CN103898035B - 生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明首要目的公开了一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株（Escherichiacoli）AHB-36，其保藏编号为CCTCCM2013629，所述的重组大肠杆菌菌株缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因，且含有天冬氨酸-1-脱羧酶基因；本发明的另外一个目的是提供一种上述重组大肠杆菌菌株的构建方法，本发明构建的重组大肠杆菌菌株敲除了天冬氨酸氨基裂解酶基因，阻止了大肠杆菌把天冬氨酸裂解为富马酸，使得天冬氨酸全部用于β-丙氨酸的生产，同时该重组大肠杆菌菌株中表达天冬氨酸-1-脱羧酶，可进一步提高β-丙氨酸的收率。

Description

生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株及其构建方法和应用。

背景技术

β-丙氨酸在医药和食品技术领域都有广泛的应用，其主要用于合成泛酸、泛酸钙，以及食品的营养添加剂，国内外有关β-丙氨酸的生产，基本上以化学合成为主，如丙烯酸法、丙烯腈法等，这些化学合成法大多需要强碱强酸、高温高压等条件，而且产物纯化繁琐，对环境造成污染，特别是采用含腈的原料进行合成，对环境及生物体都会造成损害，因此积极寻求绿色、环保的β-丙氨酸的生产方法具有十分重要的经济效益和社会效益。

中国杂志《氨基酸和生物资源》2005年第27卷第1期第52-55页中公开了一种名称为“β-氨基丙酸的合成与应用”的期刊论文（β-丙氨酸又名β-氨基丙酸），其中介绍到及川利洋等人利用产有机腈降解酶的微生物催化β-氨基丙腈水解合成β-丙氨酸，得到的β-丙氨酸产物浓度达47mmol/L（约为4.2g/L），田脇新一郎等人利用微生物转化β-氨基丙醇合成β-丙氨酸，得到的产物浓度达4g/L，但是上述生物法生产β-丙氨酸的产量较低，难以达到工业化生产的要求。根据催化反应原理，天冬氨酸-1-脱羧酶可以催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸，采用该方法的制备工艺为一步法反应，工艺简单，且副产物少，对环境污染小。

发明内容

本发明的首要目的提供一种生产β-丙氨酸的生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株（Escherichiacoli）AHB-36，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCM2013629（地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072），保藏日期为2013年12月4日，所述的重组大肠杆菌菌株缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因，且含有天冬氨酸-1-脱羧酶基因，天冬氨酸-1-脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的另外一个目的是提供一种上述重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因；

2）筛选缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的阳性克隆，该阳性克隆命名为菌株I；

3）双酶切质粒pET24a（+）以及谷氨酸棒杆菌的PanD基因，用T4连接酶将酶切产物pET24a（+）和PanD的DNA片段进行连接，得到重组质粒pET24a-PanD。

4）通过热激法将重组质粒pET24a-PanD转入菌株I中，即得用于生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株。

本发明敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因，使得天冬氨酸氨基裂解酶的活性缺失，从而避免天冬氨酸通过其他途径代谢，这样天冬氨酸即可全部用于发酵转化得到β-丙氨酸，有效提高β-丙氨酸的产率。简单的说，基因敲除是指将基因组中的目标基因删除或者破坏，而本发明敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的方法是破坏目标基因，即在大肠杆菌的基因组中插入一段外源基因，使得大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶的活性丧失，从而实现天冬氨酸氨基裂解酶基因的敲除，本发明具体敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的步骤为：

a）以pIJ773质粒的DNA为PCR扩增模板扩增Apr基因，PCR扩增Apr基因所用的引物aspA-KO-U、aspA-KO-D的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；

b）通过电转化法将PCR扩增产物转至带有pKD46质粒的大肠杆菌中，即得敲除天冬氨酸氨基裂解酶基因的大肠杆菌；所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s、50℃退火45s、72℃延伸90s，10个循环；94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s，15个循环；72℃延伸10min，1个循环，所述的pKD46质粒主要用于原核生物的基因敲除，携带该质粒的菌株通过PCR产物转化来进行基因敲除时效率较高。

筛选缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的大肠杆菌的方法为采用两对引物对转化子进行PCR验证，第一对引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，第二对引物aspA-2-F、aspA-2-R的核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。

