CN113293121B

CN113293121B - 一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法

Info

Publication number: CN113293121B
Application number: CN202110670472.8A
Authority: CN
Inventors: 范立海; 郭强; 郑辉东
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2021-06-17
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2041-06-17
Also published as: CN113293121A

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，旨在利用细胞工厂制备木糖醇过程中实现木糖醇的高效合成。本发明通过引入SecY非特异性运糖通道并同时过表达异源的木糖还原酶（CbXR），成功构建一株SecY工程化大肠杆菌。该菌株能通过自我调节，克服CCR效应，缓解5‑磷酸木糖醇对自身转运木糖的抑制效果。凭借外部碳源的变化作为响应信号，将CCR效应及5‑磷酸木糖醇的抑制作用转化为碳代谢网络中的两个重要调节开关，调控细胞对葡萄糖和木糖的代谢能力。这一方法能完全代谢底物中任意比例的葡萄糖和木糖，保证能量向目标产品的最大转化效率，更符合绿色生物制造的要求。

Description

一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法

技术领域

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法。

背景技术

生物炼制对保护环境和保护不可再生的化石燃料是有益的，工业生物技术可以将农业废料中的碳源转化为有价值的化学物质，材料和生物燃料，以实现可持续的经济发展。木糖醇是一种五碳糖醇，与蔗糖一样甜，并且天然存在于水果、蔬菜和蘑菇中。由于木糖醇具有低热量，保护牙齿，抗糖尿病和抗致癌等特性，因此被认为是食品、制药和化学工业中有价值的衍生物。木糖醇的化学生产主要以木聚糖为原料人工制造。相反，通过微生物发酵生产木糖醇更环保，成本更低。

然而，依靠代谢工程技术，利用大肠杆菌在葡萄糖和木糖的混合碳源中生产木糖醇时无法避免两个重要影响因素。首先，葡萄糖存在产生的碳分解代谢阻遏效应（简称CCR效应）抑制木糖转运蛋白表达，导致木糖无法顺利被转运至胞内；其次木糖醇还会被木酮糖激酶磷酸化从而产生5-磷酸木糖醇，对木糖转运蛋白产生反馈抑制。这也是导致木糖醇产量偏低的原因。

虽然目前已有方法在大肠杆菌基因工程菌株中分别克服CCR效应和5-磷酸木糖醇抑制作用，实现木糖醇的转化，但都需要为大肠杆菌额外添加足够的葡萄糖，保证细胞对还原力的持续需求。然而，原始生物质经过预处理后的再利用，其中的碳源配比是随机的，如何理性设计大肠杆菌的碳代谢途径，使能量最大化向木糖醇转化是一个需要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法。通过构建大肠杆菌基因工程菌株SecY工程化大肠杆菌，克服大肠杆菌发酵生产木糖醇过程中的CCR效应和5-磷酸木糖醇的抑制作用，理性设计碳代谢流量的分配，提高微生物发酵法生产木糖醇的产量。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

在大肠杆菌JM109(DE3)中成功构建了SecY非特异性运糖通道，保证木糖在浓度差的作用下，自由扩散进入细胞，并且构建了木糖到木糖醇的代谢途径，实现大肠杆菌利用混合碳源高效发酵生产木糖醇。

过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因于敲除xylF基因和xylE基因的大肠杆菌JM109(DE3)（即JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌），成功构建了SecY非特异性运糖通道。在此基础上过表达cbXR基因，成功构建了SecY工程化大肠杆菌，在大肠杆菌中实现了木糖还原为木糖醇的代谢途径，同时有效缓解了5-磷酸木糖醇对细胞代谢木糖的抑制。利用不同比例的葡萄糖和木糖发酵，阐明了SecY工程化大肠杆菌在碳代谢流量智能调控中的能量代谢方式。

一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，包括以下步骤：

（1）在JM109(DE3)ΔXylFGH-ΔXylE大肠杆菌中过表达基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG，构建并表达SecY非特异性运糖通道；

（2）在含SecY非特异性运糖通道的大肠杆菌中过表达cbXR基因，构建并表达木糖醇的合成途径；

（3）以不同配比的葡萄糖和木糖为主要条件，进行发酵，阐明碳代谢流量智能调控系统的作用。

上述步骤（1）中JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌，其构建方法包括以下步骤：分别设计含有xylF基因、xylE基因同源臂序列的PCR引物以pkD13质粒为模板进行PCR扩增，得到一段两端含有同源臂和FRT识别位点的KANA片段，后转染入含有pKD46质粒、且经过L-阿拉伯糖诱导的JM109(DE3)感受态细胞中；利用基因组序列设计PCR引物验证KANA片段成功替换掉xylF基因和xylE基因，后转染pCP20质粒，用于特异性识别FRT位点，消除KANA基因，获得JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌。

