CN104560852B - 一种l‑苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 - Google Patents

一种l‑苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌，属于代谢工程领域。本发明的重组菌株缺失了基因aroP、aceE、ldh、pstI，在原pstI位点整合了iolT2‑ppgk基因，同时转入了含有L‑Phe合成途径八个关键酶的调控表达质粒。本发明的重组菌株明显提高了L‑Phe中间产物PEP积累量，L‑Phe产量以及L‑Phe对葡萄糖的糖酸转化率，改变碳源流向降低或者阻断副产物积累，此代谢工程的手段能被应用于以PEP为前体的其他代谢产物的合成。

Description

一种L-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌
技术领域
本发明涉及一种L-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌，属于代谢工程领域。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phe)又称为L-苯基-α-氨基丙酸，其具有旋光性的芳香族氨基酸，是人体必需氨基酸之一，是重要的医药和食品化学品中间体，具有巨大的市场空间。
L-Phe的生产技术主要包括天然蛋白质水解法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中天然蛋白质水解法由于其生产工艺相对复杂，产品质量不稳定，难以用于工业化生产。化学合成法因其生产路线长、副产物多且产物为消旋不宜推广使用等缺点，因而逐渐被淘汰。由于酶法具有生产工艺简单、产物浓度高、纯化步骤简单等特点是目前工业化L-Phe的主要生产方式之一，微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小，产物浓度高等优点成为国内外工业化生产L-Phe的主要方法。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，C.glutamicum)中L-Phe合成途径主要分为三个部分：1、中心碳源代谢途径提供两个前体物质，来源于糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate,PEP)以及来源于磷酸戊糖途径的4-磷酸-赤藓糖(Erythrose-4-phosphate,E4P)；2、莽草酸途径是芳香族氨基酸合成的共同代谢途径；3、分支酸路径，以分支酸(Chorismate)为节点通过不同的酶作用分别流向三种不同的芳香族氨基酸L-Phe，L-酪氨酸和L-色氨酸。
虽然大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸能到很高的水平，但大肠杆菌由于其自身的特点而在大工业化生产中受到了限制，尤其在制备食品级的大工业化生产中。这是因为大肠杆菌本身是一种条件致病菌，所生产的重组蛋白、有机酸等产物中残留有大肠杆菌的相关抗原，从而易引起人或其他动物的免疫反应，这是公众卫生所不能接受的；此外，大肠杆菌是一种很好的噬菌体宿主菌，在大工业化发酵生产中极易遭受噬菌体的感染。
谷氨酸棒杆菌是一种食品级的微生物，本发明旨在提供一种L-苯丙氨酸产量提高的重组谷氨酸棒状杆菌。
发明内容
本发明提供一种L-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌，所述菌株发酵能明显提高L-Phe中间产物PEP积累量，L-Phe产量以及L-Phe对葡萄糖的糖酸转化率。
本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌株，其特征在于，所述菌株是以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为出发菌株，缺失了L-Phe吸收途径的基因aroP、乙酸脱氢酶系I基因aceE、乳酸脱氢酶基因ldh、葡萄糖转运PTS系统的基因pstI，在原pstI位点整合了非依赖于PEP消耗的葡萄糖转运基因iolT2-ppgK，同时转入了含有L-Phe合成途径八个关键酶的调控表达质粒。
所述pstI、iolT2-ppgK、aroP、aceE、ldh的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。
所述出发菌株为C.glutamicum ATCC 13032。
所述的八个关键酶为编码3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶的aroFfbr、编码莽草酸脱氢酶的aroE，编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA、编码转酮酶的tktA、编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶的pheAfbr、编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的aroA、编码氨基转移酶的tyrB和编码莽草酸激酶的aroL。
