CN115094005B - 枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于重金属污染修复技术领域，公开了枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用。本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1006‑3能够产聚谷氨酸，将此枯草芽孢杆菌的发酵产物应用于六价铬污染治理，此生物材料可以在72h内完全去除100mg/L的Cr(VI)，从溶液中去除的Cr(VI)的绝对量随着初始Cr(VI)浓度的增加而增加。

Description

枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用

技术领域

本发明涉及重金属污染修复技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用。

背景技术

铬具有优良的耐蚀性和硬度，因此在皮革鞣制，钢铁和合金生产，染料和颜料制造，玻璃工业，木材防腐，纺织工业，胶片和摄影，金属清洁，电镀等多个工业过程中被广泛使用。据统计，铬矿砂生产总量的90%用于冶金工业，如钢铁、合金和有色合金生产；5%用于生产耐火材料，如钢铁、水泥、玻璃、陶瓷等；其余5%则用于化学工业，如制革、电镀、木材防腐和颜料等。相关调查显示，由于人为活动，全球平均每年向土壤和水体中排放铬的量分别为896吨和142吨。这些工业产生的废渣，排放到自然环境后，会导致土壤和水源受到铬的污染，最终危害人类自身。

Cr(VI)是对人体最有害的八大化学物质之一，是国际上公认的最具致癌性的金属之一。人体一旦接触或摄入过量Cr(VI)会出现腹泻、溃疡、眼睛和皮肤过敏等症状，严重时会导致肾功能不全、肺癌，甚至死亡。Cr(VI)在原核生物和真核生物中的主要毒性机制与其在细胞膜上的易扩散有关。同时，Cr(VI)在细胞中的还原导致自由基的产生，这些自由基可能直接引起DNA的改变和其他毒性作用。而Cr(III)是哺乳动物糖、脂质和蛋白质正常代谢过程所必需的，是动物和人类饮食中必不可少的微量元素。Cr(III)通过促进胰岛素与细胞表面受体的结合，在维持血糖水平方面发挥重要作用。此外，Cr(III)对降低体脂、胆固醇和甘油三酯水平，增加肌肉质量有积极作用。由于Cr(III)配合物不易透过细胞膜，因此其毒性比Cr(VI)低10~100倍。相关研究也表明，小白鼠Cr(VI)口服毒性的LD50(半数致死量)为50~100mg/kg，而Cr(III)为1900~3000mg/kg。但长期接触过量Cr(III)也会引起皮肤过敏，甚至导致癌症。

去除金属离子的传统方法包括化学沉淀、离子交换、膜分离、反渗透、蒸发和电化学处理等。而这些处理方法成本普遍较高，并且可能导致二次污染。而生物修复因为其技术上的可行性、经济性、高效性、可重复使用性，在近年来得到了更多的关注。生物修复包括生物吸附、生物积累、生物转化等机制，生物材料通过代谢介导的吸收途径或纯粹的物理化学吸附途径（利用其配体或官能团与金属离子形成络合物）从环境中积累重金属，再通过特有的酶催化途径代谢这些化学物质，并将它们转化为安全无害的化合物。生物修复可以在对环境不产生任何有害影响的情况下，使重金属污染场地恢复原状，包括细菌、真菌、藻类和植物在内的许多生物体都显示出了这样的修复能力。

发明内容

为解决背景技术的中问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌、生物材料及在六价铬污染治理中的应用。

为达到上述目的，本发明提供的第一个技术方案为：

一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1006-3，所述枯草芽孢杆菌于2022年4月25日保藏至位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2022478；保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

本发明提供的第二个技术方案为：

一种生物材料，为权利要求1所述枯草芽孢杆菌1006-3的发酵产物。

优选的，所述发酵产物的制备方法包含以下步骤：

将枯草芽孢杆菌1006-3培养到对数生长期，按照2~3%的接种量接种到液体发酵培养基中培育36~48h。

需要说明的是，此处2~3%的接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。

本发明提供的第三个技术方案为：

生物材料在六价铬污染治理中的应用，即第二个技术方案的生物材料的应用。

优选的，所述六价铬污染包含六价铬污染水体和六价铬污染土壤。

优选的，所述应用的具体方法为向被六价铬污染对象中添加生物材料25~30mL/100g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的枯草芽孢杆菌能够产聚谷氨酸，将此枯草芽孢杆菌的发酵产物应用于六价铬污染治理，包括对六价铬污染水体和六价铬污染土壤的治理。此生物材料可以在72h内完全去除100mg/L的Cr(VI)，从溶液中去除的Cr(VI)的绝对量随着初始Cr(VI)浓度的增加而增加。

附图说明

图1为菌株1006-3的16S rRNA基因序列的系统发育树；

图2为菌株1006-3发酵液对Cr(VI)的去除效果；

图3为Cr(VI)初始浓度对Cr(VI)去除率的影响；

图4为pH对Cr(VI)去除率的影响；

图5为温度对Cr(VI)去除率的影响；

图6为菌株1006-3发酵液不同组分对Cr(VI)的去除效果；

图7为Cr(VI)处理前后胞外产物XPS分析；

图8为Cr(VI)处理前后胞外产物FTIR分析；

图9为菌株1006-3发酵液对土壤中Cr(VI)的去除效果；

图10为菌株1006-3发酵液与铬污染土壤共混培育过程中Cr形态变化。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式及附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1 用于说明枯草芽孢杆菌1006-3的分离方法

土壤样品来源于某废弃制革厂周边土壤。为了分离具有六价铬修复能力的菌株，将1g污染土壤加入至LB液体培养基进行富集培养。12 h后，将该液体培养基分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6等浓度梯度，并分别将其涂布于一定六价铬浓度的LB固体平板，置于37 ℃培养箱中培养。根据菌落形态特征和颜色的不同，挑取单个菌落于固体平板上进行划线纯化。

实施例2 用于说明分离得到的枯草芽孢杆菌1006-3性能的确定

对筛选分离所得到的目的菌株进行培养，离心收集其发酵液，并向其中加入一定体积的六价铬母液，培养48 h。测定培养前后反应体系中的六价铬浓度，以鉴定各分离菌株的六价铬去除能力，若反应体系中的六价铬浓度降低，则说明该菌株发酵液具有一定的六价铬去除能力。选取一株六价铬还原能力最强的菌株进行后续的六价铬还原实验，并对其进行16 S rRNA基因测序分析，鉴定结果如图1所示，对该菌株命名为枯草芽孢杆菌1006-3。

实施例3 用于说明枯草芽孢杆菌1006-3的遗传稳定性

对菌株1006-3进行多次斜面划线培养，观察其菌落形态特征和颜色，并对多次传代的菌落进行16S rRNA基因测序分析，以鉴定其遗传稳定性。传代30代以上，菌株16S rRNA基因序列与原始菌株一直，反应该菌株具有稳定的遗传特性。

实施例4 生物材料的制备及应用

取菌株枯草芽孢杆菌1006-3对数期后期种子液2mL(OD600=1.0)接种至发酵培养基中，置于30℃、220rpm的摇床培养36h得到生物材料即发酵液备用；所使用的发酵培养基配方为：L-谷氨酸20g/L，柠檬酸12g/L，甘油60g/L，NH₄Cl 8g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeCl₃·6H₂O 0.04g/L，CaCl₂·6H₂O 0.15g/L，MnSO₄·4H₂O 0.1g/L，pH7.5。

将Cr(Ⅵ)溶液按100mg/L的浓度添加至上述发酵液中，在同样的条件下继续培养。以无菌发酵培养基和提取的菌株1006-3胞外产物溶液为对照，每隔12h取样一次，离心去除菌体，采用二苯碳酰二肼显色法检测不同样品上清液中剩余的Cr(VI)浓度，根据与初始Cr(VI)浓度的比值即可计算Cr(VI)去除率。若菌株1006-3发酵液中的Cr(VI)去除率高于无菌发酵培养基和胞外产物溶液中的Cr(VI)去除率，则证明该发酵液具有Cr(VI)去除能力。反之，则证明该发酵液不具有Cr(VI)去除能力或者说Cr(VI)含量的降低与发酵过程无关。设置三个平行样品。结果如图2所示，随着修复时间的延长，接种菌株1006-3的实验组中的六价铬能被完全去除。相比之下，接种纯培养基的对照组六价铬去除能力却小得多。

实施例5 不同Cr(VI)初始浓度对Cr(VI)去除率的影响

取菌株1006-3对数期后期种子液2mL(OD600=1.0)接种至上述发酵培养基中，置

于30℃、220rpm的摇床培养36h后，将Cr(Ⅵ)溶液分别按50、100、150、200、

250、300、350、400mg/L的浓度梯度添加至发酵液中，在同样的条件下继续培

养，每隔12h取样一次，离心去除菌体，检测发酵上清液中剩余的Cr(VI)浓度，

根据与初始Cr(VI)浓度的比值即可计算Cr(VI)去除率。设置三个平行样品。结果

如附图3所示，菌株1006-3能在36 h内完全去除50 mg/L Cr(VI)，但随着Cr(VI)浓度增大，去除效率明显降低。初始Cr(VI)浓度为100 mg/L时，需要72 h才能完全去除其中的Cr(VI)。当Cr(VI)初始浓度从150 mg/L增加至400 mg/L时，其72 h去除率从82.93%降低到41.26%。尽管Cr(VI)去除率随着Cr(VI)浓度的增加而逐渐降低，但是从溶液中去除的Cr(VI)的绝对量随着初始Cr(VI)浓度的增加而增加。此外还发现，在所有浓度下，前36 h菌株对Cr(VI)的去除效率要高于后36 h。

实施例6 不同pH对Cr(VI)去除率的影响

取菌株1006-3对数期后期种子液2mL(OD600=1.0)接种至上述发酵培养基中，置于30℃、220rpm的摇床培养36h后，添加Cr(Ⅵ)溶液至发酵液中终浓度为150mg/L，将培养液的pH分别调至6、7、8、9，在同样的条件下继续培养，每隔12h取样一次，离心去除菌体，检测发酵上清液中剩余的Cr(VI)浓度，根据与初始Cr(VI)浓度的比值即可计算Cr(VI)去除率。设置三个平行样品。结果如图4所示，在pH 6~9范围内研究了初始pH对菌株1006-3发酵液去除Cr(VI)的影响，其最佳pH为8。在pH 6~8这一范围内，随着pH值的升高，Cr(VI)的72 h去除率逐渐升高。而在pH为 9的条件下，其72 h去除率仅为23.42%。大量研究发现pH 6~8.5范围是大多数菌株去除Cr(VI)的最佳条件，pH对微生物生长速率和酶活性有着显著影响。

实施例7 不同温度对Cr(VI)去除率的影响

取菌株1006-3对数期后期种子液2mL(OD600=1.0)接种至上述发酵培养基中，置于30℃、220rpm的摇床培养36h后，添加Cr(Ⅵ)溶液至发酵液中终浓度为100 mg/L，将培养液分别置于25、30、37、40、45℃的摇床中继续培养，每隔12h取样一次，离心去除菌体，检测发酵上清液中剩余的Cr(VI)浓度，根据与初始Cr(VI)浓度的比值即可计算Cr(VI)去除率。设置三个平行样品。结果如图5所

示，在40 ℃和45 ℃条件下，48 h内100 mg/L Cr(VI)去除率达到了100%。而培养温度为37 ℃时，需要72 h才能完全去除其中的Cr(VI)。在25 ℃和30 ℃时，其72 h Cr(VI)去除率分别为45.56%和61.81%。

实施例8 发酵液中不同组分对Cr(Ⅵ)的去除

为了确定菌株1006-3发酵液中对Cr(VI)的去除起主要作用的部分，对比了发酵上清液、静息细胞、灭活细胞、可渗透细胞、细胞膜组分、细胞质组分对Cr(VI)的去除效果。经发酵培养36h后，通过离心分离上清液和菌体。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗菌体去除表面干扰物质，然后重悬于同样的磷酸盐缓冲液中，得到菌悬液。将菌悬液分离出一部分作为静息细胞样品；一部分在60℃水浴中处理15min作为灭活细胞样品；再取一部分菌悬液，加入0.2% (v/v)甲苯，涡旋20min，得到可渗透细胞，重悬于磷酸盐缓冲液中。剩下的菌体在冰浴中用超声波破碎（200W，超声3s，间隔2s，20个循环）。将所得匀浆液在4℃下，13,000rpm离心25min。离心后的沉淀为细胞膜组分，用0.22 μm膜过滤后的上清液为细胞质组分。在各样品中加入低浓度的Cr(Ⅵ)溶液，在30℃摇床中培养，分别于0、6、24h取样检测Cr(Ⅵ)含量。所有实验均设置三个平行样品。结果如附图6所示，发酵上清液和无菌培养基的24 h Cr(Ⅵ)去除率分别为40.23%和13.24%，静息细胞对Cr(Ⅵ)也有一定的去除作用，其在24 h内对Cr(Ⅵ)的去除率为9.14%，而相比之下灭活细胞则基本无Cr(Ⅵ)去除能力。然后以静息细胞为对照，研究了渗透细胞、细胞膜组分、细胞质组分对Cr(Ⅵ)的去除率。结果显示，渗透细胞的24 h Cr(Ⅵ)去除率达到了17.82%，相较于静息细胞的24 h Cr(Ⅵ)去除率提升了8.68%。细胞质组分对Cr(Ⅵ)的24 h去除率为3.6%，而细胞膜组分对Cr(Ⅵ)则几乎没有去除作用。用甲苯处理细胞，破坏了细胞膜的磷脂双分子层，细胞通透性提高，使得Cr(Ⅵ)离子更容易进入细胞或胞内的还原性物质更容易释放出来，从而提高了Cr(Ⅵ)去除效果。

实施例9 Cr(Ⅵ)的去除机制

通过对Cr(Ⅵ)处理前后的菌株1006-3胞外产物进行表征，推测菌株1006-3发酵液去除Cr(Ⅵ)的作用机制。采用X射线光电子能谱仪对菌株1006-3胞外产物进行全谱和C1s，O1s，Cr2p的精细谱扫描。分析Cr(VI)溶液处理前后菌株1006-3胞外产物元素组成及含量的变化，以及胞外产物与Cr元素之间的结合状态、以及与之相关的官能团结构。采用傅里叶变换红外光谱，确定Cr与胞外产物相互作用所涉及的官能团。结果如图7所示，通过分峰拟合可知，在585.08 eV和576.18 eV处有两个明显的峰，与Cr(III)化合物的Cr 2p1/2的峰值范围(585.0~588.0 eV)和Cr 2p3/2的峰值范围(576.0~578.0 eV)一致。在588.58 eV和580.48 eV处的两个峰，则与标准Cr(VI)化合物K2Cr2O7的Cr 2p1/2和Cr 2p3/2的峰值一致。C1s的谱图中，C-C、C-H（284.8 eV）的相对峰面积由58.59%下降到了57.01%，而在O1s的谱图中，O-H（532.47 eV）的相对峰面积由43.07%减少到了40.27%，可知羟基或酚类等含氧配位体参与了与Cr(VI)的配位。Cr(III)特征峰的存在可以推测Cr(VI)浓度的降低可能是由于还原作用。可进一步推测，Cr(VI)被生物还原为Cr(III)，少量Cr被吸附在胞外产物表面。如图8所示，无铬样品和铬处理样品之间吸收峰的变化表明，羧基、酰胺等官能团可能参与了Cr与胞外产物的相互作用。由于在水溶液中，Cr(VI)常以HCrO₄ ^-、CrO₄ ^2-等阴离子形式存在，而Cr(III)则主要以Cr³⁺、Cr(OH)²⁺等阳离子形式存在。而羧基电离后则常以阴离子形式存在，容易与金属阳离子结合，这一结果也从侧面说明了，存在金属Cr以Cr(III)的形式与胞外产物结合。

实施例10 土壤培育实验

在土壤中预先混合600mg/kg的Cr(Ⅵ)，在试样土壤中以25mL/100 g的含量添加菌株1006-3的36h发酵液作为实验组，添加同样量的无菌培养基作为对照组。混合均匀后放入30℃恒温培养箱进行培育实验，期间定期向试样中添加去离子水，以维持试样土壤30%的含水量。固定时间取样，采用碱溶液提取法对土壤中的Cr(Ⅵ)进行提取测量，采用Tessier连续提取法分析土壤中Cr的形态变化。结果如图9所示，含发酵液的土壤中，Cr(Ⅵ)含量呈较快的下降趋势，在3天时间内，就能将Cr(Ⅵ)含量稳定在20 mg/kg的较低水平。而对照组的土壤中的Cr(Ⅵ)则需要7天时间才能将Cr(Ⅵ)含量稳定在相同水平。同时还发现，在每个时间段内含发酵液土壤中的Cr(Ⅵ)含量均低于对照组土壤中的Cr(Ⅵ)含量，并且在实验的最后含发酵液土壤中的Cr(Ⅵ)含量持续稳定在8 mg/kg左右的较低水平。以上实验结果说明菌株1006-3的发酵液对土壤中的Cr(Ⅵ)也具有相应的去除效果，并且能够在短时间内将土壤中的Cr(Ⅵ)含量控制在较低水平，能够有效减轻Cr(Ⅵ)对土壤的持续性污染。如图10所示，在土壤培育初期，Cr主要以可交换态(EX)的形式存在，其在对照组和实验组中分别占比为60.11%和59.10%，随着培育时间的增加，其占比显著降低，在第60天时，其在对照组和实验组中占比仅为10.96%和1.84%。而碳酸盐结合态(CB) Cr的含量在整个土壤培育过程中处于动态变化的状态，但其与可交换态Cr相加的含量，在培育过程中呈现逐步下降的趋势，并且其在实验组中的下降率高于在对照组中的下降率。EX形态重金属的溶解度最大，CB形态重金属的溶解度则受pH值变化的影响。重金属的生物有效性受到其与溶解度相关的化学形式的控制，而EX和CB形态是植物吸收重金属的最重要形式。EX和CB形态Cr含量的降低，表明Cr在土壤中的溶解度和生物有效性逐步降低，并且相较于对照组，实验组的效果更为明显。易迁移的金属主要以可交换态和有机结合态存在，其迁移行为受到不断变化的土壤条件的强烈影响。

有机结合态含量的变化可能受总有机碳含量控制，土壤中的有机质作为电子供体，为Cr(VI)还原为Cr(III)提供了有利条件。被微生物活动消耗的有机物在降解过程中会导致有机酸的释放，使土壤pH值降低，从而促进Cr(III)的形成，而这样形成的Cr(III)容易形成迁移性较强的可溶性有机配合物。在培育过程中，有机结合态(OM) Cr的含量呈小幅增长趋势，其在对照组和实验组中的增幅分别为5.32%、5.85%，但其与可交换态Cr相加的含量呈明显下降趋势，说明Cr在土壤中的可迁移性逐步下降，并且相较于对照组，实验组的效果更为明显。铁锰氧化态(OX)和残渣态(RS)Cr的含量在培育过程中均逐步增加，其在对照组中的增幅分别为22.23%和15.12%，在实验组中的增幅分别为28.30%和20.46%。铁锰氧化态Cr受pH或氧化还原电位变化的影响，而残渣态Cr在正常条件下则不易释放。综上所述，在菌株1006-3发酵液的影响下，土壤中Cr逐渐形成较强的结合态，其溶解率、迁移率以及生物有效性逐步降低。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1006-3，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌于2022年4月25日保藏至位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M2022478；保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

2.一种生物材料，其特征在于，为权利要求1所述枯草芽孢杆菌1006-3的发酵产物；

所述发酵产物为发酵上清液、静息细胞、可渗透细胞、细胞膜组分、细胞质组分；

其中，所述细胞膜组分和细胞质组分的制备方法为：将枯草芽孢杆菌1006-3发酵培养离心得到的菌体在冰浴中用200W超声波破碎处理3s，间隔2s，共20个循环，将所得匀浆液在4℃下，13,000rpm离心25min，所述离心后的沉淀为细胞膜组分，所述离心后用0.22 μm膜过滤后的上清液为细胞质组分。

3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述发酵产物的制备方法包含以下步骤：

将枯草芽孢杆菌1006-3培养到对数生长期，按照2~3%的接种量接种到液体发酵培养基中培育36~48h。

4.如权利要求2或3所述的生物材料在六价铬污染治理中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述六价铬污染包含六价铬污染水体和六价铬污染土壤。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为向被六价铬污染对象中添加生物材料25~30mL/100g。

Images