CN102161979B - 一种联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌及其应用。本发明提供的重组菌，为按照如下8种方法制备的8类重组菌：1)将次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌8；2)将次级醇脱氢酶编码基因导入出发菌A中，得到重组菌1；3)将次级醇脱氢酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌2。本发明的实验证明，本发明构建表达质粒psADH、psADH-ctfAB、psADH-ADC或psADH-ctfAB-ADC，同时优选电击转化的方法，使这三个基因能分别或同时在产丙酮丁醇的梭菌中高效表达。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌及其应用。
背景技术
随着能源与环境危机的日益加重，迫使人们去寻找新的方法来逐步减少对于化石资源的依赖。通过微生物利用可再生资源来生产化学品是重要的途径之一。乙醇作为一种常见的化学品具有广泛的用途，近年来燃料乙醇受到许多国家的关注，尤其是巴西，美国，但是乙醇并不是一种理想的汽油替代品，因为乙醇的能量密度比汽油低而且不能与汽油任意比混合，同时乙醇具有吸湿性和腐蚀性，不利于储存与运输。而丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合，是一种极具潜力的新型生物燃料。同时丁醇还是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。异丙醇是一种重要的化工产品和化工原料，是石油化工发展史上从石油原料制得的第一个化工产品，主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。涂料和油墨是其主要应用领域，约占异丙醇总消费量的50％。另外，异丙醇还可以作为汽油添加剂，相对于现在常用的燃料乙醇，异丙醇具有更高的能量密度，而且其辛烷值比正丁醇还要高。异丙醇有特殊的香气，是水果、蔬菜、乳制品和酒类等食品中的天然成分之一。欧美国家在饮料和糖果等产品中添加异丙醇。2004年日本制定了异丙醇作为香料添加剂的标准，指定异丙醇为食品用香料。目前世界异丙醇的总生产能力约为230万吨/年，美国是世界上异丙醇消费量最大的国家，近年我国异丙醇消费保持高速增长势头，价格一直在1万元/吨波动，市场前景广阔。
1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇，1912年魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。而研究发现拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和NESTE 255可以在细胞内合成大约100mM的异丙醇，其合成机理是通过一种次级醇脱氢酶(secondary alcoholdehydregenase，sADH)将丙酮催化成异丙醇。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌，为按照如下8种方法制备的8类重组菌中的任一种：
1)将次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌8；
2)将次级醇脱氢酶编码基因导入出发菌A中，得到重组菌1；
3)将次级醇脱氢酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌2；
4)将次级醇脱氢酶编码基因和辅酶A转移酶编码基因导入出发菌A中，得到重组菌3；
5)将次级醇脱氢酶编码基因和辅酶A转移酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌4；
6)将次级醇脱氢酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌A中，得到重组菌5；
7)将次级醇脱氢酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌B中，得到重组菌6；
8)将次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌A中，得到重组菌7；
所述出发菌A为产丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)；
所述出发菌B为buk基因敲除的产丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)。
所述次级醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列6；
所述辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列7；
所述乙酰乙酸脱羧酶的氨基酸序列为序列表中序列8。
所述次级醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述乙酰乙酸脱羧酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3。
所述次级醇脱氢酶编码基因通过重组载体1导入出发菌A中；
所述次级醇脱氢酶编码基因通过重组载体1导入出发菌B中；
所述次级醇脱氢酶编码基因和辅酶A转移酶编码基因通过重组载体2导入出发菌A中；
所述次级醇脱氢酶编码基因和辅酶A转移酶编码基因通过重组载体2导入出发菌B中；
所述次级醇脱氢酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因通过重组载体3导入出发菌A中；
所述次级醇脱氢酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因通过重组载体3导入出发菌B中；
所述次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因通过重组载体4导入出发菌A中；
所述次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因通过重组载体4导入出发菌B中；
所述重组载体1为将次级醇脱氢酶编码基因插入pITF质粒的BamH I和EcoR I识别位点得到的载体；
所述重组载体2为将辅酶A转移酶编码基因插入所述重组载体1的EcoR I和Nar I识别位点得到的载体；
所述重组载体3为将乙酰乙酸脱羧酶编码基因插入所述重组载体1的Cla I和Bsm I识别位点得到的载体；
所述重组载体4为将乙酰乙酸脱羧酶编码基因插入所述重组载体2的Cla I和Bsm I识别位点得到的载体。
所述产丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridium beijorinckii)；
所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)优选为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB009或丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC824；所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)优选为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052；
所述出发菌B按照如下方法制备：将buk基因敲除载体转入所述丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB009、所述丙酮丁醇梭菌ATCC824或所述拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NCIMB 8052中得到的重组菌；
所述buk基因敲除载体按照如下方法制备：将buk基因特异性的II型内含子的核苷酸插入pMTL009的HindIII和BsrGI识别位点间得到的载体；
所述II型内含子的核苷酸序列为序列表中的序列5。
本发明的另一个目的是一种生产醇的方法。
本发明体的方法，包括如下步骤：发酵所述的重组菌，收集发酵产物，从所述发酵产物中分离得到所述醇，所述醇为下述三种醇中的至少一种：丁醇、异丙醇和乙醇。
所述发酵温度为35℃-40℃；所述发酵温度具体为35℃、37℃或40℃，
所述发酵时间为55h-65h，所述发酵时间具体为55h、60h或65h；
所述发酵培养基的pH为6.5-6.95，所述发酵培养基的pH具体为6.5、6.75或6.95。
所述发酵为厌氧发酵，是指在转速150rpm以下，通氮气，利用发酵罐进行发酵；静置厌氧发酵是指不搅拌、不转动，通氮气，利用发酵罐或厌氧瓶进行发酵。
每1L所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：
(75g-85g)葡萄糖、(0.1g-0.8g)硫酸镁、(0.005g-0.015g)硫酸锰、(0.005g-0.015g)硫酸亚铁、(0.5g-1.5g)氯化钠、(4.5g-5.5g)酵母粉、(1.5g-2.5g)硫酸铵、(0.5-g1.0g)磷酸二氢钾、(0.5g-1.0g)磷酸氢二钾、(1.5g-2.5g)天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基；
每1L所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：
(75g、70g或85g)葡萄糖、(0.1g、0.4g或0.8g)硫酸镁、(0.005g、0.01g或0.015g)硫酸锰、(0.005g、0.01g或0.015g)硫酸亚铁、(0.5g、1.0g或1.5g)氯化钠、(4.5g、5.0g或5.5g)酵母粉、(1.5g、2.0g或2.5g)硫酸铵、(0.5g、0.75g或1g)磷酸二氢钾、(0.5g、0.76g或1g)磷酸氢二钾、(1.5g、2.0g或2.5g)天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
本发明的实验证明，本发明将拜氏梭菌NRRL B593的sADH基因单独或与丙酮丁醇梭菌的ctfAB和/或adc基因一起插入到穿梭质粒PITF中，并连接丙酮丁醇梭菌的自身启动子，构建表达质粒psADH、psADH-ctfAB、psADH-ADC或psADH-ctfAB-ADC，同时优选电击转化的方法，将重组质粒导入buk基因敲除或不敲除的梭菌细胞，使这三个基因能分别或同时在丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌中高效表达。
附图说明
图1为质粒PITF和pIMP1的结构示意图
图2为基于II型内含子的敲除质粒pMTL009结构示意图
图3为表达质粒psADH
图4为表达质粒psADH-ctfAB
图5为表达质粒psADH-ADC
图6为表达质粒psADH-ctfAB-ADC(psADH-ctfAB-Ads)
图7为buk基因敲除质粒pMTL009(buk)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、丙酮丁醇梭菌中敲除buk基因并表达重组质粒psADH-ctfAB-ADC获得联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌
1)buk基因敲除质粒pMTL009(buk)的构建
对buk基因序列进行计算和分析，设计以下引物：
IBS：5’-AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGAAATAGCAAAAGTGCGCCCAGATAGGGTG-3’
EBS1d：5’-CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGCAAAAGATAACTTACCTTTCTTTGT-3’
EBS2：5’-TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATTTCTCGATAGAGGAAAGTGTCT-3’
EBS Universal：5’-CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC-3’
以pMTL009质粒(Dong，H.，Y.Zhang，et al.″Engineering clostridium strain to acceptunmethylated DNA.″PLoS One 5(2)：e9038，公众可从中国科学院微生物研究所获得。图2)为模板，分别以IBS和EBS Universal为一对引物，以EBS1d和EBS2为另一对引物，采用全式金公司的Taq酶进行PCR扩增，其PCR扩增程序均为：
预变性：94℃，2min
30个循环：
94℃，30s
55℃，30s
72℃，30s
最后延伸：72℃，10min。
将所得的PCR产物进行核酸电泳然后切胶回收，然后将两段产物进行融合PCR(融合PCR的模板为两段产物，引物为IBS和EBS1d)，得到的350bp产物进行PCR产物回收，随后用NEB公司的HindIII和BsrGI对纯化的PCR产物和pMTL009质粒进行混合酶切，37℃静置4h后，用DNA回收试剂盒纯化消化的PCR产物，-20℃保存。
取适量的经过酶切的PCR产物和质粒DNA(其含量比例大于5∶1)用于T4DNA连接酶反应，16℃连接4-8h。取2μl的连接产物，加入100μl高效感受态细胞(E.coli JM109)中，混匀；冰浴放置30min后，42℃水浴热激90s；冰浴放置2min，加入800μl新鲜LB培养基，37℃，150rpm，放置45min；吸取100μl菌液涂布于含氯霉素的LB平板上。培养20h-24h后，将克隆划线分离，并取单菌落用于富集培养，提取质粒，送去测序，该质粒含有的序列为序列5的核苷酸，该质粒为将序列5插入到pMTL009的HindIII和BsrG I酶切位点间得到的载体，将该质粒质粒命名为pMTL009(buk)(图7)。
2)pMTL009(buk)转化梭菌及buk敲除菌的筛选和验证
丙酮丁醇梭菌电转感受态细胞的制备：厌氧环境下，取RCM培养基培养的对数中后期的丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)SMB009(Dong，H.，Y.Zhang，et al.″Engineering clostridium strain to accept unmethylated DNA.″PLoS One 5(2)：e9038，2010，公众可从中国科学院微生物研究所中获得。)细胞液约48ml置于50ml的可密封的离心管(Nalgene，菌液装满根离心管)中，冰浴放置10min。4℃，2000g离心10min。厌氧环境下，去上清液，加入足量预冷的电转缓冲液(270mM蔗糖，5mM NaH2PO4，pH7.4)，洗涤两次，并重新悬浮到1.5ml的电转缓冲液，放置冰浴用于电转化。
丙酮丁醇梭菌的转化：取0.4cm的电转杯，放置在冰浴中冷却，加入200μg质粒pMTL009(buk)和20μl新鲜配制的SMB009感受态细胞，冰浴放置2min。采用2.0kv脉冲电压和25μF的电容进行电转化；随后将电转液加到含10ml RCM培养基的厌氧瓶中静置厌氧培养4h(37℃)。离心收集细胞，并将所得细胞涂布于3-5个含氯霉素抗性的RCM琼脂培养基(氯霉素在培养基中的终浓度为30mg/l)中。培养24-36h后，挑取单菌落接入无抗性的RCM液体培养基中培养，然后吸取100μl菌液放入900μl RCM液体培养基中进行梯度稀释，吸取100μl 10-4稀释液涂布到无抗性的RCM琼脂培养基中，最后通过菌落PCR(引物为EBS1d和buk-1：atgtatagattactaataatcaatcctggct)，结果为760bp即为buk基因敲除的阳性克隆，记为C.acetobutylicum SMB009Δbuk。
3)表达质粒psADH-ctfAB-ADC的构建
A.构建表达sADH基因的psADH质粒
采用细菌基因组提取试剂盒提取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRLB593(购自ARS(NRRL)Culture Collection)的染色体DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：
B593-1：5’-CGCGGATCCATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGGTATTAATAA-3’
B593-2：5’-CCGGAATTCTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC-3’
采用TaKaRa公司的高效保真酶Primerstart进行PCR扩增，其PCR扩增程序为：
预变性：98℃，2min
30个循环：98℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后延伸：72℃，10min
将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列表1所示的核苷酸，该PCR产物的基因为sADH(GenBank数据库中的登录号是AF157307.2的从2351到3406之间的1056bp序列)。
随后用NEB公司的BamHI-HF(-HF表示高保真，以下同)和EcoRI-HF对纯化的PCR产物进行双酶切，37℃静置4h后，用DNA回收试剂盒纯化酶切后的PCR产物，-20℃保存。
采用质粒小提试剂盒提取E.coli中含有的pITF质粒(Wang，S.，Y.Zhang，etal.″Formic Acid Triggers the″Acid Crash″of Acetone-Butanol-EthanolFermentation of Clostridium acetobutylicum.″Appl Environ Microbiol，2011，77(5)：1674-1680。公众可从中国科学院微生物研究所获得。)(由pIMP1衍生而得，含有硫解酶启动子的质粒，硫解酶启动子序列见序列表4)，其大小约为4.5kb。取适量的质粒，同样用NEB公司的BamHI-HF和EcoRI-HF对其双酶切，随后用DNA回收试剂盒纯化回收酶切后的质粒DNA，-20℃保存。
取适量的经过双酶切的PCR产物和质粒DNA(其含量比例大于5∶1)用T4DNA连接酶反应，16℃保存4-8h。取5μl的连接产物，加入100μl的高效感受态细胞(E.coli JM109)中，混匀；冰浴放置30min后，42℃水浴热激90s；冰浴放置2min，加入800μl新鲜LB培养基，37℃，150rpm，放置45min；取100μl菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上。培养20-24h后，挑取单菌落少量细胞，用于菌落PCR验证阳性克隆子。将阳性克隆子划线分离，并取单菌落用于富集培养，提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pITF质粒的BamHI和EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为psADH(图3)。
B.构建表达ctfAB基因的pctfAB质粒
用同样的方法提取对数后期的丙酮丁醇梭菌SMB009的染色体DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：
c tfAB-1：5’-CGCGGATCCATGAACTCTAAAATAATTAGATTTG-3’
c tfAB-2：5’-CCGGAATTCCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTCA-3’
将PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，为ctfAB基因(GenBank数据库中登录号为AY187686的从2613到3936之间的1324bp序列)。
将该PCR产物经过BamHI和EcoRI酶切，与经过同样酶切的pITF质粒连接，连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取质粒，送去测序，结果该质粒为将序列表中的序列2插入pITF的BamHI和EcoRI酶切位点间得到的载体，该质粒命名为pctfAB。
用同样的方法提取对数后期的丙酮丁醇梭菌SMB009的染色体DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：
adc-1：5’-CGCGGATCCTGAAGTAATTAAACAAATTAGCACGCCATT-3’
adc-2：5’-CCGGAATTCTTTTCGCATTTATAAGCTCACATATTCTAG-3’
将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，为adc基因(GenBank数据库中登录号为AE001438.3的从179848到180582之间735bp序列)。
将该PCR产物经过BamHI和EcoRI酶切，与经过同样酶切的pITF质粒连接，连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取质粒，送去测序，结果该质粒为将序列表中的序列3插入pITF的BamHI和EcoRI酶切位点间得到的载体，该质粒命名为pADC。
C.构建共表达sADH、ctfAB、adc基因的psADH-ctfAB-ADC质粒
以pctfAB质粒为模板，用以下引物进行PCR扩增：
pthl-ctfAB-1：5’-CCGGAATTCTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG-3’
pthl-ctfAB-2：5’-TACGGGCGCCCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTCA-3’
将得到的PCR产物经过EcoRI和NarI酶切，与经过同样酶切的psADH连接，得到的连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，将该质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列2插入psADH的EcoRI和NarI得到的载体，命名为psADH-ctfAB，为sADH和ctfAB共表达的质粒，见图4。
以pADC质粒为模板，用以下引物进行PCR扩增：
pthl-adc-1：5’-CCATCGATTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGGTATAATTAAGTTG-3’
pthl-adc-2：5’-CTGGAATGCGTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGCTCTAGGCAA-3’
将得到的PCR产物经过Cla I和Bsm I酶切，分别与经过同样酶切的psADH和psADH-ctfAB连接，得到的连接产物转化大肠杆菌，分别得到2种转化子，提取2种转化子的质粒，将1种质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入psADH的Cla I和Bsm I得到的载体，命名为psADH-ADC，为sADH和adc共表达的质粒见，图5；另一种质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入psADH-ctfAB的Cla I和Bsm I得到的载体，命名为psADH-ctfAB-ADC，为sADH、ctfAB和adc共表达的质粒，见图6。
4)多种重组菌的获得
采用步骤2)的方法进行如下操作：
将psADH-ctfAB-ADC转入C.acetobutylicum SMB009Δbuk中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ctfAB-ADC，该重组菌命名为C.acetobutylicumSMB009Δbuk-004。
将表达质粒psADH转化buk基因敲除菌株C.acetobutylicum SMB009Δbuk中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH，将重组菌命名为C.acetobutylicumSMB009Δbuk-001；
将表达质粒psADH转化C.acetobutylicum SMB009中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH，将重组菌命名为C.acetobutylicum SMB009-001；
将psADH-ctfAB转化buk基因敲除菌株C. acetobutylicum SMB009Δbuk中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ctfAB，将重组菌命名为C.acetobutylicum SMB009Δbuk-002；
将psADH-ctfAB转化C.acetobutylicum SMB009中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ctfAB，将重组菌命名为C.acetobutylicum SMB009-002；
将psADH-ADC转化buk基因敲除菌株C.acetobutylicum SMB009Δbuk中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ADC，将重组菌命名为C.acetobutylicumSMB009Δbuk-003；
将psADH-ADC转化C.acetobutylicum SMB009中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ADC，将重组菌命名为C.acetobutylicum SMB009-003；
将psADH-ctfAB-ADC转化c.acetobutylicum SMB009中，得到重组菌，提取质粒送去测序，该质粒为psADH-ctfAB-ADC，将重组菌命名为C.acetobutylicumSMB009-004。
采用同样的方法将空载体pIMP I(pIMP I的结构示意图如图1所示，与pITF的区别在于含有硫解酶启动子和甲酸脱氢酶基因的质粒，硫解酶启动子序列见序列表4，该质粒记载在Wang，S.，Y.Zhang，et al.″Formic Acid Triggers the″Acid Crash″of Acetone-Butanol-Ethanol Fermentation of Clostridium acetobutylicum.″ApplEnviron Microbiol，2011，77(5)：1674-1680.公众可从中国科学院微生物研究所获得。)分别转入C.acetobutylicum SMB009和C.acetobutylicum SMB009Δbuk中得到转空载体c.acetobutylicum SMB009和转空载体C.acetobutylicum SMB009Δbuk。经过直接涂布红霉素抗性平板，长出的菌落即是阳性克隆。
实施例2、丙酮丁醇梭菌ATCC824表达重组质粒获得联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌
1、质粒甲基化
将实施例1中的表达质粒psADH和psADH-ctfAB-ADC分别转入含DNA甲基化酶的质粒的E.coli(pAN1)(Mermelstein，L.D.and E.T.Papoutsakis.″In vivomethylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage phi 3T Imethyltransferase to protect plasmids from restriction upon transformation ofClostridium acetobutylicum ATCC 824.″Appl Environ Microbiol，1993，59(4)：1077-1081，公众可从中国科学院微生物研究所中获得。)中，将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的双抗LB平板上，挑取单菌落并富集培养，分别用B593-1和B593-2引物对、ctfAB-1和ctfAB-2引物对进行菌落PCR验证，得到1056bp为质粒psADH甲基化的阳性克隆，得到1324bp为质粒psADH-ctfAB-ADC甲基化的阳性克隆。
提取质粒psADH甲基化的阳性克隆的质粒，转入丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC824中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为psADH，将该重组菌命名为重组菌C.acetobutylicum ATCC824-001；
提取质粒psADH-ctfAB-ADC甲基化的阳性克隆的质粒，转入丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC824中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为psADH-ctfAB-ADC，将该重组菌命名为重组菌C.acetobutylicumATCC824-002；
将空载体pIMP I(采用上述方法进行甲基化)转入丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC824中，经过直接涂布红霉素抗性平板，长出的菌落即是阳性克隆，将阳性菌命名为转空载体C.acetobutylicum ATCC824。
实施例3、拜氏梭菌NCIMB 8052表达重组质粒获得联产丁醇、异丙醇及乙醇的重组菌
将实施例1得到的表达质粒psADH转入拜氏梭菌(Clos tridium beijerinckii)NCIMB 8052中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为psADH，将该重组菌命名为重组菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052-001；
采用同样的方法将空载体pIMP I(不需要甲基化)，经过直接涂布红霉素抗性平板，长出的菌落即是阳性克隆，将阳性菌命名为转空载体Clostridium beijerinckiiNCIMB 8052。
实施例4、重组菌的发酵分析
方法一：
分别将实施例1得到的重组菌C.acetobutylicum SMB009Δbuk-001、C.acetobutylicum SMB009-001、C.acetobutylicum SMB009Δbuk-002、C.acetobutylicum SMB009-002、C.acetobutylicum SMB009Δbuk-003、C.acetobutylicum SMB009-003、C.acetobutylicum SMB009Δbuk-004、C.acetobutylicum SMB009-004，实施实例2得到的重组菌C.acetobutylicumATCC824-001、C.acetobutylicumATCC824-002，实施实例3得到重组菌Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052-001进行厌氧发酵(在转速150rpm以下，通氮气，利用发酵罐进行发酵)60h；
发酵培养基为RCM培养基，按照如下方法制备：酵母粉(OXOID，1112852-02)：3g/L；胰蛋白胨(OXOID，955927)：10g/L；牛肉浸膏(北京化学试剂公司，69004494)：10g/L；Cys-HCl(国药集团化学试剂有限公司，62007534)：0.5g/L；无水乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司，10018892)：3g/L；氯化钠10g/L；葡萄糖：5g/L；可溶性淀粉：5g/L(这三个为：北京现代东方精细化学品有限公司)，发酵培养到对数中期，以5％-10％的接种量接种到含CGM培养基(葡萄糖70g/L；硫酸镁0.4g/L；硫酸锰0.01g/L；硫酸亚铁0.01g/L；氯化钠1g/L；酵母粉5g/L(OXOID，1112852-02)；硫酸铵2g/L；磷酸二氢钾0.75g/L；磷酸氢二钾0.75g/L；天冬氨酸2g/l；溶剂为水；115℃条件下灭菌20分钟，pH为6.75)的发酵罐中，低转速(转速150rpm)培养，发酵温度为37℃。
方法二：
与方法一基本相同，不同的是：发酵温度为35℃，发酵时间为55h；发酵培养基的pH为6.5；
每1L发酵采用的培养基CGM培养基按照如下方法制备：
75g葡萄糖、0.1g硫酸镁、0.005g硫酸锰、0.005g硫酸亚铁、0.5g氯化钠、4.5g酵母粉、1.5g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、1.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
方法三：
与方法一基本相同，不同的是：发酵温度为40℃，发酵时间为65h；发酵培养基的pH为6.95；
每1L发酵采用的培养基按照如下方法制备：
85g葡萄糖、0.8g硫酸镁、0.015g硫酸锰、0.015g硫酸亚铁、1.5g氯化钠、5.5g酵母粉、2.5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1g磷酸氢二钾、2.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
分别取方法一得到的各发酵液离心后的上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析，Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4溶液，流速0.5ml/min。以C.acetobutylicum SMB009、C.acetobutylicum SMB009Δbuk、转空载体C.acetobutylicum SMB009Δbuk、转空载体C.acetobutylicum SMB009、C.acetobutylicum ATCC824、转空载体C.acetobutylicum ATCC824、Clostridiumbeijerinckii NCIMB 805和转空载体C.beijerinckii NCIMB 8052为对照。
标准品为丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇，标准品保留时间各为40分钟、24分钟、27分钟、23分钟，而样品在相应时间也有出峰，因此说明样品中含有丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇。
结果如下表1所示：
表1为各重组菌的构建方法及醇产量
C.acetobutylicum SMB009的总醇、丁醇、丙酮和乙醇的产量为21.3、13.1、6.4和1.8；
C.acetobutylicum SMB009Δbuk的总醇、丁醇、丙酮和乙醇的产量为21.6、14.2、5.3和2.1；
C.acetobutylicum ATCC824的总醇、丁醇、丙酮和乙醇的产量为21.4、13.4、5.9和2.1；
C.beijerinckii NCIMB 8052的总醇、丁醇、丙酮和乙醇的产量为14.95、9.6、4.8和0.55；
转空载体C.acetobutylicum SMB009Δbuk与C.acetobutylicum SMB009Δbuk结果无显著差异。
转空载体C.acetobutylicum SMB009与C.acetobutylicum SMB009结果无显著差异。
转空载体C.acetobutylicum ATCC824与C.acetobutylicum ATCC824结果无显著差异。
转空载体C.beijerinckii NCIMB 8052与C.beijerinckii NCIMB 8052结果无显著差异。
采用上述方法检测方法二和方法三得到的发酵液，结果与方法一无显著差异。
Claims (6)
1.一种重组菌，是将次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因导入出发菌B中，得到的重组菌；
所述出发菌B为buk基因敲除的产丙酮丁醇的梭菌（Clostridium)；
所述次级醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述乙酰乙酸脱羧酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述次级醇脱氢酶编码基因、辅酶A转移酶编码基因和乙酰乙酸脱羧酶编码基因通过重组载体4导入出发菌B中；
所述重组载体4为将乙酰乙酸脱羧酶编码基因插入重组载体2的多克隆识别位点得到的载体；
所述重组载体2为将辅酶A转移酶编码基因插入重组载体1的多克隆识别位点得到的载体；
所述重组载体1为将次级醇脱氢酶编码基因插入pITF质粒的多克隆识别位点得到的载体；
所述产丙酮丁醇的梭菌（Clostridium）为丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum)；
所述丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）为丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）SMB009；
所述出发菌B按照如下方法制备：将buk基因敲除载体转入所述丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）SMB009中得到的重组菌；
所述buk基因敲除载体按照如下方法制备：将buk基因特异性的II型内含子的核苷酸插入pMTL009的多克隆位点间得到的载体；
所述II型内含子的核苷酸序列为序列表中的序列5。
2.一种生产醇的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的重组菌，收集发酵产物，从所述发酵产物中分离得到所述醇，所述醇为丁醇、异丙醇和乙醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述发酵温度为35℃-40℃；所述发酵时间为55h-65h；
所述发酵培养基的pH为6.5-6.95；
所述发酵为厌氧发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述发酵温度为35℃、37℃或40℃；所述发酵时间为55h、60h或65h；
所述发酵培养基的pH为6.5、6.75或6.95。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：
每1L所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：
75g-85g葡萄糖、0.1g-0.8g硫酸镁、0.005g-0.015g硫酸锰、0.005g-0.015g硫酸亚铁、0.5g-1.5g氯化钠、4.5g-5.5g酵母粉、1.5g-2.5g硫酸铵、0.5g-1.0g磷酸二氢钾、0.5g-1.0g磷酸氢二钾、1.5g-2.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
每1L所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：
75g或85g葡萄糖、0.1g、0.4g或0.8g硫酸镁、0.005g、0.01g或0.015g硫酸锰、0.005g、0.01g或0.015g硫酸亚铁、0.5g、1.0g或1.5g氯化钠、4.5g、5.0g或5.5g酵母粉、1.5g、2.0g或2.5g硫酸铵、0.5g、0.75g或1g磷酸二氢钾、0.5g、0.75g或1g磷酸氢二钾、1.5g、2.0g或2.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。
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