使用して遺伝子ライブラリー
を調製し、 （ｃ）前記遺伝子ライブラリーからなる組み換えベクタ
ーをグラム陰性宿主細胞中に挿入し、（ｄ＞工程（ｃ）
の形質転換された宿主細胞を機能的中性プロテアーゼ酵
素の産生についてアッセイし、そして （ｅ）工程（ｄ）において陽性のアッセイを生ずる細胞
を分離する、 を含む、機能的ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂ
ｒｉｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチル
ス（ＢＣｉｌｌｕｓ）の中性プロテアーゼ酵素を合成す
る方法。

８、前記グラム陰性微生物は大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ
）またはセラチア（ＳｅｒｒａＬｉａ）の種である上記
第７項記載の方法。

９、前記グラム陰性微生物は機能的中性プロテアーゼ酵
素を自然に発現しない上記第７項記載の方法。

１０、工程（ａ）の中性１０テア一ゼ陽性菌株はヴィブ
リオ・プロテオリチクス（Ｖｔｂｒｊ。

ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５３５５９であ
る上記第７項記載の方法。

１１、ヴィブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）中性プロテアーゼ遺
伝子を含有する組み換えＤＮＡ。

１２、ヴィブリオ・プロテオリチクス（ＶＬｂｒｉｏ　
　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の中性プロテアーゼ遺
伝子を含有する上記第１１項記載の組み換えＤＮＡ。

１３、ヴ□イブリオ・１０テオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ
　　　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５３５５
９の中性プロテアーゼ遺伝子を含有する上記第１２項記
載の方法。

１４、大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｔ）ＡＴＣＣ６７４９９
または大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｔ）ＡＴＣＣ６７５０１
から分離された上記第１３項記載の組み換えＤＮＡ。

１５、第１図の配列を含む上記第１１項記載の組み換え
ＤＮＡ。

１６、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｃｉｌｌ
ｕｓ　　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ　ｕｓ）Ｎ
ＲＲＬ−Ｂ−３８８０の中性プロテアーゼ遺伝子を含有
する組み換えＤＮＡ。

１７、大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ６７５００
から分離された上記第１６項記載の組み換えＤＮＡ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ　　ｐｒｏｔｅｏｌ、ｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５３５
５９から細胞外中性プロテアーゼ（ビブリオリシン）遺
伝子のＤＮＡ配列の表示である。 第２［！ｌは、実施例ＩＩのプラスミドｐＶＰＰ４の制
限地図であり、Ｐｓｔ　　Ｉ断片はヴィブリオ（Ｖｉｂ
ｒｉｏ）中性プロテアーゼ遺伝子の一部を含有する。 第３図は、実施例ＩＩのｐＶＰＨ２の制限地図であり、
Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ断片はヴィブリオ（Ｖｉｂｒｈｏ）
中性プロテアーゼ遺伝子を含有する。 特開平１”１０８９７８　（１３） く◆ト　　＋ 特開平１−１０８９７８　（ｉ５） ＦＩＧ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏｐｒ
   ｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチルス（Ｂｃｉｌｌ
   ｕｓ）の種の１種または２種以上の中性プロテアーゼ酵
   素の遺伝情報を指定するＤＮＡを含有することを特徴と
   するグラム陰性微生物。 ２、工程： （ａ）ヴィブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏｐ
   ｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはバチルス（Ｂｃｉｌ
   ｌｕｓ）の中性プロテアーゼ陽性菌株を選択し、 （ｂ）前記菌株のＤＮＡを使用して遺伝子ライブラリー
   を調製し、 （ｃ）前記遺伝子ライブラリーからなる組み換えベクタ
   ーをグラム陰性宿主細胞中に挿入し、（ｄ）工程（ｃ）
   の形質転換された宿主細胞を機能的中性プロテアーゼ酵
   素の産生についてアッセイし、そして （ｅ）工程（ｄ）において陽性のアッセイを生ずる細胞
   を分離する、 を含ことを特徴とする、機能的ヴィブリオ・プロテオリ
   チクス（Ｖｉｂｒｉｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ま
   たはバチルス（Ｂｃｉｌｌｕｓ）の中性プロテアーゼ酵
   素を合成する方法。 ３、ヴィブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）中性プロテアーゼ遺伝
   子を含有することを特徴とする組み換えＤＮＡ。 ４、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｃｉｌｌｕ
   ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＲＲＬ−
   Ｂ−３８８０の中性プロテアーゼ遺伝子を含有すること
   を特徴とする組み換えＤＮＡ。