CN103421725A

CN103421725A - 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN103421725A
Application number: CN2012101577290A
Authority: CN
Inventors: 肖磊; 黄静; 李娟�; 周杰; 汪正华; 朱蓓霖; 赵芸
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2013-12-04

Abstract

一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明公开一种含有透明颤菌血红蛋白基因vgb的枯草芽孢杆菌，能够产生γ-聚谷氨酸。本发明还公开了通过电转化方法将含有所述血红蛋白基因vgb片段的重组质粒转入枯草芽孢杆菌中，得到含有血红蛋白基因vgb及能够表达γ-聚谷氨酸的重组枯草芽孢杆菌。本发明重组枯草芽孢杆菌可实现在培养基粘度大、溶氧低条件下进行高产量生产γ-聚谷氨酸，解决γ-聚谷氨酸在大规模生产过程中要求高溶氧的问题，有效降低生产成本。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与利用该菌生产γ-聚谷氨酸的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸是自然界中微生物发酵产生的阴离子多聚氨基酸，由D-型和L-型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键形式形成的高分子聚合物。γ-聚谷氨酸及其衍生物是一种环保型生物高分子，具有良好的水溶性，能彻底被生物降解，对人类和环境无毒害，因而在农业、食品、医药、环保、纤维轻化工等领域具有广阔的应用前景。

目前γ-聚谷氨酸的生物合成主要通过芽胞杆菌属的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）发酵来获得。芽胞杆菌发酵生产的过程中，由于γ-聚谷氨酸的不断生成，发酵液的粘度越来越大，发酵液中的溶氧问题越来越突出。因此，迫切需要研制出一种解决溶氧问题的γ-聚谷氨酸生产方法和γ-聚谷氨酸工程菌。

发明内容

为解决芽孢杆菌在发酵γ-聚谷氨酸过程中溶氧的问题，本发明提供一种重组枯草芽孢杆菌，是能够表达透明颤菌血红蛋白的γ-聚谷氨酸产生菌。该菌具有以下结构：该菌为能够产出γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，其携带质粒中含有表达透明颤菌血红蛋白的基因。

其中，所述血红蛋白基因vgb序列如下（如SEQ ID:1所示）：

ATGTTAGATCAACAAACAATTAATATTATTAAAGCAACAGTTCCTGTTTTAAAAGAACATGGAGTTACAATTACAACAACATTTTATAAAAATTTATTTGCAAAACATCCTGAAGTTAGACCTTTATTTGATATGGGAAGACAAGAATCTTTAGAACAACCTAAAGCATTAGCAATGACAGTTTTAGCAGCAGCACAAAATATTGAAAATTTACCTGCAATTTTACCTGCAGTTAAAAAAATTGCAGTTAAACATTGTCAAGCAGGAGTTGCAGCAGCACATTATCCTATTGTTGGACAAGAATTATTAGGAGCAATTAAAGAAGTTTTAGGAGATGCAGCAACAGATGATATTTTAGATGCATGGGGAAAAGCATATGGAGTTATTGCAGATGTTTTTATTCAAGTTGAAGCAGATTTATATGCACAAGCAGTTGAATAA。

本发明还提供了所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括步骤：构建含有所述血红蛋白基因vgb片段的重组质粒pLJ-vgb，再通过电转化将所述重组质粒pLJ-vgb转入枯草芽孢杆菌中，得到含有血红蛋白基因vgb并能够表达γ-聚谷氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

本发明中重组质粒pLJ-vgb制备方式为：以质粒pGH-vgb为模板进行PCR扩增，得到血红蛋白基因vgb片段，在5’端加入EcoRⅠ酶切位点，3’端加入SacⅠ酶切位点，将所述血红蛋白基因vgb片段插入E.coil/B.subtilis穿梭质粒pLJ的EcoRⅠ/SacⅠ酶切位点处，获得重组质粒pLJ-vgb；其中，所述PCR扩增使用以下引物：

vgb上游引物5’- GCGGAATTCATGTTAGATCAACAAAC-3’ （如SEQ ID:3所示）；

vgb下游引物5’-GCCGAGCTCTTATTCAACTGCTTGTGC-3’ （如SEQ ID:4所示）。

所述重组质粒pLJ-vgb中，以P_glv为启动子。

本发明所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法中，在构建所述重组质粒pLJ-vgb之前，根据枯草芽孢杆菌偏爱密码子表对所述血红蛋白基因vgb片段进行优化改造，vgb基因G+C的含量由45.3%降低到31.1%。