所述的八个关键酶的核苷酸序列分别是：aroFfbr(序列如SEQ ID NO.17所示)、pheAfbr(序列如SEQ ID NO.18所示)、aroE(Gene ID:3343183)、ppsA(Gene ID:14791674)、tktA(Gene ID:3343601)、aroA(Gene ID:3345010)、tyrB(Gene ID:12933673)、aroL(GeneID:12930837)
所述谷氨酸棒杆菌重组菌株的表达质粒，包括一个过表达aroFfbr、aroE、ppsA、tktA基因的质粒，和一个过表达pheAfbr、aroA、tyrB、aroL基因的质粒。
所述表达质粒，其构建方法，是aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac(SEQ ID NO.15)和Plac(SEQ ID NO.16)构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，即pSUTL；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL即pSDTL。
所述谷氨酸棒杆菌重组菌株命名为，命名为C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh(pSUTL,pSDTL)。
.本发明的第二个目的是提供一种所述谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，步骤如下：
(1)根据目标基因及其上下游序列，构建目标基因缺失的敲除框后与载体pk18mobSacB连接，构建成1个pstI基因缺失且在原pstI基因处整合了iolT2-ppgk基因的敲入载体pK18mobSacB-iolT2-ppgk和3个分别缺失aroP、aceE、ldh基因的敲除载体pK18mobSacB-aroP、pK18mobSacB-aceE、pK18mobSacB-ldh；
(2)将4个载体转化到C.glutamicum获得阳性转化子，即C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh；
(3)将过表达L-Phe合成途径八个关键酶aroFfbr、aroE、ppsA、tktA、pheAfbr、aroA、tyrB、aroL的质粒转化到步骤2得到的菌株中，即获得谷氨酸棒杆菌重组菌株。
所述构建方法中的载体pk18mobSacB还可以被载体pK19mobSacB替代。
所述重组菌的构建方法中，所述敲除载体的构建方法是：通过融合PCR的方法得到目标基因缺失或者部分缺失的含有目标基因上下游序列的片段，将该片段连接到pK18mobSacB载体上。
本发明的第三个目的是提供一种提高L-Phe糖酸转化率的方法，是使用谷氨酸棒杆菌重组菌株进行发酵。
所述方法，其特征在于，所述重组菌株的发酵方法是：是将活化的种子接入发酵培养基中，加入IPTG诱导质粒表达重组酶，通风发酵培养。
所述发酵方法中，接种量为8％至10％。
所述发酵方法中，加入IPTG终浓度1mM。
所述发酵方法中，IPTG的添加时机在本发明的一种实施方式中是接种时添加。
所述发酵方法中，发酵培养时间为60-80h。
所述种子液的种子培养基(g/L)为：葡萄糖25.0，玉米浆固体干粉17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，pH 6.8-7.0。
所述发酵培养基(g/L)为：葡萄糖100.0，玉米浆固体干粉6.0，硫酸铵25.0，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。
所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，还包括0.5g/L的硫酸镁。
本发明对谷氨酸棒杆菌基因组进行修饰，通过aroP、ldh、aceE基因的敲除分别减少了L-Phe的吸收、阻断乳酸的形成途径、阻断乙酸的形成，敲除会阻断依赖于PEP消耗的葡萄糖转运PTS系统的基因ptsI的同时通过整合非依赖于PEP消耗的葡萄转运基因iolT2-ppgK能够回补菌体由于阻断了依赖于PEP消耗的葡萄糖转运PTS系统造成的菌体生长的缺陷，构建了重组菌C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh(pSUTL,pSDTL)，其L-Phe对葡萄糖转化率是出发菌株C.glutamicum ATCC13032的50.9倍，其PEP积累增加一倍，乙酸、乳酸积累量显著降低。本发明的重组菌能够明显提高L-Phe中间产物PEP积累量，L-Phe产量以及L-Phe对葡萄糖的糖酸转化率，改变碳源流向降低或者阻断副产物积累，此代谢工程的手段能被应用于以PEP为前体的其他代谢产物的合成。
附图说明
图1：含有不同基因的敲除框、敲入框载体的构建
图2：重组质粒pK18mobSacB-iolT2-ppgk酶切验证以及基因组敲入验证
Line 1:DL1000；Line 2:C.glutamicum ATCC 13032中敲入基因簇iolT2-ppgk阳性重组子，Line 3:C.glutamicum ATCC 13032中敲入基因簇iolT2-ppgk阴性重组子；Line4:敲除载体pk18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI；Line 5:pk18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI敲除框酶切验证
