CN112831422B - 一种锰氧化真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有锰氧化能力的真菌，该真菌能够将水体中的Mn2+氧化生成不溶于水的锰氧化物，该Mn2+氧化真菌为枝孢菌Cladosporium sp.XM01，保藏号为CGMCC NO.21083。将本发明的枝孢菌XM01菌株用于自然水体中的Mn2+氧化，其操作稳定(15‑30℃)在常温范围，pH值(6.0‑7.5)在中性范围，具有很高的Mn2+氧化效率，通过本发明所采用的XM01循环氧化二价锰，可实现重金属或微量有机物污染的水体和土壤原位修复。本发明菌株生长过程中氧化生成的锰氧化物在污水治理、水环境修复和土壤等领域具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种锰氧化真菌及其应用。
背景技术
近年来，由于生物锰氧化物具有良好的吸附能力和氧化能力，与化学合成的锰氧化物相比，生物氧化锰结晶弱，粒径小Mn价态高，结构中八面体空穴多，因而具有更强的吸附、氧化等表面活性。另外，生物锰氧化物是在环境友好的条件下生产的，无需过度使用能源，因此它可以被视为一种成本效益高、环境友好型材料，用于被污染的环境修复。
锰氧化物的形成机制有化学成因和生物成因两种。相比而言，生物成因认为微生物主要介导了自然界中的锰氧化过程，且生物介导的锰氧化反应速率要比化学催化的速率快几倍甚至几万倍以上。迄今为止，自然界中种类众多的微生物已被发现具有锰氧化性能，这些锰氧化物广泛分布在自然环境中，其中陆地系统中的锰氧化菌主要存在于土壤、沉积物、水管、荒漠漆皮、洞穴、矿石中。淡水系统中的锰氧化菌主要存在于淡水温泉、河流、小溪、池塘、浅水湖中富含锰的表面膜、铁锰结核、淡水中的沉积物、海湾中的好氧/缺氧界面中。
细菌和真菌都被认为是重要的锰转化剂，可以氧化Mn2+生成Mn(III，IV)，并产生结晶不良的纳米级生物锰氧化物。目前，有关锰的微生物氧化多集中在细菌上，包括锰氧化细菌对污染环境中重金属的去除、锰氧化细菌氧化锰所形成产物的结构特征以及锰氧化细菌对锰氧化的机理等内容，如专利CN112094766A公开了一种锰氧化细菌，而有关锰氧化真菌对环境中锰氧化物转化的贡献及对无机物环境命运的影响知之甚少。然而，丝状真菌相比细菌，对环境中锰的氧化更有优势：(1) 真菌在宽pH范围内生长的能力；(2)真菌对高浓度有毒金属和有机污染物的抗性。从土壤、岩石表面、沉淀物、淤泥和淡水等环境中分离出许多能够氧化锰(II) 的真菌，包括吖啶属、链格孢属、枝孢属、锥孢属、弯孢属、青霉属等。锰氧化真菌研究较多的是支顶孢属(Acremonium sp.)和白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)。通过此类锰氧化真菌的生物吸附与氧化，可将水中的锰离子Mn(II) 形成生物锰氧化物，这些发现为生物除锰和吸附氧化水中污染物(如重金属、微量有机污染物)带来了崭新的思路，是一种新型的含锰废水生物处理方法，具有广阔的应用前景。在自然水质条件下，存在着营养缺乏和微生物的竞争作用，都会影响到菌株的存活和锰氧化活性。因此寻找能适应自然水质条件的锰氧化菌株的工作显得十分重要。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种锰氧化真菌及其应用，本发明的锰氧化真菌属于枝孢菌属，能够适应复杂自然水体并发挥锰氧化作用，具有很好的应用前景。
本发明所涉及的锰氧化真菌在温度(15-30℃)的范围，操作pH值(6.0-7.5)在中性范围，具有很高的Mn2+氧化效率。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种锰氧化真菌，该锰氧化真菌为枝孢菌Cladosporium sp.XM01，已于2020 年12月03日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 21083，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
本发明所述的锰氧化真菌来源于湖南湘潭锰矿附件的土壤，经驯化、分离、纯化得到。