上述步骤（1）中，所述基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG的核苷酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

上述步骤（1）中构建并表达SecY非特异性运糖通道，具体过程包括：用带有相对应酶切位点的四组引物分别对secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因进行PCR扩增，得到四个基因的片段后，将secY(Δp)和secE基因与pETDuet质粒连接，secG和sCVE基因与prsfDuet质粒连接，获得重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE；将重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE转染进入JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌细胞实现SecY非特异性运糖通道在大肠杆菌基因工程菌中的表达。

上述步骤（2）中构建并表达木糖醇的合成途径，具体过程包括：将cbXR基因连接至重组载体prsfDuet-secG-sCVE上构建成功重组载体prsfDuet-secG-sCVE-cbxR；向JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌细胞中转染重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR；大肠杆菌细胞中成功过表达cbXR外源基因后，得到SecY工程化大肠杆菌，即JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE携带pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR；所述cbXR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述步骤（3）中所述发酵培养基为在M9培养基中设置不同比例的葡萄糖和木糖，发酵条件为：发酵温度28-37℃，时间为60小时，摇床转速220 rpm，，诱导剂IPTG浓度0.4mM。优选的，葡萄糖和木糖的浓度为：0 mM和100 mM，或33 mM和66 mM；或50 mM和50 mM。

进一步，步骤（3）所述“碳代谢流量智能调控”参照图1，SecY工程化大肠杆菌在识别糖信号后能进行自我调节。在第一阶段(A)，磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（简称PTS系统）在运输葡萄糖的同时严格控制木糖相关基因的表达，木糖通过SecY非特异性运糖通道进入细胞后开始生产木糖醇；在第二阶段(B)，培养基中仅剩木糖，激活涉及木糖代谢的基因，产生的5-磷酸木糖醇立即阻断木糖的转运功能。木糖穿过质膜后，一部分进入磷酸戊糖途径为细胞供能，而另一部分继续支持木糖醇的产生。

上述一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法在木糖醇生产中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

在本发明中，木糖转运不需要依赖于天然的木糖转运蛋白，只通过SecY非特异性运糖通道就能解除CCR效应和5-磷酸木糖醇的抑制作用。同时，最大限度的实现原料的完全利用，在碳代谢流量智能调控的作用下，任意比例的葡萄糖和木糖都能持续的进入到SecY工程化大肠杆菌的代谢流，木糖醇的生产不再受到葡萄糖含量的制约。

附图说明

图1碳代谢流量智能调控流程图。

图2 xylF和xylE的敲除结果示意图。A中，左：1为标准条带；2-5为含同源臂的KANA片段；中：1为标准条带；2-5为验证基因组上xylE基因位置成功被KANA片段取代；右：pCP20质粒转染成功并识别FRT位点，敲除基因组上KANA1片段；1为标准条带；2-5为验证消抗片段。B中，左：1为标准条带；2-5为含同源臂的KANA片段；中：1为标准条带；2-9为验证基因组上xylF基因位置成功被KANA片段取代；右：pCP20质粒转染成功并识别FRT位点，敲除基因组上KANA1片段；1为标准条带；2-9为验证消抗片段。

图3 SecY非特异性运糖通道高效转运木糖。A:细胞生长曲线；B:培养基中木糖的消耗情况。

图4 SecY工程化大肠杆菌用于木糖醇高效合成。Xylose:木糖消耗曲线；Xylitol:木糖醇生成曲线；OD₆₀₀：细胞生长曲线。

图5碳代谢流量智能调控下糖代谢情况及木糖醇合成能力。Glucose葡萄糖消耗曲线；Xylose:木糖消耗曲线；Xylitol:木糖醇生成曲线；OD₆₀₀：细胞生长曲线。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。

实施例1

在大肠杆菌JM109(DE3)中敲除xylF和xylE，完全切除菌种体内木糖转运能力，限制菌种对木糖进行代谢。利用λred同源重组技术敲除了大肠杆菌天然木糖转运蛋白xylF和xylE，目的是验证SecY非特异性运糖通道在基因工程菌株中的作用。

