CN104293817A - 生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种在高产琥珀酸同时又能大大降低生产成本的基因工程菌DYCMG111。本申请还公开了上述重组质粒和基因工程菌的制备方法。本申请同时公开了上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。使用本发明的重组质粒构建出来的基因工程菌DYCMG111的稳定性高，相比原始菌DC1515，生长速率提高，在加入不同浓度的IPTG诱导剂时，在双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大的提高。

Description

生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种用于生产丁二酸的重组质粒和一种高产丁二酸的基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备发酵生物质生产丁二酸的生物产品中的用途。

背景技术

能源和环保是当今世界面临的重要问题。丁二酸作为一种生物基化学品，是最好的石油替代品之一。

丁二酸(IUPAC succinic acid，中文又名琥珀酸)是一种四碳二羧酸，化学式为HOOC-CH₂-CH₂-COOH。主要作为有机合成的原料，生产如丁二酸酐、丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等化工产品；随着催化工艺的发展，丁二酸还可转化为醇酸树脂、油漆、食品调味剂等精细化工产品和医药产品如磺胺药、维生素A、维生素B、抗痉挛剂等。目前全世界市场需求超过2.76×10⁵t/a，且以每年6％-10％的速度增长。

目前，大部分工业用丁二酸是以石油为原料通过化学方法来合成，如丁烯二酸催化加氢、氯乙酸甲酯的氰化水解以及石蜡氧化法等，c成本高，且造成环境污染。随着人们可持续发展意识和环保意识的提高，发酵法生产丁二酸进入了人们的视线，引起了研究热潮。一旦实现了丁二酸发酵大规模生产，便可以减少石油资源的使用和石化法带来的严重污染。丁二酸发酵消耗1mol葡萄糖的同时固定1mol CO₂，消耗了温室效应气体，因此，发酵法生产的丁二酸是一种很好的绿色平台化学品。然而，采用一般厌氧瘤胃菌株发酵丁二酸难度大，底物转换率低，产品价格偏高。因此，迫切需找或构建能代谢廉价碳源，发酵条件简单，底物利用率高，丁二酸高产的新菌株。

与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，丁二酸发酵研究起步较晚，文献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括产丁二酸厌氧螺菌、产丁二酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、丁二酸等。但是，丁二酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化碳水平下，产丁二酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产丁二酸放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高CO₂浓度的条件下进行发酵才以丁二酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌株本身有多条产丁二酸途径，具有代谢灵活，易于改造的特性。对大肠杆菌丁二酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸发酵中，丁二酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该途径产生1mol的丁二酸伴随着1mol CO₂的固定。该途径的关键反应是将三碳中间物：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为四碳化合物草酰乙酸。草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合成酶生成富马酸，最后由富马酸裂解酶生成丁二酸。

在大肠杆菌发酵葡糖的过程中，有机酸逐渐积累，导致环境的pH值逐渐降低。为了控制细菌生长环境的pH值，需要在发酵液中添加大量的碱中和剂，目前研究的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖产丁二酸的过程中，用到的碱性中和剂有NaOH，Na₂CO₃，NaHCO₃，Mg(OH)₂，MgCO₃。经过研究，我们发现不同的碱性中和剂对细胞的生长和丁二酸产量有显著影响，见表1。

碱中和剂	细胞干重	葡萄糖利用率(％)	丁二酸产量(％)
				NaOH	3.62g/L	66.6	53.5
Na2CO3	4.05g/L	89.6	49.8
				NaHCO3	3.87g/L	98.2	59.7
Mg(OH)2	4.18g/L	98.5	53.3
				MgCO3	5.36g/L	99.4	71.2

