CN102140431B - L-色氨酸基因工程菌,其构建方法以及使用其发酵生产l-色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L-色氨酸生产菌株，其基因工程构建方法及发酵法生产制备L-色氨酸的方法，通过基因工程的手段将L-色氨酸代谢途径相关的基因进行突变，缺失，促使L-色氨酸代谢失调，造成L-色氨酸高产，同时通过基因整合，或通过适当的表达载体过表达L-色氨酸代谢途径相关基因，造成L-色氨酸代谢流的增强，最终通过发酵生产造成发酵液中大量积累L-色氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及L-色氨酸发酵生产菌株、其构建方法及使用其发酵生产L-色氨酸的方法，具体地说，本发明涉及一种高产L-色氨酸基因工程菌株，其构建方法及使用其发酵生产L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸的生产方法主要有四种：蛋白水解提取法、化学合成法、酶促转化法和直接发酵法。前2种方法分别存在着材料来源有限、需多步合成工艺和光学拆分及得率低、周期长等缺点，酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它是生产L-色氨酸较为有效的方法。目前日本与我国许多企业采用酶法生产。我国中科院微生物研究所余志华等采用重组DNA技术，成功地构建了能够高效表达用于酶法生产的色氨酸合成酶基因工程菌E.coli，并进行了规模化生产。但由于酶法底物之一L-丝氨酸价格昂贵，另一底物吲哚难溶于水，且对色氨酸合成酶抑制强烈，影响转化率提高。因此目前L-色氨酸的市场价格仍居高不下。
L-色氨酸发酵研究始于上世纪60年代初期。虽然对这种方法的研究进行得比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，另一方面，L-色氨酸生物合成途径中的调控机制也比较复杂。从葡萄糖被细菌吸收开始，需要经过细胞膜上的磷酸转运系统(Phosphotransferase System，PTS)， 糖酵解途径(Embden Meyerhof Parnas，EMP)和磷酸戊碳糖途径(Hexose Monophosphate Pathway，HMP)，分别合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和赤藓糖-4-磷酸(D-erythrose-4-phosphate，E4P)，经过共有的莽草酸途径到达分支酸，然后在分支合成三种芳香族氨基酸L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸。在大肠杆菌中，编码莽草酸激酶的基因存在同工酶基因aroL和aroK。aroB、aroD、aroE、aroA、aroC则只有一个。从分支酸开始进入分支途径分别合成三种芳香族氨基酸，分别由tyrA和pheA基因的产物分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(或脱水酶)(Chorimate mutase/Prephenate dehydrogenase，Chorimate mutase/Prephenate dehydratase，CM-PD)双功能酶中的分支酸变位酶催化分支酸到预苯酸，接着由预苯酸脱氢酶催化预苯酸合成L-酪氨酸前体对羟基苯丙酮酸，由预苯酸脱水酶催化预苯酸合成L-苯丙氨酸前体苯丙酮酸，最后由tyrB基因产物芳香族氨基酸转氨酶催化分别合成L-酪氨酸和L-苯丙氨酸；而L-色氨酸是由色氨酸操纵子trpEDCBA催化合成，首先由邻氨基苯甲酸合成酶(Anthranilate synthase，ANS)催化分支酸合成邻氨基苯甲酸，接着由磷氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(anthranilate phosphoribosyl transferase，PRT)催化合成磷酸核糖磷氨基苯甲酸，再由N-(5’-磷酸核糖)-氨基苯甲酸同分异构酶和吲哚-3-甘油磷酸合酶双功能酶催化合成吲哚-3-甘油磷酸，再由色氨酸合成酶(Tryptophan synthase，TS)催化合成L-色氨酸。
用传统方法诱变黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等出发菌株，解除菌体自身反馈调节，切断支路代谢，增加前体物的合成等，对芳香族氨基酸生物合成正常代谢机制进行调节，取得了一定成果，如：1982年日本杉本慎一等利用黄色短杆菌酪氨酸、蛋氨酸双重缺陷型兼对-氟苯丙氨酸抗性株，诱导5-氟色氨酸抗性株积累8.0g/L L-色氨酸，进一步赋予重氮丝氨酸抗性，积累10.3g/L L-色氨酸。1987年他们又从该株诱变出磺酸胍抗性突变株，在相同的培养条件下积累L-色氨酸18.8g/L。1987年日本仓桥等发现高浓 度的L-色氨酸抑制枯草杆菌色氨酸生产菌生长，依次赋予该菌具有对以下各结构类似物5-氟色氨酸、吲哚霉素、重氮丝氨酸，6-重氮-5-氧基-L-正亮氨酸、肉桂酸的抗性，诱变得到了AJ-11982菌株，能从200g/L葡萄糖生产21.5g/L色氨酸。
已知的L-色氨酸生产方法是基于一个突变的trpE基因的表达，该基因编码有对色氨酸不敏感的邻氨基苯甲酸(anthranilate)合酶，以及基于在合适的可自动复制的载体上的L-色氨酸操纵子的其它基因的表达。由于这些基因的相对高拷贝数，trpE基因的表达也多，对应的L-色氨酸代谢中的每一种酶的量也增加了，即可实现L-色氨酸的过量生产。
1979年Tribe和Pittard首次利用DNA重组技术将trpE引入E.coli中。1982年Aiba等将带有失调的trpE和trpD基因引入trpR和tnaA缺陷的E.coli中，在含有葡萄糖和邻氨基苯甲酸的培养基中培养，同时他们还分离到一株抗6-氟色氨酸的突变株，以此菌株为出发菌株，同时引入增强表达的L-色氨酸操纵子。
1993年Chan等将三个拷贝的色氨酸操纵子基因整合到E.coli的基因组中，获得了稳定生产L-色氨酸的生产菌株，在没有选择压力的情况下也能稳定表达，因此将基因整合到基因组中获得稳定表达也是非常有用的策略。通过增强失调的L-色氨酸操纵子在宿主菌中的表达来提高L-色氨酸的产量的在Berry(1996)和Camakaris等(1997)也有所描述。
随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，在L-色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高方面出现了突破。例如从大肠杆菌EMS4-C25中分离得到抗反馈调节的色氨酸操纵子，并将其克隆到质粒pUC19和pHSG576中分别得到重组质粒pTC7O1和pTC576，将pTC576转化到大肠杆菌中得到高产的L-色氨酸生产菌株。Ikeda等将带有DAHP合成酶和色氨酸合成酶的质粒引入产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌KYl0-894中，使L-色氨酸的产量提高了54％。
基因工程育种在各种L-色氨酸生产菌中的成功实践说明其发展势头，也必将成为未来工业微生物育种的发展趋势。
基因工程构建L-色氨酸生产菌的专利报道有：
日本协和发酵公司申请的专利EP-A-O 401 735描述了以含有重组质粒的棒状杆菌或短杆菌来生产L-色氨酸的方法。在这些质粒中含有合成DAHP合酶，邻氨基苯甲酸合酶，吲哚-3-甘油-P合酶，色氨酸合酶和磷酸甘油脱氢酶的遗传信息。使用了抗反馈邻氨基苯甲酸合酶的等位基因。
Stauffer化学公司申请的专利EPO 149 539中揭示了通过在细胞中防止丝氨酸降解来提高L-色氨酸产量的方法。使用了破坏丝氨酸降解酶(丝氨酸脱氨酶，Serine deaminase，sda)的大肠杆菌K-12突变体来生产氨基酸。