将本发明XM01的ITS rRNA测序结果导入NCBI中的GenBank数据库中进行同源性比对，结果表明，最大形似菌株为枝孢菌(Cladosporium sp.)，相似度为 99％。所以能够判断该菌株属于枝孢菌，命名为Cladosporium sp.XM01。
本发明所述锰氧化真菌在15-30℃，pH 6.0-7.5，优选pH值为7，在Mn2+浓度不高于800μM的条件下能生长并且具有Mn2+氧化活性，Mn2+去除率达到99.9％，锰氧化率达到80％以上。
本发明所述锰氧化真菌在不灭菌的水体或固体基质中生存并发挥Mn2+氧化活性。
本发明所述的锰氧化真菌用于有毒金属元素或微量有机污染物的治理，去除水体或固体基质中的Mn2+，或用于制备微生物菌剂，或用于制备金属元素的吸附剂。其中，所述水体包括工业废水、生活废水、地下水及自来水，所述固体基质包括土壤、沉积物。
一种锰氧化真菌的基因序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种微生物菌剂，包含保藏号为CGMCC NO.21083的枝孢菌XM01菌株作为活性成分。
一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，包括下述步骤：将所述的锰氧化真菌或包含锰氧化真菌的微生物菌剂接种到所述水体或固体基质中，在15-30℃， pH6.0-7.5的条件下培养适当的时间，其中，所述水体包括工业废水、生活废水、地下水及自来水，所述固体基质包括土壤、沉积物。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)锰氧化成本较低：在整体的氧化过程中，采用传统的真菌PYG培养基即可达到菌种的高密度活化，且在后期的氧化过程中，微量的营养因子可达到较好的氧化效果，不需要复杂昂贵的药品或仪器设备。
(2)应用潜力巨大：该自主筛选的锰氧化菌株具有较高的氧化Mn2+能力，生成的高价态不溶性锰氧化物在催化氧化、降解和吸附水中污染物(如重金属、有机污染物)等方面具有较高的研究价值，可以考虑应用于水环境和土壤的治理和修复。
附图说明
图1为本发明枝孢菌XM01基于ITS rRNA基因发育树图；
图2为本发明枝孢菌XM01电泳图(DL2000条带分布：2000、1000、750、 500、250、100bp)；
图3为本发明枝孢菌XM01所生成的生物锰氧化物的扫描电镜图(2kX)及标记点对应的能谱分析图，其中，方框部分为标记点(b与c，其中b为标记1，c为标记2)；
图4为本发明枝孢菌XM01吸附与氧化Mn2+的特性(初始浓度为200μM)；
图5为本发明枝孢菌XM01在不同浓度锰下的Mn2+氧化曲线；
图6为本发明枝孢菌XM01在不同温度下的Mn2+氧化活性；
图7为本发明枝孢菌XM01在不同pH下的Mn2+氧化活性。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，其中所用的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
实施例1
锰氧化菌Cladosporium sp.XM01菌株的分离与纯化
Cladosporium sp.XM01是从湖南湘潭锰矿堆放锰矿的土壤中取样，经过驯化、分离及纯化得到。具体步骤如下：
(1)初筛：从湖南湘潭锰矿附近收集黑褐色土壤，在实验室中取2g土壤，加入到经过高温(115℃，25min)灭菌的HAY培养基(0.246g/L乙酸钠；0.15g/L 酵母粉；0.05g/L七水硫酸镁；5mg/L磷酸氢二钾；2mL/L矿物质盐，每升矿物质盐成分：3.7g二水氯化钙；0.44g七水硫酸锌；0.29g二水钼酸钠；2.5g硼酸；5mg 五水硫酸铜；1.0g六水氯化铁)中，使MnCl2含量为200μM，培养基中缓冲液为终浓度为20mM的HEPES，pH为7.0；其中MnCl2溶液和HEPES缓冲液采用0.22 μm滤膜过滤灭菌添加。在避光25℃，170rpm的摇床中驯化培养，每次驯化7天，驯化结束后取5mL驯化后的菌液添加到新制备的45mLHAY培养基中继续驯化，共驯化4次。
(2)复筛：驯化结束后，用灭菌自来水将菌液稀释10-1到10-7倍，各取0.1mL 稀释液于含100μM Mn2+的固体培养基(上述HAY液体培养基中加入2％琼脂而制得)上涂布分离，避光25℃下培养。长出明显菌落后，挑取在菌落上形成有棕色物质的单菌落，划线分离纯化。通过考察这些菌的生长速率及Mn2+氧化速率，确定一株锰氧化能力较强的菌株。
(3)Cladosporium sp.XM01菌株的液体培养条件：在250mL在250mL锥形瓶中加入150mL HAY培养基，并添加终浓度为20mM的pH 6.0-8.0的HEPES缓冲液，摇床设为15-30℃，170rpm。通过离心收集菌体，离心条件为3000-5000r/min， 10min。
实施例2
Cladosporium sp.XM01的分子生物学鉴定
使用真菌基因组试剂盒(购自Omega,Code no.D3390-02)提取枝孢菌XM01 采用真菌ITS rRNA基因通用引物ITS1(TCCGTAGGT GAACCTGCGG)和 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增。PCR反应体系为：
PCR扩增程序：
序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。测序得到的序列，如SEQ ID NO.1所示，在线使用BLAST和数据库里的序列比对，选取相似性大于97％的序列作为参比序列，使用Mega4.0软件采用Neighbor-Joining构建真菌系统发育树(如图1)。
实施例3
Cladosporium sp.XM01菌株扫描电镜(SEM)和能谱分析(EDX)
将分离得到的枝孢菌XM01接种到含Mn2+的HAY液体培养基中(接种量为 1×105分生孢子/mL)，于25℃，170rpm避光培养3d后收集生物锰氧化物，进行扫描电镜观察和能谱分析。扫描电镜结合能谱分析的结果如图3及表1所示，其中标记1为含有锰氧化物的聚集体，标记2为无锰氧化物的菌丝表面，在枝孢菌XM01 的菌体上标记1处能检测到较高的氧化锰含量，达30.81％，相比标记2处，锰的含量增大了25.68％。可见菌株XM01能在孢子外壁形成锰氧化物的聚集体，其可能通过分布于孢子外壁上的蛋白因子参与锰的氧化过程。
表1能谱分析结果
注：Ka指原子K层激发的能量。
实施例4
Cladosporium sp.XM01菌株对Mn2+的生物氧化特性研究
在添加Mn2+的HAY培养基中，考察本发明的锰氧化真菌(Cladosporium sp. XM01，保藏号：CGMCC NO.21083)对Mn2+的吸附氧化能力，发现本发明的真菌对Mn2+有很好的吸附氧化能力，能在较短时间内将基质中的可溶性Mn2+全部去除，大部分转化为不溶于水的锰氧化物。
具体步骤如下：
(1)本发明真菌在不同时间下锰吸附与氧化特性
将分离得到的枝孢菌XM01接种到含Mn2+浓度为200μM的HAY液体培养基中(接种量为1×105分生孢子/mL)，于25℃，170rpm避光培养3d。在间隔特定时间内取样，测定培养液中剩余Mn2+浓度，以及收集生物锰氧化物采用两步提取法测定锰氧化菌对Mn2+的吸附与氧化量。
培养液样品由0.45μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，5110系列)测定培养液中剩余Mn2+的浓度。
两步提取法：将培养基在3000r/min下离心10min，收集沉淀物(包括菌丝体和固相锰氧化物)后用去离子水洗涤，然后用20mM硫酸铜再悬浮16h提取胞外吸附的Mn2+，用去离子水洗涤后，采用细胞破碎法(工作3s，间歇2h，共15个声波周期)彻底破碎沉淀物中的细胞，然后采用细胞外吸附法对破碎样品进行处理，提取细胞内吸附的Mn2+，最后用50mM盐酸羟胺处理，提取氧化的Mn。用电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，5110系列)测定提取物中的锰浓度。
如图4所示，培养0-24h，该菌株对环境敏感，对锰的氧化能力较低，主要通过细胞外吸附作用去除Mn(II)。培养24-48h，菌株达到对数增长期，菌株数量迅速增加，有利于其吸附，48h时细胞吸附率为13.64％，然而，该菌株适应环境，具有氧化锰的能力。培养48-66h，吸附效率增长缓慢，在66h时细胞吸附率达到 21.18％，然而，培养72h溶液中Mn(II)基本去除，吸附量出现了降低，吸附率降低为18.63％，这可能是因为由于在对数阶段，由于其数量迅速增加，其吸附速率迅速增长。在稳定阶段，吸附量趋于稳定甚至下降，导致其吸附速率缓慢增长。培养24h后，Mn(II)氧化迅速增强，72h时锰氧化率达到81.18％。这一发现证明了它具有很高的锰氧化能力。在72h吸附量呈下降趋势，而氧化倾向于增加。这是吸附的锰氧化的结果。总之，锰氧化真菌Mn(II)氧化是可溶性Mn(II)的去除的主导作用。
现有文献：
1、Zhang Y,Tang YK,et al.A novel manganese oxidizing bacterium-Aeromonas hydrophila strain DS02:Mn(II)oxidization and biogenic Mn oxidesgeneration.Journal of Hazardous Materials,2019,367:539–545.
2、Tang WW,Gong JM,Wu LJ,et al.DGGE diversity of manganese minesamples and isolation of a Lysinibacillus sp.efficient in removal of high Mn(II)concentrations. Chemosphere,2016,165:277-283.
如表2所示，与上述现有文献报道的锰氧化菌相比，本专利的锰氧化真菌锰去除率为99.9％，锰氧化率达到81.18％，具有显著的优势。
表2不同锰氧化菌的锰去除和氧化效果比较
(2)本发明真菌在不同浓度Mn2+条件下的锰氧化特性
在添加Mn2+的HAY培养基中，考察本发明的锰氧化真菌(Cladosporium sp. XM01，保藏号：CGMCC NO.21083)对Mn2+的氧化能力。发现本发明的真菌对 Mn2+有很好的氧化能力，能在较短时间内将基质中的可溶性Mn2+全部去除，大部分转化为不溶于水的锰氧化物。由不同Mn2+初始浓度下的培养实验发现：本发明的真菌能完全去除800μM及更低浓度的Mn2 +，并且随着Mn2+初始浓度的提高，真菌的锰氧化活性会稍有延迟。具体步骤如下：
将分离得到的枝孢菌XM01接种到含不同Mn2+浓度的HAY液体培养基中(接种量为1×105分生孢子/mL)，于25℃，170rpm避光培养。在间隔特定时间内取样，经0.45μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，5110 系列)测定培养液中剩余Mn2+的浓度。
如图5所示，真菌对于800μM及更低浓度的Mn2+都能彻底去除，但随着Mn2+浓度的提高，真菌对Mn2+的氧化活性出现时间有所延迟，但是800μM的Mn2+浓度已经远远高于常见的河水或者地下水中的Mn2+浓度。说明本发明的真菌系能够彻底氧化常见水体中的浓度范围内的Mn2+。
(3)本发明的真菌在不同温度条件下的锰氧化特性
在不同培养温度下研究真菌的锰氧化特性，发现本发明的真菌在15-30℃均具有Mn2+氧化活性，从实际应用的角度看，选择20-30℃较为适宜。具体步骤如下：
将分离得到的枝孢菌XM01接种到含Mn2+浓度为200μM的HAY液体培养基中(接种量为1×105分生孢子/mL)，并以过滤的方式加入终浓度为200μM的Mn2+和20mM的pH＝7的HEPES缓冲液，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃的摇床中170rpm避光培养。在间隔特定时间内取样，经0.45μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，5110系列)测定培养液中剩余Mn2+的浓度。
如图6所示，随着培养温度的下降，真菌的锰氧化活性下降，15℃时氧化速度最慢，20℃时的速度稍快，25-30℃时速率最高。这说明真菌最适的氧化温度处于25-30℃。真菌能在15℃的低温下发挥锰氧化活性，显示出其对温度很强的适应性。
(4)本发明的真菌在不同pH条件下的锰氧化特性
由不同起始pH值条件的氧化实验，发现真菌最适锰氧化pH值为7，具体步骤如下：
将分离得到的枝孢菌XM01接种到含Mn2+浓度为200μM的HAY液体培养基中(接种量为1×105分生孢子/mL)，并以过滤的方式加入终浓度为200μM的Mn2+，再分别用MES缓冲液调节pH至6和6.5，用HEPES缓冲液调节pH至7.0，7.5，在25℃，170rpm的摇床中避光培养。在间隔特定时间内取样，经0.45μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，5110系列)测定培养液中剩余Mn2+的浓度。
如图7所示，在pH＝7时锰氧化速率最高，在pH 6.0-7.5之间，真菌能将Mn2+均能发生锰氧化，而这个pH范围与自然界中大多水体的pH值一致，表明该真菌在自然水体pH条件下能够发挥锰氧化活性。
综上，发明人研究发现，该枝孢菌XM01在pH6.0-7.5，15-30℃具有Mn2+氧化活性，在Mn2+浓度不高于800μM的条件下具有Mn2+氧化活性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 同济大学
<120> 一种锰氧化真菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 557
<212> DNA
<213> 枝孢菌(Cladosporium sp.XM01)
<400> 1
ttccgttggg ggggcctgcg gagggatcat tacaagttga ccccggccct cgggccggga 60
tgttcacaac cctttgttgt ccgactctgt tgcctccggg gcgaccctgc ctccgggcgg 120
gggccccggg tggacatttc aaactcttgc gtaactttgc agtctgagta aatttaatta 180
ataaattaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga 240
aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat 300
tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgttcgagcg tcatttcacc actcaagcct 360
cgcttggtat tgggcgacgc ggtccgccgc gcgcctcaaa tcgaccggct gggtctttcg 420
tcccctcagc gttgtggaaa ctattcgcta aagggtgccg cgggaggcca cgccgtaaaa 480
caaccccatt tctaaggttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata 540
tcaaaaggcc ggaggaa 557
Claims (6)
1.一种锰氧化真菌，其特征在于，该锰氧化真菌为枝孢菌（Cladosporium sp.）XM01，已于2020年12月03日保藏，保藏编号为CGMCC NO. 21083。
2.如权利要求1所述的一种锰氧化真菌的应用，其特征在于，所述的锰氧化真菌用于去除水体或固体基质中的Mn2+。
3.根据权利要求2所述的一种锰氧化真菌的应用，其特征在于，所述水体包括工业废水、生活废水、地下水及自来水，所述固体基质包括土壤、沉积物。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含保藏号为CGMCC NO. 21083的枝孢菌XM01菌株作为活性成分。
5.一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，其特征在于，包括下述步骤：
将权利要求1所述的锰氧化真菌或包含权利要求1的锰氧化真菌的微生物菌剂接种到水体或固体基质中，在15-30℃，pH6.0-7.5的条件下培养适当的时间。
6.根据权利要求5所述的一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，其特征在于，所述水体包括工业废水、生活废水、地下水及自来水，所述固体基质包括土壤、沉积物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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