表1不同碱中和剂对大肠杆菌生长代谢以及产丁二酸的影响

由表中数据可以得到，以MgCO₃作为碱中和剂得到的细胞干重，葡萄糖利用率和丁二酸产量均为最高。分析原因有二，第一，以上碱中和剂中，金属阳离子有两个，Na⁺和Mg²⁺。在对大肠杆菌代谢的研究中发现，Mg²⁺离子可以作为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)代谢生成草酰乙酸过程中的PEP羧化酶的辅因子，而这一步代谢是大肠杆菌生成丁二酸的关键步骤。在大肠杆菌的代谢过程中，Na⁺对跨膜pH梯度，细胞渗透压有重要影响，且掌管着细胞内的pH值。高的Na⁺离子浓度会导致细胞渗透过高而影响大肠杆菌的生长和代谢，所以在作为碱性中和剂时，Mg(OH)₂比NaOH的效果好，MgCO₃比Na₂CO₃的效果好。第二，以上碱中和剂中，阴离子有CO₃ ^2-，OH^-，HCO₃ ^-，在相同浓度下，OH^-的pH更大，也就是说在相同阳离子作为碱性中和剂的时候，RCO₃比R(OH)₂为细菌生长环境提供更多的R²⁺，因此MgCO₃比Mg(OH)₂提供更多的Mg²⁺，而Mg²⁺是对大肠杆菌生长代谢和产丁二酸都有好处的，因此MgCO₃比Mg(OH)₂作为碱性中和剂的效果好。

MgtA基因是大肠杆菌基因组中的一个基因，可表达镁离子转运蛋白，其作用是运输细胞外Mg²⁺离子到细胞内。但是MgtA基因的表达受体外Mg²⁺浓度影响，在Mg²⁺浓度很低时，MgtA基因几乎不表达。即使体外培养液中Mg²⁺浓度较高，Mg²⁺转运效率也受到细胞自身MgtA基因的严紧调控，镁离子转运蛋白表达有限。在高效丁二酸生产菌株中，细胞丁二酸代谢途径关键酶均需要高浓度的Mg²⁺，这就造成了由于转运蛋白不足造成的体内Mg²⁺浓度不足，细胞关键酶酶活提高受限，丁二酸生产能力受到严重影响。这也正是MgCO₃比Mg(OH)₂作为碱性中和剂可达到高产丁二酸的根本原因。说明在改造大肠杆菌生产丁二酸时MgtA基因的高表达可能发挥更好的功效。

经过市场调查发现，作为碱性中和剂的MgCO₃是4200元到5000元每吨，而Mg(OH)₂的价格是3900元每吨，NaOH的价格是2500元每吨。如果MgtA基因能在大肠杆菌内高表达，可以将NaOH和Mg(OH)₂的混合物作为碱中和剂来保证丁二酸的高效生产。在确保pH值达到作为碱中和剂的要求的同时，Na⁺离子的含量不至于达到造成大肠杆菌细胞渗透压过高而影响大肠杆菌生长代谢产丁二酸，而Mg²⁺离子浓度虽然减少，但MgtA基因的高表达弥补了运输到细胞内的Mg²⁺离子的减少。这就大大减少了大肠杆菌工程菌产丁二酸的成本，并且提高了大肠杆菌工程菌产丁二酸的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产丁二酸，并降低生产成本的重组质粒和一种高产丁二酸的基因工程菌。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌在发酵生产丁二酸的生物产品中的用途。

为了充分利用大肠杆菌本身具有的多条丁二酸代谢途径的优势，同时发挥目的基因MgtA提高Mg²⁺利用率从而提高大肠杆菌代谢流更多流向丁二酸的优势，本发明旨在提高本实验室保存的大肠杆菌DC1515的丁二酸产量。DC1515是将野生型大肠杆菌乳酸脱氢酶，丙酮酸甲酸裂解酶，葡萄糖转运蛋白敲除的菌株，可发酵1mol葡萄糖产0.96mol丁二酸。本发明提供的重组大肠杆菌DYCMG111，是含有一定拷贝数的携带完整的MgtA基因重组质粒的基因工程菌株DC1515。

综上，本发明的基本技术构思是：将MgtA基因克隆到质粒载体pTrchisA上，再将重组后的质粒转入工程菌DC1515中，通过MgtA基因的过量表达提高大肠杆菌DC1515吸收Mg⁺离子的能力来达到提高丁二酸产量的目的。