具体敲除过程，包括以下步骤：

分别设计含有同源臂序列的PCR引物以pkD13质粒为模板进行PCR扩增，得到一段两端含有同源臂和FRT识别位点的KANA片段，后转染入含有pKD46质粒、且经过L-阿拉伯糖诱导的JM109(DE3)感受态细胞中，37℃培养。利用基因组序列设计PCR引物验证KANA片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示）成功替换掉xylF基因和xylE基因，后转染pCP20质粒，用于特异性识别FRT位点，消除KANA基因，获得JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌。图2结果显示，xylF和xylE已成功敲除。

涉及到的PCR引物如下：

实施例2 构建构建并表达SecY非特异性运糖通道

选择JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌为底盘宿主，通过重组载体双表达质粒pETDuet-1及pRSFDuet-1共表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因。

上述secY(ΔP)基因的获得，包括如下方法：利用重叠PCR基因工程手段，构建将大肠杆菌K族菌株secY基因中60-74位氨基酸用一段包括GlySerGlySer四个氨基酸的柔性片段替换后的突变基因secY(ΔP)，secY(ΔP)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 secY基因NCBI Gene ID：947799。重叠PCR所涉及到的引物如下：

上述sCVE基因的获得，包括如下方法：根据大肠杆菌编码氨基酸的偏爱性，经过密码子优化后，人工合成sCVE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

上述secE基因和secG 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示，NCBI Gene ID分别为948486和947720。

具体构建过程为：用带有相对应酶切位点的四组引物分别对secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因进行PCR实验，得到四个基因的片段后，将质粒和基因片段分别进行双酶切，回收后利用T4DNA连接酶16℃过夜连接，经转化验证，获得重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE；prsfDuet-secG-sCVE。涉及到的PCR引物如下：

向JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌中转染重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE，引入SecY非特异性运糖通道，进行发酵，实现SecY非特异性运糖通道在大肠杆菌基因工程菌中的表达。发酵培养基为M9加4g/L木糖的培养基，菌种LB试管过夜活化，接种浓度OD600=0.1，30℃，220rpm培养，诱导剂IPTG浓度0.4mM。250ml摇瓶发酵96小时，12小时取样一次。

M9培养基配方如下：7.52 g/L Na₂HPO₄·2H₂O, 3 g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L NaCl,0.5 g/L NH₄Cl, 0.25 g/L MgSO₄·7H2O, 44.1 mg/L CaCl₂·2H₂O, 1 mg/L biotin, 1mg/L thiamin, 50 mg/L EDTA, 8.3 mg/L FeCl₃·6H₂O, 0.84 mg/L ZnCl₂, 0.13 mg/LCuCl₂·2H₂O, 0.1 mg/L CoCl₂·2H₂O, 0.1 mg/L H₃BO₃, 和 0.016 mg/L MnCl₂·4H₂O。

图3结果表明，在不含SecY非特异性运糖通道的菌种中，细胞生长停滞，木糖未产生明显代谢；引入SecY非特异性运糖通道，为细胞转运木糖提供了保障，细胞恢复正常生长。实验结果说明SecY非特异性运糖通道具有木糖转运能力。

实施例3构建并表达木糖醇的合成途径，过表达cbXR基因

cbXR基因来自Candida boidinii，该基因是经密码子优化后人工合成，优化后cbXR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。将cbXR基因连接至重组载体prsfDuet-secG-sCVE上构建成功重组载体prsfDuet-secG-sCVE-cbxR。

向JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌中转染重组载体pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR。大肠杆菌细胞中成功过表达cbXR外源基因后，得到SecY工程化大肠杆菌，即JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE携带pETDuet-secY(Δp)-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR。在LB培养基（5 g/L 酵母粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl）中初步验证是否能合成木糖醇。培养基中加入50 mM木糖，30℃，220rpm培养诱导剂IPTG浓度0.4mM。250ml摇瓶发酵72小时，12小时取样一次。实验结果如图4，50 mM木糖被完全代谢，有19.5 mM木糖醇产生。木糖醇的大量产生也能说明细胞对木糖的转运已经不受5-磷酸木糖醇的限制。SecY非特异性运糖通道对木糖醇的合成有正向推动作用。

