CN110016459B - 一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产β‑丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法，属于代谢工程领域。本发明构建得到的菌株B0016‑083BB/pPL‑panD、B0016‑100BB/pPL‑panD、B0016‑110BB/pPL‑panD厌氧发酵生产β‑丙氨酸的产量分别为57.55×10^‑3g/L、58.37×10^‑3g/L、80.31×10^‑3g/L，较出发菌株B0016‑080BB/pPL‑panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。本发明首次利用厌氧发酵生产β‑丙氨酸，与好氧发酵相比，理论转化率更高，副产物更少，且避免了好氧发酵中所需通气搅拌，降低了生产成本。

Description

一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法

技术领域

本发明涉及一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

β-丙氨酸即3-氨基丙酸，是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸。近年来，在医药、化工、食品、环境等领域的作用日渐突出。有报道称β-丙氨酸是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。目前，β-丙氨酸的市场需求巨大，但是工业生产β-丙氨酸主要采用化学合成法，存在着环境污染严重、副产物多、纯化困难、工艺条件苛刻等问题。寻求绿色的生产方法具有十分明显的经济和社会效益。生物合成法通常指利用拥有特定代谢途径的微生物转化底物生成β-丙氨酸的方法，生物合成法有绿色无污染、生产条件温和、对设备要求简单等优点，因此越来越受到青睐。

能够发酵积累β-丙氨酸的微生物菌株有很多，目前用于研究的菌株主要集中在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。但谷氨酸棒杆菌发酵生产β-丙氨酸副产物谷氨酸浓度较高，后续需要复杂的分离和纯化过程，增加生产成本。大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，即可以在好氧条件下进行快速生长，又可以在厌氧条件下进行混合酸发酵。作为一种模式生物，大肠杆菌遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究β-丙氨酸发酵途径和提高β-丙氨酸产量的理想载体。

大肠杆菌可以利用甘油为底物经过一系列酶促反应合成富马酸，富马酸在天冬氨酸氨裂解酶(由aspA基因编码)的催化下合成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸在天冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因编码)的催化下合成β-丙氨酸。

现有报导的大肠杆菌发酵生产β-丙氨酸均为好氧发酵，但是好氧发酵生产β-丙氨酸副产物多而复杂，导致转化率低，且好氧通气搅拌成本较高。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产β-丙氨酸的重组菌，所述重组菌同时整合表达和游离表达了天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD；所述整合表达，包括将前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD整合到大肠杆菌出发菌株的染色体上；所述游离表达，包括将天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD连接到质粒pPL451上获得重组质粒pPL-panD，然后将重组质粒pPL-panD转入大肠杆菌出发菌中。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌出发菌株是敲除野生型菌株E.coli CICIMB0016中的乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldhA得到重组菌株E.coli B0016-050，然后在E.coli B0016-050中敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG而获得的菌株，将其命名为B0016-080BB。

在一种实施方式中，所述天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的融合基因片段为ci857-p_R-p_L-panD-kan，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述重组菌是B0016-083BB/pPL-panD，其是将融合基因ci857-p_R-p_L-panD整合到大肠杆菌出发菌株B0016-080BB的染色体上，得到重组菌B0016-083BB；然后将重组质粒pPL-panD转入B0016-083BB得到。

在一种实施方式中，所述重组菌在B0016-083BB/pPL-panD的基础上还做了如下改造：利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶aspA基因原有的弱启动子；命名为B0016-100BB/pPL-panD。

在一种实施方式中，所述强诱导型启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述重组菌在B0016-100BB/pPL-panD的基础上还做了如下改造：敲除染色体中乙醛酸循环抑制子iclR基因；命名为B0016-110BB/pPL-panD。

本发明的第二个目的是提供一种采用厌氧发酵法生产β-丙氨酸的方法，所述方法是将所述的重组菌进行厌氧发酵生产。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵为将所述重组菌接种于含有甘油的培养基中，进行厌氧发酵。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵具体是，将所述重组菌接种至发酵培养基中，震荡好氧培养至OD₆₀₀＝2.5，然后补料甘油并调节pH＝7，同时调节温度至42℃诱导，密闭后继续静置厌氧培养。