针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒是携带有MgtA基因的pMD19-T载体(pMD-mgtA1)。

优选地，该重组质粒携带完整的包括MgtA基因上下游68个碱基在内的片段。

另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是携带有MgtA基因的pMD19-T载体(pMD-mgtA2)。

优选地，该重组质粒是携带完整的包括MgtA基因编码序列的pMD19-T载体。

另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是通过将前述的重组质粒pMD-mgtA2与大肠杆菌质粒pTrchisA分别用BamHI和HindIII双切酶。将切下的MgtA基因片段链接的到质粒pTrchisA中而得到的(pTrc-mgtA)。

优选地，所述重组质粒是携带有一定拷贝数的完整的MgtA基因的pTrc-mgtA(+)载体。I

另一方面，本发明提供一种丁二酸高产基因工程菌，所述工程菌是通过将前述的pTrc-mgtA重组质粒转入到原始菌株大肠杆菌DC1515中而得到的。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-mgtA1的构建方法，所述方法包括：

首先设计引物：mgtA up：-5′GGAGGGACTCCTTATGTTTAA3′-，mgtAdown：-5′GCTATCGTGCCCAGTTTAT3′-：

以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个2765bp的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，用于构建所述的重组质粒pMD-mgtA1，2765bp中包括MgtA基因上游13个碱基和下游55个碱基在内的序列；

经测序证实其包含具体序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的MgtA基因片段(2697bp)；

纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到所述重组质粒。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-mgtA2的构建方法，所述方法包括：

利用设计的引物：pTrchisA-mgtA up：-5′CGATTCGGATCCCTCCTT3′-，划线处为BamHI酶切位点；pTrchisA-mgtA down：-5′CGTACCCGGAAGCTTTCTAGAGA3-′，划线处为HindIII酶切位点：以质粒pMD-mg1为模板，进行PCR扩增，得到一个约为2759bp的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，其中MgtA基因片段序列为2697bp，用于构建所述的重组质粒pMD-mgtA2和下述的重组质粒pTrc-mgtA，经测序证实为MgtA基因的编码序列，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-mgtA2。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pTrc-mgtA的构建方法，所述方法包括：将前述方法得到的质粒pMD-mgtA2与大肠杆菌质粒pTrchisA分别用BamHI和HindIII双切酶，将MgtA的基因片段插入质粒pTrchisA的酶切位点，构建所述的重组质粒pTrc-mgtA。

另一方面，本发明提供一种所述的高产丁二酸基因工程菌的制备方法，将前述重组质粒pTrc-mgtA转入大肠杆菌DC1515中，即得到所述基因工程菌DYCMG111。

另一方面，本发明提供一种能降低用发酵法产丁二酸的生产成本的重组质粒pTrc-mgtA。

本发明产生如下的技术效果：

本发明的菌株和质粒能够在不影响原始工程菌DC1515丁二酸产量的同时，将常用的碱性中和剂MgCO₃改用为Mg(OH)₂与NaOH的混合物，大大降低了工程菌产丁二酸的成本；在不改变碱性中和剂的条件下，所发明的重组基因工程菌的丁二酸产量更高。

实验结果对比证明，构建的工程菌在利用Mg(OH)₂与NaOH的混合物作为碱中和剂时的丁二酸产量与原始菌株DC1515在利用MgCO₃作为碱中和剂时的丁二酸产量相当，甚至更高；而原始菌在利用Mg(OH)₂与NaOH的混合物作为碱中和剂时的丁二酸产量偏低。表明这株工程菌DYCMG111存在一定的工业应用。