德国电化学公司申请的中国专利CN93117586.0(授权公告CN1065909C)通过一个去调控的色氨酸代谢和至少一个抗反馈serA等位基因而去调控的丝氨酸代谢的突变体，在相同培养条件下产量提高2.6倍。
另外以重组大肠杆菌(E.coli)为宿主菌生产L-色氨酸的授权专利还有CN1085950A，EP0293207，US4371614，US4588687等。各专利保护其新构建的位点，也描述了它们的不同发酵产酸能力。
本发明首次提出利用基因工程的方法改造大肠杆菌的芳香族氨基酸代谢途径的共有途径，通过增强相关基因的组合最终获得高产L-色氨酸生产菌株，同时本发明在国内为首家用发酵法生产L-色氨酸，本发明构建的基因工程菌株为大肠杆菌L-色氨酸高产菌株，能有效积累L-色氨酸，为L-色氨酸的产业化生产奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程的方法对大肠杆菌的L-色氨酸相关代谢途径进行改造，从而提供L-色氨酸的生产菌株，菌株构建及L-色氨酸发酵法制备的方法。
①L-色氨酸生产菌株的trpR、tyrR、tnaA、tyrA和pheA一 个或几个基因进行敲除或失活，通过对这些基因的改造有效解除L-色氨酸的负调控或切断分支代谢从而有利于L-色氨酸的积累；
②构建含有L-色氨酸代谢途径被突变基因aroGfbr、SerA和trpEfbrDCBA的重组质粒pTrp，其中基因aroGfbr和trpEfbr通过引入突变位点，导致其表达产物对L-色氨酸不敏感；
③构建含有L-色氨酸代谢途径被过表达基因aroFfbr、aroE、aroB、ppsA、tktA、aroK、aroA和aroC的重组质粒pSKKAC，对基因进行过表达，目的是为了增强整个芳香族氨基酸代谢途径的前体供应，最终增加L-色氨酸的产量。
④将重组质粒pTrp、pSKKAC分别或同时转入基因敲除菌株中，获得L-色氨酸生产菌株。
利用本发明获得的L-色氨酸生产菌株进行发酵，可以获得L-色氨酸的有效积累，为L-色氨酸的产业化生产奠定了基础。
具体地，在一个实施方案中，本发明提供了一种L-色氨酸生产菌，其特征在于所述L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变，并且/或者一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因敲除或失活，并且/或者一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被过表达；优选地，其中所述突变基因为aroFfbr和/或aroGfbr、trpEfbr，并且其中所述突变基因aroFfbr和/或aroGfbr、trpEfbr具有代谢终产物抗反馈抑制脱敏的特性，更优选地所述aroFfbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸；优选地，其中所述敲除或失活基因为tyrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA中的一个或几个；优选地，其中所述过表达的基因为aroFfbr、aroB、aroE、aroD、aroL和/或aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA和tktA。
在一个优选实施方案中，上述基因是组合表达在合适拷贝的表达载体上或整合在基因组上。
在一个实施方案中，本发明提供了一种重组载体pTrp，其特征在于在pSUN007的多克隆位点中插入以下基因：aroGfbr、SerA和trpEfbrDCBA基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组载体 pSKKAC，其特征在于在pSU2718的多克隆位点中插入以下基因：aroFfbr、aroE、aroB、ppsA、tktA、aroK、aroA和aroC，其中所述aroFfbr是经突变的，优选地所述突变为aroFfbr的148位脯氨酸突变成亮氨酸。
在另一个优选实施方案中，所述L-色氨酸生产菌的特征在于其pheA和/或tyrA基因被敲除；优选地，所述的L-色氨酸生产菌还被所述重组载体pTrp和/或所述重组载体pSKKAC所转化。
优选地，前述L-色氨酸生产菌属于大肠杆菌种属。
在另一个实施方案中，本发明提供了前述L-色氨酸生产菌在L-色氨酸生产中的应用。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了前述重组载体pTrp和pSKKAC在制备用于生产L-色氨酸的L-色氨酸生产菌中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种发酵生产L-色氨酸的生产方法，其中使用前述L-色氨酸生产菌作为发酵生产菌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种L-色氨酸生产菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤中一步或多步：
A、L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因敲除或失活；
B、L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变；
C、L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被过表达。
D、将含有L-色氨酸代谢途径中被突变和被过表达关键基因的重组质粒转入基因敲除菌株中，获得了L-色氨酸的生产菌株。
优选地，其中所述步骤A包括敲除或失活基因为tyrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA中的一个或几个；并且/或者，其中所述步骤B包括突变基因为aroFfbr和/或aroGfbr、trpEfbr，并且其中所述突变基因aroFfbr和/或aroGfbr和trpEfbr具有代谢终产物抗反馈抑制脱敏的特性；并且/或者，其中所述步骤C包括过表达的基因 为aroFfbr、aroB、aroE、aroD、aroL和/或aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA和tktA；并且/或者，其中所述步骤D包括权利要求4的重组质粒和/或权利要求5的重组质粒。
在另一个优选实施方案中，前述方法还包括，将所述重组质粒pTrp和pSKKAC转入基因敲除菌株中，从而获得了L-色氨酸生产菌株。
附图说明
图1：为重组质粒pTrp的示意图，过表达L-色氨酸操纵子trpEfbrDCBA以及aroGfbr和serA基因。
图2：为重组质粒pSK的示意图，过表达aroE、aroB、tktA、ppsA和aroFfbr。
图3：为重组质粒pSKKAC的示意图，在pSK的基础上，将aroK、aroA和aroC进行过表达。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而并非用于限定本发明的范围。
根据大肠杆菌中L-色氨酸的代谢途径，本发明是在菌株CGSC7692的基础上构建了一系列突变体，如：trpR、tyrA、tnaA和pheA等的敲除或失活，其中trpR的敲除去除了基因组上色氨酸合成及转运关键酶受到的反馈阻遏调控，pheA、tyrA的敲除切断了分支代谢从而有利于L-色氨酸的积累，tnaA的敲除阻断了色氨酸的分解代谢。在这些突变体中在合适的载体上组合表达aroFfbr/aroGfbr、aroB、aroE、aroD、aroK/L、aroA、aroC、ppsA、tktA、serA和L-色氨酸操纵子trpEfbrDBCA等，构建了一系列的L-色氨酸基因工程菌。
CGSC7692(购于E.coli Genetic Stock Center，YaleUniversity，New Haven，Connecticut，USA)突变菌株的构建，参考Gust.B.等的文献(PCR-targeting system in Streptomycescoelicolor，Gust.B.，Kieser T.et al，2002)，利用PCR-Targeting方法进行大肠杆菌基因组中pheA、trpR、tyrA和tnaA基因的敲除，具体如下：
实施例1：敲除pheA基因的菌株CGSC7692(ΔpheA)的制备
1.突变菌株CGSC7692(ΔpheA::Kan)的制备
以CGSC10048(ΔpheA::Kan)基因组为模板，利用引物pheA-V-F和pheA-V-R，PCR扩增phe A突变基因片段，引物序列如下：
正向引物pheA-V-F：5′-GGAGGCGTTTCGTCGTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)
反向引物pheA-V-R：5′-GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3′(SEQ ID NO：2)
扩增反应体系：10×KOD缓冲液(不含MgSO4)5μl，MgSO4(25mM)3μl，dNTP(2.5mM)4μl，KOD聚合酶1μl，模板1μl，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，加ddH2O至50μl(本发明所用PCR反应试剂均购于TOYOBO公司)。
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，68℃，90sec，30个循环。
胶回收pheA突变基因片段的PCR产物1.5kb(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物电转入100μl已转有pKD46(pKD46购于E.coli Genetic Stock Center，Yale University，NewHaven，Connecticut，USA)质粒的CGSC7692大肠杆菌感受态细胞(即大肠杆菌CGSC7692/pKD46感受态细胞)中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，于37℃ 下LB培养基培养1～2小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)的固体LB平板上，37℃过夜静置培养，对长出的转化子进行菌落PCR验证，PCR片段大小为1.5kb表明对应的转化子就是pheA基因的突变菌株CGSC7692(ΔpheA::Kan)。
将获得的阳性转化子以引物：
正向引物pheA-V-F：5′-GGAGGCGTTTCGTCGTGTGA-3′
反向引物pheA-V-R：5′-GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3′
进行菌落PCR鉴定，阳性片段大小应为1.5kb。
PCR鉴定体系：10×Taq缓冲液(不含MgCl2)2μl，MgCl2(25mM)1.2μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，Taq聚合酶1μl，Primer-F(10μM)1μl，Primer-R(10μM)1μl，加ddH2O至20μl(本发明PCR验证鉴定所用试剂均购于TAKARA公司)。
PCR鉴定条件：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30个循环。
2.抗性基因环出
将携带有高温诱导的能识别FLP识别位点(FRT)的重组酶FLP的BT340质粒(购于E.coli Genetic Stock Center)，借助电击(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)转化入突变菌株CGSC7692(ΔpheA::Kan)，菌液涂布于含有氯霉素(25μg/ml)固体LB平板上30℃下静置培养24小时，将得到的单菌落转接到不含抗生素的LB平板上，42℃静置培养12小时，利用高温诱导的重组酶FLP将FRT位点间基因盒去除掉，得到敲除pheA基因的菌株CGSC7692(ΔpheA)。
获得的基因敲除菌株以引物：
正向引物pheA-V-F2：5′-GGAAACAAACATGAAACACATACCG-3′(SEQ ID NO：3)
反向引物pheA-V-R：5′-GCAAGGTGGAGCACTGGTTC-3
进行菌落PCR鉴定，阳性片段应为同源臂大小400bp左右，PCR条件同实施例1中第1步所述的鉴定方法。
实施例2敲除tyrA基因的菌株CGSC7692(ΔtyrA)制备
1.突变菌株CGSC7692(ΔtyrA::Kan)的制备
以CGSC10049(ΔtyrA::Kan)基因组为模板，利用引物tyrA-V-F和tyrA-V-R，PCR扩增tyrA突变基因片段，引物序列如下(PCR所用试剂及反应体系同实施例1中所述的基因扩增方法)：
正向引物tyrA-V-F：5′-TATCCGTAACCGATGCCTGC-3′(SEQ ID NO：4)
反向引物tyrA-V-R：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′(SEQ ID NO：5)
胶回收tyrA突变基因的PCR产物1.5kb(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌CGSC7692/pKD46感受态细胞中(方法同实施例1中所述)，于37℃下LB培养基培养1～2小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)的固体LB平板上，37℃过夜静置培养，对长出的转化子进行菌落PCR验证，PCR片段大小为1.5kb表明对应的转化子就是tyrA基因的突变菌株CGSC7692(ΔtyrA::Kan)。
获得的阳性转化子以引物：
正向引物tyrA-V-F：5′-TATCCGTAACCGATGCCTGC-3′
反向引物tyrA-V-R：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′
进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定体系及条件同实施例1所述的菌落PCR鉴定方法，阳性片段大小应为1.5kb左右。
2.抗性基因环出
将携带有高温诱导的能识别FRT的重组酶FLP基因的BT340质粒(购于E.coli Genetic Stock Center)，借助电击(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)转化入突变菌株CGSC7692(ΔtyrrA::Kan)，抗性基因环出方法同实施例1中所述，得到敲除tyrA基因的菌株CGSC7692(ΔtyrA)。
获得的基因敲除菌株以引物：
正向引物tyrA-V-F2：5′-TCGCTCAATTATTGGTCTGATGATC-3′(SEQ ID NO：6)
反向引物tyrA-V-R：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′
进行菌落PCR鉴定，阳性片段应为同源臂大小300bp左右，PCR条件同实施例1中第1步所述的菌落PCR鉴定方法。
实施例3敲除trpR基因的菌株CGSC7692(ΔtrpR)的制备
1.突变菌株CGSC7692(ΔtrpR::Kan)的制备
以CGSC11110(ΔtrpR::Kan)基因组为模板，利用引物trpR-V-F和trpR-V-R，PCR扩增trpR突变基因片段，引物序列如下(PCR所用试剂及反应体系同实施例1的基因扩增方法)：
正向引物trpR-V-F：5′-ATGGGGGATAAACCGACGTT-3′(SEQ ID NO：7)