实施例4

SecY工程化大肠杆菌在M9培养基中发酵，设置三组葡萄糖与木糖的不同配比：0mM和100 mM；33 mM和66 mM；50 mM和50 mM。30℃，220rpm培养诱导剂IPTG浓度0.4mM。250ml摇瓶发酵72小时，12小时取样一次。实验结果分析，在碳代谢流量智能调控的第一阶段，磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（简称PTS系统），木糖醇的得率为70.3%；在碳代谢流量智能调控的第二阶段，木糖醇的得率为27.9%。智能调控的第二阶段，72.1%的木糖进入糖酵解途径为细胞生长及木糖醇合成供能。图5是葡萄糖和木糖分别为33 mM和66 mM的代谢情况，从图中可以看出，葡萄糖和木糖几乎在同一时间开始代谢，说明CCR效应已经被SecY非特异性运糖通道解除，同时木糖醇的最终产量为30 mM。葡萄糖和木糖在60小时内几乎全部代谢，进一步说明碳代谢流量智能调控系统的优势作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法

<130> 26

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagcaagcga accggaattg ccagc 25

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccaattcat tcacgcggca tggagag 27

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cagcaagcga accggaattg ccagc 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctgtggctg tgtaattcga aacggc 26

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atggctaaac aaccgggatt ag 22

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agatagaagc gctgcccgaa ccggtgcctc gctgttgctc 40

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agcgaggcac cggttcgggc agcgcttcta tctttgctct gg 42

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttatcggccg tagcctttc 19

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

catgccatgg ctaaacaacc gggattagat 30

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgcggatcct tagtggtgat gatggtgatg tcggccgtag cctt 44

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tatacatatg agtgcgaata ccgaagctca a 31

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cggggtacct tatcagaacc tcaggccagt ga 32

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catgccatgg tgatgtatga agctctttta gtagtttt 38

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgcggatcct tagttcggga tatcgctggt cgg 33

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tatacatatg tactcgttcg tatctgaaga aac 33

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cggggtacct taaaccagca ggtccgggac ac 32

Claims

1.一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：在大肠杆菌JM109(DE3)中成功构建了SecY非特异性运糖通道，保证木糖在浓度差的作用下，自由扩散进入细胞，并且构建了木糖到木糖醇的代谢途径，实现大肠杆菌利用混合碳源高效发酵生产木糖醇；

包括以下步骤：

（1）在JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌中过表达基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG，构建并表达SecY非特异性运糖通道；所述基因secY(ΔP)、sCVE、secE和secG的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

（2）在含SecY非特异性运糖通道的大肠杆菌中过表达cbXR基因，构建并表达木糖醇的合成途径；所述cbXR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（3）以不同配比的葡萄糖和木糖为主要条件，发酵培养，阐明碳代谢流量智能调控系统的作用。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（1）中所述JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌，其构建方法包括以下步骤：分别设计含有xylF基因、xylE基因同源臂序列的PCR引物以pkD13质粒为模板进行PCR扩增，得到一段两端含有同源臂和FRT识别位点的KANA片段，后转染入含有pKD46质粒、且经过L-阿拉伯糖诱导的JM109(DE3)感受态细胞中；利用基因组序列设计PCR引物验证KANA片段成功替换掉xylF基因和xylE基因，后转染pCP20质粒，用于特异性识别FRT位点，消除KANA基因，获得JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（1）中构建并表达SecY非特异性运糖通道，具体过程包括：用带有相对应酶切位点的四组引物分别对secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因进行PCR扩增，得到四个基因的片段后，将secY(ΔP )和secE基因与pETDuet质粒连接，secG和sCVE基因与prsfDuet质粒连接，获得重组载体pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE；将重组载体pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE转染进入JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌细胞实现SecY非特异性运糖通道在大肠杆菌基因工程菌中的表达。

4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（2）中构建并表达木糖醇的合成途径，具体过程包括：将cbXR基因连接至重组载体prsfDuet-secG-sCVE上构建成功重组载体prsfDuet-secG-sCVE-cbxR；向JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE大肠杆菌细胞中转染重组载体pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR；大肠杆菌细胞中成功过表达cbXR外源基因后，得到SecY工程化大肠杆菌，即JM109(DE3)ΔXylF-ΔXylE携带pETDuet-secY(ΔP )-secE和prsfDuet-secG-sCVE-cbxR。

5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（3）中发酵培养基为在M9培养基中设置不同比例的葡萄糖和木糖，接种SecY工程化大肠杆菌发酵，发酵条件为：发酵温度28-37℃，时间为60小时，摇床转速220 rpm，诱导剂IPTG浓度0.4mM。

6.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法，其特征在于：步骤（3）中葡萄糖和木糖的浓度为：0 mM和100 mM，或33 mM和66 mM；或50 mM和50mM。

7.如权利要求1所述的一种大肠杆菌产木糖醇的碳代谢流量智能调控方法在木糖醇生产中的应用。