附图说明

图1质粒pTrc-mgtA的构建过程示意图；

图2pTrc-mgtA用BamHI单酶切(左)和pTrc-mgtA用BamHI和HindIII双酶切(右)凝胶电泳图；

图3DC1515与DYCMG111的生长曲线对比图；

图4DYCMG111在不同浓度IPTG诱导下的琥珀酸产量图；

图5在以不同浓度MgCO₃作为碱中和剂DC1515与DYCMG111的琥珀酸产量对比图；

图6以不同浓度Mg(OH)₂与NaOH的混合物作为碱中和剂DC1515与DYCMG111的琥珀酸产量对比图；

图7DYCMG111在双料阶段补料发酵琥珀酸产量和葡萄糖残余量曲线图。

具体实施方法

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施方式中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。大肠杆菌DC1515是敲除葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)、乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflA)基因的菌株，具有发酵生产丁二酸的潜力，由美国南伊利诺伊州大学P.Clark教授惠赠。

一、配制培养基

LB培养基成分为含有5g/L酵母粉，10g/L胰蛋白胨和10g/L NaCl。固体培养基为液体基中加入1.5％的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素的使用浓度0.1mg/mL。

二、利用试剂盒提取大肠杆菌DNA基因组

取大肠杆菌DC1515的培养物1-5mL，按照细菌DNA提取试剂盒说明书对大肠杆菌DC1515的DNA组进行提取。所用试剂盒为康为世纪公司所提供的细菌基因组DNA提取试剂盒(6次装)。

三、重组质粒pMD-mgtA1的构建

1)用PCR法获取目的基因MgtA，PCR反应体系如下：

10×Buffer	5μl
		dNTP(2.5mM)	4μl
Sense Primer(10μm)	5μl
		Antisense Primer(10μm)	5μl
Taq酶	0.3μl
		大肠杆菌DNA组模板	0.5μl
ddH2O	30.2μl
		总体积	50μl

2)切胶回收纯化目的基因MgtA

3)将目的基因MgtA连接到pMD19-T载体，体系如下：

16℃反应180分钟，全量(6μl)加入到60μl的DH5α感受态细胞。

4)通过蓝白斑法筛选出具有pMD-mgtA1重组质粒的DH5α大肠杆菌；

5)对筛选出的具有pMD-mgtA1重组质粒的DH5α大肠杆菌进行质粒提取(本步由购于TaKaRa公司的质粒提取试剂盒来完成)，获得重组质粒pMD-mg1。

四、重组质粒pMD-mgtA2的酶切分析

用质粒提取试剂盒来提取质粒pMD-mgtA2。

取2μl质粒DNA，用BamHI和HindIII双切酶。混合均匀，稍稍离心使溶液聚集到管底。37℃，反应2小时。酶切反应体系如下：

酶切完成后上样电泳检测，电泳见图2。

五、重组质粒pTrc-mgtA的构建

pTrchisA质粒的酶切体系按如下配比组成：

酶切反应37℃进行3小时后，电泳检测酶切程度。用DNA回收试剂盒回收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP(浓度0.01U/μl)进行末端去磷酸化。反应按如下配比组成：

以上成分混合后在37℃反应30分钟后，再加入0.01U/μl的CIAP5μl，继续在30℃反应30分钟后加入300μl的反应终止液。反应终止液的成分是10mmol/L Tris-HCl(pH＝7.5)，1mmol/L EDTA(pH＝7.5)，200mmol/L NaCl，0.5％SDS。然后用酚：氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷pTrc-mgtA质粒。

用质粒提取试剂盒提取pMD-mgtA2重组质粒，BamHI和HindIII双酶切，反应体系如下：

酶切反应在37℃进行3小时后，凝胶电泳并回收约为2800bp的条带，此即为MgtA插入片段。该片段与处理好的pTrchisA载体按如下方法混合后进行连接反应。

连接反应在16℃进行4小时后用于转化。

六、DNA连接产物的转化反应与阳性克隆的筛选

感受态细胞用CaCl₂法制备。选取大肠杆菌DC1515制成感受态细胞，用热击法进行转化反应，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后加入800μl的LB培养基，37℃活化45分钟后涂于含100μl/ml氨苄的LB平板上37℃过夜培养。挑取单菌落培养后碱液裂解法小量提取质粒，用BamHI和HindIII双酶切分析，其结果如图2所示。表明用DC1515为宿主菌得到了阳性克隆。克隆所选用的方法是双酶切，这样克隆方向确定，保证了克隆基因的读码框方向正确。