反向引物trpR-V-R：5′-ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3′(SEQ ID NO：8)
胶回收trpR突变基因的PCR产物1.5kb(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌CGSC7692/pKD46感受态细胞中(方法同实施例1)，于37℃下LB培养基培养1～2小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)的固体LB平板上，37℃过夜静置培养，对长出的转化子进行菌落PCR验证，PCR片段大小为1.5kb表明对应的转化子就是trpR基因的突变菌株CGSC7692(ΔtrpR::Kan)。
获得的阳性转化子以引物：
正向引物trpR-V-F：5′-ATGGGGGATAAACCGACGTT-3′
反向引物trpR-V-R：5′-ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3′
进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定体系及条件同实施例1中所述的菌落PCR鉴定方法，阳性片段大小应为1.5kb左右。
2.抗性基因环出
将携带有高温诱导的能识别FRT的重组酶FLP的BT340质粒(购于E.coli Genetic Stock Center)，借助电击(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)转化入突变菌株CGSC7692(ΔtrpR::Kan)，抗性基因环出方法同实施例1，得到敲除trpR基因的菌株 CGSC7692(ΔtrpR)。
获得的基因敲除菌株以引物：
正向引物trpR-V-F2：5′-AGACGCGCGGTTATGTGAAG-3′(SEQ ID NO：9)
反向引物trpR-V-R：5′-ATGCCGTGTATTAAGCGCCT-3′
进行菌落PCR鉴定，阳性片段应为同源臂大小400bp左右，PCR条件同实施例1中第1步所述的菌落PCR鉴定方法。
实施例4敲除tnaA基因的菌株CGSC7692(ΔtnaA)的制备
1.突变菌株CGSC7692(ΔtnaA::Kan)的制备
以CGSC8309(ΔtnaA::Kan)基因组为模板，利用引物tnaA-V-F和tnaA-V-R，PCR扩增tnaA突变基因片段，引物序列如下(PCR所用试剂及反应体系同实施例1中所述的基因扩增方法)：
正向引物tnaA-V-F：5′-CCTTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3′(SEQ ID NO：10)
反向引物tnaA-V-R：5′-CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3′(SEQ ID NO：11)
胶回收tnaA突变基因的PCR产物1.5kb(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌CGSC7692/pKD46感受态细胞中(方法同实施例1)，于37℃LB培养基培养1～2小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)的固体LB平板上，37℃过夜静置培养，对长出的转化子进行菌落PCR验证，PCR片段大小为1.5kb表明对应的转化子就是tnaA基因的突变菌株CGSC7692(ΔtnaA::Kan)。
获得的阳性转化子以引物：
正向引物tnaA-V-F：5′-CCTTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3′
反向引物tnaA-V-R：5′-CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3′
进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定体系及条件同实施例1中所述的菌落PCR鉴定方法，阳性片段大小应为1.5kb左右。
2.抗性基因环出
将携带有高温诱导的能识别FRT的重组酶FLP的BT340质粒(购于E.coli Genetic Stock Center)，借助电击(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)转化入突变菌株CGSC7692(ΔtnaA::Kan)，抗性基因环出方法同实施例1，得到敲除tnaA基因的菌株CGSC7692(ΔtnaA)。
获得的基因敲除菌株以引物：
正向引物tnaA-V-F2：5′-AGTTGATGACTCATGATGAACCC-3′(SEQ ID NO：12)
反向引物tnaA-V-R：5′-CTTGATCAGTCATGATGCCACC-3′
进行菌落PCR鉴定，阳性片段应为同源臂大小400bp左右，PCR条件同实施例1中第1步所述的菌落PCR鉴定方法。
实施例5：双敲或多敲除菌株的获得
1.突变菌株CGSC7692(ΔpheAΔtyrA::Kan)的制备
以CGSC10049(ΔtyrA::Kan)(购于E.coli Genetic StockCenter，Yale University，New Haven，Connecticut，USA)基因组为模板，利用引物tyrA-V-F和tyrA-V-R，PCR扩增tyrA突变基因片段，引物序列如下(PCR所用试剂及反应体系同实施例1中所述的基因扩增方法)：
正向引物tyrA-V-F：5′-TATCCGTAACCGATGCCTGC-3′
反向引物tyrA-V-R：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30循环。
胶回收tyrA突变基因的PCR产物1.5kb(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌CGSC7692(ΔpheA)/pKD46感受态细胞中(方法同实施例1)，于37℃LB培养基活化培养1～2小时，将菌液涂布在含有卡那霉素 (100μg/ml)的固体LB平板上，能够长出的转化子进行菌落PCR鉴定，阳性片段大小应为1.5kb，对应的转化子就是在CGSC7692(ΔpheA)基础上tyrA基因的突变菌株CGSC7692(ΔpheAΔtyrA::Kan)。
2.抗性基因环出
所用方法同实施例1，得到的基因敲除菌株为CGSC7692(ΔpheAΔtyrA)，获得的阳性转化子以引物：
正向引物tyrA-V-F2：5′-TCGCTCAATTATTGGTCTGATGATC-3′
反向引物tyrA-V-R：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′
进行菌落PCR鉴定，PCR片段大小应为400bp左右，PCR条件、体系及所用试剂同实施例1。
其它不同突变株的组合方法同上，可以获得多突变菌株。
实施例6：重组质粒pTrp的构建
1.pSUNtrp的构建：
以CGSC7692的基因组为模板，用引物Trp-Op-F和Trp-Op-R扩增6.58kb的片断trpoperon(即色氨酸操纵子trpEDCBA基因)，两端利用引物引入EcoR I、BamH I酶切位点，TA克隆到pMD18-T，得重组质粒pMDtrpoperon，测序，验证后，EcoR I、BamH I双酶切，回收6.58kb片段trpoperon(胶回收参照杭州爱思进试剂盒回收方法)；
pSUN006(在pTrc99a质粒基础上，将pTrc99a质粒的NcoI酶切位点定点突变，ATG突变为TTG，从而得到pSUN006；所用引物为pTrc99aKO-F、pTrc99aKO-R，pTrc99a购于Pharmacia公司)用EcoR I、BamH I双酶切回收4.17kb片段，与trpoperon连接，转化大肠杆菌DH5α(感受态制备方法参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取转化子，抽提转化子质粒(质粒抽提参照杭州爱思进质粒抽提试剂盒方法)，用EcoR I、BamH I双酶切验证，所得阳性重组质粒pTrctrpO应为10.75k；
