KR100383138B1 - 재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 - Google Patents
재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100383138B1 KR100383138B1 KR10-2000-0041212A KR20000041212A KR100383138B1 KR 100383138 B1 KR100383138 B1 KR 100383138B1 KR 20000041212 A KR20000041212 A KR 20000041212A KR 100383138 B1 KR100383138 B1 KR 100383138B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- alkaline protease
- gene
- vapk
- recombinant plasmid
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) KS1으로부터 유래된 알칼리성 단백질 분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드 VapK를 코딩하는 유전자 단편vapk가 쌍으로 연결된 이합체 유전자vapk를 재조합시킨 벡터를 제조하고, 그 재조합 벡터를 도입한 대장균, 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) 형질전환체 및 이들 형질전환체를 이용하여 알칼리성 단백질 분해효소를 생산하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 기존에 보고된 비브리오 알칼리성 단백질 분해 효소 생산균주에 이중의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 갖는 재조합 플라스미드로 형질전환하여 균주를 개량하는 방법에 관한 것이다.
비브리오 알칼리성 단백질 분해효소는 단백질을 아미노산으로 분해하는 효소를 말하며 알칼리성 단백질 분해효소의 활성을 가지는 미생물은 다양하다. 이에는 바실러스속(Bacillus), 세라티아속(Serratia)등이 대표적으로 이용되고 있다.
상기 균주를 이용한 알칼리성 단백질 분해효소의 생산에 있어서 주요한점은 알칼리성 단백질 분해효소의 높은 활성으로 이는 생산 공정의 경제성에 매우 중요한 요소이다.
최근의 발명에서는 알칼리성 단백질 분해효소의 활성을 높이기 위해 유전공학 기술을 이용하여 알칼리성 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 벡터를 제조하고 재조합 벡터 형질전환체를 제조하여 알카리성단백질 분해효소의 활성을 증가시키는 연구가 진행되었다.
본 발명자들은 이미 "세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주"에서 균주로서 비브리오 메치니코비 KS1 및 재조합 발현벡터로서 pSBCm을 특허출원한 바 있으며(대한민국 특허출원 번호 1999-12588), 본 발명에서는 상기 벡터 및 균주를 전적으로 참조하였다.
이번 본 발명자들은 알칼리성 단백질 분해효소의 활성이 높은 형질전환체를제조하기 위해 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii)KS1으로부터 분리한 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 이중으로 함유한 재조합 벡터를 제조하여 이를 비브리오로 형질전환하고 알카리성 단백질 분해효소 활성이 증가된 형질전환체를 개발하였다.
도 1은 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk를 포함하는 재조합 플라스미드 pSBCm의 전기영동사진이다.
M : 사이즈 마커;
1 : 1선 재조합 플라스미드 pSBCm;
2 : 2선 재조합 플라스미드 pSBCm/HindIII
- 2.2Kb의 운반체 벡터 pKF3
- 2.9Kb의 비브리오 알칼리성 단백질 분해효소 유전자
도 2는 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) KS1과 pSBCm 대장균 형질전환체로부터 분리한 알칼리성 단백질 분해효소 VapK의 SDS-전기영동사진이다.
M : 사이즈 마커;
1 : 대장균 형질전환체에서 발현된 알칼리성 단백질 분해효소;
2 : 비브리오에서 발현된 알칼리성 단백질 분해효소
- 29kDa의 알카리성 단백질 분해효소
도 3은 비브리오 메치니코비 KS1과 pSBCm 대장균 형질전환체로부터 분리한 알칼리성 단백질 분해효소 VapK의 활성염색사진이다.
1 : 대장균 형질전환체에서 발현된 알칼리성 단백질 분해효소 활성;
2 : 비브리오에서 발현된 알칼리성 단백질 분해효소 활성
도 4는 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pSBCm의 제한효소지도 도면이다.
도 5는 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk와par유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pSP1의 제한효소지도 도면이다.
도 6은 역 방향의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk와par유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pSPR1의 제한효소지도 도면이다.
도 7은 역 방향의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk와par유전자를 함유하며 크기를 줄인 재조합 플라스미드 pSPR-47의 제한효소지도 도면이다.
도 8은 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk를 이합체로 포함하는 재조합 플라스미드 pDSBCm의 제한효소지도 도면이다.
도 9는 비브리오 메치니코비 KS1 균주와 재조합 비브리오 메치니코비 pSBCm 균주, 재조합 비브리오 메치니코비 pDSBCm 균주의 알칼리성 단백질 분해효소의 활성을 비교한 결과를 도시한 도면이다.
따라서 본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 알칼리성 단백질 분해효소 VapK를 코딩하는 유전자의 이합체, 즉 2개의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자가 연쇄된 플라스미드가 도입된 형질전환체를 개발하고 이를 통하여 알칼리성 단백질 분해효소를 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 알칼리성 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 비브리오 메치니코비 KS1을 배양 후 세포를 수확하여 파쇄한 후, 고형물을 원심분리로 제거한 무세포 조효소액에서 비브리오의 염색체 DNA를 얻었다. 위에서 얻은 염색체 DNA를 제한효소로 잘라서 유전자 운반체인 벡터에 재조합하여 pSBCm, pSP1, pSPR1, pSPR-47, pDSBCm 등의 재조합 플라스미드를 제조하였고 이를 대장균에 클로닝하였다.
제조된 pSBCm 재조합 플라스미드를 먼저 대장균에 클로닝하여 알칼리성 조건에서 단백질 분해효소 측정을 하여 알칼리성 단백질 분해효소의 발현을 확인하였다. 그러나 대장균에서 알칼리성 단백질 분해효소의 발현은 일반적으로 알려진 바와 같이 매우 낮았다.
이에 본 발명자는 상기의 재조합 플라스미드를 비브리오로 도입하였다. 이렇게 하여 제조된 재조합 비브리오 메츠니코비 pDSB은 기존의 비브리오 메츠니코비에 비하여 약 2.5배의 단백질 분해효소 활성이 증가하였다.
본 발명에 사용된 균주인 비브리오 메치니코비 KS1은 비브리오 메치니코비 알에이취 530 N-4-8 균주(한국종균협회에 1998년 2월 23일자로 KFCC-11030에 기탁)를 돌연변이원으로 N,N-니트로소구아니틴(NTG)을 처리하여 생산 수율을 2배 이상 올린 개량균주로서 Korean Culture Center of Microorganisms에 1998년 12월 15일자로 기탁번호 KCCM-10141로 기탁된 균주이다.
본 발명에 사용된 pSBCm 재조합 플라스미드는 대장균 Top10F'를 숙주로하여 국제기탁기관인 Korean Culture Center of Microorganisms에 1998년 12월 15일자로 기탁번호 KCCM-10142로 기탁되었다.
발명의 자세한 내용은 하기 실시예에서 서술하였다.
실시예 1
알카리성 단백질 분해효소 유전자
vapk
클로닝
비브리오 메치니코비 KS1을 하기 표 1의 조성으로 된 배지를 이용하여 30℃에서 배양 후에 세포를 회수하여 파쇄하였다. 이 파쇄액을 원심분리한(6,000rpm) 뒤 상등액을 회수하여 염색체 DNA를 정제하고 제한효소인 HindIII로 잘라서 운반체인 벡터(pKF3)에 재조합하여 2.9Kb의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자 클로닝하였다. 이를 pSBCm이라 하며 클로닝한 플라스미드에 제한효소인 HindIII로 처리한 후 1% 아가로즈 젤에서 전기영동을 하였다. 전기영동한 젤을 염색약(에티듐 브로마이드)로 염색하였다. 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 분석한 결과 알칼리성 단백질분해효소 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다. (도 1)
| LSC 배지 조성 | 양(g/L) |
| 트립톤(Trypton) | 10 |
| 효모 추출물(Yeast extract) | 5 |
| 염화나트륨(Sodium chloride) | 10 |
| 1M 탄산나트륨 완충용액 (Sodium carbonate buffer, pH 10.5) | 100(㎖/L) |
실시예 2
알칼리성 단백질 분해효소의 분리 및 정제
상기 배지에서 배양한 비브리오 메치니코비 KS1을 원심분리하여 상등액을 준비하여 효소 시료로 이용하였다. 한편 대장균(pSBCm) 형질전환체의 세포를 회수하여 파쇄한 다음 이 파쇄액을 원심분리(6000rpm)하여 상등액을 효소 시료로 준비하였다. 시료를 완충액(6M 요소, 2.5% 소디움 도데실 설페이트, 5%(w/v) β-머캅토에탄올, 0.01M 트리스-염산(pH6.8), 10%(w/v) 글리세롤, 0.002% 브로모페놀 블루)과 동량으로 섞어 15분간 끓는물에서 중탕한 후 전기영동하였다. 전기영동한 젤을 염색약(0.05% 코마시브릴리언트 블루 R-250)으로 염색하고 탈색약(50% 메탄올, 10% 초산)으로 탈색하였다. SDS-전기영동은 도 2에 나타나있으며, 그 결과 29kDa의 알칼리성 단백질 분해효소의 밴드가 확인되었다.