本发明的最后一个目的是提供一种上述重组大肠杆菌菌株在生产β-丙氨酸中的应用，具体的，重组大肠杆菌菌株发酵催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸。

本发明构建的重组大肠杆菌菌株敲除了天冬氨酸氨基裂解酶基因，阻止了大肠杆菌把天冬氨酸裂解为富马酸，使得天冬氨酸全部用于β-丙氨酸的生产，同时该重组大肠杆菌菌株中表达天冬氨酸-1-脱羧酶，进一步提高β-丙氨酸的产率，β-丙氨酸的生产过程采用常温常压操作，生产的原料及产物均无有害有毒物质，采用本发明构建的重组大肠杆菌菌株用于β-丙氨酸的生产过程不断流加L-天冬氨酸，使得β-丙氨酸浓度逐渐积累，反应结束后只需要经过简单的过膜除菌体，脱色，结晶，重结晶就可以得到精制品，采用本发明构建的重组大肠杆菌菌株进行生物酶法转化L-天冬氨酸以生产β-丙氨酸，转化率达到90%以上，产品纯度达99%以上，适合大规模的工业化生产。

附图说明

图1是酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是pIJ773质粒的图谱；

图3是pKD46质粒的图谱；

图4时pET24a-PanD重组质粒的图谱；

具体实施方式

以下结合实施例1～5对本发明公开的技术方案作进一步的说明：

实施例1

缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的大肠杆菌菌株的构建及鉴定：

1）扩增Apr基因：以pIJ773质粒的DNA为PCR扩增模板扩增Apr基因（pIJ773质粒购自合肥百迈生物技术有限公司），所述的Apr基因也就是氨苄青霉素抗性基因，PCR扩增Apr基因所用的引物aspA-KO-U、aspA-KO-D的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，PCR扩增体系为：DNA模板20ng，引物（10uM）1ul，蒸馏水40ul；PCR扩增条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s、50℃退火45s、72℃延伸90s，10个循环；94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s，15个循环；72℃延伸10min，1个循环。

2）获取DNA片段：消化步骤1得到的PCR产物，即消化从pIJ773质粒的DNA中扩增出的Apr基因，从而除去pIJ773质粒以获取待转化的DNA片段，消化体系为：Tangobuffe5μl，PCR产物45μl，DpnI酶1μl；消化条件为：在37℃条件下保温1h，将获取的消化产物进行琼脂糖凝胶电泳跑胶，收回胶段，用冷冻干燥机把收回的胶段浓缩到2μl左右。

3）转化DNA片段：将pKD46质粒通过电转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)（pKD46质粒和大肠杆菌BL21(DE3)购自合肥百迈生物技术有限公司），制作大肠杆菌BL21(DE3)-pKD46的感受态细胞，然后将步骤2的浓缩产物用PCR纯化试剂盒清洗（PCR纯化试剂盒购自合肥百迈生物技术有限公司，英文名称为EasyPurePCRPurificationKit），取30ng清洗纯化后的产物，加入2ulligationBuffer(购自NEB公司)，1ulT4连接酶，在室温下反应1h，然后取5ul加入50ul的BL21(DE3)-pKD46的感受态细胞中，先冰浴20min，然后在42℃条件下热激30S后立即置于冰上2min，加入250ul的LB平板培养基，200转，37℃孵育1h，取200ul菌液涂布在含有25mg/L卡那霉素的LB平板上。

4）菌株的鉴定：待转化子长出后，挑取转化子用第一对引物aspA-1-F和aspA-1-R进行验证，经PCR验证为正确转化子，正确转化子片段长度为877bp；挑取转化子用第二对验证引物spA-2-F和aspA-2-R进行验证，经PCR验证为正确转化子，正确转化子片段长度为1411bp，验证菌株所用的第一对引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，第二对引物aspA-2-F、aspA-2-R的核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示，PCR验证的扩增体系为：10×buffer（含Mg2+）5ul；dNTP（2.5mMeachdNTP）2ul；引物1（10uM）1ul；引物2（10uM）1ul；DNA模板2ul；Taq0.5ul；ddH₂O38.5ul；PCR验证的扩增条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，1个循环；挑取PCR验证后的单菌落培养，加入天冬氨酸溶液，在37℃、pH值为7.0的条件下培养12h后，天冬氨酸浓度保持稳定，说明挑选得到的菌株I是目标菌株，将筛选得到的菌株I命名为BL21(DE3)ΔaspA。