以pTrctrpO为模版，用引物Trc-Op-F和Trc-Op-R从 pTrctrpO扩增带Ptrc片段的trpoperon(约7kb)，分别用引物加Kpn I酶切位点，TA克隆，测序，酶切回收目的片段(7kb)，克隆入pSUN007(在pBR322基础上，以pBR322为模板，利用引物pBR322-F、pBR322-R扩增约3.3kb条带，扩增条带胶回收后，利用KpnI酶切，再利用连接酶连接，得到pSUN007；其中pBR322购于Promega)重组质粒pSUNtrp(12.3kb)。连接反应体系：10×连接缓冲液1μl，待连接的样品(胶回收产物，载体与片段的mol比为1∶3-5)，连接酶0.5-1μl，加水补足10μl，16℃过夜连接。(连接反应所用试剂及酶均购于TAKARA)。
引物序列如下：
Trp-Op-F：5′-GAGAATTCCAATGCAAACACAAAAAC-3′(SEQ ID NO：13)
Trp-Op-R：5′-TGGATCCAGAAAGTTAAAATGCCG-3′(SEQ ID NO：14)
pTrc99aKO-F：5′-CACAGGAAACAGACCTTGGAATTCGAGCTC-3′(SEQ ID NO：15)
pTrc99aKO-R：5′-GAGCTCGAATTCCAAGGTCTGTTTCCTGTG-3′(SEQ ID NO：16)
Trc-Op-F：5’-GGTACCCCATTTACGTTGACACCATC-3’(SEQ ID NO：17)
Trc-Op-R：5’-GGTACCCGGGGATCCTCGACACTC-3’(SEQ ID NO：18)
pBR322-F：5′-CGGGGTACCACTAGTCCATGGAGATCTCCCGGGCAAGAATTCTCATGTTTGAC-3′(SEQ ID NO：19)
pBR322-R：5′-CGGGGTACCGAGCTCTCTAGACTCGAGAGTACTTTAGATTGATTTAAAACTTC-3′(SEQ ID NO：20)
2.pSUNaroG-serA的构建：
以W3110基因组(GenBank登录号：AP009048)为模板， 用引物aroG-F和aroG-R扩增aroG基因，两端分别添加EcoR I和Hind III位点，克隆入pSUN006中，获得pSUNaroG(连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
以W3110基因组为模板，用引物serA-F和serA-R扩增serA基因，两端分别添加Hind III位点，克隆入pSUNaroG的Hind III位点，获得pSUNaroG-serA(连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
引物序列如下：
aroG-F：5′-CGAATTCATGAATTATCAGAACGACG-3′(SEQ ID NO：21)
aroG-R：5′-AAGCTTACCCGCGACGCGCTTTTAC-3′(SEQ ID NO：22)
serA-F：5′-AAGCTTCGCCAGTCGGGATATTAAG-3′(SEQ ID NO：23)
serA-R：5′-AAGCTTGCAGCAACGCGGCAACGG-3′(SEQ ID NO：24)
3.pTrp的构建：
以pSUNaroG-serA为模板，用引物GA-F和GA-R扩增PtrcaroG-serA片段，两端分别添加Xba I位点，克隆入pSUNtrp的Xba I位点获得质粒pTrp(连接反应条件及体系同实施例6第1步)，其结构如图1所示。
引物序列如下：
GA-F：5′-TCTAGAGTCAATTCTCATGTTTGAC-3′(SEQ ID NO：25)
GA-R：5′-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCCGG-3′(SEQ ID NO：26)
实施例6中PCR扩增所用试剂及酶均购于TAKARA，pMD18-T购于TAKARA，TA克隆及酶切方法参照TAKARA说明书，酶切反应参照TAKARA说明书进行，胶回收试剂盒购于杭州爱思进。
实施例7：重组质粒pSKKAC的构建
1.重组质粒pSU-F的克隆
以E.coli DH5α(Amersham公司)的基因组为模板，利用引物P148L(+)、P148L(-)、aroFSac I(+)和aroFSacI(-)进行重叠PCR，扩增E.coli DH5α的aroF基因，引物序列如下：
P148L(+)：5′-TTAGATCTGAATAGCCCGCAATACCTGGGC-3′；(SEQ IDNO：27)
P148L(-)：5′-GCTATTCAGATCTAACGCTTCCGTCGCCAGTGG-3′；(SEQ ID NO：28)
aroFSacI(+)：5′-AACGAGCTCACCGGAAAGTCCTCGGGCATAAG-3′；(SEQ ID NO：29)
aroFSacI(-)：5′-AACGAGCTCCGACTTCATCAATTTGATCGCGTAA-3′；(SEQ ID NO：30)
首先用引物对aroFSacI(+)和P148L(+)扩增出一个0.9kb长的片段，扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环；再用引物对aroFSacI(-)和P148L(-)扩增出另一个片段0.7kb，扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，1min，72℃，1min，30循环；胶回收上述两个PCR片段，再用引物对aroFSacI(+)和aroFSacI(-)扩增出aroF全长基因：扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
PCR产物测序结果显示已经将E.coli DH5α中的aroF基因148位脯氨酸突变成亮氨酸，克隆得到突变的aroF基因，然后将PCR片断用SacI酶切后克隆至pSU2718质粒(Martinez，E.，B.Bartolome，and F.de la Cruz.1988.pACYC184-derived cloningvectors containing the multiple cloning site and lacZαreportergene of pUC8/9 and pUC18/19 plasmids.Gene 68：159-162)，得到 重组质粒pSU-F。
2.重组质粒pSU-FE的克隆
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物aroE(NcoI)和aroE(BamI)，PCR扩增E.coli DH5α的aroE基因，引物序列如下：
aroE(NcoI)：5′-CATGCCATGGAAACCTATGCTGTTTTTG-3′；(SEQ ID NO：31)
aroE(BamI)：5′-CGGGATCCTCACGCGGACAATTCCTCCTG-3′；(SEQ IDNO：32)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroE基因胶回收，用NcoI和BamHI酶切后，克隆至质粒pTrc99a(Pharmacia公司)，得到重组质粒pTrc-aroE。酶切体系：10×Buffer 1μl，待切样品2μl，酶0.5-1μl，加水补足10μl，37℃温育1-2小时。(酶切所用试剂及酶均购于TAKARA，连接反应条件及体系同实施例6第1步)；
以质粒pTrc-aroE为模板，利用引物aroE(BglII)和aroE(BamI)，PCR扩增质粒pTrc-aroE中的aroE基因，引物序列如下：