실시예 3
분리된 알칼리성 단백질 분해효소 VapK의 활성 염색
상기 배지에서 배양한 비브리오 메치니코비 KS1을 원심분리(6000rpm, 10분)한 상등액을 조효소로 사용하였으며 대장균(pSBCm) 형질전환체의 세포를 회수하여 파쇄한 다음 이 파쇄액을 원심분리(6000rpm)하여 상등액을 시료로 준비하였다. 시료를 완충액(50mM phostate buffer (pH7.0), 10%(w/v) 글리세롤, 0.002% 브로모페놀 블루)과 동량으로 섞어 전기 영동하였다. 전기 영동한 젤을 탈지분유(Skim milk)와 버퍼(50mM Sodium carbonate buffer,pH 10.0)가 함유된 한천 위에 놓아 알칼리성 단백질 분해효소의 활성을 보았다. 결과 한천내의 탈지분유(Skim milk)가 분해되었고 이 결과로 알칼리성 단백질 분해효소의 활성을 확인할 수 있었다.(도 3)
실시예 4
이합체 알칼리성 단백질 분해효소 유전자의 클로닝
상기 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk를 포함하고 있는 재조합 플라스미드 pSBCm을 두 개의 알카리성 단백질 분해효소 유전자를 쌍으로 가진 재조합 플라스미드(dimered recombinant plasmid)로 만들기 위해 중간 단계에서 pSP1, pSPR1, pSPR-47 플라스미드를 재조합하였다.
pSBCm의 플라스미드 안정성을 높이기 위해 플라스미드의 안정성을 높이는 기능을 가진 par 유전자를 pSBCm의 PvuII, HincII 사이트에 재조합하여 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk와par유전자를 함유한 재조합 플라스미드인 pSP1을 제조하였다. (도 5)
상기 제조된 재조합 플라스미드 pSP1에 함유된 알칼리성 단백질 분해효소 유전자의 크기를 줄이기 위해 알카리성 단백질 분해효소 유전자의 방향이 반대로 재조합된 플라스미드인 pSPR1을 제조하였다. (도 6)
상기 제조된 재조합 플라스미드인 pSPR1내에 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk와par유전자 사이에 존재하는 EcoRI 사이트를 자른 후 엑소뉴클레아제인 Bal31으로 처리한 후 유전자 접합효소를 처리하였다. 이렇게 재조합하여 플라스미드 pSPR-47을 제조하였다. (도 7)
상기 제조된 재조합 플라스미드인 pSPR-47내에 존재하는 HindIII 사이트에 실시예 1에서 클로닝된 2.9Kb의 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 다시 도입하여 재조합 플라스미드 pDSBCm을 제조하였다. (도 8)
실시예 5
단일 알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 함유한 재조합 벡터의 대장균으로 형질전환
실시예 1 및 2의 2.9Kb의 알카리성 단백질 분해효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pSBCm, pSP1, pSPR1, pSPR-47, pDSBCm을 대장균에 도입하기 위하여 대장균 HB101을 LB 배지에서 배양한 후 100mM 염화칼슘을 첨가하여 0℃에서 15분간 방치한 후 다시 원심분리하여 균체를 회수하였다. 균체를 다시 100mM 염화칼슘 용액으로 현탁한 후에 0℃에서 5분간 방치한 후 pSBCm 플라스미드를 넣고 0℃에서 1시간 방치한 후 42℃에서 90초간 열 충격을 가한 후, 다시 0℃에서 5분간 방치하고 LB 배지 1㎖을 넣은 후 클로람페니콜(34㎍/㎖)이 포함된 LB 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 30℃에서 24 시간 배양하여 자라는 콜로니를 선별하였다.
실시예 6
비브리오 메치니코비에서의 형질전환
알칼리성 단백질 분해효소 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 비브리오 메치니코비 KS1에 형질전환하기 위해 일렉트로포레이션(Electroporation) 방법을 사용하였다.
KS1 균주를 상기 배지로 30℃에서 배양한 후 세포를 원심분리로 회수(6,000rpm, 10min, 4℃)하고 1/20부피의 H-완충용액(200mM Sucrose, 1mM HEPES, 10% glycerol)로 현탁하였다. 이를 2회 반복한 후 80㎕의 H-완충용액에 재현탁한다. 이 현탁액에 재조합 플라스미드를 첨가한 뒤 0.2㎝ 큐벳에 넣어서 GENE PULSER II(Bio-Rad Co.)를 사용하여 1,500V, 10㎌, 200Ω으로 전기충격을 준 다음 상기 배지 600㎕를 첨가하여 30℃에서 배양한 뒤 25㎍/ml의 클로람페니콜이 첨가된 한천배지에서 비브리오 형질전환체를 선별하였다.
실시예 7
재조합 비브리오 형질전환체에서 알칼리성 단백질 분해효소의 발현 측정
알칼리성 단백질 분해효소 활성의 측정을 위해 Yanagida et al.(1986)의 방법을 변형하여 사용하였다. 100mM 탄산나트륨 완충용액(Sodium carbonate buffer, pH 10.5)에 녹여 전열을 가한 2% 카제인 용액(casein solution) 2.5ml 과 상기 배지에서 배양한 세포를 원심분리(6000rpm, 10min, 4℃)하여 얻어진 상등액을 동일한 완충용액에 희석하여 0.5ml을 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 10분간 반응시킨 후 반응정지 용액(0.22M trichloroacetate, 0.22M acetic acid, 0.22M sodium acetate)을 첨가하여 반응을 중지시키고 얼음에서 15분간 냉각시킨 후 단백질 침전물을 원심분리(12,000rpm, 15min, 4℃)하여 제거하였다. 상층액 1ml과 증류수 9ml을 혼합 후 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 분해 효소 1 유니트(unit)는 10분간 반응시킨 반응액의 흡광도가 0.1 증가하는 양으로 정하여 사용하였다.
상기의 방법으로 비브리오 메치니코비 KS1과 재조합 비브리오 메치니코비 pDSBCm의 알칼리성 단백질 분해효소 활성을 측정한 결과 기존의 비브리오 메치니코비 KS1에 비하여 형질전환체인 비브리오 메치니코비 pDSBCm에서 알칼리성 단백질 분해효소의 활성이 2.5배이상 증가하였음을 확인하였다. (도 9)
본 발명의 재조합플라스미드의 기탁
본 발명의 재조합벡터 pDSBCm은 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) KS1을 숙주로 하여 국제 기탁기관인 한국종균협회에 2000년 7월 4일자로 기탁번호 KFCC-11180으로 기탁되었다.
본 발명의 방법에 따라 제공되는 알카리성 단백질 분해효소 코딩 유전자를 이중으로 재조합 벡터에 넣어 만든 재조합 플라스미드 형질전환체의 알칼리성 단백질 분해효소 생산능이 기존의 형질전환하지 않은 균주에 비하여 뛰어나므로 본 발명의 플라스미드를 함유하는 비브리오 메치니코비 형질전환체는 알칼리성 단백질 분해효소 생산균주로 유용히 이용될 수 있다.
Claims (5)
- 알칼리성 단백질 분해효소를 코딩한 유전자vapk가 연쇄된 이합체 유전자vapk를 함유한 플라스미드 pDSBCm.
- 제 1항에 따른 재조합 플라스미드 pDSBCm의 제조방법으로서, 알칼리성 단백질 분해효소를 코딩한 유전자vapk를 포함한 재조합 플라스미드 pSBCm에par유전자를 삽입하여 플라스미드 안정성을 향상시킨 pSP1 플라스미드를 제조하는 단계;상기 pSP1에 함유된 알칼리성 단백질 분해효소 유전자vapk가 역방향으로 재조합된 pSPR1 플라스미드를 제조하는 단계;상기 pSPR1내vapk유전자와par유전자 사이를 EcoRI으로 자른 후 엑소뉴클레아제 Bal31을 처리하고 유전자 접합효소를 처리하여 유전자 크기를 줄인 pSPR-47 플라스미드를 제조하는 단계; 및상기 pSPR-47을 HindIII로 자른 후 새로운vapk유전자를 재조합하여 재조합 플라스미드 pDSBCm을 제조하는 단계를 포함하는 알칼리성 단백질 분해효소를 코딩한vapk유전자를 쌍으로 함유하는 재조합 플라스미드 pDSBCm 제조방법.