实施例2

本发明的重组大肠杆菌菌株的构建及鉴定：

1）重组大肠杆菌菌株的构建：

第一步，用NdeI和HindIII双酶切谷氨酸棒杆菌的PanD基因，得到PanD基因的DNA片段，所述的PanD基因也就是谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸-1-脱羧酶基因，用NdeI和HindIII双酶切质粒pET24a(+)（Novagen公司产品），所述质粒pET24a(+)大小为5.31kb，其含有卡那霉素抗性基因和乳糖抑制子lacI基因，启动子是T7lac，并具有多个限制性内切酶位点，所述的酶切体系为：DNA43μl，bufferR5μl，HindIII1μl，NdeI1μl；酶切条件为：在37℃保温3h，如附图3所示是酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，琼脂糖凝胶的浓度为1.0%，其中1～3泳道是NdeI和HindIII双酶切质粒pET24a(+)后的DNA片段，M泳道是DNA分子量标签，由下至上分子量依次为：0.25kb，0.50kb，0.75kb，1.0kb，1.5kb，2.0kb，2.5kb，3.0kb，3.5kb，4.0kb，5.0kb，6.0kb，10.0kb，从图中可以看出经琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定，酶切产物确定含有目的DNA片段；

第二步，回收酶切的DNA片段胶，用T4连接酶连接PanD基因和质粒pET24a(+)的DNA片段，连接体系为：PanD7.5μl，质粒pET24a(+)1.5μl，buffer1μl，T4连接酶1μl，连接条件为：在16℃条件下保温过夜；

第三步，取5ul的连接产物加入到菌株BL21(DE3)ΔaspA的感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激30S，立即置于冰上2min，涂布到LB平板培养基上，所述LB平板培养基上含有1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化钠、1.5%琼脂粉，以及50μg/ml卡那霉素。

2）重组大肠杆菌菌株的鉴定：在37℃条件下LB平板培养基上生长出转化子，挑取单菌落，用LB液体培养基将单菌落在37℃条件下培养过夜，离心1min，离心速度为12000rpm/min，提取质粒，提取方法按照质粒提取试剂盒（购自南京生兴生物技术公司）的说明书操作。

实施例3

本发明的重组肠杆菌菌株的发酵及酶活测定：

1）重组肠杆菌菌株的发酵：

第一步，配种子液和发酵液，种子液培养基组成为：蛋白胨1%～1.5%，酵母提取物2%～2.5%，甘油0.4%～0.5%，磷酸二氢钾0.2%～0.3%，磷酸氢二钾1%～2%，卡那霉素50mg/L，余量为纯净水，用氨水调至pH为7.0～7.2；发酵液培养基组成为：蛋白胨1%～1.5%，酵母提取物2%～2.5%，甘油0.4%～0.5%，磷酸二氢钾0.2%～0.3%，磷酸氢二钾1%～2%，余量为纯净水，用氨水调至pH为7.0～7.2。

第二步，将500ml种子液培养基装在2L三角瓶中，在121℃条件下灭菌20min，冷却后接种LB平板，摇床频率为200～230rpm/min，在37℃条件下培养4h，用于发酵培养基接种。

第三步，将200ml种子液接种入4.8L的发酵液，接种量为4%，发酵液发酵培养条件：罐温37℃，通风比2.5，罐压0.05MPa，接种1.5h后罐温降至25～28℃，加入1%乳糖，1h后再加入0.5%乳糖，诱导后搅拌，罐压和通风比不变，培养12～15h。

2）酶活测定：配制60g/L的L-天冬氨酸溶液30ml，调至pH为7.0，加入1g发酵好的菌体，置于150rpm、37℃的水浴摇床震荡反应20min，取1ml菌液，用岛津LC-15C高效液相色谱仪测β-丙氨酸的生成量，岛津LC-15C高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：AglentZRABOXSB-C184.6*250mm，5μm；柱温度：30℃，流速：1.0mL/min，检测器：紫外，334nm，根据β-丙氨酸的生成量可以判断菌液的酶活，具体是1ml菌液生产1umol/minβ-丙氨酸为一个酶活单位，酶活测定的结果如表1所示：