aroE(BglII)：5′-GAAGATCTCGACATCATAACGGTTCTGGC-3′；(SEQ IDNO：33)
aroE(BamI)：5′-CGGGATCCTCACGCGGACAATTCCTCCTG-3′；(SEQ IDNO：34)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroE基因再以BglII和BamHI酶切克隆至载体质粒pSU-F，得到重组质粒pSU-FE(酶切反应条件及体系同上，连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
3.重组质粒pSU-FEB的构建
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物aroB(NcoI)和aroB(SacI)，PCR扩增E.coli DH5α的aroB基因，引物序列如下：
aroB(NcoI)：5′-CATGCCATGGATGGAGAGGATTGTCG-3′；(SEQ ID NO：35)
aroB(SalI)：5′-GCGTCGACTTACGCTGATTGACAATC-3′；(SEQ ID NO：36)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
扩增得到的aroB基因以NcoI和SalI酶切后克隆至质粒pET28(b)(Novagen公司)，得到重组质粒pET-aroB，再使用XbalI和SalI酶切重组质粒pET-aroB，将切下的aroB基因克隆至pSU-FE，得到重组质粒pSU-FEB(酶切反应条件及体系同实施例7第2步，连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
4.重组质粒pSU-FEBP的构建
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物ppsA-3和ppsA-4，PCR扩增E.coli DH5α的ppsA基因，引物序列如下：
ppsA-3：5′-CGGAATTCAAACGCACAGAAGCGTAGAACG-3′；(SEQID NO：37)
ppsA-4：5′-CGGGATCCCATAACCCCGGCGACTAAACGC-3′；(SEQID NO：38)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，57℃，45sec，72℃，2.5min，30循环。
将重组质粒pSU-FEB用HindIII酶切后补平(参照TAKARA说明书Klenow酶补平方法进行)，然后将扩增得到的ppsA基因的平端连接至pSU-FEB，得到重组质粒pSU-FEBP(酶切反应条 件及体系同实施例7第2步，连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
5.重组质粒pSK的构建
以大肠杆菌K-12(GenBank登录号：U00096)的基因组为模板，利用引物tktAF(NdeI)和tktAR(BamHI)，PCR扩增大肠杆菌K-12的tktA基因，引物序列如下：
tktAF(NdeI)：5′-GGAATTCCATATGTCCTCACGTAAAGAGCTTG-3′；(SEQID NO：39)
tktAR(BamHI)：5′-CGGGATCCTTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCG-3′；(SEQID NO：40)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，2min，30循环。
扩增得到的tktA基因以NdeI和BamHI酶切后克隆至pET-24(a)(Novagen公司)中，得到质粒pET-tktA(连接反应条件及体系同实施例6第1步)。
以质粒pET-tktA为模板，使用引物tktA(I)和tktA(II)，PCR扩增重组质粒pET-tktA中的tktA基因连同pET24(a)中的RBS位点，引物序列如下：
tktA(I)：5′-CATGCATGCTCTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3′；(SEQ IDNO：41)
tktA(II)：5′-CATGCATGCTTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCG-3′；(SEQID NO：42)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，60℃，45sec，72℃，2min，30循环。
扩增产物以SphI酶切后克隆至质粒pSU-FEBP，得到重组质粒pSK，其结构如图2所示。(酶切反应条件及体系同实施例7第2步，连接反应条件及体系同实施例6第1步)
6.重组质粒pSKKAC的构建
以W3110基因组为模板，分别PCR扩增aroK，两端加NcoI、BamHI位点，TA克隆(同实施例6，参照TAKARA说明书)，得到重组质粒pMD-K；扩增aroA，两端加BamHI、PstI位点，得到重组质粒pMD-A；扩增aroC，两端加PstI、HindIII位点，得到重组质粒pMD-C。引物序列如下，其中下划线部分为RBS，来源于pET24(a)：
pFarok ：5’-GCCATGGCAGAGAAACGCAATATC-3’(SEQ ID NO：43)
pRarok：5’-GGGATCCTTAGTTGCTTTCCAGCATG-3’(SEQ ID NO：44)
pFaroA：5’-CGGATCCAAGAAGGAGATATACATGGAATCCCTGACGTTAC-3’(SEQ ID NO：45)
pRaroA：5’-CCTGCAGTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3’(SEQ ID NO：46)
pFaroC：5’-CCTGCAGAAGAAGGAGATATAGATGGCTGGAAACACAATTG-3’(SEQ ID NO：47)
pRaroC：5’-CAAGCTTTTACCAGCGTGGAATATCAG-3’(SEQ ID NO：48)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，1.5min，30循环。
以NcoI、BamHI酶切pMD-K，回收aroK片段(600bp)，克隆至质粒pTrc99a(Pharmacia公司)，得到重组质粒pTrc-K；以BamHI、PstI酶切pMD-A，回收aroA片段(1.3kb)，克隆至质粒pTrc-K，得到重组质粒pTrc-KA；以PstI、HindIII酶切pMD-C，回收片段(1.1kb)，克隆至质粒pTrc-KA，得到重组质粒pTrc-KAC。(连接反应条件及体系同实施例6第1步)
以质粒pTrc-KAC为模板，利用引物Trc-KAC-F(NheI)和Trc-KAC-R(NheI)扩增带Ptrc的trc-KAC片段(2.9kb)，克 隆至质粒pSK，得到重组质粒pSKKAC(如图3所示)。连接反应条件及体系同实施例6第1步，所用引物序列如下：
Trc-KAC-F(NheI)：5’-CGCTAGCGTAAATCACTGCATAATTC-3’(SEQ ID NO：49)
Trc-KAC-R(NheI)：5’-GGCTAGCATGAGCGGATACATATTTG-3’(SEQ ID NO：50)
扩增条件为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，3min，30循环。
实施例7中PCR扩增所用试剂及酶均购于TAKARA，pMD18-T购于TAKARA，TA克隆、酶切及补平方法参照TAKARA说明书，胶回收试剂盒购于杭州爱思进。
实施例8：L-色氨酸重组表达菌株的获得
