CN104195073A - 一种通用弧菌电感受态细胞制备及电转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用弧菌电感受态细胞制备及电转化方法。它是将弧菌接种至脑心浸液培养基中，培养至对数生长期，取菌液，离心收集菌体，菌体用洗涤缓冲液洗涤，离心收集菌体，如此用洗涤缓冲液洗涤若干次，收集的菌体重悬于洗涤缓冲液中，由此得到弧菌电感受态细胞；所述的洗涤缓冲液含有：133-266mM蔗糖、1-5mM 4-羟乙基哌嗪乙磺，溶剂为水。利用本发明的方法能够成功的获得弧菌电感受态细胞，获得的感受态细胞按照本发明的电转化方法能够成功的将质粒转入弧菌细胞中，从而实现了将各种遗传资料转入弧菌细胞中，为对弧菌致病机理的探索提供了成熟、便捷的遗传操作技术。
Description
技术领域：
本发明属于细菌分子遗传学技术领域，具体涉及一种通用弧菌电感受态细胞制备及电
转化方法。
背景技术：
弧菌是海洋环境中最为常见的异养细菌，至少有12种弧菌可引起人类致病，其中霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌对人类健康危害最为严重。此外不少种类的弧菌也是水产经济动物病原，其引发的弧菌病导致大量养殖经济损失。尽管很早已经发现了霍乱弧菌和副溶血弧菌关键致病基因，科学家对弧菌致病机理的认识仍然严重滞后于肠杆菌科的致病菌，缺乏成熟、便捷的遗传操作技术是弧菌分子致病机理研究的主要障碍。肠杆菌科细菌分子遗传研究中应用广泛的技术包括：电转化、依赖于宿主recA的广泛同源重组系统、依赖于噬菌体来源的λ重组系统、噬菌体转导。
电转化技术是将各种遗传材料通过瞬间高压电击的方式导入到组织或细胞中，它是进行同源重组操作的基础。对于肠科菌科的细菌而言，其电转化条件已经十分成熟，但是其电转化方法完全不能应用于弧菌的电转化操作中。存在的最大问题是：(1)弧菌在常规的培养条件下，不能耐受高压电击，即使某些弧菌能够耐受高电压冲击，恢复生长十分缓慢，错过了遗传物质重组的最佳时期；(2)电转化中要求细胞悬液中不能存在较多的离子，否则就会形成电弧，造成电击失败，大肠杆菌等肠科菌的电转化常用去离子水对细胞进行洗涤，但是弧菌生活在嗜盐环境中，弧菌电感受态细胞置于去离子水环境中，细胞很快破裂死亡；(3)常规用于大肠杆菌电转化的电压会引起某些弧菌死亡；(4)电转化后，在常规的LB培养基中，弧菌细胞恢复生长缓慢，甚至不能恢复生长；(5)野生细菌中特别是弧菌中广泛存在限制性-修饰系统以及胞外核酸酶，直接破坏了外源遗传物质，导致电转化失败。
国内外有极少数研究者进行了某些弧菌电转化的探索(如鳗弧菌、副溶血弧菌)，但是实际应用时发现操作并不稳定、得到理想结果的概率低、并且缺乏通用性，已经报道的方法产生这些缺点的原因则是不能很好地同时解决上述5个问题。
发明内容：
本发明的第一个目的是针对上述问题，提供一种能够成功得到弧菌电感受态细胞的通用弧菌电感受态细胞制备方法。
本发明的通用弧菌电感受态细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将弧菌接种至脑心浸液培养基中，培养至对数生长期，取菌液，离心收集菌体，菌体用洗涤缓冲液洗涤，离心收集菌体，如此用洗涤缓冲液洗涤若干次，收集的菌体重悬于洗涤缓冲液中，由此得到弧菌电感受态细胞；
所述的洗涤缓冲液含有：133-266mM蔗糖、1-5mM 4-羟乙基哌嗪乙磺，溶剂为水。
优选，所述的通用弧菌电感受态细胞制备方法，具体步骤为：先将弧菌接种至脑心浸液培养基中，30-37℃振荡培养12-16hr，获得种子液，再将种子液以2～8％v/v的接种量接种到新鲜的脑心浸液培养基中，30-37℃振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8(此时弧菌细胞处于对数生长期，电击耐受能力强，转化率高)，得到培养液，将此培养液置于冰上10～15min，离心去上清，收集菌体，再加入洗涤缓冲液洗涤，离心去上清，收集菌体，再用洗涤缓冲液洗涤，离心去上清，收集菌体，将此菌体重悬于洗涤缓冲液中，由此得到弧菌电感受态细胞。
弧菌培养基为脑心浸液培养基(BHI，购自美国BD公司)。BHI具有非常丰富的营养，几乎所有难以培养生长缓慢的弧菌在BHI中都可以高密度快速生长，丰富的营养条件下生长的弧菌具有更强的承受电击胁迫环境的能力，并且更容易形成感受态。
洗涤缓冲液以灭菌去离子水配制，并用0.22μM滤膜过滤除菌。蔗糖提供了一种非离子的高渗环境，以维持细胞的形态完整，也不至于电击时形成电弧。HEPES是一种非离子pH稳定剂，可以在低浓度下稳定pH。维持类似于海水的偏碱性渗透对于弧菌电转化效率至关重要。
本发明的第二个目的是提供一种通用的弧菌电转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
在上述获得的弧菌电感受态细胞中加入质粒DNA，然后转移到预冷电击杯中，将电击杯置于电穿孔仪电击槽中，电击条件：1.2～1.8KV，电容25uF，电击时间5ms，电击后加入到42℃预热的BHI培养基中，置于30-37℃振荡培养1.5-3hr进行恢复生长，恢复生长的菌液接种于BHI培养基琼脂平板中，再按照常规方法进行筛选，获取转化子。
恢复生长的时间不能小于1.5hr，弧菌细胞相比于大肠杆菌对电击敏感，因此恢复生长的时间要长，如果恢复时间小于1.5hr，电击转化效率大大降低。
利用本发明的方法能够成功的获得弧菌电感受态细胞，获得的感受态细胞按照本发明的电转化方法能够成功地将质粒转入弧菌细胞中，从而实现了将遗传物质转入弧菌细胞中，为弧菌致病机理的探索提供了成熟、便捷的遗传操作技术。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：重组质粒pLP4转化拟态弧菌(Vibrio mimicus)VB542
(1)拟态弧菌接种于4ml脑心浸液培养基(BHI培养基，购自美国BD公司)中，37℃振荡培养16hr。
(2)培养结束后，以2％(V/V)比例添加到新鲜的BHI培养基中，37℃振荡培养至OD600nm＝0.6，得到培养物。此时弧菌细胞处于对数生长期，电击耐受能力强，转化率高。
(3)取出步骤(2)的培养物1ml置于冰中10min，然后4℃，8000rpm离心2min。
(4)吸尽上清，加入洗涤缓冲液1ml。洗涤缓冲液配方：266mM蔗糖、1mM HEPES(pH7.5)，溶剂为水，其是将266mmol的蔗糖，1mmol的HEPES，溶于1L的灭菌去离子水中，调pH值至7.5，用0.22μM滤膜过滤除菌备用。
(5)4℃，8000rpm离心3min，吸除上清，再加入预冷的洗涤缓冲液1ml，重悬菌液，4℃，8000rpm离心3min，吸除上清，收集菌体，共采用洗涤缓冲液洗涤2次。最后将收集的弧菌细胞重悬于40μL洗涤缓冲液中，由此获得拟态弧菌电感受态细胞，然后置于冰上，加入2μL纯化的质粒pLP4(50ng/μL)。冰上以移液枪头轻轻混匀。
(6)将弧菌细胞及混合的质粒pLP4转移到预冷电击杯中(间隙1mm)，迅速以吸水纸擦干电击杯外表，将电击杯置于电穿孔仪电击槽中。电击条件：1.8KV,电容25uF，电击时间5ms。
(7)电击后迅速加入42℃预热的BHI培养基1ml，置于37℃振荡培养1.5hr，得到恢复生长的培养物。
(8)取恢复生长后培养物100μl，涂布细胞悬液于含氯霉素(20μg/ml)的BHI琼脂平板上，超净台风干10min，37℃培养12hr。
(9)挑取平板上生长的菌落，进行转化子的鉴定，得到许多转入有重组质粒pLP4的拟态弧菌(Vibrio mimicus)VB542。
实施例2：表达质粒pACYC184△cat转化哈氏弧菌(Vibrio harveyi)E385
(1)哈氏弧菌接种于4ml BHI培养基中，30℃振荡培养16hr。
(2)培养结束后，以8％(V/V)比例添加到新鲜的BHI培养基中，30℃振荡培养至OD600nm＝0.8，得到培养物。
(3)取出步骤(2)的培养物1ml置于冰中15min，然后4℃，8000rpm离心2min。
(4)吸尽上清，加入预冷的洗涤缓冲液1ml。洗涤缓冲液配方：200mM蔗糖、5mM HEPES(pH7.5)，溶剂为水，其是将200mmol的蔗糖，5mmol的HEPES，溶于1L的灭菌去离子水中，调pH值至7.5，用0.22μM滤膜过滤除菌备用。
(5)4℃，8000rpm离心1.5min，吸除上清，再加入洗涤缓冲液1ml，重悬菌液，4℃，8000rpm离心1.5min，吸除上清，收集菌体，共采用洗涤缓冲液洗涤2次。将收集的弧菌细胞重悬于40μL洗涤缓冲液中，由此得到哈氏弧菌电感受态细胞，置于冰上，加入1μL纯化的质粒pACYC184△cat(65ng/μL)。冰上以移液枪头轻轻混匀。
(6)将弧菌细胞及混合的质粒pACYC184△cat转移到预冷电击杯中(间隙1mm)，迅速以吸水纸擦干电击杯外表，将电击杯置于电穿孔仪电击槽中。电击条件：1.2KV,电容25uF，电击时间5ms。
(7)电击后迅速加入42℃预热的BHI培养基1ml，置于30℃振荡培养3hr，得到恢复生长后的培养物。
(8)取恢复生长后的培养物100μl，涂布细胞悬液于含四环素(12μg/ml)的BHI琼脂平板上，超净台风干10min，30℃培养16hr。
(9)挑取平板上生长的菌落，进行转化子的鉴定，得到许多转有表达质粒pACYC184△cat的哈氏弧菌(Vibrio harveyi)E385。
实施例3：表达质粒pBAD18cm转化溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)A056
(1)溶藻弧菌接种于1ml BHI培养基中，37℃振荡培养12hr。
(2)培养结束后，以5％(V/V)比例添加到新鲜的BHI中，37℃振荡培养至OD600nm＝0.8，得到培养物。
(3)取出步骤(2)的培养物1ml置于冰中10min，然后4℃，8000rpm离心2min。
(4)吸尽上清，加入洗涤缓冲液1ml。洗涤缓冲液配方：133mM蔗糖、2mM HEPES(pH7.5)，溶剂为水，其是将133mmol的蔗糖，2mmol的HEPES，溶于1L的灭菌去离子水中，调pH值至7.5，用0.22μM滤膜过滤除菌备用。
(5)4℃，8000rpm离心2min，吸除上清，再加入预冷的洗涤缓冲液1ml，重悬菌液，4℃，8000rpm离心2min，吸除上清，收集菌体，共采用洗涤缓冲液洗涤2次。将收集的弧菌细胞重悬于40μL洗涤缓冲液中，由此得到溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)A056电感受态细胞，置于冰上，加入2μL纯化的质粒pBAD18cm(40ng/μL)。冰上以移液枪头轻轻混匀。
(6)将弧菌细胞及混合的pBAD18cm转移到预冷电击杯中(间隙1mm)，迅速以吸水纸擦干电击杯外表，将电击杯置于电穿孔仪电击槽中。电击条件：1.5KV,电容25uF，电击时间5ms。
(7)电击后迅速加入42℃预热的BHI培养基1ml，置于37℃振荡培养2hr，得到恢复生长后的培养物。
(8)取恢复生长后的培养物1000μl，离心后重悬于100μlBHI中，涂布细胞悬液于含氯霉素(20μg/ml)的BHI琼脂平板上，超净台风干10min，37℃培养12hr。
(9)挑取平板上生长的菌落，进行阳性转化子的鉴定，得到许多转有表达质粒pBAD18cm的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)A056。
Claims (3)
1.一种通用弧菌电感受态细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将弧菌接种至脑心浸液培养基中，培养至对数生长期，取菌液，离心收集菌体，菌体用洗涤缓冲液洗涤，离心收集菌体，如此用洗涤缓冲液洗涤若干次，收集的菌体重悬于洗涤缓冲液中，由此得到弧菌电感受态细胞；
所述的洗涤缓冲液含有：133-266mM蔗糖、1-5mM 4-羟乙基哌嗪乙磺，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的通用弧菌电感受态细胞制备方法，具体步骤为：先将弧菌接种至脑心浸液培养基中，30-37℃振荡培养12-16hr，获得种子液，再将种子液以2～8％v/v的接种量接种到新鲜的脑心浸液培养基中，30-37℃振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8，得到培养液，将此培养液置于冰上10～15min，离心去上清，收集菌体，再加入洗涤缓冲液洗涤，离心去上清，收集菌体，再用洗涤缓冲液洗涤，离心去上清，收集菌体，将此菌体重悬于洗涤缓冲液中，由此得到弧菌电感受态细胞。
3.一种通用的弧菌电转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
在权利要求1所述的弧菌电感受态细胞中加入质粒DNA，然后转移到预冷电击杯中，将电击杯置于电穿孔仪电击槽中，电击条件：1.2～1.8KV，电容25uF，电击时间5ms，电击后加入到42℃预热的BHI培养基中，置于30-37℃振荡培养1.5-3hr进行恢复生长，恢复生长的菌液接种于BHI培养基琼脂平板中，再按照常规方法进行筛选，获取转化子。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106868148A (zh) * | 2017-03-08 | 2017-06-20 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法 |
| CN109852566A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-07 | 徐州医科大学 | 一种电转化感受态细胞的制备方法及转化方法 |
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| CN1441846A (zh) * | 2000-07-19 | 2003-09-10 | 第一制糖株式会社 | 重组质粒pdsbcm,转化微生物,产生一种碱性蛋白梅vapk的方法 |
| US8993279B2 (en) * | 2007-02-01 | 2015-03-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for production of L-amino acid |
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