在一种实施方式中，所述发酵培养基配方为(每L)：NaHPO₄·12H₂O 15.1g、KH₂PO₄3.0g、NH₄Cl 1.0g、NaCl 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 13.21g，补加50％(v/v)甘油10mL，200g/L泛酸1mL，1mol/L MgSO₄ 1mL和微量元素母液1mL；微量元素母液成分为(g/L)：FeCl₃·6H₂O 2.4、CoCl₂·6H₂O 0.3、CuCl₂·2H₂O 0.15、ZnCl₂ 0.3、Na₂MO₄·2H₂O 0.3、H₃BO₃ 0.075、MnCl₂·4H₂O 0.495。

本发明还提供所述重组菌在制备药物、化工、食品或环境领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明构建得到的菌株B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD、B0016-110BB/pPL-panD厌氧发酵生产β-丙氨酸的产量分别为57.55×10^-3g/L、58.37×10^{- 3}g/L、80.31×10^-3g/L，较出发菌株B0016-080BB/pPL-panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。

(2)本发明首次利用大肠杆菌厌氧发酵生产β-丙氨酸，与好氧发酵相比，理论转化率更高，副产物更少，且避免了好氧发酵中所需通气搅拌，降低了生产成本。

附图说明

图1：基因敲除PCR验证电泳图；M：DL10 000 DNA maker；1：panD整合前；2：panD整合后；3：PaspA::Ptac替换前；4：PaspA::Ptac替换后；5：iclR敲除前；6：iclR敲除后。

图2：多基因编辑对β-丙氨酸合成的影响。

图3：panD基因的过量表达对不同菌株发酵合成β-丙氨酸的影响。

生物材料

(1)野生型菌株E.coli CICIM B0016由江南大学工业微生物资源和信息中心筛选和保藏(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)，参见周丽等人的文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》中1.1节(公开日：2015-05-04)。

(2)本发明的出发菌株B0016-080BB，即B0016 ΔackA-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA ΔlysC ΔpanC ΔptsG，已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开，其具体构建过程为：

在野生型菌株E.coli CICIM B0016中敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldh A得到重组菌株B0016-050，参见周丽等人的文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》表1(公开日：2015-05-04)。在菌株E.coli B0016-050中依次叠加敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG，获得B0016-080BB菌株，参见梁姗姗等人的文章《代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸》表1(公开日：2017-12-31)。

具体实施方式

(1)基因整合和敲除方法：

采用Red重组法，参见Datsenko等(Datsenko K A,et al.Proc Natl Acad SciUSA,2000,97:6640-6645)报道的基因整合和敲除方法。

(2)β-丙氨酸检测方法：

发酵液预处理方法：发酵液样品10000rpm离心2min，取上清液加入等体积10％(m/v)三氯乙酸，避光放置大于3h，适当稀释后用0.45μm滤膜过膜。

利用邻苯二甲醛(OPA)试剂在线衍生β-丙氨酸，用高效液相色谱(HPLC)分析β-丙氨酸的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱(250cm×4.6mm,5μm)，流动相A为：无水醋酸钠(分析纯)4.52g，先溶于水，再加三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，水定容至1L，醋酸调节pH7.2；流动相B为：无水醋酸钠4.52g，水定容为200mL，醋酸调节pH7.2，加400mL甲醇和400mL乙腈。采用梯度洗脱：0～27min，B液由8％上升到60％，流速为1mL/min；20～31.5min，B液由60％上升到100％，流速为1mL/min；32～34min，B液梯度不变，流速为1.2mL/min。34～35min，B液由100％下降到8％，流速为1mL/min。柱温为40℃，检测波长为338nm；进样量为10μL。

实施例1：在染色体上整合天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD

在panD基因前端融合温控开关p_R-p_L启动子，能够通过改变培养温度快速、有效地开启或关闭重组蛋白的表达。具体参见周丽等文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》(公开日：2015.12.31)。

(1)融合基因片段ci857-p_R-p_L-panD-kan的获得

质粒pPL-panD已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开，在该质粒中ci857、p_R启动子、p_L启动子、panD基因和kan抗性基因串联在一起。

以质粒pPL-panD为模板，利用引物PanD-PKD13F和PanD-CI857R扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ci857-p_R-p_L-panD-kan基因。

(2)将ci857-p_R-p_L-panD-kan融合基因整合到染色体上

以大肠杆菌B0016-080BB为出发菌，利用Red重组法将步骤(1)中得到的ci857-p_R-p_L-panD-kan融合基因整合到大肠杆菌染色体上，利用引物YpanDF，YpanDR对重组结果进行验证。结果表明基因整合到染色体之前扩增得到的片段长度为556bp(参见图1lane1)，将ci857-p_R-p_L-panD-kan融合基因整合到大肠杆菌染色体上之后扩增得到的片段长度为3024bp(参见图1lane2)，并经测序正确，说明ci857-p_R-p_L-panD-kan基因被整合到大肠杆菌染色体上。最后得到菌株B0016-080BB-panD，将其命名为B0016-083BB。

表1引物序列表

实施例2：替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶基因aspA原有的弱启动子

(1)强诱导型启动子Ptac的扩增

以pUC57质粒为模板，以Kan-Ptac、Kan-T为引物，扩增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的强诱导型启动子Ptac基因序列。

(2)利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上弱启动子PaspA

在实施例1中得到的菌株B0016-083BB(即菌株B0016-080BB-panD)的基础上，利用Red重组法，采用引物AspA-Ptac、AspA-pK将步骤(1)中得到的启动子Ptac基因整合到大肠杆菌染色体上，利用引物YaspAF，YaspAR对重组结果进行验证。结果表明PaspA被替换之前扩增得到的片段长度为2480bp(参见图1 lane3)，替换后扩增得到的片段长度为3578bp(参见图1lane4)，并经测序正确，说明染色体上aspA基因原有的弱启动子PaspA已经被强诱导型启动子Ptac替换。最后得到菌株B0016-083BB PaspA::Ptac，将其命名为B0016-100BB。

表2引物序列表

实施例3：敲除染色体中乙醛酸循环抑制子iclR

在实施例2中得到的菌株B0016-100BB的基础上，利用Red重组法采用引物iclR-pkd13F、iclR-pkd13R敲除大肠杆菌染色体上的乙醛酸循环抑制子iclR，利用引物YiclR F，YiclR R进行验证，iclR敲除前扩增得到的基因大小为1872bp，敲除后扩增得到的序列减少为1044bp。说明染色体上的iclR被敲除。最后得到菌株B0016-100BB ΔiclR::FRT，将其命名为B0016-110BB。

表3引物序列表

实施例4：菌株的摇瓶发酵

(1)种子培养

取-80℃甘油保藏的菌种B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB，在氨苄青霉素抗性的LB平板划线，于33℃恒温培养24h后，转接到50mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于33℃摇床200r/min震荡培养至OD₆₀₀＝2.5，得到菌株的种子液。

(2)厌氧发酵培养

将步骤(1)中得到的种子液转接至50mL M9-2培养基中，使OD₆₀₀终浓度为0.05，于33℃、200r/min震荡好氧培养至OD₆₀₀＝2.5。然后补料1.5mL50％(v/v)甘油并用100g/L的NaHCO₃调节pH＝7，同时调节温度至42℃诱导，密闭并继续静置厌氧培养。发酵过程中每6h补加1mL50％(v/v)甘油，并用100g/L的NaHCO₃调节pH＝7，42h结束厌氧发酵，每次试验采用三个平行并计算其平均值。

M9-2培养基成分(每L)：NaHPO₄·12H₂O 15.1g、KH₂PO₄ 3.0g、NH₄Cl 1.0g、NaCl0.5g、(NH4)₂SO₄ 13.21g，补加50％(v/v)甘油10mL，200g/L泛酸1mL，1mol/L MgSO₄ 1mL和微量元素母液1mL。微量元素成分为(g/L)：FeCl₃·6H₂O 2.4；CoCl₂·6H₂O 0.3；CuCl₂·2H₂O0.15；ZnCl₂ 0.3；Na₂MO₄·2H₂O 0.3；H₃BO₃ 0.075；MnCl₂·4H₂O 0.495。

B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB菌株的β-丙氨酸合成水平如图2所示，出发菌株B0016-080BB无法利用厌氧发酵合成β-丙氨酸，B0016-083BB可以利用厌氧发酵合成β-丙氨酸，产量为12.883×10^-3g/L，B0016-100BB菌株和B0016-110BB菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-083BB分别提高24.81％和50.39％。结果说明过表达panD基因可以大幅度提高β-丙氨酸的产量。

表4菌株的发酵结果

实施例5：将pPL-panD质粒分别转化入菌株

质粒pPL-panD已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开。

(1)菌株的构建

将pPL-panD质粒分别通过电转化法转化入菌株B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB的感受态细胞中，在氨苄抗性平板中进行抗性筛选，能够在氨苄抗性平板生长的菌即为转化成功，最终获得B0016-080BB/pPL-panD、B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD、B0016-110BB/pPL-panD重组菌株。

(2)菌株的厌氧摇瓶发酵

发酵方法与实施例4相同。

将步骤(1)中得到的菌株进行厌氧摇瓶发酵，摇瓶发酵结果如图3所示，B0016-080BB/pPL-panD菌株可以在厌氧发酵过程中合成β-丙氨酸，产量为30.961×10^-3g/L，B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD和B0016-110BB/pPL-panD菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-080BB/pPL-panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。说明继续过量表达panD基因显著提高了β-丙氨酸合成量。

表5菌株的发酵结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu

20 25 30

Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp

35 40 45

Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala

50 55 60

Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn

65 70 75 80

Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Ala

85 90 95

Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn

100 105 110

Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser

115 120 125

Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile

130 135

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgctgcgca ccatcctcgg aagtaagatt caccgagcca ctgtcactca agctgatcta 60

gattatgttg gctctgtaac catcgacgcc gacctggttc acgccgccgg attgatcgaa 120

ggcgaaaaag ttgccatcgt agacatcacc aacggcgctc gtctggaaac ttatgtcatt 180

gtgggcgacg ccggaacggg caatatttgc atcaatggtg ccgctgcaca ccttattaat 240

cctggcgatc ttgtgatcat catgagctac cttcaggcaa ctgatgcgga agccaaggcg 300

tatgagccaa agattgtgca cgtggacgcc gacaaccgca tcgttgcgct cggcaacgat 360

ctggcggaag cactacctgg atccgggctt ttgacgtcga gaagcattta g 411

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu

20 25 30

Ser Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val

35 40 45

Gly Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala

50 55 60

Leu Leu Thr Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser

65 70 75 80

Ile Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Gln Pro

85 90 95

Ser Leu Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Pro Val Phe Ser His Val Gln Ala

100 105 110

Gly Met Phe Ser Pro Lys Leu Arg Thr Phe Thr Lys Gly Asp Ala Glu

115 120 125

Arg Trp Val Ser Thr Thr Lys Lys Ala Ser Asp Ser Ala Phe Trp Leu

130 135 140

Glu Val Glu Gly Asn Ser Met Thr Ala Pro Thr Gly Ser Lys Pro Ser

145 150 155 160

Phe Pro Asp Gly Met Leu Ile Leu Val Asp Pro Glu Gln Ala Val Glu

165 170 175

Pro Gly Asp Phe Cys Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asp Glu Phe Thr Phe

180 185 190

Lys Lys Leu Ile Arg Asp Ser Gly Gln Val Phe Leu Gln Pro Leu Asn

195 200 205

Pro Gln Tyr Pro Met Ile Pro Cys Asn Glu Ser Cys Ser Val Val Gly

210 215 220

Lys Val Ile Ala Ser Gln Trp Pro Glu Glu Thr Phe Gly

225 230 235

<210> 4

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgagcacaa aaaagaaacc attaacacaa gagcagcttg aggacgcacg tcgccttaaa 60

gcaatttatg aaaaaaagaa aaatgaactt ggcttatccc aggaatctgt cgcagacaag 120

atggggatgg ggcagtcagg cgttggtgct ttatttaatg gcatcaatgc attaaatgct 180

tataacgccg cattgcttac aaaaattctc aaagttagcg ttgaagaatt tagcccttca 240

atcgccagag aaatctacga gatgtatgaa gcggttagta tgcagccgtc acttagaagt 300

gagtatgagt accctgtttt ttctcatgtt caggcaggga tgttctcacc taagcttaga 360

acctttacca aaggtgatgc ggagagatgg gtaagcacaa ccaaaaaagc cagtgattct 420

gcattctggc ttgaggttga aggtaattcc atgaccgcac caacaggctc caagccaagc 480

tttcctgacg gaatgttaat tctcgttgac cctgagcagg ctgttgagcc aggtgatttc 540

tgcatagcca gacttggggg tgatgagttt accttcaaga aactgatcag ggatagcggt 600

caggtgtttt tacaaccact aaacccacag tacccaatga tcccatgcaa tgagagttgt 660

tccgttgtgg ggaaagttat cgctagtcag tggcctgaag agacgtttgg ctga 714

<210> 5

<211> 2865

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tcagccaaac gtctcttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggaacaact 60

ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct 120

atccctgatc agtttcttga aggtaaactc atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc 180

acctggctca acagcctgct cagggtcaac gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg 240

cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc 300

actggctttt ttggttgtgc ttacccatct ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag 360

cttaggtgag aacatccctg cctgaacatg agaaaaaaca gggtactcat actcacttct 420

aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata catctcgtag atttctctgg cgattgaagg 480

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taatgcattg atgccattaa ataaagcacc aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc 600

tgcgacagat tcctgggata agccaagttc atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag 660

gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt taatggtttc ttttttgtgc tcatacgtta 720

aatctatcac cgcaagggat aaatatctaa caccgtgcgt gttgactatt ttacctctgg 780

cggtgataat ggttgcatgt actaaggagg ttgtatggaa caacgcataa ccctgaaaga 840

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ttatctctgg cggtgttgac ataaatacca ctggcggtga tactgagcac atcagcagga 1020

cgcactgacc accatgaagg tgacgctctt aaaaattaag ccctgaagaa gggcagcatt 1080

caaagcagaa ggctttgggg tgtgtgatac gaaacgaagc attgggatct taaggaggtt 1140

aactatgctg cgcaccatcc tcggaagtaa gattcaccga gccactgtca ctcaagctga 1200

tctagattat gttggctctg taaccatcga cgccgacctg gttcacgccg ccggattgat 1260

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cgatctggcg gaagcactac ctggatccgg gcttttgacg tcgagaagca tttaggaatt 1560

cattccgggg atccgtcgac ctgcagttcg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 1620

ttcagagcgc ttttgaagct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 1680

gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 1740

ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 1800

tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 1860

gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 1920

cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 1980

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 2040

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 2100

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 2160

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 2220

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 2280

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 2340

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 2400

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 2460

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 2520

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 2580

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 2640

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 2700

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 2760

tcgccttctt gacgagttct tctaataagg ggatcttgaa gttcctattc cgaagttcct 2820

attctctaga aagtatagga acttcgaagc agctccagcc tacac 2865

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcaggcatcg cctgcttcgt taacgacagg gtagaaaggt agaagttatg tgtaggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 8

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tggtgagtaa ccagccgcag ggataacaat caagcaacct gtaccggaat gcggtaagtc 60

gcataaaaac cattcttc 78

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcttaagaac ggattcgctg gagac 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgccgtcag atgagtagac actaaac 27

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

agctccagcc tacacggtgc accaatgctt ctggc 35

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acggatcccc ggaatatcgt cgaacggcag gcgt 34

<210> 13

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acttccctgg tacccaacag atcttcttcg atacgaatgt tgtttgacat gaattctgtt 60

tcctgtgtga aattgttatc c 81

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

attctgtgtg tttaaagcaa atcattggca gcttgaaaaa gaaggttcac attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cgccagagag atgttgccag tac 23

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atcattgctg gtttgctgct tttatt 26

<210> 17

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

agaatattgc ctctgcccgc cagaaaaagt cagcgcattc caccgtacgc gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 18

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

caataaaaat gaaaatgatt tccacgatac agaaaaaaga gactgtcatg attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gtcgccccgg aaaataacat tgacc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

actctggatc atggtgccca taccg 25

Claims (3)

1.一种采用厌氧发酵法生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，将产β-丙氨酸的重组菌进行厌氧发酵生产；

所述产β-丙氨酸的重组菌同时整合表达和游离表达了天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD，并敲除染色体中乙醛酸循环抑制子iclR基因；所述整合表达是将前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD整合到大肠杆菌出发菌株的染色体上；所述游离表达是将天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD连接到质粒pPL451上获得重组质粒pPL-panD，然后将重组质粒pPL-panD转入大肠杆菌出发菌中；

所述大肠杆菌出发菌株是敲除野生型菌株E. coli CICIM B0016中的乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldhA得到重组菌株E. coliB0016-050，然后在E. coli B0016-050中敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白EⅡCBGlc的编码基因lysC、panC和ptsG而获得的菌株；

所述天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述重组菌利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶aspA基因原有的弱启动子；所述强诱导型启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵为将所述重组菌接种于含有甘油的培养基中，进行厌氧发酵。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵具体是，将所述重组菌接种至发酵培养基中，震荡好氧培养至OD₆₀₀=2.5，然后补料甘油并调节pH=7，同时调节温度至42℃诱导，密闭后继续静置厌氧培养。

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