将实施例1-5获得的多种敲除基因的大肠杆菌宿主菌CGSC7692突变体制成感受态细胞，然后用化学转化方法或电击转化方法将实施例6和7获得的多种组合重组表达质粒转入感受态细胞(感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆III》第1章96页)。
即将pTrp、pTrp/pSKKAC重组质粒分别转入宿主菌CGSC7692、CGSC7692(ΔpheAΔtyrA)和CGSC7692(ΔtrpR)中，获得了L-色氨酸发酵生产基因工程菌如表1所示：
表1.获得的基因工程菌
| CIBTS2 | CGSC7692/pTrp |
| CIBTS120 | CGSC7692/pTrp/pSKKAC |
| CIBTSXXA | CGSC7692(ΔpheAΔtyrA)/pTrp |
| CIBTSXXB | CGSC7692(ΔpheAΔtyrA)/pTrp/pSKKAC |
| CIBTSXXC | CGSC7692(ΔtrpR)/pTrp |
| CIBTSXXD | CGSC7692(ΔtrpR)/pTrp/pSKKAC |
实施例9：L-色氨酸基因工程菌发酵生产L-色氨酸
无菌牙签挑取单菌落接种于含4ml含四环素(15μg/ml)和/或氯霉素(25μg/ml)LB培养基的试管中，37℃，200rpm过夜培养，然后按1％的接种量接种至25ml摇瓶种子培养基中，37℃，220rpm培养24小时，随后按20％的比例转接至25ml摇瓶发酵培养基中，37℃，220rpm培养28小时。
同时以不含重组质粒的CGSC7692、CGSC7692(ΔpheAΔtyrA)、CGSC7692(ΔtrpR)空菌进行摇瓶发酵作为对照。
发酵结束，以HPLC测定发酵液上清中的L-色氨酸含量，HPLC的测定条件如下：
HPLC(Agilent technologies，1100)，柱子：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm)，流动相组成，水∶乙腈＝92∶8(v/v)，流速是1ml/min，鉴于色氨酸在226nm处有最大吸收，故检测波长226nm。
LB培养基：
| 名称 | 用量(g/L) |
| 蛋白胨(OXOID) | 10 |
| 酵母提取物(OXOID) | 5 |
| 氯化钠 | 10 |
| pH | 7.0 |
摇瓶种子培养基：
| 名称 | 用量(g/L) |
| 葡萄糖 | 28 |
| KH2PO4 | 10 |
| K2HPO4 | 24 |
| MgSO4·7H2O | 1.0 |
| (NH4)2SO4 | 5 |
发酵培养基：
| 名称 | 用量(g/L) |
| 葡萄糖 | 35 |
| KH2PO4 | 7.5 |
| MgSO4·7H2O | 0.02 |
| 柠檬酸 | 2.0 |
| (NH4)2SO4 | 25 |
| Na2SO4 | 1 |
| MnSO4 | 0.2 |
| FeSO4·7H2O | 0.16 |
| ZnCl2 | 0.002 |
| CoCl2·6H2O | 0.002 |
| CuSO4·5H2O | 0.00003 |
| CaCO3 | 20 |
对每种菌株进行三次平行摇瓶发酵，摇瓶发酵L-色氨酸产量结果如表2、3所示：
表2.部分基因工程菌L-色氨酸产量比较
表3.部分空菌L-色氨酸产量
从表2可得知CIBTS2摇瓶发酵L-色氨酸产量最高为2.13g/L，CIBTS120摇瓶发酵L-色氨酸产量比CIBTS2提高了20％左右；CIBTXXA摇瓶发酵L-色氨酸产量比CIBTXXB提高了24％；当trpR基因缺失时，CIBTSXXD菌株的L-色氨酸摇瓶发酵产量达到了3.10g/L，表明对基因的缺失突变起到了明显的效果；从表2、3对比可得知，空白菌摇瓶发酵色氨酸产量非常低，但双敲除的菌株仍然高于野生型菌株，将重组质粒转入宿主菌后，色氨酸的产量最高达到了3.10g/L，且双质粒菌株的产量明显高于单质粒。
综上所述，本发明所构建的L-色氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中L-色氨酸的有效积累，从而为L-色氨酸生产的产业化奠定了基础。
Claims (12)
1.一种L-色氨酸生产菌，其特征在于
1)所述L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变；或者
2)所述L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变，并且一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被敲除或失活；或者
3)所述L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变，并且一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被过表达；或者
4)所述L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被突变，一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因被过表达；
其中所述被突变基因选自aroFfbr、aroGfbr和trpEfbr，并且其中所述被突变基因aroFfbr、aroGfbr和trpEfbr具有代谢终产物抗反馈抑制脱敏的特性；
其中所述被敲除或失活基因选自tyrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA；
其中所述被过表达的基因选自aroFfbr、aroB、aroE、aroD、aroL、aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA和tktA；
其中所述aroFfbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸；
其中所述trpEfbr是通过以下方式改造的：以CGSC7692的基因组为模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物扩增得到trpoperon基因，将其两端利用引物引入EcoR I和BamH I酶切位点，TA克隆到pMD18-T中，得重组质粒pMDtrpoperon，进行测序，然后以EcoR I和BamH I双酶切，回收片段trpoperon；将该片段连接到pSUN006的EcoR I和BamH I位点中得到重组质粒pTrctrpO，再以该质粒为模板，以SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18为引物扩增得到带Ptrc片段的trpoperon，两端用引物加Kpn I酶切位点，TA克隆，测序，酶切回收7kb的目的片段，克隆入pSUN007得到重组质粒pSUNtrp；
其中所述aroGfbr是通过以下方式改造的：以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物扩增得到aroG基因，两端分别添加EcoR I和Hind III位点，克隆入pSUN006得到pSUNaroG；然后再以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物扩增serA基因，两端添加Hind III位点，克隆到pSUNaroG的Hind III位点中，获得pSUNaroG-serA；再以pSUNaroG-serA为模板，以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物扩增得到PtrcaroG-serA，两端添加XbaI位点，克隆到pSUNtrp的XbaI位点中；
其中所述pSUN006是通过以下方式获得的：以pTrc99a质粒为基础，对其NcoI酶切位点进行突变，将ATG突变为TTG；