七、重组菌的生长特征及稳定性分析

原始菌DC1515不具有氨苄抗性，但是载体质粒pTrc-mgtA上有抗氨苄的基因。因此本工程菌DYCMG111如果能在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上生长，就说明重组质粒pTrc-mgtA已经转入到原始工程菌DC1515中。将本工程菌DYCMG111接种于不含任何抗生素的平板上培养，挑取30个这样的菌落接种于含有100μg/ml的氨苄的平板上，不能在该平板上生长的菌株说明重组质粒pTrc-mgtA没有转入其中。经过24h的培养，平板上长出了28个菌落，说明该菌株在没有任何选择性压力的条件下仍十分稳定，高达90％以上。

八、重组菌DYCMG111的生长速率

在含有氨苄(浓度为100μg/ml)的平板上挑取DYCMG111单菌落，接入到20ml的并且加有氨苄1mg的LB培养基中。30℃，150转/分钟培养，12h后，按1％的接种量接入500ml并且加有氨苄25mg的LB培养基，30℃，150转/分钟培养，培养1.5h后加入IPTG0.2mM。同时设立相同培养条件下的原始工程菌DC1515作为对照。每隔1h分别取样，测定菌株DC1515和菌株DYCMG111的OD值，见图3。可以看出在加入IPTG6h后，重组菌体DYCMG111的生长速率开始加快了，并且指数生长末期的生物量与DC1515比较有所增长，可能是重组菌DYCMG111的Mg²⁺吸收速率的增加，使PEP更好地转化成草酰乙酸的同时，也使得菌体代谢加快，从而促进了生物量的积累加快。当然，当加入IPTG诱导后的4h内，因为菌体要过量表达MgtA基因所表达的蛋白，导致了菌体的生长速率有所下降。

九、工程菌DYCMG111在不同浓度的IPTG下的琥珀酸产量

为了找出工程菌DYCMG111产琥珀酸最适的IPTG浓度，先以15g/L浓度的MgCO₃为碱中和剂，在不同浓度的IPTG下测工程菌DYCMG111的琥珀酸产量。当菌体生长OD值为0.3时，加入IPTG诱导剂，使诱导物的终浓度为0.1mM-2mM。此时的培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为60g/L。完全厌氧的条件下发酵40小时，采用HPLC的方法检测最终琥珀酸的产量。图4显示的是分别用0.1mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mM IPTG诱导DYCMG111发酵40h的琥珀酸产量，由该图得到最适的IPTG浓度为1mM，因此接下来的实验IPTG浓度均是在1mM浓度下进行的。

十、工程菌DYCMG111与工程菌DC1515分别利用不同浓度的MgCO₃碱中和剂时的琥珀酸产量

当工程菌DYCMG111与出发菌DC1515生长OD值为0.3时，加入1mMIPTG诱导剂。此时培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为60g/L，MgCO₃浓度由0-50g/L变化。完全厌氧条件下发酵70h，采用HPLC的方法检测最终琥珀酸的产量。图5所示为分别用10g/L，20g/L，25g/L，30g/L，40g/L，50g/L MgCO₃作为碱中和剂厌氧发酵40小时工程菌DYCMG111与工程菌DC1515的琥珀酸产量。由图5得，工程菌DC1515与工程菌DYCMG111相比，在用碳酸镁为碱中和剂的情况下，DYCMG111的琥珀酸产量比DC1515的高12.3％，且都是在MgCO₃的浓度为23g/L时，琥珀酸产量最高，分别为83.2g/L，73.1g/L。

十一、工程菌DYCMG111与工程菌DC1515分别利用不同浓度的Mg(OH)₂与NaOH的混合物作为碱中和剂时的丁二酸产量

当工程菌DYCMG111与工程菌DC1515生长OD值为0.3时，加入1mMIPTG诱导剂，。此时培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为60g/L，Mg(OH)₂和NaOH的质量比始终为1∶1(最佳比例由实验所得)，混合碱中和剂的浓度由0-30g/L变化。完全厌氧条件下发酵70h，采用HPLC的方法检测最终琥珀酸的产量。图6显示的分别用5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L Mg(OH)₂与NaOH的混合物(质量比始终为1∶1)作为碱中和剂厌氧发酵40小时工程菌DYCMG111与工程菌DC1515的琥珀酸产量。由图6，工程菌DC1515与工程菌DYCMG111在混合碱中和剂浓度为16g/L时，琥珀酸产量最高，分别为63.4g/L，81.6g/L。工程菌DC1515的琥珀酸产量比以上所有组实验的琥珀酸产量都要低，而工程菌DYCMG111的琥珀酸产量与在以MgCO₃为碱中和剂时DYCMG111的琥珀酸产量相当。实验现象说明DC1515工程菌在不含有MgtA基因的情况下对Mg²⁺离子的吸收明显不如工程菌DYCMG111，因此在以Mg(OH)₂和NaOH的混合物作为碱中和剂时，由于细胞质外Mg²⁺含量低，不能高产琥珀酸，更不能减低成本。从而更进一步说明了本发明中工程菌DYCMG111能在提高琥珀酸产量的基础上较少成本。

十二、工程菌DYCMG111在最适条件下双阶段培养并补料流加时琥珀酸产量

在加有4L发酵液的6L Bioflo II发酵罐中进行补料发酵。加入100mL培养6h的种子培养基到发酵罐内，双阶段发酵都需要加入IPTG至终浓度为1mM，种子培养基为LB培养基。厌氧发酵培养基为LB培养基，并向LB发酵培养基中加入葡萄糖，初始浓度为70g/L，另外加无机盐K₂HPO43.0g/L，KH₂PO₄1.0g/L，(NH4)₂SO₄1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，调pH为7.5。在厌氧发酵过程中，定时检测发酵液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低至5g/L时，补加葡萄糖保持葡萄糖浓度为5g/L。种子培养和发酵阶段间或加入氨苄，以防止质粒pTrc-mgtA丢失。图7显示的是发酵40h内每隔3h检测琥珀酸和葡萄糖浓度的变化。至发酵终点，琥珀酸浓度达到81.6g/L。

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的MgtA基因及其上下游68个碱基在内的片段；优选地，该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA片段的pMD19-T载体。 

2.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA片段的pMD19-T载体，是以权利要求1所述的质粒为模板扩增得到的。 

3.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是通过权利要求2的重组质粒与pTrchisA质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，将切下的序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段连接到质粒pTrchisA中而得到的。 

4.一株琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111，其特征在于：所述工程菌是通过将权利要求3所述的重组质粒转入起始菌DC1515中而得到的。 

5.权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计引物：mgtA up：-5′GGAGGGACTCCTTATGTTTAA3′-，mgtA down：-5′GCTATCGTGCCCAGTTTAT3′-；以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个2765bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQ ID NO：1的DNA片段。纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-mgtA1。 

6.权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用设计的引物pTrchisA-mgtA up：-5′CGATTCGGATCCCTCCTT3′-，划线处为BamHI酶切位点；pTrchisA-mgtA down：-5′CGTACCCGGAAGCTTTCTAGAGA3-′，划线处为HindIII酶切位点；以权利要求5的方法得到的质粒为模板，进行PCR扩增，得到序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段，经测序证实为MgtA基因的编码序列，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-mgtA2。 

7.权利要求3的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将权 力要求6的方法得到的质粒与pTrchisA质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，将序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段插入质粒pTrchisA的酶切位点处，构建出所述重组质粒。 

8.权利要求4的琥珀酸高产、低成本基因工程菌的制备方法，其特征在于：权利要求3的重组质粒转入到起始菌DC1515中，得到所述的基因工程菌DYCMG111。 

9.权利要求3中的重组质粒或权利要求4的基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。 

10.使用权利要求4的基因工程菌来发酵葡萄糖来生产琥珀酸的方法，其特征在于：所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂时，在双阶段发酵而生产琥珀酸。