CN110358720B - 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 - Google Patents
一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110358720B CN110358720B CN201910725678.9A CN201910725678A CN110358720B CN 110358720 B CN110358720 B CN 110358720B CN 201910725678 A CN201910725678 A CN 201910725678A CN 110358720 B CN110358720 B CN 110358720B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- isobutanol
- recombinant
- strain
- zymomonas mobilis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 148
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 13
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 13
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 9
- 229960004295 valine Drugs 0.000 abstract description 9
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 13
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 13
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 8
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 5
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- JTEYKUFKXGDTEU-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxy-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)C(O)=O JTEYKUFKXGDTEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010031852 Pyruvate Synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- HWKRAUXFMLQKLS-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylidenepropanoic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O.CC(=O)C(O)=O HWKRAUXFMLQKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100162204 Aspergillus parasiticus (strain ATCC 56775 / NRRL 5862 / SRRC 143 / SU-1) aflH gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150024743 adhA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011064 split stream procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01009—Dihydroxy-acid dehydratase (4.2.1.9), i.e. acetohydroxyacid dehydratase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用。本发明以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，首先通过基因工程的手段对菌株进行改造，利用运动发酵单胞菌自身的缬氨酸合成途径中的中间代谢产物，引入二羟酸脱氢酶(KDCA)基因，实现对缬氨酸途径中2‑ketoisovalerate转换为异丁醇的前体isobutyraldehyde，然后在醇脱氢酶协助下生成异丁醇。其次，通过过表达L‑valine合成途径中的基因并筛选代谢途径中乙酰乳酸合酶达到增产的目的。最后通过调试代谢通路中不同基因的表达量，最终实现高产的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用。
背景技术
由于全球能源危机及化石能源引起的严重环境问题，环保、可再生的生物燃料引起了广泛的关注。随着合成生物学技术的发展和进步，利用微生物进行代谢工程改造和系统生物学研究受到越来越多的关注。以微生物为载体从廉价的可再生资源中生产生物燃料和增值化学品，为解决化石资源短缺及其引发的相关环境问题提供了有效的替代方案。近年来，通过代谢工程和合成生物学开发了多种可再生生物燃料的微生物。目前为止，生物乙醇是研究最多的生物基燃料并且木质纤维素乙醇生产已成功在多个国家进行商业应用。但是因乙醇有如高吸湿性、高挥发性和低能量密度等特性，限制了其在特定用途中的广泛应用。但是高级醇，如异丁醇等具有能量密度高、低吸湿性、低蒸气压以及高辛烷值等优点，并且可以作为异丁烯生产的前体，使其有希望成为现有化石燃料的替代品。
公布号为CN106755035A的中国发明专利披露了一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法，其构建了一株能够高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株，以45g/L初始葡萄糖浓度，30h完成发酵，异丁醇产量达到13.67g/L。
但是，上述构建的重组大肠杆菌属于好氧菌，其发酵过程属于严格好氧发酵，工业化生产成本较高。
运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）作为天然产乙醇菌株，具备独特ED代谢途径和较高的糖发酵效率，并且具有乙醇产量高、产生物量少、乙醇耐受力强、耐高渗透压等理想工业细胞工厂的特性，是目前构建生物燃料及其他生物及平台化合物的工程菌株的优选宿主之一。运动发酵单胞菌作为一种兼性厌氧生物，在厌氧条件下相对于有氧条件下表现更好，终产物更少，运动发酵单胞菌使用Entner-Doudoroff（ED）途径而不是Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径进行糖酵解，ED途径较EMP途径少产生50％ATP，运动发酵单胞菌通过碳代谢以达到能量平衡，可有效提高代谢产物的产量和产率。模式菌株Z. mobilis ZM4的基因组序列已被确定，并且已通过系统生物学数据完善了它的基因组注释，其基因组仅为2-M，约有1700多个编码区，有利于基因组规模代谢网络建模和代谢工程实践。目前已经在Z. mobilis中实现了乳酸、琥珀酸、2-3丁二醇以及聚羟基丁酸（PHB）的尝试。此外，通过代谢工程研究改造，运动发酵单胞菌可将来自木质纤维素生物质作为发酵底物，使得运动发酵单胞菌具有很大前景。这些工作有助于更好地了解运动发酵单胞菌的应用和开发，以便作为更低成本、更高产和适合生化产品的平台，使其成为理想的细胞工厂。
公告号为CN102876625B的中国发明专利披露了一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法，其通过将2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivd)和醇脱氢酶基因(adhA)构建至运动发酵单胞菌中，最终得到产量为0.1g/L的重组菌。
上述基于重组运动发酵单胞菌的生产异丁醇的方法，虽然由好氧发酵改进为了静置厌氧发酵；但是，其异丁醇的产量太低，仅为0.1g/L，无法满足工业化生产的要求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用。本发明的目的是以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，通过基因工程的手段对菌株进行改造，引入特定的基因，实现在运动发酵单胞菌中生产异丁醇，并通过筛选和调试通路中的基因来提升异丁醇的产量。为在该菌株中开展理性设计异源代谢途径及细胞工厂用于生物质燃料和生物材料的生产提供参考，促进代谢工程等相关研究领域的发展。
本发明是这样实现的，一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株，宿主菌为运动发酵单胞菌，将二羟酸脱氢酶基因kdcA基因构建至宿主菌中，得到重组菌株，kdcA基因序列见SEQ ID NO.1。
进一步，将缬氨酸合成途径中得Als, ilvC, ilvD 基因整合至权利要求1所得到的重组菌株中，其中Als的基因序列见SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.19中的任一个，ilvC, ilvD 基因序列见SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
进一步，利用诱导型启动子或组成型启动子控制kdcA基因的表达。
一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：根据二羟酸脱氢酶基因kdcA基因序列设计引物，进行PCR扩增，获得目标片段；
步骤2：获取抗性筛选标记基因片段、启动子基因片段以及宿主菌目标片段插入位点上下游基因片段，所述插入位点为Z. mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的基因片段转入载体，并转化至ZM4感受态细胞，构建重组菌株。
进一步，所述启动子为诱导型启动子Ptet或组成型启动子Pgap。
进一步，步骤1中根据kdcA基因序列设计的引物序列见SEQ ID NO.2和见SEQ IDNO.3。
进一步，步骤3中所述载体为pUC57载体。
一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
步骤a：获取Als, ilvC, ilvD 基因片段；
步骤b：将上述获取的三种基因片段整合至穿梭质粒pEZ15a中，构建重组质粒；
步骤c：将重组质粒转入权利要求4获得的重组菌株中。
如上所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株在生产异丁醇中的应用。
利用上述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法构建的重组菌株在生产异丁醇中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，首先通过基因工程的手段对菌株进行改造，利用运动发酵单胞菌自身的缬氨酸（L-valine）合成途径中的中间代谢产物，引入二羟酸脱氢酶（dihydroxy-acid dehydratase，KDCA）基因，实现对缬氨酸途径中2-ketoisovalerate转换为异丁醇的前体isobutyraldehyde，然后在醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）协助下生成异丁醇。其次，通过过表达L-valine合成途径中的基因并筛选代谢途径中乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）达到增产的目的。最后通过调试代谢通路中不同基因的表达量，最终实现高产的目的。本发明制备的重组菌具有以下优势：
（1）抗病毒污染，发酵单胞菌自身有强大的限制修饰系统，较大肠杆菌等常用工程菌株有更强的抗病毒能力。
（2）降低生产成本，由于发酵单胞菌为兼性厌氧微生物，在发酵过程中不需要额外的溶氧控制设备，可以有效降低生产的成本。
（3）潜在产率高，由于发酵单胞菌是一种生长和代谢非偶联的生物，由碳源到终代谢产物乙醇的转化效率高（95%以上），因而适合进行其他化合物的生产，并具有潜在高转化率。
附图说明
图1是将kdcA表达模块引入运动发酵单胞菌中的重组示意图；
图2是实施例2中的六种重组质粒结构示意图；
图3是实施例2中制备的重组菌的异丁醇产量示意图；
图4是实施例3中的重组菌的结构示意图；
图5是实施例3中的重组菌的异丁醇产量示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1将kdcA表达模块引入运动发酵单胞菌中，得到能够诱导产异丁醇的重组菌ZM-Q1
在本实施例中，首先将来源于Lactococcus lactis的二羟酸脱氢酶（dihydroxy-acid dehydratase，KDCA）基因通过同源重组的方法将其整合到模式菌株Z. mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点，并采用诱导型启动子来控制核酸酶表达量，构建重组菌株ZM-Q1，重组菌株的重组示意图如图1所示。
1. 重组质粒的构建
利用PCR分别扩增kdcA基因序列，抗性筛选标记（壮观霉素），诱导型启动子基因序列（四环素诱导启动子），插入位点上下游的基因序列及反向扩增用于整合的pUC57的载体序列。PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；产物经纯化后-20°C保存。PCR扩增条件体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.5 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.5 μL |
| PrimerSTAR DNA Polymerase (Takara) | 10 μL |
| Template (5-10 ng) | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 20 μL |
| Total volume | 20 μL |
kdcA序列见SEQ ID NO.1。其中，用于kdcA合成的序列，壮观霉素抗性基因和诱导型启动子组合模板来为实验室前期构建（本领域已知，有文献报道， S. Yang, et al.,Biotechnol Biofuels,(2016)），用于扩增上下游的基因序列模板（ZMO0037, ZMO0039）来自于发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4的基因组，反向扩增pUC57的模板为pUC57载体（通用载体），扩增引物如下：
kdca-F: GAGGAGAAAGGATCTCCCATG ATGTATACCGTCGGTGATTATTTG，见SEQ ID NO.2；
kdca-R: CGTCTATCTGAATATTTAACGATTATTTATTTTGTTCGGCGAACAATTTGC，见SEQ IDNO.3；
Ptet-F: TTAAGACCCACTTTCACATTTAAG，见SEQ ID NO.4；
Ptet-R: GGGAGATCCTTTCTCCTCTTTAG，见SEQ ID NO.5；
Spe-F: CTGAATATTTAACGAAATTCTCATGTTTGACAGCTTATC，见SEQ ID NO.6；
Spe-R: GAAAGTGGGTCTTAAATTCAGTACTCACTACGGAATTG，见SEQ ID NO.7；
Up-F: TTAGGCGAGAAGGGAAAGGGC，见SEQ ID NO.8；
Up-R: TCGTTAAATATTCAGATAGACGGAGAT，见SEQ ID NO.9；
Down-F: TCACGCCCGACGCCAG，见SEQ ID NO.10；
Down-R: CTCGAGTTTGGATCCCACCCTCTGGTGATTGTCGA，见SEQ ID NO.11；
pUC-F: GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAG，见SEQ ID NO.12；
pUC-R: ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTGAATT，见SEQ ID NO.13；
将获取的片段和载体按照3:1的比例进行混合，按照下表反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌感受态细胞，采用通用方法进行转化。利用壮观霉素抗性平板进行筛选，挑取单菌落，分别用M13引物通过colony PCR进行验证（PCR扩增程序设置为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸80 s，共30个循环），条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
| 试剂 | 体积 |
| DNA fragment | 0.12 pM |
| Vector | 0.04 pM |
| 10×Buffer 4 (Thermo) | 0.5 μL |
| T5 Exonuclease | 0.5 U |
| ddH<sub>2</sub>O | To 5 μL |
2.转化
将ZM4感受态细胞至于冰上，待其融化后，转入0.1cm的电转杯中，然后加入1 μg左右的步骤1构建的质粒，按照1600 V，25 μF，200 Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30 ℃条件下静置培养4-6h，然后取200 μL左右涂布于50 μg/mL氯霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
3.重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；反应体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| 2×T5 Super PCR Mix (Tsingke) | 5 μL |
| Template | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 10 μL |
| Total volume | 10 μL |
其中，验证引物序列如下：
M13-Fwd: GTAAAACGACGGCCAGT；
M13-Rev: GTCATAGCTGTTTCCTG；
条带大小与预期一致的菌株通过测序进行验证，正确的菌株保存待用，菌株命名为ZMQ1。
4.重组菌株产量检测
将重组菌株在富集培养基(rich medium, RM,10 g/L yeast extract, 50 g/LGlucose·H2O, 2 g/L KH2PO4) RMG5的培养基中进行培养（30℃，100 rpm）并在必要时添加抗生素，抗生素终浓度为壮观霉素（spectinomycin）100 μg/mL，氯霉素（chloramphenicol）50 μg/mL。
ZMQ1菌株中的kdcA基因在诱导型启动子Ptet的控制下进行表达，添加诱导物四环素后提升下游基因的表达。在重组菌株进行表达时，添加不同浓度的诱导物，测试其对产量的影响。本发明中在三个诱导物梯度浓度（0，0.2，1.0 μg/mL）条件下进行培养。
从摇瓶中取样后离心取上清（4℃，12000 rpm），然后将上清液用0.2 μm过滤器过滤到HPLC小瓶中。通过配备有BioRad Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和折射率检测器（refractive index detector，RID）的HPLC系统（HPLC，Shimadzu，Japan）测定上清液中存在的异丁醇。检测时柱温设定在60℃，以5mM H2SO4溶液用作流动相，流速为0.5mL/min。
ZMQ1重组菌株在不同诱导物浓度条件下异丁醇的产量如下表所示：
| 诱导物浓度 （μg/mL） | 异丁醇产量 （mg/L） |
| 0 | 0.00±00.0 |
| 0.2 | 80.14±8.52 |
| 1 | 104.41±20.12 |
实施例2过表达L-valine合成途径中的基因，并筛选代谢途径中ALS实现异丁醇的增产目的
在异丁醇合成途径中，丙酮酸（pyruvate）首先由丙酮酸合成酶(ALS, EC2.2.1.6)催化生成乙酰乳酸（acetolactate），然后由酮酸还原异构酶(ILVC, EC1.1.1.86)还原为2,3-二羟基异戊酸酯（2,3-dihydroxyisovalerate）。中间体2,3-二羟基异戊酸酯经二羟基酸脱水酶(ILVD, EC 4.2.1.9)转化为2-酮异戊酸酯（2-ketoisovalerate）。然后，2-ketoisovalerate可以通过KDCA进一步转化为异丁醛，再通过醇脱氢酶(ADHs)转化为醇。
重组菌株ZM-Q1可以产异丁醇，过表达缬氨酸合成途径中得Als, ilvC, ilvD 对可将碳流从乙醇合成转入异丁醇的生产。将这三个基因整合到穿梭质粒pEZ15a中，并采用诱导型启动子来控制基因的表达量，将重组质粒转入到ZM-Q1的重组菌株中，检测异丁醇产量。
鉴于丙酮酸合成酶(ALS, EC 2.2.1.6)催化生成乙酰乳酸（acetolactate）是异丁醇和乙醇分流的关键步骤，合适的ALS酶有助于提升异丁醇的产量。三种不同来源的Als基因被构建到穿梭质粒pEZ15a中，并采用诱导型启动子来控制基因的表达量，将重组质粒转入到ZM-Q1的重组菌株中，检测异丁醇产量。将不同来源的Als以及来源于运动发酵单胞菌的ilvC, ilvD按照不同的组合进行组装，其中Als, ilvC, ilvD用合成的RBS连接（BBa_B0034），共构建六种质粒，质粒的示意图如图2所示。
1. 重组质粒的构建
利用PCR分别扩增四种Als基因序列，以及ilvC, ilvD，并在当中插入RBS序列，然后整合到pEZ15a的载体序列当中。PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；产物经纯化后-20℃保存。PCR扩增条件体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.5 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.5 μL |
| PrimerSTAR DNA Polymerase (Takara) | 10 μL |
| Template (5-10 ng) | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 20 μL |
| Total volume | 20 μL |
其中ilvC, ilvD为运动发酵单孢菌自身的基因，四种Als基因分别为来自运动发酵单孢菌的ZmAls，来源于Escherichia coli的EcAls，来源于Bacillus licheniformis的BlAls以及来源于Bacillus subtilis的BsAls。其中ZmAls与运动发酵单孢菌基因组一致，ZmAls，ilvC, ilvD的基因序列分别见SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.16；另外三种EcAls、BlAls和BsAls的基因序列分别见SEQ ID NO.17- SEQ ID NO.19。
扩增各片段的引物如下：
15A-反扩-F： ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTGAATT，见SEQ ID NO.21；
15A-反扩-R： GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAG，见SEQ ID NO.22；
IlvC-F: ATTAAAGAGGAGAAAATGAAAGTTTATTACGATAGTGATG，见SEQ ID NO.23；
IlvC-R: CTAGTTGCGAGCCTTATC，见SEQ ID NO.24；
IlvD-F: AAGGCTCGCAACTAGATTAAAGAGGAGAAAATGC，见SEQ ID NO.25；
IlvD-R: ACTCGAGTTTGGATCCTTAACGCCGTTCGAGCTG，见SEQ ID NO.26；
ZmAls-F: GAGAAAGGATCTcCCATGTGTCGCCAACTCAG，见SEQ ID NO.27；
ZmAls-R: TTTCTCCTCTTTAATTTAACCGCGAATGGTGGTC，见SEQ ID NO.28；
EcAls-F: GAGAAAGGATCTcCCATGAATAGCGAAAAACAAAGCCG，见SEQ ID NO.29；
EcAls-R: TTTCTCCTCTTTAATTTAAAGGATTTGCGAAAG，见SEQ ID NO.30；
BlAls-F: GAGAAAGGATCTcCCATGAATGAAAATGGTGGTGTC，见SEQ ID NO.31；
BlAls-R: TTTCTCCTCTTTAATTTACGATTGTTTGGAAGCTTC，见SEQ ID NO.32；
BsAls-F: GAGAAAGGATCTcCCATGACGAAAGCCACGAAAG，见SEQ ID NO.33；
BsAls-R: TTTCTCCTCTTTAATTTACAGAGCTTTCGTTTTCATC，见SEQ ID NO.34；
将获取的片段和载体pEZ15a按照3:1的比例进行混合，按照下表反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌感受态细胞，采用通用方法进行转化。利用壮观霉素抗性平板进行筛选，挑取单菌落，分别用引物通过colony PCR进行验证（PCR扩增程序设置为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸，共30个循环），条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
| 试剂 | 体积 |
| DNA fragment | 0.12 pM |
| Vector | 0.04 pM |
| 10×Buffer 4 (Thermo) | 0.5 μL |
| T5 Exonuclease | 0.5 U |
| ddH<sub>2</sub>O | To 5 μL |
其中验证引物序列如下：
15A-Fwd: GGCAAAGCCACCCTATTTTTAG，见SEQ ID NO.35；
15A-Rev: CACTTCACTGACACCCTCAT，见SEQ ID NO.36；
2.转化
将实施例1中制备的ZMQ1感受态细胞至于冰上，待其融化后，转入0.1cm的电转杯中，然后加入1 μg左右的步骤1构建的质粒，按照1600 V，25 μF，200 Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30 ℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
3. 重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；反应体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| 2×T5 Super PCR Mix (Tsingke) | 5 μL |
| Template | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 10 μL |
| Total volume | 10 μL |
条带大小与预期一致的菌株通过测序进行验证，正确的菌株保存待用。
其中验证引物序列如下：
15A-Fwd: GGCAAAGCCACCCTATTTTTAG，见SEQ ID NO.35；
15A-Rev: CACTTCACTGACACCCTCAT，见SEQ ID NO.36；
4. 重组菌株产量检测
将重组菌株在富集培养基(rich medium, RM,10 g/L yeast extract, 50 g/LGlucose·H2O, 2 g/L KH2PO4) RMG5的培养基中进行培养（30 °C，100 rpm）并在必要时添加抗生素，抗生素终浓度为壮观霉素（spectinomycin）100 μg/mL，氯霉素（chloramphenicol）50 μg/mL。
从摇瓶中取样后离心取上清（4℃，12000 rpm），然后将上清液用0.2 μm过滤器过滤到HPLC小瓶中。通过配备有BioRad Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和折射率检测器（refractive index detector，RID）的HPLC系统（HPLC，Shimadzu，Japan）测定上清液中存在的异丁醇。检测时柱温设定在60℃，以5mM H2SO4溶液用作流动相，流速为0.5mL/min。
将六种重组质粒转入ZMQ1重组菌株后，本发明中在三个不同诱导物浓度（0，0.2，1.0 μg/mL）条件下测试异丁醇的产量，结果见图3，各菌种字母编号代表的重组质粒的类型与图2中相对应。实验结果表明，在所有的重组菌株中，在无诱导物条件下，均无异丁醇的产生，在有诱导物存在条件下（0.2，1.0 μg/mL），不同的菌株表现为不同的情况。
在1.0 μg/mL诱导物物浓度条件下，重组菌株ZMQ1中异丁醇产量0.1g/L；在仅仅引入BsAls后，在重组菌株ZMQ1-B中，异丁醇产量0.075g/L；在仅引入ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ1-A0中，异丁醇产量0.038g/L；在同时引入来源于Z.mobilis的ZmAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ1-A1中，异丁醇产量0.026g/L；在同时引入EcAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ1-A2中，异丁醇产量0.82g/L；在同时引入BlAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ1-A3中，异丁醇产量1.21g/L；在同时引入BsAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ1-A4中，异丁醇产量1.26g/L.
实施例3 调试代谢通路中不同基因的表达量构建高产异丁醇重组菌株
发明人前期通过实验发现，启动子强度在一定程度上限制了异丁醇的产量，将kdcA表达模块上的诱导型启动子替换成组成型启动子。将来源于Lactococcus lactis的二羟酸脱氢酶（dihydroxy-acid dehydratase，KDCA）基因通过同源重组的方法将其整合到Z. mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点，采用组成型启动子Pgap来控制核酸酶表达量，构建重组菌株ZMQ3。将缬氨酸代谢途径中的三个基因整合到穿梭质粒pEZ15a中，并采用诱导型启动子来控制基因的表达量，将重组质粒转入到ZMQ3的重组菌株中，检测异丁醇产量。重组菌株的重组示意图如图4所示。
1.重组质粒的构建
同实施例1中的构建方法一致。将诱导型启动子Ptet替换为组成型启动子Pgap，其中Pgap序列见SEQ ID NO.20。
2.转化
将ZM4感受态细胞至于冰上，待其融化后，转入0.1cm的电转杯中，然后加入1 μg左右的步骤1构建的质粒，按照1600 V，25 μF，200 Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30 ℃条件下静置培养4-6h，然后取200 μL左右涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
3.重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；反应体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| 2×T5 Super PCR Mix (Tsingke) | 5 μL |
| Template | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 10 μL |
| Total volume | 10 μL |
同实施例1中菌落PCR的引物一致，条带大小与预期一致的菌株通过测序进行验证，正确的菌株保存待用。
4.高产重组菌株的获取
将实施案例2中构建的载体pEZ-A2，pEZ-A3，pEZ-A2转入ZMQ3感受态细胞中。将感受态细胞至于冰上，待其融化后，转入0.1cm的电转杯中，然后加入1 μg左右的步骤1构建的质粒，按照1600 V，25 μF，200 Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mLRM培养基中在30 ℃条件下静置培养4-6h，然后取200 μL左右涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸（根据片段长度按照10 s/kb进行设置），共30个循环；循环反应结束后72℃保持5 min；反应体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| F-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| R-primer(10 μM) | 0.3 μL |
| 2×T5 Super PCR Mix (Tsingke) | 5 μL |
| Template | X μL |
| ddH<sub>2</sub>O | To 10 μL |
| Total volume | 10 μL |
同实施例2中菌落PCR的引物一致，条带大小与预期一致的菌株通过测序进行验证，正确的菌株保存待用。其中，ZMQ3中包含质粒pEZ-A2的重组菌株命名为ZMQ3-A2，ZMQ3中包含质粒pEZ-A3的重组菌株命名为ZMQ3-A3，ZMQ3中包含质粒pEZ-A4的重组菌株命名为ZMQ3-A4。
5.重组菌株产量检测
将重组菌株在富集培养基(rich medium, RM,10 g/L yeast extract, 50 g/LGlucose·H2O, 2 g/L KH2PO4) RMG5的培养基中进行培养（30 ℃，100 rpm）并在必要时添加抗生素，抗生素终浓度为壮观霉素（spectinomycin）100 μg/mL，氯霉素（chloramphenicol）50 μg/mL。
从摇瓶中取样后离心取上清（4℃，12000 rpm），然后将上清液用0.2 μm过滤器过滤到HPLC小瓶中。通过配备有BioRad Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和折射率检测器（refractive index detector，RID）的HPLC系统（HPLC，Shimadzu，Japan）测定上清液中存在的异丁醇。检测时柱温设定在60℃，以5mM H2SO4溶液用作流动相，流速为0.5mL/min。
重组菌株在三个不同诱导物浓度（0，0.2，1.0 μg/mL）条件下培养，异丁醇的产量结果如图5所示。实验说明在所有的重组菌株中，在无诱导物条件下，异丁醇的产量较低，均不足1.0 g/L，其中，在同时引入EcAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ2中，异丁醇产量0.26g/L；在同时引入BlAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ3中，异丁醇产量0.62g/L；在同时引入BsAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ4中，异丁醇产量0.94g/L。在有诱导物存在条件下（0.2，1.0 μg/mL），不同的菌株表现为不同的情况。在1.0 μg/mL诱导物物浓度条件下，在同时引入EcAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ2中，异丁醇产量1.72g/L；在同时引入BlAls， ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ3中，异丁醇产量3.51g/L；在同时引入BsAls，ilvC，ilvD后，在重组菌株ZMQ4中，异丁醇产量3.94g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> kdcA(kdcA)
<400> 1
atgtataccg tcggtgatta tttgttggat cgcttgcatg aattgggcat cgaagaaatt 60
tttggcgttc cgggtgatta taacttgcag ttcttggatc aaatcattag ccgcgaagat 120
atgaaatgga tcggtaatgc taatgaattg aatgccagct atatggctga tggctatgcc 180
cgtaccaaaa aagccgctgc ctttttgacc accttcggcg tcggtgaatt gagcgccatc 240
aatggcttgg ctggtagcta tgccgaaaat ttgccggttg tcgaaattgt tggcagcccg 300
accagcaaag tccagaatga tggtaaattt gttcatcata ccttggccga tggcgatttc 360
aagcatttca tgaagatgca tgaaccggtt accgctgccc gtaccttgtt gaccgccgaa 420
aatgctacct atgaaatcga tcgcgtcttg agccaattgt tgaaggagcg taagccggtt 480
tatatcaact tgccggttga tgtcgctgcc gctaaagctg aaaaaccggc cttgagcttg 540
gaaaaagaaa gcagcaccac caataccacc gaacaggtca tcttgagcaa aattgaagaa 600
agcctgaaaa atgctcaaaa accggttgtc atcgccggcc atgaagttat tagctttggt 660
ttggaaaaga ccgttaccca gttcgtcagc gaaaccaaat tgccgatcac caccttgaat 720
tttggtaaaa gcgccgtcga tgaaagcctg ccgagcttct tgggcatcta taatggtaaa 780
ttgagcgaaa ttagcttgaa gaactttgtc gaaagcgctg atttcatttt gatgttgggc 840
gttaaattga ccgatagcag caccggtgcc ttcacccatc atttggatga aaacaagatg 900
atcagcttga acatcgatga aggcatcatc ttcaacaagg ttgtcgaaga tttcgatttc 960
cgcgccgttg tcagcagctt gagcgaattg aaaggcatcg aatatgaagg ccagtatatc 1020
gataagcaat atgaagaatt tatcccgagc agcgctccgt tgagccagga tcgtttgtgg 1080
caagccgtcg aaagcctgac ccagagcaat gaaaccatcg ttgctgaaca aggcaccagc 1140
tttttcggtg ccagcaccat ctttttgaaa agcaatagcc gcttcatcgg tcagccgttg 1200
tggggcagca ttggttatac ctttccggcc gctttgggca gccaaatcgc tgataaagaa 1260
agccgtcatt tgttgttcat tggcgatggt agcttgcagt tgaccgtcca agaattgggt 1320
ttgagcatcc gcgaaaaatt gaacccgatc tgcttcatca tcaacaacga tggctatacc 1380
gttgaacgtg aaatccatgg tccgacccaa agctataatg atattccgat gtggaattat 1440
agcaaattgc cggaaacctt tggcgccacc gaagatcgcg ttgtcagcaa aatcgttcgt 1500
accgaaaatg aatttgttag cgtcatgaaa gaagcccagg ctgatgtcaa tcgcatgtat 1560
tggatcgaat tggttttgga aaaggaagat gctccgaaat tgttgaagaa aatgggcaaa 1620
ttgttcgccg aacaaaataa ataa 1644
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(kdca-F)
<400> 2
gaggagaaag gatctcccat gatgtatacc gtcggtgatt atttg 45
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(kdca-R)
<400> 3
cgtctatctg aatatttaac gattatttat tttgttcggc gaacaatttg c 51
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Ptet-F)
<400> 4
ttaagaccca ctttcacatt taag 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Ptet-R)
<400> 5
gggagatcct ttctcctctt tag 23
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Spe-F)
<400> 6
ctgaatattt aacgaaattc tcatgtttga cagcttatc 39
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Spe-R)
<400> 7
gaaagtgggt cttaaattca gtactcacta cggaattg 38
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Up-F)
<400> 8
ttaggcgaga agggaaaggg c 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Up-R)
<400> 9
tcgttaaata ttcagataga cggagat 27
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Down-F)
<400> 10
tcacgcccga cgccag 16
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Down-R)
<400> 11
ctcgagtttg gatcccaccc tctggtgatt gtcga 35
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-F)
<400> 12
ggatccaaac tcgagtaagg atctccag 28
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-R)
<400> 13
atgtatatct ccttcttaaa agatcttttg aatt 34
<210> 14
<211> 1788
<212> DNA
<213> ZmAls(ZmAls)
<400> 14
atgtgtcgcc aactcagcgg cgccgccatt gttcttgaaa cactcaagga tatgggtgtc 60
gatctgatct tcggctatcc cggcggagca gttctcccca tttacgatgc cctttatcag 120
gatgaaggca tccggcatat tctggctcgc caagaaggcg gggctgtcca tgcagcagaa 180
ggctatgcgc ggtcgaccgg aaaacccggt gttgttatag tgacttcagg tccgggggcg 240
acaaatgccg ttaccggcat cgctgatgcc atgcttgatt ccattccgtt ggttgttttt 300
tctggtcagg tcgccacgaa tttaatcgga accgatgctt tccaagaggc ggataccatc 360
ggcattaccc gccattgcac caagcataac tatctggttc gcgacccgaa ggatttagct 420
cagacgattg tcgaggcctt ccatctggcg acctccggtc gtccgggacc ggtggttatt 480
gaccttccga aaaatgttca gacggcggtt atcgactata tcaaaccgga tcctaacaag 540
cggatgcatc gcggttatcg tccgcgtgtt aaagcggatc cagtcgaaat taccaacgct 600
cttgatatga ttgccaaggc aaagcgtccg gttttctata ctggtggcgg cgttatcaat 660
tctggtcccg atgccagcaa agccttgcgt gaattggccg acttgacggg tgttccggta 720
acctcaaccc tgatgggctt gggcgcattt ccagcctctt cccagcaatg gttgggtatg 780
cttggtatgc acggcactta cgaagccaat tttgccatgc atgacgctga tttagtagtt 840
gcccttggca gccgctttga tgatcgtgtg acatgtcggg ttgatagctt ttcacctcat 900
tccaagaaaa tccatgtcga tattgatcgt tcttcgatca accgtatcat ccatgtggac 960
ttaccgattg tgggtgatgt cggatcagtc atgcaggaca tggtcgcgct ttggaaagaa 1020
aagcattacc agatgcagga tatttcggca tggtgggtgc agattgatga atggcgcgcc 1080
aaacaatgcc tgaattttac caagcagggt aacgagatca tgccgcagca ggctatccgt 1140
agcctgtggg aagccacaaa gggtaagaat ccgatcgtct cgacagaagt cggacagcat 1200
cagatgtgga ccgcccaata tttcggtttt gactctccca atcatttcct gacttcaggt 1260
ggtttgggaa cgatgggcta tggtttcccg tctattattg gcgcgcaggt cggtaatcca 1320
gacagcctct gcatgacgat tgctggtgaa gcctctttcc agatgaatat tcaggaaatg 1380
gctacggttg ctcaatatcg tttgccggtg aaaattttca tcttgaataa ccgtttcatg 1440
ggcatggtgc gtcagtggca agatttgctt tatgatcatc gccggtcaca aagctattca 1500
gaagcactgc ctgattttgt cgctttggcc aaggcttatg gctggaatgc gcttaaaatt 1560
gagaagcctt cccagcttga agatggcatc aaaacgatgt tggaaacgcc ggggcctgtc 1620
ttggttgatt gtcaggttgc tcaattagcg aattgtttgc ccatggtgcc gccgggagcc 1680
ggccagactg aaatgatttt ggaatcggat atcaccgata accatgtcaa gaagccggaa 1740
tatacccctt ccgctgcgcc ttcgtctgcg accaccattc gcggttaa 1788
<210> 15
<211> 1020
<212> DNA
<213> ilvC(ilvC)
<400> 15
atgaaagttt attacgatag tgatgctgat cttgggctga tcaagtccaa gaaaatcgct 60
attcttggct atggtagcca gggtcacgcc catgcacaga atttgcgcga ttccggtgtt 120
gctgaagtag ctattgcgct tcgtcctgat tcggcttctg ttaaaaaagc acaggatgct 180
ggtttcaagg ttttgaccaa tgctgaagcc gcaaaatggg ctgatatcct gatgatcttg 240
gcacctgatg aacatcaggc tgctatctat gccgaagatt taaaagataa tttgcgccct 300
ggtagtgcaa ttgcttttgc tcatggtttg aatatccatt tcggtctgat cgaaccccgc 360
aaagatatcg atgttttcat gatcgcaccg aaaggcccag gtcacacggt tcgttctgaa 420
tatgtccgtg gcggtggtgt gccttgcttg gtcgccgttg atcaggatgc cagcggtaac 480
gctcatgaca tcgctcttgc ttatgcttct ggcatcggtg gcggtcgttc tggtgttatt 540
gaaaccactt tccgtgaaga agtcgaaacc gatttgtttg gtgagcaggc tgttctctgc 600
ggtggtttga ctgcgcttat cacggctggt tttgaaactt tgactgaagc cggttacgct 660
cctgaaatgg cattcttcga atgtatgcat gaaatgaagc tgatcgtgga tctgatctac 720
gaagcgggta ttgccaatat gcgttattcg atttctaaca ctgccgaata tggtgatatc 780
gtatctggcc cgcgggtcat caatgaagaa tccaaaaagg caatgaaggc tattctggac 840
gacatccaga gcggtcgttt tgtcagcaaa tttgttcttg ataaccgcgc tggtcagccg 900
gaactcaaag ctgcccgtaa acgtatggct gctcacccga tcgaacaggt tggtgcacgt 960
ctgcgtaaaa tgatgccgtg gatcgccagc aacaagctgg ttgataaggc tcgcaactag 1020
<210> 16
<211> 1857
<212> DNA
<213> ilvD(ilvD)
<400> 16
atgcctccct atcgttccag aaccacgact catggtcgta atatggcggg tgccagaagt 60
ttatggcgcg caaccggcgt caaaaatgaa gattttggta agccgattat cgctgttgcc 120
aacagcttta cgcaatttgt ccccggtcat gtccatttaa aggatatggg acagcttgtt 180
gctgaagaaa ttgaaaaagc tggcggtatc gccaaagaat tcaatacgat tgcgattgat 240
gatggtatcg cgatgggaca tggcgggatg ctttattcct tgccgtctcg ggaattgatt 300
gccgattccg tcgaatatat ggtcaacgcc cattgtgctg atgctttggt ctgtatttcc 360
aactgcgaca agattacgcc tggtatgttg atggcttcga tgcgcctgaa tatcccgaca 420
gttttcgtct ctggtggacc tatggaagcc ggtaaagccg aggtcaaagg cgtcaagcgg 480
gcgcttgatc tgatcgatgc tatggtgatt gctgccgatg accattacag cgatggtgaa 540
gtcgaagtta tcgagcagac ggcttgcgct acctgcggtt cctgttccgg tatgtttacg 600
gccaattcga tgaattgcct gaccgaggcc ttggggcttt ctttcccagg taatggttcg 660
atgcttgcga cccatagcga tcgggaacag cttttccgca aggctgggca taccattgtt 720
gatatggcgc gcagctatta tgagcaggat gatgccgctg tattaccgcg ttcaattgcc 780
acgcttgagg cttttgaaaa tgcgatgagt cttgatatcg ccatgggtgg ttccaccaat 840
acggttttgc atctgttggc ggtcgcgcag gaaggcaacg tgcctttcac tatggcggat 900
attgatcgtc tttcccgtca tgtcccttgc ttatgcaagg tcgcaccggc caaaaatgat 960
gtccatatgg aagatgttca tcgggcaggg ggcgttatgg ccattttagg ccagcttgat 1020
cgtgccggat tgatcaatac cagcttgcgc accattcatt ctccgacttt aggcgcagca 1080
ttggacgcat gggatatcag ccgtgacagt tgttctgaag aagcgcagtt attctatcgc 1140
gcggctccgg ggggtgttcc gactcaaaag gctttcagcc agtcttctcg ctatgaagcg 1200
ctggatactg accgcgaaaa aggtgtgatt cgttctaaaa atcatgcttt ttcgacggat 1260
ggtggtctgg ccgtcttatt tggcaatctt gctcctgaag gcagtattgt caaaactgcc 1320
ggtgtggatg agtctattct gaaattcacc ggtaaagcca aggtttacga aagtcaggaa 1380
gccgccgttg ccggtattct tggcaatgat gtcgaagctg gtgaagtggt gatcgttcgc 1440
tatgaaggtc ccaaaggtgg ccccggtatg caggaaatgc tgtatccgac cagctatctg 1500
aaatcgaaag gtttgggtaa actctgcgct ctgattaccg atggtcgttt ttctggtggt 1560
agctctggtt tatccatcgg ccatgtttct cctgaagcgg ccgagggcgg cttgatcgct 1620
ttggtcgaaa ccggtgatac aattgttatc gatattcctg aacggattat ccatctggat 1680
gttgatgatg ctgttattgc cgatcgtcat gcccgcatgg aagccaaggg ggcggcagca 1740
tggaaaccgc aaaaccgtaa tcgtccgatt tcttcggctt tgaaagccta tgcagctttg 1800
acgacaaacg ctgcccgtgg ggcagttcga gatgtcaatc agctcgaacg gcgttaa 1857
<210> 17
<211> 1680
<212> DNA
<213> EcAls(EcAls)
<400> 17
atgaatagcg aaaaacaaag ccgtcagtgg gcgcatggtg ccgatatggt cgttggtcaa 60
ttagaagctc aaggcgtcaa acaagtcttt ggtattcccg gcgccaaaat cgataaagtt 120
ttcgattctt tgcttgattc tagcatcgaa atcatccctg ttcgccatga agccaatgct 180
gcttttatgg cggcagccgt cggccggttg accggtaaag ccggcgttgc tcttgtcacc 240
tctggtccgg gctgtagcaa tttgattacg ggtatcgcaa cagccaattc ggaaggcgat 300
cctgttgtcg cgttgggtgg cgcagttaaa cgtgcggata aagcaaaact tgtccatcag 360
tccatggata ccgtcgccat gttttcgccc gttacgaaat atgctgttga agtctcctcg 420
ccggatgcta ttgcggaagt tgtctcaaat gcttttcgtg ctgcggaaca tggtcgtccg 480
ggtggcgctt tcgttagttt accccaggat attgtcgatc aaccggccac aggtgctatc 540
ttacctgcat ctggtcctgc tctgatgggt cctgctcctg aaagcgcaat caatgatgtt 600
gcgaaattga tcgataatgc aaaaaatcct gtcatcctgc tgggcttaat ggcctcccag 660
cccgctaatt cggcagccct gcgtaaattg cttgaaaaat cacgcatccc tgttaccagt 720
acgtatcagg ctgcgggtgc ggtcaatcaa gaacatttta cgcgtttcgc tggtcgcgtt 780
ggcttgttta ataatcaagc gggtgatcgt ttactgcatt tagcagatct gattatctgc 840
attggctatt cccctgtcga atatgaaccc tccatgtgga atagcggtga tgccacgtta 900
gttcatatcg atgtcctgcc tgcttatgaa gaacgcaatt atgtccccga tattgaatta 960
gttggtgata tcgcagccac actgaatttg cttgccagcc ggattgatca taaattagaa 1020
ctgtcacaac gtgctagtga aatcttggtt gatcggcagc atcaacgtga tttactggat 1080
cgtcgcggcg cctctcttaa tcagtttgct ttgcatccgc ttcgcattgt tcgggccatg 1140
caagatatcg ttaataatga tgtcacactg accgttgata tgggtagctt tcatatttgg 1200
atcgctcgtt atctgtattc attccgggcg cgtcaggtta tgattagtaa tggtcagcaa 1260
acgatgggcg tcgcattgcc ttgggctatt ggtgcatggc ttgttaatcc tggccggaaa 1320
gttgtctctg tcagcggcga tggtggcttt ttgcaatcaa gtatggaact tgaaacggcc 1380
gtccgcttga atgctaatgt tcttcatatc atctgggtcg ataatggtta taatatggtt 1440
gccattcagg aagaaaagaa atatcaacgc ttgtctggtg tcgcttttgg cccggttgat 1500
ttcaaagcat atgccgatgc ttttggtgcg cgtggcttcg cagttgaatc tgcggatgca 1560
ttagaaagca ccctgcgcgc tgcgatggat gttaatggcc cggccgttgt cgctattcct 1620
gtcgattatt ccgataatcc tttgcttatg ggccagttgc atctttcgca aatcctttaa 1680
<210> 18
<211> 1746
<212> DNA
<213> BlAls(BlAls)
<400> 18
atgaatgaaa atggtggtgt ccgcgccctg aataatgtcg cagccaaaaa tgaaaccctt 60
accgtccgtg gtgccgaact tgtcgtcgat tctttgatcc agcaaggcgt tacccatgtc 120
ttcggtatcc ccggcgcaaa aatcgatgcc gttttcgatg tcctgaaaga taaaggcccg 180
gaactgattg tctgtcgcca tgaacagaat gccgctttta tggcggcagc cgttggtcgg 240
ttgacgggta aacctggcgt ttgccttgtc acaagcggtc ccggcgcttc caatttagcg 300
accggtctgg tcacggccaa tacagaaggc gatccggttg tcgcccttgc tggtgcggtt 360
aaacgggctg atcgtttgaa gaaaacccat cagagtatgg ataatgctgc gttgttccaa 420
ccgatcacca aatattctgc tgaagttgaa gatgcgaata atattcctga agcagtcacc 480
aatgcctttc gtgcagccgc ttctggtcag gctggtgctg catttctttc cttccctcaa 540
gatgttaccg ccggccctgc aaccgcaaaa cctgtcaaaa cgatgcccgc tccgaaatta 600
ggtgccgctt cggatgaaca gatctcagcg gcaattgcaa aaatccataa tgccaatttg 660
cctgttgtcc ttgtcggcat gaaaggtggc cggcccgaag ctattgaagc ggttcgtcgc 720
ttgcttcgta aagttaaact tcctttcgtc gaaacatatc aagccgctgg taccttaagc 780
catgatctgg aagatcagta tttcggtcgt attggcctgt ttcgcaatca acccggcgat 840
atgttactgg aaaaagccga tgttgtcttg acagttggtt atgatccgat cgaatatgat 900
cctgtcttct ggaatggtaa aggcgaacgt tccgttattc atttggatga aatccaggcc 960
gatattgatc atgattatca accggaaatc gaactgatcg gcgatattgc tgaaacgctg 1020
aatcatatcg aacatgattc attgcctgtt agtattgatg aatcttttgc ccctgtcttg 1080
gattatttga agaaagcctt ggaagaacag tcggaaccgc ctaaagaaac caaaacggat 1140
ttggttcatc cgcttcaaat cgtccgcgat ttgcgggaat tgctttcaga tgatattaca 1200
gttacctgtg atatcggcag tcatgctatt tggatgtctc gttattttcg cacctatcgg 1260
cctcatggtt tactgatcag taatggtatg cagaccttag gcgttgctct gccctgggcg 1320
attgcggcaa cgttggttaa tccgggccaa aaagttgtct ctgtcagcgg tgatggtggc 1380
tttctgttct cagccatgga attggaaacg gctgtccggc ttaaagcgcc tatcgttcat 1440
attgtctgga atgatagcac gtatgatatg gttgctttcc agcaagaaat gaaatataaa 1500
cgtacatccg gtgttgattt cggtggcatt gatatcgtca aatatgcaga atcgtttggt 1560
gcgaaaggcc ttcgcgttaa ttcaccggat gaattggccg aagtccttaa agcaggttta 1620
gatgccgaag gccccgttgt cattgatatc ccggttgatt atagcgataa tattcattta 1680
gccgatcagc gttttcctaa aaaattcgaa gaacatttca ataaagaagc ttccaaacaa 1740
tcgtaa 1746
<210> 19
<211> 1713
<212> DNA
<213> BsAls(BsAls)
<400> 19
atgacgaaag ccacgaaaga acagaaatcg ctggttaaaa atcggggtgc tgaattagtc 60
gttgattgct tagttgaaca aggcgttacc catgtttttg gtatccccgg tgcgaaaatc 120
gatgcggtct ttgatgctct tcaggataaa ggtccggaaa ttatcgttgc tcgccatgaa 180
cagaatgctg cctttatggc gcaagcagtt ggccgcttga cgggtaaacc tggcgtcgtt 240
ttggtcacgt ctggccctgg tgccagcaat cttgcgacgg gtcttcttac cgctaatacc 300
gaaggtgatc ctgttgtcgc tcttgcgggt aatgtcattc gtgccgatcg gttaaaacgg 360
acccatcaaa gccttgataa tgccgctttg tttcagccca tcaccaaata tagcgttgaa 420
gtccaggatg ttaaaaatat tcctgaagca gtcaccaatg ccttccgtat tgcgtcagct 480
ggccaggctg gtgcagcttt cgtcagcttt cctcaagatg tcgtcaatga agttacgaat 540
accaaaaatg tccgtgctgt tgcagccccg aaattaggcc ctgccgcaga tgatgccatc 600
agcgcagcga ttgccaaaat tcagacggcc aaactgcccg ttgtcttggt tggtatgaaa 660
ggcggccgcc ccgaagcgat taaagccgtc cgtaaacttc tgaaaaaggt ccagcttccg 720
tttgtcgaaa cgtatcaagc cgcaggcacg ttaagccgcg atcttgaaga tcaatatttt 780
ggtcgcatcg gcttatttcg taatcaaccc ggtgatttgt tgcttgaaca ggccgatgtc 840
gttctgacga ttggttatga tcctatcgaa tatgatccta aattttggaa tattaatggc 900
gatcgtacga tcatccattt agatgaaatt atcgctgata tcgatcatgc atatcaaccc 960
gatcttgaac ttattggtga tatcccgtcc acgatcaatc atattgaaca tgatgcggtc 1020
aaagttgaat ttgctgaacg ggaacaaaaa attctttcag atttgaaaca atatatgcat 1080
gaaggtgaac aagtccctgc tgattggaaa tccgatcgtg cgcatccttt agaaatcgtt 1140
aaagaactgc gtaatgctgt cgatgatcat gtcaccgtta cgtgtgatat tggtagtcat 1200
gcaatctgga tgtctcgtta ttttcgctcc tatgaacctt tgaccttgat gatttctaat 1260
ggtatgcaaa cccttggcgt cgcattgcct tgggcaattg gtgcgagctt ggtcaaaccg 1320
ggtgaaaaag ttgtcagtgt ctcaggcgat ggtggcttct tgttttccgc gatggaattg 1380
gaaacagctg ttcgtcttaa agcacctatc gttcatatcg tctggaatga ttccacctat 1440
gatatggttg catttcaaca gctgaaaaaa tataatcgca cctctgcggt tgattttggt 1500
aatattgata ttgtcaaata tgccgaaagc tttggtgcga ccggccttcg tgtcgaatct 1560
ccggatcaac ttgctgatgt tttacgccag ggtatgaatg ccgaaggtcc ggtcattatc 1620
gatgttcctg ttgattattc tgataatatt aatctggcgt cggataaact gcctaaagaa 1680
tttggcgaac tgatgaaaac gaaagctctg taa 1713
<210> 20
<211> 314
<212> DNA
<213> Pgap(Pgap)
<400> 20
cgcggccgcg ttcgatcaac aacccgaatc ctatcgtaat gatgttttgc ccgatcagcc 60
tcaatcgaca attttacgcg tttcgatcga agcagggacg acaattggct gggaacggta 120
tactggaata aatggtcttc gttatggtat tgatgttttt ggtgcatcgg ccccggcgaa 180
tgatctatat gctcatttcg gcttgaccgc agtcggcatc acgaataagg tgttggccgc 240
gatcgccggt aagtcggcac gttaaaaaat agctatggaa tataatagct acttaataag 300
ttaggagaat aaac 314
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(15A-F)
<400> 21
atgtatatct ccttcttaaa agatcttttg aatt 34
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(15A-R)
<400> 22
ggatccaaac tcgagtaagg atctccag 28
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(IlvC-F)
<400> 23
attaaagagg agaaaatgaa agtttattac gatagtgatg 40
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(IlvC-R)
<400> 24
ctagttgcga gccttatc 18
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(IlvD-F)
<400> 25
aaggctcgca actagattaa agaggagaaa atgc 34
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(IlvD-R)
<400> 26
actcgagttt ggatccttaa cgccgttcga gctg 34
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(ZmAls-F)
<400> 27
gagaaaggat ctcccatgtg tcgccaactc ag 32
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(ZmAls-R)
<400> 28
tttctcctct ttaatttaac cgcgaatggt ggtc 34
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(EcAls-F)
<400> 29
gagaaaggat ctcccatgaa tagcgaaaaa caaagccg 38
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(EcAls-R)
<400> 30
tttctcctct ttaatttaaa ggatttgcga aag 33
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(BlAls-F)
<400> 31
gagaaaggat ctcccatgaa tgaaaatggt ggtgtc 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(BlAls-R)
<400> 32
tttctcctct ttaatttacg attgtttgga agcttc 36
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(BsAls-F)
<400> 33
gagaaaggat ctcccatgac gaaagccacg aaag 34
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(BsAls-R)
<400> 34
tttctcctct ttaatttaca gagctttcgt tttcatc 37
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(15A-Fwd)
<400> 35
ggcaaagcca ccctattttt ag 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(15A-Rev)
<400> 36
cacttcactg acaccctcat 20
Claims (8)
1.一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株，其特征在于：所述重组菌的基因组ZMO0038位点替换为抗性筛选标记基因、启动子基因片段以及KdcA基因；所述重组菌还转入了能够融合表达缬氨酸合成途径中的Als, ilvC, ilvD 基因的表达载体；
其中，kdcA基因序列见SEQ ID NO.1；
所述表达重组表达载体携带依次连接的启动子基因片段、Als基因、RBS基因、ilvC基因、RBS基因和ilvD 基因，Als的基因序列见SEQ ID NO.19，ilvC, ilvD 基因序列见SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16；
启动子基因片段为诱导型启动子Ptet或组成型启动子Pgap；
利用诱导型启动子或组成型启动子控制kdcA基因的表达和Als, ilvC, ilvD 基因的表达。
2.如权利要求1所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：根据二羟酸脱氢酶基因kdcA基因序列设计引物，进行PCR扩增，获得目标片段；
步骤2：获取抗性筛选标记基因片段、启动子基因片段以及宿主菌目标片段插入位点上下游基因片段，所述插入位点为Z. mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点；
步骤3：将步骤1和步骤2获得的基因片段转入载体，并转化至ZM4感受态细胞，构建重组菌株。
3.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：所述启动子为诱导型启动子Ptet或组成型启动子Pgap。
4.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：步骤1中根据kdcA基因序列设计的引物序列见SEQ ID NO.2和见SEQ ID NO.3。
5.根据权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于：步骤3中所述载体为pUC57载体。
6.如权利要求2所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：获取Als, ilvC, ilvD 基因片段；
步骤b：将上述获取的三种基因片段整合至穿梭质粒pEZ15a中，构建重组质粒；
步骤c：将重组质粒转入权利要求4获得的重组菌株中。
7.如权利要求1所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株在生产异丁醇中的应用。
8.利用权利要求2~6任一所述的一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株的构建方法构建的重组菌株在生产异丁醇中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910725678.9A CN110358720B (zh) | 2019-08-07 | 2019-08-07 | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910725678.9A CN110358720B (zh) | 2019-08-07 | 2019-08-07 | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110358720A CN110358720A (zh) | 2019-10-22 |
| CN110358720B true CN110358720B (zh) | 2023-01-13 |
Family
ID=68223450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910725678.9A Active CN110358720B (zh) | 2019-08-07 | 2019-08-07 | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110358720B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114196607B (zh) * | 2021-12-29 | 2022-10-28 | 湖北大学 | 一种生产phb的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
| CN114196608B (zh) * | 2021-12-29 | 2022-11-01 | 湖北大学 | 一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
| CN114774453B (zh) | 2022-03-14 | 2023-04-21 | 湖北大学 | 一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用 |
| CN115125180B (zh) * | 2022-05-24 | 2023-11-21 | 天津大学 | 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 |
| CN116355821B (zh) * | 2023-03-10 | 2023-09-29 | 湖北大学 | 一种生产乙二醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9206445B2 (en) * | 2013-04-29 | 2015-12-08 | Alliance For Sustainable Energy, Llc | Biocatalysts with enhanced inhibitor tolerance |
| CN104630250B (zh) * | 2014-12-23 | 2020-04-07 | 天津大学 | 一种基于基因组尺度代谢网络模型指导胞内还原力调节的异丁醇合成菌株构建方法 |
| CN106755035A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 天津大学 | 一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法 |
| CN107699536B (zh) * | 2017-11-27 | 2021-02-05 | 南京工业大学 | 一种基因工程菌及其在生产d-1,2,4-丁三醇中的应用 |
| CN110066758A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 武汉骏安生物科技有限公司 | 一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用 |
-
2019
- 2019-08-07 CN CN201910725678.9A patent/CN110358720B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110358720A (zh) | 2019-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110358720B (zh) | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 | |
| Cheng et al. | Engineering Clostridium for improved solvent production: recent progress and perspective | |
| Wen et al. | Improved n-butanol production from Clostridium cellulovorans by integrated metabolic and evolutionary engineering | |
| Green | Fermentative production of butanol—the industrial perspective | |
| Shanmugam et al. | High-efficient production of biobutanol by a novel Clostridium sp. strain WST with uncontrolled pH strategy | |
| Schiel-Bengelsdorf et al. | Butanol fermentation | |
| Kumar et al. | Developments in biobutanol production: new insights | |
| Becerra et al. | Biobutanol from cheese whey | |
| Sakuragi et al. | Molecular breeding of advanced microorganisms for biofuel production | |
| Dong et al. | Biobutanol | |
| CN109652434B (zh) | 一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN104204206B (zh) | 一种用于生产丁醇的方法 | |
| US8563283B2 (en) | Strains of Escherichia coli modified by metabolic engineering to produce chemical compounds from hydrolyzed lignocellulose, pentoses, hexoses and other carbon sources | |
| US9914943B2 (en) | Modified bacteria for the production of bioalcohol | |
| JP4927297B2 (ja) | 組換え型コリネ型細菌を用いるエタノールの製造方法 | |
| CN111979167B (zh) | 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用 | |
| Khalili-Samani et al. | Sugar fermentation: C2 (ethanolic) platform | |
| CN107267559A (zh) | 一种提高酿酒酵母蔗糖发酵性能的方法及其应用 | |
| CN107988241B (zh) | ptna基因片段在生产丁醇中的应用 | |
| Ye et al. | Engineering coenzyme A-dependent pathway from Clostridium saccharobutylicum in Escherichia coli for butanol production | |
| CN101633690B (zh) | 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| US12098410B1 (en) | Recombinant Zymomonas mobilis for producing ethylene glycol, method and uses thereof | |
| CN102876625A (zh) | 一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法 | |
| CN114015634B (zh) | 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN102618569B (zh) | 产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240424 Address after: Room A316, Building B4-B8, Building B8, Wuhan National Bioindustry (Jiufeng Innovation) Base, No. 666 Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province, 430062 Patentee after: Wuhan Ruijiakang Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 430062 368 Friendship Avenue, Wuchang District, Wuhan, Hubei. Patentee before: Hubei University Country or region before: China |