其中所述pSUN007是通过以下方式获得的：以pBR322为模板，利用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物扩增约3.3kb的条带，将扩增条带回收纯化后以KpnI酶切，再利用连接酶连接。
2.权利要求1所述的L-色氨酸生产菌，其特征在于所述被突变的基因是组合表达在合适拷贝的表达载体上或整合在基因组上，所述被敲除或失活基因是发生在基因组上，所述被过表达的基因是组合表达在合适拷贝的表达载体上。
3.权利要求1所述的L-色氨酸生产菌，其特征在于所述L-色氨酸生产菌为基因trpR、tyrA和pheA中的一个或多个同时被敲除或失活。
4.一种重组载体pTrp，其特征在于在pSUN007的多克隆位点中插入以下基因：aroGfbr、SerA和trpEfbrDCBA基因；
其中所述trpEfbr是通过以下方式改造的：以CGSC7692的基因组为模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物扩增得到trpoperon基因，将其两端利用引物引入EcoR I和BamH I酶切位点，TA克隆到pMD18-T中，得重组质粒pMDtrpoperon，进行测序，然后以EcoR I和BamH I双酶切，回收片段trpoperon；将该片段连接到pSUN006的EcoR I和BamH I位点中得到重组质粒pTrctrpO，再以该质粒为模板，以SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18为引物扩增得到带Ptrc片段的trpoperon，两端用引物加Kpn I酶切位点，TA克隆，测序，酶切回收7kb的目的片段，克隆入pSUN007得到重组质粒pSUNtrp；
其中所述aroGfbr是通过以下方式改造的：以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物扩增得到aroG基因，两端分别添加EcoR I和Hind III位点，克隆入pSUN006得到pSUNaroG；然后再以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物扩增serA基因，两端添加Hind III位点，克隆到pSUNaroG的Hind III位点中，获得pSUNaroG-serA；再以pSUNaroG-serA为模板，以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物扩增得到PtrcaroG-serA，两端添加XbaI位点，克隆到pSUNtrp的XbaI位点中；
其中所述pSUN006是通过以下方式获得的：以pTrc99a质粒为基础，对其NcoI酶切位点进行突变，将ATG突变为TTG；
其中所述pSUN007是通过以下方式获得的：以pBR322为模板，利用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物扩增约3.3kb的条带，将扩增条带回收纯化后以KpnI酶切，再利用连接酶连接。
5.一种重组载体pSKKAC，其特征在于在pSU2718的多克隆位点中插入以下基因：aroFfbr、aroE、aroB、ppsA、tktA、aroK、aroA和aroC，其中所述aroFfbr突变为aroF的148位脯氨酸突变成亮氨酸。
6.权利要求3所述的L-色氨酸生产菌，其特征在于其还被权利要求4所述的重组载体pTrp和/或权利要求5所述的重组载体pSKKAC所转化。
7.权利要求1-3和6中任一项所述的L-色氨酸生产菌，其属于大肠杆菌。
8.权利要求1-3和6-7中任一项所述的菌在L-色氨酸生产中的应用。
9.权利要求4-5中任一项所述的重组载体在制备用于生产L-色氨酸的L-色氨酸生产菌中的用途。
10.一种发酵生产L-色氨酸的生产方法，其中使用权利要求1-3和6-7中任一项所述菌株作为发酵生产菌。
11.一种L-色氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤中的步骤B、步骤A+B、步骤B+C、步骤A+B+C，或者步骤A、B和C中的一种或多种+步骤D：
A.将L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因敲除或失活；
B.将L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因突变；
C.将L-色氨酸生产菌中一个或多个与L-色氨酸代谢途径相关的基因过表达；
D.将含有被突变和被过表达的L-色氨酸代谢途径中关键基因的重组质粒转入基因敲除菌株中；
其中，所述步骤A中被敲除或失活基因选自tyrR、trpR、tnaA、tyrA和pheA；
所述步骤B中被突变基因选自aroFfbr、aroGfbr和trpEfbr，并且其中所述被突变基因aroFfbr、aroGfbr和trpEfbr具有代谢终产物抗反馈抑制脱敏的特性；
所述步骤C中被过表达的基因选自aroFfbr、aroB、aroE、aroD、aroL、aroK、aroA、aroC、trpEfbrDCBA、serA、ppsA和tktA；
所述重组质粒包括权利要求4的重组质粒pTrp和/或权利要求5的重组质粒pSKKAC；
其中所述aroFfbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸；
其中所述trpEfbr是通过以下方式改造的：以CGSC7692的基因组为模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物扩增得到trpoperon基因，将其两端利用引物引入EcoR I和BamH I酶切位点，TA克隆到pMD18-T中，得重组质粒pMDtrpoperon，进行测序，然后以EcoR I和BamH I双酶切，回收片段trpoperon；将该片段连接到pSUN006的EcoR I和BamH I位点中得到重组质粒pTrctrpO，再以该质粒为模板，以SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18为引物扩增得到带Ptrc片段的trpoperon，两端用引物加Kpn I酶切位点，TA克隆，测序，酶切回收7kb的目的片段，克隆入pSUN007得到重组质粒pSUNtrp；
其中所述aroGfbr是通过以下方式改造的：以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物扩增得到aroG基因，两端分别添加EcoR I和Hind III位点，克隆入pSUN006得到pSUNaroG；然后再以W3110基因组为模板，以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物扩增serA基因，两端添加Hind III位点，克隆到pSUNaroG的Hind III位点中，获得pSUNaroG-serA；再以pSUNaroG-serA为模板，以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物扩增得到PtrcaroG-serA，两端添加XbaI位点，克隆到pSUNtrp的XbaI位点中；
其中所述pSUN006是通过以下方式获得的：以pTrc99a质粒为基础，对其NcoI酶切位点进行突变，将ATG突变为TTG；
其中所述pSUN007是通过以下方式获得的：以pBR322为模板，利用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物扩增约3.3kb的条带，将扩增条带回收纯化后以KpnI酶切，再利用连接酶连接。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，将权利要求11中的重组质粒pTrp、pSKKAC转入基因敲除菌株中，从而获得了L-色氨酸生产菌株。
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