表1不同批号的反应罐中菌液的酶活测定结果

实施例4

本发明的重组肠杆菌菌株催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸：

在1L反应罐中加入0.6L水和20g的L-天冬氨酸，用氨水调至pH为7.2，加入100g打散的菌体，70μl丙酮酸，0.1g磷酸吡哆醛，随着转化过程中pH值的升高，分批次加入130g的L-天冬氨酸，维持反应罐内物料的pH值在7.2，然后用10%的盐酸控制反应液的pH值在7.2，用岛津LC-15C高效液相色谱仪测β-丙氨酸的生成量，确定L-天冬氨酸的转化是否完全，待反应完全后，先离心除菌，再加入活性炭脱色，经过膜过滤后进行减压浓缩，将浓缩物缓慢搅拌进行降温，析出白色晶体，将白色晶体离心、烘干，即得β-丙氨酸，经计算β-丙氨酸的收率为92%，纯度为99.1%。

核苷酸序列表

SEQUENCELISTING

<110>安徽华恒生物工程有限公司

<120>生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株及其构建方法和应用

<130>

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>411

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>1

atgctgcgcaccatcctcggaagtaagattcaccgtgccactgtcactcaagctgatctg60

gattatgttggctctgtaaccatcgacgccgacctggttcacgccgccggattgatcgaa120

ggcgaaaaagttgccatcgtagacatcaccaacggcgctcgtctggaaacttatgtcatt180

gtgggcgacgccggaacgggcaatatttgcatcaatggtgccgctgcacaccttattaat240

cctggcgatcttgtgatcatcatgagctaccttcaggcaactgatgcggaagccaaggcg300

tatgagccaaagattgtgcacgtggacgccgacaaccgcatcgttgcgctcggcaacgat360

cttgcggaagcacttcctggatccgggcttttgacgtcgcgtagcatttag411

<210>2

<211>59

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>2

aagcaaatcattggcagcttgaaaaagaaggttcacatgattccggggatccgtcgacc59

<210>3

<211>58

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>3

ctgacgtgccttttttatttgtactaccctgtacgattatgtaggctggagctgcttc58

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>4

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<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

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<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>6

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<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Escherichiacoli

<400>7

gccagcaaaactatgatgag20

Claims (7)

1.一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株(Escherichiacoli)AHB-36，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCM2013629。

2.一种如权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因；

2)筛选缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的阳性克隆，该阳性克隆命名为菌株I；

3)双酶切质粒pET24a(+)以及谷氨酸棒杆菌的PanD基因，用T4连接酶将酶切产物质粒pET24a(+)和PanD基因的DNA片段进行连接，得到重组质粒pET24a-PanD；

4)通过热激法将重组质粒pET24a-PanD转入菌株I中，即得用于生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌菌株的构建方法,其特征在于：所述敲除大肠杆菌的天冬氨酸氨基裂解酶基因的步骤如下：

a)以pIJ773质粒的DNA为PCR扩增模板扩增Apr基因，PCR扩增Apr基因所用的引物aspA-KO-U、aspA-KO-D的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；

b)通过电转化法将PCR扩增产物转至带有pKD46质粒的大肠杆菌中，即得敲除天冬氨酸氨基裂解酶基因的大肠杆菌。

4.根据权利要求2或3所述的重组大肠杆菌菌株的构建方法,其特征在于：筛选缺失天冬氨酸氨基裂解酶基因的大肠杆菌的方法为采用两对引物对转化子进行PCR验证，第一对引物aspA-1-F、aspA-1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，第二对引物aspA-2-F、aspA-2-R的核苷酸序列如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。

5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌菌株的构建方法,其特征在于：所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s、50℃退火45s、72℃延伸90s，10个循环；94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s，15个循环；72℃延伸10min，1个循环。

6.一种如权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株在生产β-丙氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌菌株的应用，其特征在于：重组大肠杆菌菌株发酵催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸。