CN102876625A

CN102876625A - 一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN102876625A
Application number: CN2012103860123A
Authority: CN
Inventors: 高强; 朱燕; 孟庆艳; 潘超强
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: CN102876625B

Abstract

本发明涉及产异丁醇的运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）ATCC10988基因工程菌及其构建方法。本发明克隆得到乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）1.2829中的2-酮异戊酸脱羧酶基因（kivd）和醇脱氢酶基因（adhA），并将其连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA。将重组质粒电转化入Z.mobilis中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。本发明得到的基因工程菌经诱导后可以分解葡萄糖合成异丁醇，这是首次利用运动发酵单胞菌发酵法生产异丁醇，也显示了运动发酵单胞菌的巨大潜力与价值。

Description

一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，具体的是一种产异丁醇的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

异丁醇是一种典型的长链醇，相对于燃料乙醇而言具有高能量密度、低腐蚀性、低吸湿性、更易与汽油和柴油混合以及与现今的设备更好的相容性等特点。因此，异丁醇成为潜在的新型可再生能源替代品和燃料添加剂。异丁醇除了作为一种潜在的新型汽油代替燃料外，目前在化工市场上也有很多用途。生物质作为一种来源丰富的绿色可再生资源，可以广泛用做发酵制备多种化学品的原料，因此通过可再生资源代谢生成异丁醇有着具有良好的发展前景。

过去的研究表明没有原核生物能够由葡萄糖合成异丁醇，现在研究人员通过一定的基因工程技术对一些宿主菌进行改造从而获得合成异丁醇的能力。目前，以大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌为宿主产异丁醇的研究已有很大的突破。其中，Antonino Baez等在2011年应用1L发酵罐，采用边发酵边分离提取的技术应用大肠杆菌基因工程菌株产异丁醇的量已达到50g/L。

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ATCC 10988是一种革兰氏阴性菌，它独有的ED代谢途径能够高效地利用葡萄糖和果糖生成乙醇。运动发酵单胞菌与其他菌相比能耐受较高浓度的葡萄糖及乙醇，在乙醇浓度5.5%条件下可以不影响生长，浓度达到7.7%时无法生长；在含有20%浓度葡萄糖环境中可以正常生长，当浓度达到40%时仍有11～89%的菌株可以存在。此外，在代谢方面，运动发酵单胞菌具有很高的转化效率，它只把很少量的一部分葡萄糖同化作为构造细胞用，约98%的葡萄糖发酵生成乙醇，只有2%作为碳源。然而，目前还没有利用基因工程的方法研究运动发酵单胞菌产异丁醇的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。

本发明的另一个目的在于提供该基因工程菌的构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：宿主菌为运动发酵单胞菌，转入含氯霉素抗性的重组质粒pZY507KA中。也就是将kivd和adhA连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA,再转入运动发酵单胞菌中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

本发明克隆得到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） 1.2829中的2-酮异戊酸脱羧酶基因（kivd）和醇脱氢酶基因（adhA），并将其连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA。将重组质粒电转化入Z. mobilis中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

本发明所述重组质粒pZY507KA中kivd为2-酮异戊酸脱羧酶基因，来源于乳酸乳球菌中，大小为1434bp，其序列为SEQ ID NO：1。

所述重组质粒pZY507KA中adhA为醇脱氢酶基因，来源于乳酸乳球菌中，大小为1067bp，其序列为SEQ ID NO：2。

所述重组质粒pZY507KA包含表达所需的启动子，启动子下游有一段多克隆位点，多克隆位点包含若干单一酶切位点。

本发明进一步公开了产异丁醇的基因工程菌的构建方法包含如下步骤：

（1）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，利用PCR得到2-酮异戊酸脱羧酶基因。

（2）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，利用PCR得到醇脱氢酶基因。

（3）表达载体的构建：

1）将步骤（1）所得的kivd基因经SacI和BamHI双酶切后与用相同内切酶酶切后的表达载体pZY507连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507K。

2）将步骤（2）所得的adhA基因经BamHI和SalI双酶切后与用相同内切酶酶切后的重组质粒pZY507K连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507KA。

（4）转化：重组质粒pZY507KA转化表达宿主运动发酵单胞菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。

本发明制备的运动发酵单胞菌基因工程菌所具有的生化特性如下：

（1）此菌含有质粒pZY507KA，其中K为2-同异戊酸脱羧酶基因，A为醇脱氢酶基因，来源均为乳酸乳球菌基因组。

（2）此菌可以利用外源引入的2-酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶将葡萄糖代谢的中间产物2-酮异戊酸转化为异丁醇。

（3）此菌经24h发酵后异丁醇产量可达0.1g/L。

本发明制备的运动发酵单胞菌基因工程菌与公知技术相比，所具有的积极效果在于：

(1)本发明改造了运动发酵单胞菌缬氨酸代谢途径，引入外源基因kivd与adhA，使运动发酵单胞菌可以分解葡萄糖合成异丁醇，最终产量可达到0.1g/L，气相色谱图如图2所示。

(2)运动发酵单胞菌具有独特的ED途径，只把很少量的一部分葡萄糖同化作为构造细胞用，约98%的葡萄糖发酵转化成产物，只有2%作为碳源。并且，运动发酵单胞菌具有较高的异丁醇耐受能力。

(3)本发明得到的基因工程菌经诱导后可以分解葡萄糖合成异丁醇，这是首次利用运动发酵单胞菌发酵法生产异丁醇，也显示了运动发酵单胞菌在发酵生产异丁醇方面的巨大潜力与价值。

附图说明：

图1、重组质粒pZY507KA示意图；

图2、运动发酵单胞菌基因工程菌气相色谱图；

图3、2-酮异戊酸脱羧酶基因扩增电泳图，其中1、1kb ladder DNA Marker；2、PCR获得的2-酮异戊酸脱羧酶基因；

图4、醇脱氢酶基因扩增电泳图，其中1、1kb ladder DNA Marker；2、PCR获得的醇脱氢酶基因；

图5、kivd基因测序结果比对；

图6、adhA基因测序结果比对。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）1.2829与大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α均有市售；pZY507质粒载体由德国斯图加特大学的Georg A. Sprenger教授赠送，公众通过联系，可以进行索取获得，但只限于科学研究目的，不得用于商业用途以及转让给第三方。

实施例1 2-酮异戊酸脱羧酶与醇脱氢酶基因的扩增

（1）乳酸乳球菌的培养及总DNA的制备

乳酸乳球菌在MRS培养基（蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温80 1mL/L，pH7.0）中30℃静置培养至对数期后，利用基因组提取试剂盒提取总DNA。

（2）2-酮异戊酸脱羧酶基因的扩增

提取乳酸乳球菌基因组，根据GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因序列，设计引物如下：

上游引物k1：5'-CGAGCTCAATAAAATATGGAGGAATGCGATG-3' 酶切位点为SacI；

下游引物k2：5'-CGCGGATCCACCATTATCCAAGAAAAATG-3' 酶切位点为BamHI；

以乳酸乳球菌基因组为模板进行PCR扩增，采用50μL扩增体系：

模版DNA 2μL

primerk1 (10μmol/L) 2μL

primer k2 (10μmol/L) 2μL

dd H₂O 19μL

Taq MIX 25μL

Total volume 50μL

PCR循环体系为：

Step 1 95℃ 5min

Step 2 (30cycles) 92℃ 45sec

65℃ 60sec

72℃ 90sec

Step 3 72℃ 10min

Keep at 4℃

将得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，可以看到在1434bp处出现特异性条带，其大小与目的基因完全吻合。将此特异性条带进行切胶回收，并连接在pMD19-T载体上，委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序（测序的结果见图5）。

3. 醇脱氢酶基因的扩增

提取乳酸乳球菌基因组，根据GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因序列，设计引物如下：

上游引物a1：5'-CGGATCCTTTTATATATAGAGGAGACTTTCTT-3' 酶切位点为BamHI；

下游引物a2：5'-GACGTCGACAAATTTTTCGAATTCATCTGC-3' 酶切位点为SalI；

模版DNA 2μL

primer a1 (10μmol/L) 2μL

primer a2 (10μmol/L) 2μL

dd H₂O 19μL

Taq MIX 25μL

Total volume 50μL

PCR循环体系为：

Step 1 95℃ 5min

Step 2 (30 cycles) 92℃ 45sec

65℃ 60sec

72℃ 90sec

Step 3 72℃ 10min

Keep at 4℃

将得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，可以看到在1067bp处出现特异性条带，其大小与目的基因完全吻合，将此特异性条带进行切胶回收，并将其连接在pMD19-T载体上，委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序（测序的结果见图6）。

实施例2. 重组质粒的构建

（1）表达载体的制备

在含氯霉素（100μg/mL）的LB培养基(氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，pH7.5)中，接种携带质粒pZY507的大肠杆菌DH5α，于37℃，200r/min培养过夜。用质粒提取通用试剂盒提取质粒。

（2）pZY507K重组质粒的构建

对载体pZY507和pMD19-kivd分别用SacI和BamHI进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳、将所需要的DNA片段进行切胶回收，用T4连接酶连接，其中的双酶切体系为：

质粒 20μL

SacI 1μL

BamHI 1μL

10×Buffer 5μL

dd H₂O 23μL

Total volume 50μL

37℃反应1h

上述酶切片段采用DNA纯化试剂盒进行纯化，所得到的线性DNA片段可以用于连接反应。

载体和目的基因的连接，连接体系为：

kivd双酶切片段 7μL

pZY507双酶切片段 1μL

T4连接酶 1μL

T4 buffer 1μL

Total volume 10μL

连接条件：16℃连接过夜。

所得的连接产物转化入大肠杆菌中

（2）pZY507KA重组质粒的构建

对重组质粒pZY507K和pMD19-adhA分别用BamHI和SalI进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳、将所需要的DNA片段进行切胶回收，用T4连接酶连接，其中的双酶切体系和连接体系同上。

将所得到的连接产物转化入购买的E. coli DH5α（对外购买后在本实验室保藏）中，鉴定正确转化后提取质粒备用，此即为重组质粒pZY507KA。

实施例3. 基因工程菌株的构建

运动发酵单胞菌感受态的制备：

（1）从新鲜培养的琼脂平板上挑取单菌落，接种于10mL的T培养基（葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L，pH6.5）中，30℃静置培养过夜。

（2）将上述培养物按1%接种量转接到500mL的T液体培养液中，30℃静置培养。

（3）当培养物的OD₆₀₀达到0.36时，停止培养，迅速将培养物置于冰浴中15～30min，使培养物迅速冷却。

（4）将菌液转移至冰冷的离心管中，4℃ 5000r/min离心10min，回收细胞，弃去上清液，用10mL冰冷的无菌10%甘油洗涤沉淀三次。

（5）用4mL冰冷的无菌10%甘油重悬沉淀，将菌液分装到己灭菌的1.5mL离心管中，每管190μL，用于电转化或于-80℃保存备用。

运动发酵单胞菌的电转化：

转化时取出感受态细胞，冰浴5min，加入10μL重组质粒pZY507KA，混匀，继续冰浴5min。将菌液加入预冷的0.2cm间距电击杯中，按照仪器使用说明书进行电击转化操作，电转化条件为2.5kV，25μF，400Ω。电击结束后，迅速加入1mL T培养基，混匀后转移到1.5mL无菌离心管中，30℃培养2h。浓缩10倍后涂布T+Cm（终浓度为50μg/mL的Cm）筛选平板。30℃培养2～3d。

基因工程菌的鉴定：

将筛选平板上长出的单克隆挑选到含氯霉素抗性的T培养基中，30℃静置培养过夜，用质粒通用提取试剂盒提取质粒，对其进行酶切鉴定及PCR鉴定，鉴定正确后该菌株即为所需的运动发酵单胞菌基因工程菌。

实施例4. 运动发酵单胞菌发酵产异丁醇

将含有重组质粒的运动发酵单胞菌活化后接种于种子培养基（T培养基)，30°C静置培养过夜。将种子液以1:100接种于发酵培养基（补加40g/L葡萄糖的T培养基）中，当OD₆₀₀达到0.4时添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，30°C静置培养发酵24h。发酵液于4℃，5000r/min离心10min，取上清进行气相色谱检测。

实施例5. 发酵液中异丁醇的测定

异丁醇的测定采用Agilent7890气相色谱仪结合G1888顶空进样器测定。

色谱条件：Polyethylene Glycol HP-INNOWax色谱柱，FID（250°C）检测器；进样口压力4.7543psi；初始柱温40℃保持2min，再以15℃/min的速率升到110℃保持4.5min；氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min，氮气流量30mL/min；顶空进样器参数：炉温50℃，环温60℃，传输管温100℃，平衡时间5min，加压0.4min，注射1min，重复测定3次取均值。

最终测定运动发酵单胞菌24h发酵液中异丁醇产量为0.1g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 2-酮异戊酸脱羧酶基因

<400> 1

aataaaatat ggaggaatgc gatgtataca gtaggagatt acctattaga ccgattacac 60

gagttaggaa ttgaagaaat ttttggagtc cctggagact ataacttaca atttttagat 120

caaattattt cccgcaagga tatgaaatgg gtcggaaatg ctaatgaatt aaatgcttca 180

tatatggctg atggctatgc tcgtactaaa aaagctgccg catttcttac aacctttgga 240

gtaggtgaat tgagtgcagt taatggatta gcaggaagtt acgccgaaaa tttaccagta 300

gtagaaatag tgggatcacc tacatcaaaa gttcaaaatg aaggaaaatt tgttcatcat 360

acgctggctg acggtgattt taaacacttt atgaaaatgc acgaacctgt tacagcagct 420

cgaactttac tgacagcaga aaatgcaacc gttgaaattg atcgagtact ttctacacta 480

ctaaaagaaa gaaaacctgt ctatatcaac ttaccagttg atgttgctgc tgcaaaagca 540

gagaaaccct cactcccttt gaaaaaggaa aatccaactt caaatacaag tgaccaagaa 600

attttgaaca aaattcaaga aagcttgaaa aatgccaaaa aaccaatcgt gattacagga 660

catgaaataa ttagttttgg cttagaaaaa acagtcactc aatttatttc aaagacaaaa 720

ctccctatta cgacattaaa ctttggaaaa agttcagttg atgaaactct cccttcattt 780

ttaggaatct ataatggtaa actctcagaa cctaatctta aagaattcgt ggaatcagcc 840

gacttcatcc tgatgcttgg agttaaactc acagactctt caacaggagc cttcactcat 900

catttaaatg aaaataaaat gatttcactg aatataaatg aaggaaaaat atttaacgaa 960

agaatccaaa attttgattt tgaatccctc atctcctctc tcttagacct aagcggaata 1020

gaatacaaag gaaaatatat cgataaaaag caagaagact ttgttccatc aaatgcgctt 1080

ttatcacaag accgcctatg gcaagcagtt gaaaacctaa ctcaaagcaa tgaaacaatc 1140

gttgctgaac aagggacatc attctttggc gcttcatcaa ttttcttaaa accaaagagt 1200

cattttattg gtcaaccctt atggggatca attggatata cattcccagc agcattagga 1260

agccaaattg cagataaaga aagcagacac cttttattta ttggtgatgg ttcacttcaa 1320

cttacagtgc aagaacgcaa attgcaagtc caagttagcc agccaagctc atctcatatg 1380

aactcttata gttgaacatt tttcttggat aatggtggat ccttttatat atag 1434

<210> 2

<211> 1067

<212> DNA

<213> 醇脱氢酶基因

<400> 2

ctttcttatg aaagcagcag tagtaagaca caatccagat ggttatgcgg accttgttga 60

aaaggaactt cgagcaatca aacctaatga agctttgctt gacatggagt attgtggagt 120

ctgtcatacc gatttgcacg ttgcagcagg tgattatggc aacaaagcag ggactgttct 180

tggtcatgaa ggaattggaa ttgtcaaaga aattggaact gatgtaagct cgcttcaagt 240

tggtgatcgg gtttcagtgg cttggttctt tgaaggatgt ggtcactgtg agtactgtgt 300

atctggtaat gaaacttttt gtcgagaagt taaaaatgca ggatattcag ttgatggcgg 360

aatggctgaa gaagcaattg ttgttgccga ttatgctgtc aaagttcctg acggacttga 420

cccaattgaa gctagctcaa ttacttgtgc tggagtaaca acttacaaag caatcaaagt 480

atcaggagta aaacctggtg attggcaagt aatttttggt gctggaggac ttggaaattt 540

agcaattcaa tatgctaaaa atgtttttgg agcaaaagta attgctgttg atattaatca 600

agataaatta aatttagcta aaaaaattgg agctgatgtg attatcaatt ctggtgatgt 660

aaatccagtt gatgaaatta aaaaaataac tggcggctta ggagcacaaa gtgcaatagt 720

ttgtgctgtt gcaaggattg cttttgaaca agcggttgct tctttgaaac ctatgggcaa 780

aatggttgct gtggcacttc ccaatactga gatgacttta tcagttccaa cagttgtttt 840

tgacggagtg gaggttgcag gttcacttgt cggaacaaga cttgacttgg cagaagcttt 900

tcaatttgga gcagagggta aggtaaaacc aattgttgcg acacgcaaac tggaagaaat 960

caatgatatt attgatgaaa tgaaggcagg aaaaattgaa ggccgaatgg tcattgattt 1020

tactaaataa atataaaaga ggcgatgcag atgaattcga aaaattt 1067

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 2-酮异戊酸脱羧酶基因上游引物k1

<400> 3

cgagctcaat aaaatatgga ggaatgcgat g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 2-酮异戊酸脱羧酶基因下游引物k2

<400> 4

cgcggatcca ccattatcca agaaaaatg 29

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 醇脱氢酶基因上游引物a1

<400> 5

cggatccttt tatatataga ggagactttc tt 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 醇脱氢酶基因下游引物a2

<400> 6

gacgtcgaca aatttttcga attcatctgc 30

Claims

1. 一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：宿主菌为运动发酵单胞菌，转入了含氯霉素抗性的重组质粒pZY507KA。

2.权利要求1所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：它是将kivd和adhA连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA,再转入运动发酵单胞菌中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。

3.权利要求1或2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA包含表达所需的启动子，启动子下游有一段多克隆位点，多克隆位点包含若干单一酶切位点。

4.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的kivd为2-酮异戊酸脱羧酶基因，大小为1434bp，其序列为SEQ ID NO：1。

5.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的kivd来源为乳酸乳球菌。

6.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其中所述重组质粒pZY507KA中的adhA为醇脱氢酶基因，大小为1067bp，其序列为SEQ ID NO：2。

7.权利要求2所述的运动发酵单胞菌基因工程菌，其特征在于：所述重组质粒pZY507KA中的adhA来源为乳酸乳球菌。

8.一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌的构建方法，其具体步骤如下：

（1）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因（NCBI GeneID: 1114953）为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，利用PCR得到2-酮异戊酸脱羧酶基因；

（2）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因（NCBI GeneID: 1115472）为依据，设计引物，引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，利用PCR得到醇脱氢酶基因；

（3）表达载体的构建：

1）将步骤（1）所得的kivd基因经SacI和BamHI双酶切后与用相同内切酶酶切后的表达载体pZY507连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507K；

2）将步骤（2）所得的adhA基因经BamHI和SalI双酶切后与用相同内切酶酶切后的重组质粒pZY507K连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507KA；

（4）转化：重组质粒pZY507KA电转化入表达宿主运动发酵单胞菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。