图3：aroP敲除载体酶切验证
Line 1:DL 10000DNA marker；Line 2:pk18mobSacB-aroP酶切；Line 1:DL2000DNAmarker
图4：谷氨酸棒杆菌基因组aroP基因敲除验证
Line 1:DL 2000DNAmarker；Line 2:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgK敲除aroP阳性重组子，Line 3:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgK敲除aroP阴性重组子
图5：aceE基因敲除载体的验证
Line 1：DL 10000DNAmarker；Line 2:pk18mobSacB-aceE敲除框酶切验证；Line3:DL2000DNAmarker
图6：基因组水平敲除aceE验证
Line 1:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroP敲除aceE阳性重组子，Line 2:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroP敲除aceE阴性重组子，Line 3:DL2000DNAmarker
图7：ldh基因敲除载体的验证
Line 1:pk18mobSacB-ldh敲除框酶切验证；Line 2:DL 10000DNA marker；Line3:DL 2000DNAmarker
图8：基因组水平敲除ldh验证
Line 1:DL 2000DNA，Line 2:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceE敲除ldh阳性重组子，Line 3:C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceE敲除ldh阴性重组子
图9：表达载体pSUTL和pSDTL构建流程示意图
具体实施方式
高效液相色谱(HPLC)测定L-Phe含量：
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)；
色谱柱：Thermo ODS-2HYPERSIL 4.6*250mm；
流动相：A(1L)：无水醋酸钠5g，5mL四氢呋喃，200μL三乙胺，pH 7.2；B：无水醋酸钠5g(定容200mL，调节pH 7.2)抽虑后加入400mL乙腈和400mL甲醇；
色谱条件：流速，1mL/min；柱温，40℃；进样量，10μL；紫外检测器波长，338nm；在线衍生化进样，梯度洗脱程序如表1所示：
表1梯度洗脱程序
高效液相色谱分析仪测定有机酸：
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配示差折光检测器和工作站)。
色谱柱：美国伯乐Bio-Rad#125-0140300×7.8mm有机酸和醇分析柱。
流动相：0.1％稀硫酸。
色谱条件：流速，0.8mL/min；柱温，45℃；进样量，10μL。
实施例1pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI载体的构建及验证
敲除载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI的构建通过两次融合PCR进行获取。
(1)首先三个同源臂：用引物1#(序列如SEQ ID NO.1所示)和2#(序列如SEQ IDNO.2所示)以C.glutamicum ATCC 13032为模板扩增到812bp大小的PtsI上游同源臂(下游带有iolT2-ppgK基因簇的互补序列，上游引物带有EcoRI酶切位点)，用引物3#(序列如SEQID NO.3所示)和4#(序列如SEQ ID NO.4所示)以载体pECXK99E-iolT2-ppgK为模板扩增到2.3Kb大小的iolT2-ppgK基因簇(上游带有与PtsI上游同源臂的下游互补的序列，下游带有与PtsI下游同源臂的上游互补的序列)；用引物5#(序列如SEQ ID NO.5所示)和6#(序列如SEQ ID NO.6所示)以C.glutamicum ATCC 13032为模板扩增到817bp的PtsI下游同源臂(上游带有iolT2-ppgK基因簇下游的互补序列，下游引物带有SmaI酶切位点)。
(2)对上面三个同源臂通过融合PCR进行融合。首先对需要进行融合的两个片段，进行PCR胶回收需要融合的上下游同源臂片段，不加入引物以PCR以长同源臂设计延伸时间扩增10个循环，取5μL PCR反应液为作为模板加入上游同源臂上游引物以及下游同源臂下游引物进行PCR获取融和片段，进行两次融合PCR最终融合成一个PtsI-iolT2-ppgk-PtsI的敲入框大小约为3.9Kb(上游酶切位点EcoRI，下游酶切位点SmaI)。
(3)分别对载体pK18mobSacB和ptsI-iolT2-ppgk-ptsI的敲入框使用EcoRI和SmaI进行双酶切，构建iolT2-ppgK基因簇的敲入载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI，构建结果见图2所示，泳道4为DL 10000DNA marker，泳道5为敲除载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI，泳道6为使用EcoRI和SmaI酶切验证敲除载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI，在4kb大小的位置有一个明显的片段为融合构建的敲除片段ptsI-iolT2-ppgk-ptsI，说明敲除载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI构建成功。
表2引物
实施例2pK18mobSacB-aroP载体的构建
以C.glutamcium ATCC 13032基因组为模板，使用表2中的引物9#(序列如SEQ IDNO.9所示)和引物10#(序列如SEQ ID NO.10所示)以扩增的到740bp的aroP基因的上游同源臂aroP F，使用引物11#(序列如SEQ ID NO.11所示)和引物12#(序列如SEQ ID NO.12所示)AroP-R-F1/R1扩增到747bp的aroP基因的下游同源臂aroP R中间缺失854bp。使用融合PCR方法融合aroP F、aroP R成为1487bp的aroP F/R。将片段aroP F/R和质粒pK18mobSacB使用EcoRI和SmaI进行双酶切后，使用T4连接酶将aroP F/R连接到质粒载体pK18mobSacB，转化大肠杆菌E.coli JM109，提取质粒使用限制性内切酶EcoRI和SmaI酶切验证如图3所示，泳道1为DL 10000DNAMarker，泳道2为pK18mobSacB-aroP酶切，泳道3为DL 2000DNAMarker，有泳道3，能看出酶切载体pK18mobSacB-aroP有一个约1.5Kb大小的条带即为aroP敲除框，说明敲除载体构建成功pK18mobSacB-aroP。
实施例3C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroP菌株的验证
在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032中转入构建的敲入iolT2-ppgK基因簇的载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI基因敲除验证方法对重组菌株进行筛选，提取基因组以表2的引物7#(序列如SEQ ID NO.7所示)和引物8#(序列如SEQ ID NO.8所示)进行PCR验证(敲除验证引物在敲除ptsI基因内部，Text-PtsI-F和Text-PtsI-R敲除前800bp，成功敲除后PCR无产物)结果见图2所示，从泳道3所示扩增得到800bp大小的PCR条带为阴性重组子，从泳道2，无PCR条带，说明得到的菌株为ptsI位点敲入基因簇iolT2-ppgK的重组子，说明得到的菌株就是C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgK。在重组菌株C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgK的基础上，通过转入敲除pK18mobSacB-aroP的质粒，通过基因敲除验证方法对重组菌株进行筛选，提取基因组，以aroP敲除验证引物13#(序列如SEQ ID NO.13所示)和引物14#(序列如SEQ ID NO.14所示)进行PCR验证(下游验证引物在敲除的删除的片段内部，敲除前1012bp，成功敲除后PCR无条带)，结果见图4所示，从泳道2能够看出无PCR条带，说明得到的菌株为敲除aroP的重组菌株，从泳道3，能看出1.1Kb大小PCR条带说明此为阴性转化子没有敲除aroP基因，与预期的结果相符。说明得到的菌株就是C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroP。
实施例4基因组敲除/敲入框的构建，以及重组菌株的构建
参照实施例1、2、3所述的方法，含有不同基因敲除框，敲入框pk18mobSacB载体的构建构建，获取上下游同源臂，通过融合PCR构建敲除框，通过酶切并与载体pk18mobSacB连接构建成，pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI，pK18mobSacB-aroP，pK18mobSacB-aceE(aceE序列如SEQ ID NO.19所示)和pK18mobSacB-ldh(ldh序列如SEQ ID NO.20所示)1个敲入载体和3个敲除载体，构建流程图见图1所示，构建的载体验证见图2、图3、图5、图7，构建敲入或者敲除载体分别电击转化C.glutamicum ATCC 13032通过两步重组获得阳性转化子，获取重组菌株C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgK,C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroP,C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceE和C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh,敲除重组子验证见图2、图4、图6、图8。进一步把两个表达L-Phe合成途径八个关键酶基因的2个重组质粒分别转入重组菌C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh中，获得重组菌株C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh(pSUTL,pSDTL)。
实施例5pECXK99E-iolT2-ppgK、pSUTL、pSDTL载体的构建
pECXK99E-iolT2-ppgK载体构建：将基因iolT2(Gene ID:14794205)与pECXK99E酶切连接获得载体pECXK99E-iolT2，继续将载体pECXK99E-iolT2与基因ppgK(Gene ID:3344173)酶切连接最终获得载体pECXK99E-iolT2-ppgK。
以pEC-XK99E(GenBank:AY219683.1)过量表达四个基因aroFfbr，aroE，ppsA和tktA，同时结合两个启动子Ptac和Plac构建重组质粒pECXK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA简写为pSUTL。以pXMJ19(Jakoby M,Ngouoto-Nkili CE,BurkovskiA.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors[J].Biotechnology techniques.1999.13(6):437-441)过量表达四个基因pheAfbr、aroA、tyrB和aroL，同时结合两个启动子Ptac(序列如SEQ ID NO.15所示)和Plac(序列如SEQ IDNO.16所示)构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL简写为pSDTL。
根据构建调控表达载体pSUTL和pSDTL构建流程示意图9所示，以对应的模板分别单独获取八个关键酶基因(aroFfbr(序列如SEQ ID NO.17所示)、pheAfbr(序列如SEQ IDNO.18所示)、aroE(Gene ID:3343183)、ppsA(Gene ID:14791674)、tktA(Gene ID:3343601)、aroA(Gene ID:3345010)、tyrB(Gene ID:12933673)、aroL(Gene ID:12930837)，PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；变性94℃ 30s，退火Tm(根据实际设计的引物而定)30s，延伸72℃(时间根据PCR获取基因的长度而定)(返回到变性步骤重复30个循环)；后延伸72℃ 10min，并以1％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，验证正确后，进一步构建融合基因aroFfbr-aroE，ppsA-tktA，pheAfbr-aroA和tyrB-aroL。将aroFfbr-aroE、ppsA-tktA与pEC-XK99E酶切连接，将pheAfbr-aroA、tyrB-aroL与pXMJ19酶切连接，最终获取八个基因的基础调控质粒pSU和pSD，酶切验证，进一步对基础质粒pSU和pSD按照图9所示进行酶切两次，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac，构建获得到重组质粒pSUTL和pSDTL。
实施例6基因组敲除对重组谷氨酸棒状杆菌发酵L-Phe的影响
重组菌株C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh(pSUTL,pSDTL)进行发酵结果见表3所示，C.glutamicum ATCC13032(pSUTL,pSDTL)为在出发菌株C.glutamicum ATCC13032基础上表达了两个质粒pSUTL、pSDTL的菌株。如表3所示重组菌C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh(pSUTL,pSDTL)胞外L-Phe，乙酸，乳酸以及胞内PEP积累量分别为7.46±0.16g/L，0.74±0.09g/L，0g/L和1.44±0.02mg/L，相比于C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)的L-Phe对葡萄糖转化率由5.95％提高到了8.57％，是出发菌株C.glutamicumATCC13032的L-Phe糖酸转化率的50.9倍。同时相对于两对照菌株，其PEP积累量增加，乙酸、乳酸积累量显著降低。
表3不同菌株发酵参数
(1)培养基：
种子活化培养基(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，葡萄糖5.0，装液量20mL/250mL。
种子活化培养基(LBG固体)(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，营养琼脂15.0～20.0。
发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆固体干粉17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，pH 6.8-7.0，装液量20mL/250mL。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆固体干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0，装液量20mL/250mL。
谷氨酸棒杆菌培养基根据需要添加对应的抗生素：氯霉素(17mg/L)；硫酸卡那霉素(Kan，25mg/L)，IPTG添加量终浓度为1mM，发酵诱导时间为0h诱导。
(2)摇瓶培养：
种子培养：接种一环LBG平板种子于发酵种子培养基，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃培养18h。
发酵培养：按10％接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃发酵培养72h。
实施例7细胞内代谢物的提取
(1)取样与菌体淬灭
当菌体生长至稳定期中期时，用移液器取5mL发酵液，迅速转移至含20mL，-40℃预冷的甘油-NaCl(甘油与13.5g/L的NaCl溶液的体积比为1:1)混合液的50mL离心管中进行菌体淬灭；迅速在12,000rpm 4℃离心3min，弃上清液，将菌体沉淀置冰浴中。
(2)菌体的洗涤
用5mL 4℃预冷的0.9％NaCl溶液悬浮菌体，8,000rpm 4℃离心3min，弃上清液，再重复洗涤一次。将含有菌体沉淀的离心管置-80℃冰箱中保藏，或直接进行菌体胞内物质的提取。
(3)胞内代谢物的提取
将含有菌体沉淀的离心管置冰浴中，加入5mL预冷至4℃的甲醇水混合液(甲醇和水的体积比为1:1)，间歇在漩涡混合器上混匀，直至完全悬浮菌体；将含有悬浮菌体的离心管置于液氮中2-3min，取出置冰上解冻，重复液氮冻融操作三次；12,000rpm 4℃离心5min，将上清液分装至1mL离心管中，置-80℃冰箱中保藏，或直接进行样品中代谢物浓度的测定。
实施例8测定样品的处理
(1)葡萄糖测定样品分析处理
取待分析的样品，在10,000rpm常温离心10min，取上清液使用去离子水进行稀释适当的倍数，使得终浓度在1g/L以内下进行测定，取25μL进行分析。
(2)氨基酸样品分析处理
取待分析的样品，在10,000rpm常温离心10min，取上清液使用5％三氯乙酸稀释到合适的浓度，经0.45μm滤膜过滤转移到1.5mL离线管中，10,000rpm常温离心10min供氨基酸液相分析用。
(3)有机酸样品分析处理
取待分析的样品，在10,000rpm常温离心10min，取上清液使用0.1％稀硫酸稀释到合适的浓度，经0.45μm滤膜过滤转移到1.5mL离线管中，10,000rpm常温离心10min供有机酸液相分析用。
实施例9谷氨酸棒状杆菌电转化
(1)-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态，冰浴中融化。
(2)加入1-5μL预冷质粒混匀(DNA总量约为1μg)，冰浴上放置5-10min。
(3)加入于预冷的0.1cm电击杯中，1.8KV 5ms电击2次。
(4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBHIS)(酵母膏2.5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L)1mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后放入冰浴中。
(5)将菌体置于巡回式摇床(100r/min)上，30℃后培养2h。
(6)6,000rpm，常温离心1min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。
(7)感受态效率的验证：阴性对照加入5μL无菌的ddH2O，无菌落形成，阳性对照加入0.1μL的质粒pXMJ19或者pECXK99E，长出大量菌落。
实施例10C.glutamicum基因敲除以及验证流程
(1)构建的敲除或者敲入载体，电击C.glutamicum感受态细胞(制备方法参见文献：Xu DQ,TanYZ,Huan XJ,Hu XQ,Wang XY(2010)Construction ofa novel shuttlevector for use in Brevibacterium flavum,an industrial amino acid producer.JMicrobiol Method 80:86–92)。
(2)电击转化后涂布电击转化恢复平板(LBHIS)，加入15μg/L Kan作为筛选标记，置于30℃恒温培养箱中，培养36h；(敲除载体不能在谷氨酸棒杆菌中复制，只有通过单交换整合到谷氨酸棒杆菌基因组上才能够在平板中长出)
(3)挑选3-6个转化子分别接种于5mL LBG培养基中(不加入抗生素)，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃培养过夜；
(4)菌液按照进行以下稀释度进行涂布到指定的平板：
备注：敲除载体为蔗糖致死型质粒，只有在含有蔗糖平板上面SacB发生第二次重组，使得Kan从基因组上面掉下来，从而使得敲除框重组到基因组上面。进行下一步挑选重组子。如果第二次重组没有问题，出现以下情况LBG含有10％蔗糖，25μg/L Kan(稀释102倍)长出来的菌落远远少于LBG含有25μg/L Kan(稀释104)中长出来的菌落。
(5)在上一步骤中第二次重组没有问题，即进行下一步操作，于LBG含有10％蔗糖(稀释101、102、103、104的平板)挑出50转化子同步点种于LBG、含有25μg/L Kan的LBG平板中，置于30℃恒温培养箱中，培养36h。
(6)在上一步骤中挑选出在LBG中长而在LBG含有25μg/L Kan平板中不长的菌落，接种于LBG培养基中，进行提取基因组，进行PCR验证以及测序敲除/敲入是否成功。
实施例11含pSUTL、pSDTL质粒的谷氨酸棒状杆菌重组子验证
将检出平板中的转化子，使用白色无菌枪头挑选单菌落，点种到新的相同抗生素的LBG平板中，置于30℃恒温培养箱培养12h，同时点种到菌落PCR体系中，进行PCR验证之后进行电泳，挑选正确的重组子，对平板中对应的重组子进行转接到LBG液体培养基中，培养12h，提取重组质粒，使用限制性内切酶酶切，DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，缺失了L-Phe吸收途径的基因aroP、乙酸脱氢酶系I基因aceE、乳酸脱氢酶基因ldh、葡萄糖转运PTS系统的基因pstI，在原pstI位点整合了非依赖于PEP消耗的葡萄糖转运基因iolT2-ppgK，同时转入了含有L-Phe合成途径八个关键酶的调控表达质粒；所述基因pstI、iolT2-ppgK、aroP、aceE、ldh的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示；所述的八个关键酶为编码3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶的aroFfbr、编码莽草酸脱氢酶的aroE，编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA、编码转酮酶的tktA、编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶的pheAfbr、编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的aroA、编码氨基转移酶的tyrB和编码莽草酸激酶的aroL；所述八个关键酶的核苷酸序列分别是：SEQ ID NO.17、Gene ID:3343183、Gene ID:14791674、Gene ID:3343601、SEQ ID NO.18、Gene ID:3345010、Gene ID:12933673、Gene ID:12930837所示的序列。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株为C.glutamicum ATCC13032。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述表达质粒，包括一个过表达aroFfbr、aroE、ppsA、tktA基因的质粒，和一个过表达pheAfbr、aroA、tyrB、aroL基因的质粒；所述表达质粒的构建方法，是aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA即pSUTL，pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL即pSDTL；所述启动子Ptac序列是SEQ IDNO.15所示的序列；所述Plac的序列是SEQ ID NO.16所示的序列。
4.一种权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，步骤如下：
(1)根据目标基因及其上下游序列，构建目标基因缺失的敲除框后与载体pk18mobSacB连接，构建成1个pstI基因缺失处整合了iolT2-ppgk基因的敲入载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI和3个分别缺失aroP、aceE、ldh基因的敲除载体pK18mobSacB-aroP、pK18mobSacB-aceE、pK18mobSacB-ldh；
(2)将4个载体转化到C.glutamicum获得阳性转化子，即C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh；
(3)将过表达L-Phe合成途径八个关键酶aroFfbr、aroE、ppsA、tktA、pheAfbr、aroA、tyrB、aroL的质粒转化到步骤2得到的菌株中，即获得谷氨酸棒杆菌重组菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体pk18mobSacB被载体pk19mobSacB替代。
6.一种利用权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌提高L-Phe糖酸转化率的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌的种子活化后，接种到发酵培养基中，加入IPTG诱导质粒表达重组酶，通风发酵培养60-80h；所述发酵培养基按g/L计含有：葡萄糖100.0，玉米浆固体干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。
7.权利要求1所述重组菌在L-Phe生产以及食品、医药领域的应用。
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