- 제 1항의 재조합 플라스미드 벡터를 포함하는 형질전환된 대장균 또는 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii).
- 삭제
- 제 3항의 형질전환된 대장균 또는 비브리오 메치니코비를 이용하여 알카리성 단백질 분해효소 VapK를 생산하는 방법.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0041212A KR100383138B1 (ko) | 2000-07-19 | 2000-07-19 | 재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 |
| CN01812799A CN1441846A (zh) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | 重组质粒pdsbcm,转化微生物,产生一种碱性蛋白梅vapk的方法 |
| JP2002512386A JP2004504034A (ja) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | 組換えプラスミドｐＤＳＢＣｍ、これの形質転換された菌株およびアルカリ性蛋白質分解酵素ＶａｐＫを生産する方法 |
| AT01952008T ATE309377T1 (de) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Rekombinantes plasmid pdsbcm, mit diesem transformierte mikroorganismen und verfahren zur herstelung einer alkalinen vapk-protease |
| DE60114835T DE60114835T2 (de) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Rekombinantes plasmid pdsbcm, mit diesem transformierte mikroorganismen und verfahren zur herstelung einer alkalinen vapk-protease |
| EP01952008A EP1303627B1 (en) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Recombinant plasmid pdsbcm, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease vapk |
| CA002415268A CA2415268C (en) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Recombinant plasmid pdsbcm, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease vapk |
| US10/333,261 US6858408B2 (en) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Recombinant plasmid pDSBCm, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease VapK |
| AU2001272804A AU2001272804A1 (en) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Recombinant plasmid pdsbcm, microorganisms transformed therewith, and method forproducing an alkaline protease vapk |
| PCT/KR2001/001232 WO2002006494A1 (en) | 2000-07-19 | 2001-07-19 | Recombinant plasmid pdsbcm, microorganisms transformed therewith, and method for producing an alkaline protease vapk |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0041212A KR100383138B1 (ko) | 2000-07-19 | 2000-07-19 | 재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020007769A KR20020007769A (ko) | 2002-01-29 |
| KR100383138B1 true KR100383138B1 (ko) | 2003-05-12 |
Family
ID=36686693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0041212A KR100383138B1 (ko) | 2000-07-19 | 2000-07-19 | 재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6858408B2 (ko) |
| EP (1) | EP1303627B1 (ko) |
| JP (1) | JP2004504034A (ko) |
| KR (1) | KR100383138B1 (ko) |
| CN (1) | CN1441846A (ko) |
| AT (1) | ATE309377T1 (ko) |
| AU (1) | AU2001272804A1 (ko) |
| CA (1) | CA2415268C (ko) |
| DE (1) | DE60114835T2 (ko) |
| WO (1) | WO2002006494A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100377259B1 (ko) * | 2000-07-19 | 2003-03-26 | 씨제이 주식회사 | 재조합 플라스미드 피에스피원, 이의 형질전환된 균주 및알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는 방법 |
| KR20030032605A (ko) * | 2001-10-19 | 2003-04-26 | 씨제이 주식회사 | 비브리오 메치니코프 유도체로부터 얻어진 단백질분해효소및 이를 포함하는 세탁용 세제 조성물 |
| CN104195073A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-10 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种通用弧菌电感受态细胞制备及电转化方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4966846A (en) * | 1987-10-01 | 1990-10-30 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Molecular cloning and expression of a vibrio proteolyticus neutral protease gene |
| KR20000065867A (ko) * | 1999-04-09 | 2000-11-15 | 손경식 | 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주 |
| KR100377259B1 (ko) * | 2000-07-19 | 2003-03-26 | 씨제이 주식회사 | 재조합 플라스미드 피에스피원, 이의 형질전환된 균주 및알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는 방법 |
-
2000
- 2000-07-19 KR KR10-2000-0041212A patent/KR100383138B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-19 JP JP2002512386A patent/JP2004504034A/ja active Pending
- 2001-07-19 WO PCT/KR2001/001232 patent/WO2002006494A1/en active IP Right Grant