本发明中，所采用枯草芽孢杆菌为DL，其能够高效合成γ-聚谷氨酸。

本发明中，重组枯草芽孢杆菌携带的质粒中含有表达透明颤菌血红蛋白基因的碱基数为441bp。

本发明中，质粒的启动子为麦芽糖诱导启动子P_glv。

本发明方法在基因水平上优化透明颤菌血红蛋白密码子，采用E.coil/B.subtilis大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，并利用电转化的方法将透明颤菌血红蛋白基因片段导入枯草芽孢杆菌DL中，获得表达透明颤菌血红蛋白的γ-聚谷氨酸产生菌。

本发明还提出所述表达透明颤菌血红蛋白的枯草芽孢杆菌的应用，即用所述的透明颤菌血红蛋白的表达解决枯草芽孢杆菌DL在发酵γ-聚谷氨酸过程中溶氧难的问题。将本发明表达透明颤菌血红蛋白的枯草芽孢杆菌DL在含有麦芽糖的液体培养基中培养48小时，产生和积累γ-聚谷氨酸。通过本发明方法制备的γ-聚谷氨酸，其产量有明显提高。摇瓶发酵过程中生物量提高及粘度明显下降。因此，本发明方法从根本上解决γ-聚谷氨酸发酵过程中发酵液粘度大，溶氧难的问题。

本发明提供了一种在培养基粘度大，溶氧低的水平下生产出较高产量γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。本发明提供的枯草芽孢杆菌能够表达透明颤菌血红蛋白和γ-聚谷氨酸，能够实现在培养基粘度大，溶氧低条件下生产较高产量的γ-聚谷氨酸，解决γ-聚谷氨酸在大规模生产过程中要求高溶氧的问题，有效降低生产成本。

本发明的优点在于：（1）通过基因工程技术的方法解决γ-聚谷氨酸发酵过程中溶氧问题比利用通气和搅拌等传统方法成本低；（2）透明颤菌血红蛋白的基因经过偏爱密码子优化，血红蛋白表达量增加。（3）通过血红蛋白的表达，枯草芽孢杆菌对氧气的亲和力增强，极大的提高对氧气的利用率，进而提高了菌体的生物量，最终提高γ-聚谷氨酸的产量。

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌及利用该菌生产γ-聚谷氨酸，产量高，生产成本较低。

附图说明

图1所示为枯草芽孢杆菌偏爱密码子表。

图2所示为小分子γ-聚谷氨酸的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详述本发明。说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等，以及未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。

实施例1 构建一种表达透明颤菌血红蛋白的重组枯草芽孢杆菌：含有透明颤菌血红蛋白的基因工程菌。

第一步碱基序列合成

将透明颤菌血红蛋白基因按照枯草芽孢杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造,改造方法如下：从NCBI数据库中查出透明颤菌血红蛋白基因vgb序列（如SEQ ID:2所示），根据枯草芽孢杆菌偏爱密码子表（如图1所示）对透明颤菌血红蛋白基因vgb进行优化改造，其中78个碱基发生改变，改变率为17.69%，vgb基因G+C的含量由45.3%降低到31.1%，从而提高透明颤菌血红蛋白基因vgb在枯草芽孢杆菌中的表达效率。

上述方法中委托专业生物技术公司化学合成优化后的血红蛋白基因。化学合成长度为441bp，其碱基序列如下（如SEQ ID:1所示）：

ATGTTAGATCAACAAACAATTAATATTATTAAAGCAACAGTTCCTGTTTTAAAAGAACATGGAGTTACAATTACAACAACATTTTATAAAAATTTATTTGCAAAACATCCTGAAGTTAGACCTTTATTTGATATGGGAAGACAAGAATCTTTAGAACAACCTAAAGCATTAGCAATGACAGTTTTAGCAGCAGCACAAAATATTGAAAATTTACCTGCAATTTTACCTGCAGTTAAAAAAATTGCAGTTAAACATTGTCAAGCAGGAGTTGCAGCAGCACATTATCCTATTGTTGGACAAGAATTATTAGGAGCAATTAAAGAAGTTTTAGGAGATGCAGCAACAGATGATATTTTAGATGCATGGGGAAAAGCATATGGAGTTATTGCAGATGTTTTTATTCAAGTTGAAGCAGATTTATATGCACAAGCAGTTGAATAA

第二步构建表达透明颤菌血红蛋白基因的基因工程菌

将含有透明颤菌血红蛋白的基因克隆到E.coil/B.subtilis穿梭质粒载体上，得到含有透明颤菌血红蛋白基因的重组质粒。质粒的启动子P_glv为麦芽糖诱导表达。

提取质粒pGH-vgb，用EcoRI/SacI双酶切后纯化回收小片断vgb；同时将质粒pLJ用EcoRI/SacI双酶切，回收大片段pLJ。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中。以质粒pGH-vgb为模板，vgb上游引物5’- GCGGAATTCATGTTAGATCAACAAAC-3’， vgb下游引物5’-GCCGAGCTCTTATTCAACTGCTTGTGC-3’进行PCR扩增，得到441bp的血红蛋白基因vgb片段。在血红蛋白基因vgb5’端加入EcoRⅠ酶切位点，3’端加入SacⅠ酶切位点。将441bp血红蛋白基因vgb片段插入E.coil/B.subtilis穿梭质粒pLJ的EcoRⅠ/SacⅠ酶切位点处，得到含有透明颤菌血红蛋白基因的质粒pLJ-vgb（vgb代表透明颤菌血红蛋白基因），以P_glv为启动子。

从大肠杆菌DH5α中提取质粒pLJ-vgb，利用电转化方法将重组质粒转入至枯草芽孢杆菌DL中，得到表达透明颤菌血红蛋白基因的基因工程菌，于-70℃保藏。

其中，电转化方法步骤如下：

1. 枯草芽孢杆菌DL感受态的制备：

（1）从新鲜的枯草芽孢杆菌DL平板上挑去单菌落于20mlLB培养基，37℃,210r/min过夜培养12小时。

（2）取1.25ml的过夜培养物于20ml的LBS培养基（LB+0.5mol/L山梨醇）中, 37℃,210r/min培养（OD₆₀₀=1.5）。摇瓶冰浴10min。

（3）5000g 4℃离心5min收集菌体，用预先冰浴的电转洗液（0.5mol/L山梨醇 +0.5mol/L甘露醇+10%甘油）洗涤4次。500ul的电转洗液悬浮保存于-70℃。

2. 重组质粒pLJ-vgb转化枯草芽孢杆菌DL

（1）取1.5ml离心管加入感受态细胞60ul和1ul(50ng/ul-150ng/ul)质粒DNA，冰浴1-1.5min，将细胞转至1mm电转化杯中，用电脉冲转化仪电击。（25UF 200Ω 21kv/cm）

（2）电击完后，迅速加入1ml预热的恢复培养基（LBS+0.38mol/L甘露醇）

37℃,210r/min培养3小时。

（3）2000r/min离心1min,弃800ml上清，余200ml吹匀后涂于30ug/ml氯霉素平板。37℃培养过夜。

上述构建涉及到的枯草芽孢杆菌DL，E.coil/B.subtilis穿梭质粒pLJ为实验室保存，委托合成碱基序列的专业生物技术公司是上海捷瑞生物技术有限公司。

实施例2 表达透明颤菌血红蛋白的重组枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的应用

第一步发酵γ-聚谷氨酸

将构建成功的表达透明颤菌血红蛋白的枯草芽孢杆菌于发酵培养基（麦芽糖50g/L、酵母提取物10g/L、谷氨酸钠 30g/L、氯化钠10g/L、磷酸二氢钾 5g/L、硫酸镁0.5g/L）中，37℃，210r/min，培养48小时，产生和积累γ-聚谷氨酸。

第二步收集γ-聚谷氨酸

利用盐酸调节发酵培养液，使其pH值为3.0，离心发酵培养液，16,000r/min，离心20 min，除去发酵液中的菌体，得上清液，调节上清液的pH值至7.0，在溶液中缓慢加入体积为其3倍的乙醇，并且采用玻璃棒进行缓慢搅拌，得到沉淀，提取沉淀为粗品γ-聚谷氨酸。

将本发明构建的重组枯草芽孢杆菌与野生枯草芽孢杆菌产生γ-聚谷氨酸的结果比较，如下表1所示。

由以上实验结果可见，本发明通过基因工程技术的方法解决了γ-聚谷氨酸发酵过程中溶氧问题，提高了枯草芽孢杆菌的生物量，以及γ-聚谷氨酸的产量。本发明利用透明颤菌血红蛋白的基因经过偏爱密码子优化，增加血红蛋白表达量。血红蛋白的表达，协助枯草芽孢杆菌提高对氧气的利用率，进而提高了菌株的生物量及γ-聚谷氨酸的产量。

实施例3 小分子量γ-聚谷氨酸的制备

将上述制备所得的γ-聚谷氨酸作为母体材料，称取其粉末，用蒸馏水配制为1%浓度的γ-聚谷氨酸溶液，调节其pH为4.0，将其置于80℃的恒温水浴锅内，分别降解0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，5.0h，然后对其冰浴冷却，并调节其pH为7.0，然后通过水平式0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定降解产物的分子量，实验结果如图2所示。图2中，1-3表示：14.5 kD、20.5 kD、64.0 kD的γ-聚谷氨酸标准品；4表示：大分子γ-聚谷氨酸对照；5-10表示：大分子γ-聚谷氨酸分别降解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，3.0 h，5.0 h后的样品。

结果显示：通过调节γ-聚谷氨酸不同降解条件，来获得适合于做药物载体的小分量γ-聚谷氨酸，并通过0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳的方法进行分子量分析，随着降解作用时间的延长，γ-聚谷氨酸分子量越来越小。大分子γ-聚谷氨酸在80℃条件下，降解时间为2.0h～3.0h时，降解得到的小分子γ-聚谷氨酸的分子量在20.5kD～64.0kD之间，适合于做药物载体。

实施例 4

本实施例对本发明表达透明颤菌血红蛋白的重组枯草芽孢杆菌所生产的样品γ-聚谷氨酸作为絮凝试剂的应用，即γ-聚谷氨酸用于铜、镍、铬离子的吸附实验。

配制铜、镍、铬离子浓度为100mg/L、150mg/L的溶液，加适量的氨水溶液（0.1mol/L），将溶液pH值调至5，分别加入5％已经制备好的γ-聚谷氨酸母液（10g/L），作用时间3小时，过滤，测定上清液离子浓度。

γ-聚谷氨酸对铜、铬、镍的絮凝效果对比和分析，分两组浓度进行絮凝实验。一组为100mg/L的铜、铬、镍溶液，另一组为150mg/L的铜、铬、镍溶液。实验结果如表2所示。

Figure 2012101577290100002DEST_PATH_IMAGE002

实验结果表明：γ-PGA对铜离子的吸附率分别为72.01%和54.85%，对铬离子的吸附率分别为86.10%和83.45%，而对镍离子的吸附率分别为77.60%和74.62%。由此可见，本发明表达透明颤菌血红蛋白的γ-聚谷氨酸产生菌所生产的样品γ-聚谷氨酸能够作为生物絮凝剂，γ-聚谷氨酸用于铜、镍、铬离子等具有较好的吸附作用。

以上描述的具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。

<110> 华东师范大学

<120> 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 4

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213>Vitreoscilla sp. hemoglobin (vgb) gene

<400> 2

ATGTTAGACCAGCAAACCATTAACATCATCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAGGAGCATGGCGTTACCATTACCACGACTTTTTATAAAAACTTGTTTGCCAAACACCCTGAAGTACGTCCTTTGTTTGATATGGGTCGCCAAGAATCTTTGGAGCAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTATTGGCGGCAGCGCAAAACATTGAAAATTTGCCAGCTATTTTGCCTGCGGTCAAAAAAATTGCAGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCAGCAGCGCATTATCCGATTGTCGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAAGTATTGGGCGATGCCGCAACCGATGACATTTTGGACGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCAGATGTGTTTATTCAAGTGGAAGCAGATTTGTACGCTCAAGCGGTTGAATAA

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

vgb上游引物5’- GCGGAATTCATGTTAGATCAACAAAC-3’

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

vgb下游引物5’-GCCGAGCTCTTATTCAACTGCTTGTGC-3’。

Claims

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是含有如SEQ ID:1所示透明颤菌血红蛋白基因vgb的枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌能够产生γ-聚谷氨酸。

2.一种如权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：构建含有所述血红蛋白基因vgb片段的重组质粒pLJ-vgb，再通过电转化方法将所述重组质粒pLJ-vgb转入枯草芽孢杆菌中，得到含有血红蛋白基因vgb并能够表达γ-聚谷氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pLJ-vgb制备方式为：以质粒pGH-vgb为模板进行PCR扩增，得到血红蛋白基因vgb片段，在5’端加入EcoRⅠ酶切位点，3’端加入SacⅠ酶切位点，将所述血红蛋白基因vgb片段插入E.coil/B.subtilis穿梭质粒pLJ的EcoRⅠ/SacⅠ酶切位点处，获得重组质粒pLJ-vgb；其中，所述PCR扩增使用以下引物：

vgb上游引物5’- GCGGAATTCATGTTAGATCAACAAAC-3’

vgb下游引物5’-GCCGAGCTCTTATTCAACTGCTTGTGC-3’。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pLJ-vgb中，以P_glv为启动子。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在构建所述重组质粒pLJ-vgb之前，根据枯草芽孢杆菌偏爱密码子表对所述血红蛋白基因vgb片段进行优化改造，vgb基因G+C的含量由45.3%降低到31.1%。

6.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌在γ-聚谷氨酸生产中的应用。