- 2001-07-19 CA CA002415268A patent/CA2415268C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-19 DE DE60114835T patent/DE60114835T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-19 EP EP01952008A patent/EP1303627B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-19 US US10/333,261 patent/US6858408B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-19 AU AU2001272804A patent/AU2001272804A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-19 CN CN01812799A patent/CN1441846A/zh active Pending
- 2001-07-19 AT AT01952008T patent/ATE309377T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2415268A1 (en) | 2002-01-24 |
| EP1303627B1 (en) | 2005-11-09 |
| CN1441846A (zh) | 2003-09-10 |
| KR20020007769A (ko) | 2002-01-29 |
| ATE309377T1 (de) | 2005-11-15 |
| CA2415268C (en) | 2007-06-26 |
| AU2001272804A1 (en) | 2002-01-30 |
| DE60114835T2 (de) | 2006-08-03 |
| JP2004504034A (ja) | 2004-02-12 |
| EP1303627A1 (en) | 2003-04-23 |
| EP1303627A4 (en) | 2005-01-19 |
| WO2002006494A1 (en) | 2002-01-24 |
| DE60114835D1 (de) | 2005-12-15 |
| US20040009575A1 (en) | 2004-01-15 |
| US6858408B2 (en) | 2005-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Palva | Molecular cloning of α-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in B. subtilis | |
| Zukowski et al. | Chromogenic identification of genetic regulatory signals in Bacillus subtilis based on expression of a cloned Pseudomonas gene. | |
| Cornet et al. | Characterization of two cel (cellulose degradation) genes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases | |
| US5641650A (en) | Expression of heterologous polypeptides in halobacteria | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| Hirata et al. | Molecular basis of isozyme formation of beta-galactosidases in Bacillus stearothermophilus: isolation of two beta-galactosidase genes, bgaA and bgaB | |
| Berry et al. | Cloning and expression of the pneumococcal neuraminidase gene in Escherichia coli | |
| Sabe et al. | Molecular cloning of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene, ppc, of Escherichia coli | |
| KR100383138B1 (ko) | 재조합 플라스미드 피디에스비씨엠, 이의 형질전환된 균주및 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는방법 | |
| KR0167761B1 (ko) | 플라스미드, 이의 작제방법 및 플라스미노겐 활성자 제조에 있어서의 이의 용도 | |
| Fultz et al. | Wild-type isopropylmalate isomerase in Salmonella typhimurium is composed of two different subunits | |
| US5290916A (en) | Purified glucanase enzymes | |
| KR100377259B1 (ko) | 재조합 플라스미드 피에스피원, 이의 형질전환된 균주 및알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이를 생산하는 방법 | |
| CA2179623A1 (en) | Proteases from streptomyces and use thereof in protein expression systems | |
| US6955907B1 (en) | Alkaline, protease VapK suitable for laundry detergent, VapK gene, recombinant expression vector, and transformed microorganisms | |
| JPH0253488A (ja) | ウリカーゼのｄｎａ配列および製法 | |
| de la Torre et al. | On the respective roles of the two proteins encoded by the Bacillus sphaericus 1593M toxin genes expressed in Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
| Romaniec et al. | Cloning and expression of a Clostridium thermocellum DNA fragment that encodes a protein related to cellulosome component S L | |
| Yeh et al. | Improved translational efficiency of subtilisin YaB gene with different initiation codons in Bacillus subtilis and alkalophilic Bacillus YaB | |
| EP0154351B1 (en) | Expression plasmids useful in b. subtilis | |
| Lee et al. | Cloning of aprE86-1 gene encoding a 27-kDa mature fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH86-1 | |
| Oyama et al. | Secretion of Escherichia coli aminopeptidase P in Bacillus subtilis using the prepro-structure coding region of subtilisin amylosacchariticus | |
| JPH03501322A (ja) | 発現ベクター及びそれらの構成方法 | |
| Sen et al. | High level extracellular secretion of thermostable α-amylase of Bacillus stearothermophilus in Escherichia coli | |
| KR930006707B1 (ko) | 바실러스 메가테리움 atcc 14945의 세파로스포린 반합성 효소를 코드화하는 dna |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20090427 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |