CN102703493B - 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法 - Google Patents

一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102703493B
CN102703493B CN201210206766.6A CN201210206766A CN102703493B CN 102703493 B CN102703493 B CN 102703493B CN 201210206766 A CN201210206766 A CN 201210206766A CN 102703493 B CN102703493 B CN 102703493B
Authority
CN
China
Prior art keywords
butanol
atcc
bacterial strain
pimp1
sol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210206766.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102703493A (zh
Inventor
陈新德
侯小虎
熊莲
黄超
张海荣
陈雪芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Original Assignee
Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS filed Critical Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Priority to CN201210206766.6A priority Critical patent/CN102703493B/zh
Publication of CN102703493A publication Critical patent/CN102703493A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102703493B publication Critical patent/CN102703493B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。该方法是将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh；或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。本发明重组菌株能够表达丁醇产生菌丁醇生物合成基因编码的丁醇生物合成酶，从而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代谢强度得到提高，丁醇的产量和转化率可得到进一步提高，有利于丁醇的工业化生产。

Description

一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。
背景技术：
丁醇是一种重要的化工原料，主要用于增塑剂、溶剂、萃取剂等。近年来发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，且能与汽油以任意比混合，可以使用现有的石油管道运输方式，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。
丁醇主要有发酵和石油化工合成的方法生产。发酵法是粮食或其它淀粉质农副产品，经水解得到发酵液，然后在丙酮、丁醇梭菌作用下，经发酵制得丙酮、丁醇和乙醇的混合物，通常的比例为3：6：1，再经精馏得到相应产品。80年代起石油化工业的迅猛发展，发酵法无法与以丙烯为原料的羰基合成法竞争，因此很少采用该方法生产丁醇产品。但是，近年来由于石油价格的飞速上涨，加之石油资源的日益紧缺，导致原油价格的持续上涨，通过石油化工方法生产丁醇、丙酮的成本大大提高，发酵法生产丙酮、丁醇的技术重新显示出其优势，特别是发酵法生产丙酮丁醇是以可再生资源替代不可再生的石油基原料制造，符合国家能源安全的长远战略。与化学合成法相比，发酵法具有以下优势：
1)化工合成法以石油为原料，投资大，技术设备要求高；而微生物发酵法一般以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和木质纤维素等为原料，其工艺设备与酒精生产相似，原料价廉，来源广泛，设备投资较小；
2)发酵法生产条件温和，一般常温操作，不需贵重金属催化剂；
3)选择性好、安全性高、副产物少，易于分离纯化；
4)降低了对有限石油资源的消耗和依赖。
但目前，丁醇发酵缺乏经济竞争力，其主要原因是：1）用作发酵的碳源成本偏高；2）发酵液中的丁醇浓度低；3）发酵过程中的丁醇选择性不高。为了解决上述问题，使发酵法在经济上具有较好的竞争能力，自上世纪六十年代以来，世界各国研究工作者在菌种改造、发酵原料、代谢途径、产物分离等方面进行了大量研究，我国工作者也对丙酮丁醇发酵进行了一系列探索。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。
本发明将丁醇产生菌的丁醇生物合成途径的酶的基因克隆进入丙酮丁醇梭菌中，使丁醇生物合成途径的酶过量表达，以提高丁醇的产量，从而实现了本发明的目的。
本发明的高产丁醇的重组菌株是通过以下方法构建的，包括以下步骤：
将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；
所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh；或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；
所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
所述的表达盒EC具体是将氯霉素启动子Pcm、β-羟丁酰-CoA脱氢酶基因hbd（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示）、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl的自身启动子Pthl、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示）、β-羟丁酰-CoA脱水酶（巴豆酸酶）基因crt的自身启动子Pcrt、β-羟丁酰-CoA脱水酶（巴豆酸酶）基因crt（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示）、丁酰-CoA脱氢酶基因bcd（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示）顺序相连，得到表达盒EC。
所述的操纵子Sol具体是将操纵子Sol启动子Psol1、Psol2、醇脱氢酶基因adhE（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.17所示）、酰基-CoA转移酶基因ctfA（其编码蛋白的序列如SEQID NO.18所示）、ctfB（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.19所示）顺序连接，得到操纵子Sol。
所述的丁醇脱氢酶基因bdh具体是将丁醇脱氢酶基因bdhA自身启动子PbdhA、丁醇脱氢酶基因bdhA（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.21所示）、bdhB自身启动子PbdhB、丁醇脱氢酶基因bdhB（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.22所示）顺序连接，得到丁醇脱氢酶基因bdh。
所述的表达载体优选为表达载体pIMP1。
所述的丙酮丁醇梭菌包括但不限于Clostridium acetobutylicum CICC8008、CICC8011、CICC8012、CICC8016、CICC8017和美国典型微生物菌种保藏中心ATCC所保藏的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum或Clostridium saccharobutylacetonicum或Clostridiumbeijerinkii)ATCC 824、ATCC 3625、ATCC 4259、ATCC 8529、ATCC 10132、ATCC 25752、ATCC 27021、ATCC 35702、ATCC 39057、ATCC 39058、ATCC 39236、ATCC 43084、ATCC51743、ATCC 55025、ATCC 824D-5、BAA-117。
本发明的第二个目的是提供本发明的高产丁醇的重组菌株在以淀粉类或糖类为原料生产丁醇中的应用。
本发明的高产丁醇的重组菌株的培养可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质、以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。
就碳源而言，诸如淀粉类、葡萄糖、木糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、纤维素水解液、半纤维素水解液、淀粉水解物、糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。
就有机微量营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，麸皮、豆粕、玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。
就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等等均可采用。
培养方式为发酵温度为30～42℃单釜或连续发酵，发酵时间36～108h，培养基中就会积累大量的丁醇。
培养结束后，可以采用常规蒸馏方法从发酵培养基中收集丁醇。
利用本发明的方法构建的重组菌株，其能够表达丁醇产生菌丁醇生物合成基因编码的丁醇生物合成酶，从而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代谢强度得到提高，丁醇的产量和转化率可得到进一步提高，有利于丁醇的工业化生产，具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1是丁醇生物合成途径示意图，图中ldh,乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase；pdc,丙酮酸脱羧酶pyruvate decarboxylase；hyd,氢化酶hydrogenase；pfor,丙酮酸：铁氧化还原蛋白氧化还原酶pyruvate:ferredoxin oxidoreductase；thl,乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)acetyl-CoAacetyltransferase(thiolase)；hbd,β-羟丁酰-CoA脱氢酶β-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase；crt,β-羟丁酰-CoA脱水酶（巴豆酸酶）3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase(crotonase)；bcd,丁酰-CoA脱氢酶butyryl-CoA dehydrogenase；aad,乙醛丁醛脱氢酶Acetaldehyde butyraldehydedehydrogenase;bdhAB,丁醇脱氢酶butanol dehydrogenase；adh,醇脱氢酶alcoholdehydrogenase；pta,磷酸乙酰基转移酶phosphate acetyltransferase；ack,乙酸激酶acetatekinase；ptb,磷酸丁酰基转移酶phosphate butyryltransferase；buk,丁酸激酶butyrate kinase;CtfAB,乙酰乙酰-CoA酰基-CoA转移酶acetoacetyl-CoA:acyl-CoAtransferase；Fd,铁氧化还原蛋白ferredoxin；Etf，电子转移黄素蛋白electron transfer flavoprotein；AAc,乙酰乙酸acetoacetate；AAc-CoA,乙酰乙酰-CoA acetoacetyl-CoA；Ac/Bu,acetate/butyrate；Ac-CoA/Bu-CoA,acetyl-CoA/butyryl-CoA；ox,被氧化的oxidized；red,被还原的reduced.。
图2是重叠PCR制备表达盒EC示意图；
图3是表达载体pIMP1图谱；
图4是重组表达质粒pIMP1-EC图谱；
图5是重组表达质粒pIMP1-Sol图谱；
图6是重组表达质粒pIMP1-Bdh图谱；
图7是重组表达质粒pIMP1-Sol-EC图谱；
图8是重组表达质粒pIMP1-EC-Bdh图谱；
图9是重组表达质粒pIMP 1-Sol-EC-Bdh图谱；
图10是重叠PCR制备表达盒EC琼脂糖凝胶电泳图，图中Lane M:DL 10,000DNA Marker;lane 1:Pcm-hbd PCR产物（926bp）;lane 2:Pthil-thil PCR产物（1391bp）;lane 3:Pcm-hbd-Pthil-thil PCR产物(2317bp);lane 4:Pcrt-crt-bcd PCR产物(2117bp);lane 5:Pcm-hbd-Pthil-thil-Pcrt-crt-bcd PCR产物(4434bp)。
图11是重组表达质粒验证琼脂糖凝胶电泳图,图中Lane M:DL 10,000DNA Marker;lane 1:pIMP1BamHI单切产物（4695bp）;lane 2:表达盒EC PCR产物（4434bp）;lane 3:Sol操纵子PCR产物(4755bp);lane 4:丁醇脱氢酶基因Bdh基因PCR产物(2930bp);lane5:pIMP1-ECBamHI单切产物(9129bp)；lane 6:pIMP1-Sol SmaI单切产物(9456bp)；lane7:pIMP1-Bdh BamHI单切产物(7632bp)；lane 8:pIMP1-Sol-EC SmaI单切产物(13890bp)；lane9:pIMP1-EC-Bdh SalI单切产物(12066bp)；lane 10:pIMP1-Sol-EC-Bdh KpnI单切产物(16827bp)；lane 11:pIMP1-Sol-EC SmaI酶切产物；lane 12:pIMP1-EC-Bdh SmaI酶切产物；lane13:pIMP1-Sol-EC-Bdh SmaI酶切产物。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、表达盒EC、操纵子Sol和丁醇脱氢酶基因bdh的制备。
1）丁醇产生菌丁醇生物合成途径的酶的基因的解析及表达盒的制备
丁醇生物合成途径示意图如图1所示，丁醇生物合成途径的酶的基因的表达强度是通过启动子控制的，本发明采用的启动子如表1所示。目的基因的获得以及目的基因与启动子的融合是通过PCR实现的。
表1：所采用启动子功能区序列
50μL PCR反应体系包括：dNTP 4μL，10×PS buffer(Mg2+plus)5μL，正向引物(20μmol/L)1μL，反向引物(20μmol/L)1μL，DNA模板100μg，PrimeSTARTM HS DNAPolymerase 0.5μL，dd H2O补至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；98℃变性10s，退火15s，72℃延伸，循环30次；72℃延伸10min；4℃保存。PCR实验中的退火温度和延伸时间根据引物退火温度和反应产物的长度设定，具体如表2所示。
2）表达盒EC的制备是以Clostridium acetobutylicum ATCC43084基因组DNA为模板通过重叠PCR获得的，其合成示意图如图2所示，具体步骤如下：
a)第一轮PCR分别获得相应产物Pcm-hbd、Pthl-thl和Pcrt-crt-bcd。以Clostridiumacetobutylicum ATCC43084基因组DNA为模板，分别以P1（其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）P2（其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）、P3（其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）P4（其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示）和P5（其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示）P6（其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示）为引物进行PCR，PCR反应体系与步骤1）基本相同，只是引物不同，其反应条件与步骤1）基本相同，只是退火温度和延伸时间如表2所示，对PCR产物进行电泳和胶回收，由此分别获得片段Pcm-hbd、Pthil-thl和Pcrt-crt-bcd（其电泳图如图10所示）。
b）第二轮PCR：将片段Pcm-hbd和Pthl-thl等摩尔比混合，以P1P4为引物进行PCR（PCR反应体系与步骤1）基本相同，只是引物不同，其反应条件与步骤1）基本相同，只是退火温度和延伸时间如表2所示），对PCR产物进行电泳和胶回收，由此获得片段Pcm-hbd-Pthl-thl（其电泳图如图10所示）。
c）第三轮PCR：将片段Pcm-hbd-Pthl-thl和Pcrt-crt-bcd等摩尔比混合，以P1-P6为引物进行PCR（PCR反应体系与步骤1）基本相同，只是引物不同，其反应条件与步骤1）基本相同，只是退火温度和延伸时间如表2所示），对PCR产物进行电泳和胶回收，由此获得片段Pcm-hbd-Pthil-thl-Pcrt-crt-bcd（其电泳图如图10所示），经测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，将片段Pcm-hbd-Pthil-thl-Pcrt-crt-bcd命名为表达盒EC。重叠PCR制备表达盒EC琼脂糖凝胶电泳图如图10所示。
3）操纵子Sol的扩增是以Clostridium acetobutylicum ATCC824基因组DNA为模板，以P7（其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示）–P8（其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示）为引物，进行PCR（PCR反应体系与步骤1）基本相同，只是引物不同，其反应条件与步骤1）基本相同，只是退火温度和延伸时间如表2所示），对PCR产物进行电泳（其电泳图如图11所示）和胶回收，测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，由此获得操纵子Sol。
4）丁醇脱氢酶基因Bdh基因的扩增是以Clostridium acetobutylicum ATCC43084基因组DNA为模板，以P9（其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示）–P10（其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示）为引物，进行PCR（PCR反应体系与步骤1）基本相同，只是引物不同，其反应条件与步骤1）基本相同，只是退火温度和延伸时间如表2所示），对PCR产物进行电泳（其电泳图如图11所示）和胶回收，测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，由此获得丁醇脱氢酶基因bdh。
表2：PCR反应相关信息
二、构建重组表达质粒
将PCR获得的表达盒EC通过SalI和BamHI双酶切，与同样经过SalI和BamHI双酶切的表达载体pIMP1相连，得到重组表达质粒pIMP1-EC，pIMP1-EC图谱如图4所示；
将PCR获得的操纵子Sol通过SalI单酶切，与同样经过SalI单酶切的表达载体pIMP1相连，得到重组表达质粒pIMP1-Sol，pIMP1-Sol图谱如图5所示；
将PCR获得的丁醇脱氢酶基因Bdh通过SmaI单酶切，与同样经过SalI单酶切的表达载体pIMP1相连，得到重组表达质粒pIMP1-Bdh，pIMP1-Bdh图谱如图6所示；
将PCR获得的操纵子Sol通过SalI单酶切，与同样经过SalI单酶切的重组表达质粒pIMP1-EC相连，得到重组表达质粒pIMP1-Sol-EC，pIMP1-Sol-EC图谱如图7所示；
将PCR获得的丁醇脱氢酶基因Bdh通过SmaI单酶切，与同样经过SalI单酶切的重组表达质粒pIMP1-EC相连，得到重组表达质粒pIMP1-EC-Bdh，pIMP1-EC-Bdh图谱如图8所示；
将PCR获得的丁醇脱氢酶基因Bdh通过SmaI单酶切，与同样经过SalI单酶切的重组表达质粒pIMP1-Sol-EC相连，得到重组表达质粒pIMP1-Sol-EC-Bdh，pIMP1-Sol-EC-Bdh图谱如图9所示。
重组表达质粒验证琼脂糖凝胶电泳图如图11所示。
三、构建重组菌株
a)重组表达质粒甲基化修饰
将上述重组表达质粒pIMP1-EC、pIMP1-Sol、pIMP1-Bdh、pIMP1-Sol-EC、pIMP1-EC-Bdh和pIMP1-Sol-EC-Bdh分别电转化到含有质粒pAN1的E.coli ER2275中(pAN1含有来源于Bacillus subtilis噬菌体Φ3T的甲基转移酶Φ3T I基因)（Mermelstein LD,Papoutsakis ET（1993）In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage Φ3TImethyl-transferase to protect plasmids from restriction upon transformation of Clostridiumacetobutylicum ATCC 824.Appl Environ Microbiol 59:1077–1081）。并将转化后的细胞涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB平板上，挑取单菌落富集培养，PCR验证阳性克隆子后，提取阳性克隆子的质粒即为甲基化的重组表达质粒，由此分别得到甲基化的重组表达质粒pIMP1-EC、pIMP1-Sol、pIMP1-Bdh、pIMP1-Sol-EC、pIMP1-EC-Bdh和pIMP1-Sol-EC-Bdh。
b)甲基化的重组表达质粒转化丙酮丁醇梭菌
强化梭菌培养基（RCM）组成（g/L）：酵母粉3；蛋白胨10；牛肉膏10；葡萄糖5；可溶性淀粉10；乙酸钠3；L-半胱氨酸盐酸盐0.5，余量为水，pH6.8。
厌氧的条件下培养丙酮丁醇梭菌C.acetobutylium（用两种丙酮丁醇梭菌分开做实验，C.acetobutylium ATCC824和C.acetobutyliumATCC43084）至OD600值0.8时，4℃、5000rpm离心收集菌体，用预冷的ETB溶液（0.27mol/L蔗糖，0.005mol/L磷酸二氢钠，pH7.4）洗涤2次，最后用适量ETB溶液悬浮菌体，分装。将甲基化的重组质粒载体（甲基化的重组表达质粒pIMP1-EC、pIMP1-Sol、pIMP1-Bdh、pIMP1-Sol-EC、pIMP1-EC-Bdh或pIMP1-Sol-EC-Bdh）与菌体混合，置于冰上10min，然后将混合物转移至0.4cm电击杯进行转化，电转化参数为：电压2kV，电容25μF，电阻∞，电击持续时间13ms。电转化完毕后立即将菌体转至RCM培养基中，复壮6-8h，涂布于含有40ug/mL的红霉素RCM平板上，37℃培养36h出现转化子。对转化子按照步骤a）的方法进行PCR验证阳性克隆子后，即得到含有重组表达质粒的重组菌株。由此分别获得含重组表达质粒pIMP1-Sol、pIMP1-Bdh、pIMP1-EC、pIMP1-Sol-EC、pIMP1-EC-Bdh和pIMP1-Sol-EC-Bdh的重组菌株。
四、重组菌株发酵生产丁醇
种子活化培养基：质量分数5%的玉米醪。121℃高压蒸汽灭菌2h。
糖发酵培养基：质量分数8%的玉米醪与质量分数5%的葡萄糖以3：7的质量比混合定量。115℃高压蒸汽灭菌40min。
分别取4℃保藏的含重组表达质粒pIMP1-Sol、pIMP1-Bdh、pIMP1-EC、pIMP1-Sol-EC、pIMP1-EC-Bdh和pIMP1-Sol-EC-Bdh的丙酮丁醇梭菌C.acetobutylium孢子（C.acetobutyliumATCC824和C.acetobutyliumATCC43084），沸水浴90s后迅速用冷水冷却，以杀死营养体及较弱的孢子。将经过热处理的孢子接入种子活化培养基（250mL三角瓶装200ml活化培养基），37℃恒温培养12h后即可用于接种糖发酵培养基，然后在糖发酵培养基中，37℃培养72h，用气相色谱测定培养物中丁醇、丙酮和乙醇的含量。气相色谱HP6820(Hewlett packardcorporation,USA)，毛细管色谱柱Agilet FFAP，氢火焰检测器。初温：90℃；终温230℃；升温速率15℃/min。进样口温度：200℃，检测器温度：250℃，进样量：0.5μL，内标物：丁醇。
测定结果如表3和表4所示：
表3：C.acetobutylium ATCC824重组菌株的丁醇发酵参数
表4：C.acetobutylium ATCC43084重组菌株的丁醇发酵参数
由表3和表4可以看出，转入了重组表达质粒的重组菌株，除了转入重组表达质粒pIMP1-Sol的重组菌株，其丁醇产量与野生型的未转入重组表达质粒的菌株基本一样外，其他转入重组表达质粒pIMP 1-Bdh、pIMP 1-EC、pIMP 1-Sol-EC、pIMP 1-EC-Bdh和pIMP1-Sol-EC-Bdh的重组菌株，其丁醇的产量都得到了很大的提高，差异显著。虽然转入重组表达质粒pIMP1-Sol的重组菌株，其丁醇产量与野生型的未转入重组表达质粒的菌株基本一样，但是其乙醇产量显著高于野生型菌株。

Claims (5)

1.一种高产丁醇的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；
所述的目的片段为表达盒EC；或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；
所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体为表达载体pIMP1。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的丙酮丁醇梭菌为Clostridiumacetobutylicum CICC8008、CICC8011、CICC8012、CICC8016、CICC8017、丙酮丁醇梭菌ATCC 824、ATCC 3625、ATCC 4259、ATCC 8529、ATCC 10132、ATCC 25752、ATCC 27021、ATCC 35702、ATCC 39057、ATCC 39058、ATCC 39236、ATCC 43084、ATCC 51743、ATCC 55025、ATCC 824D-5或BAA-117。
4.一种按照权利要求1、2或3所述的高产丁醇的重组菌株的构建方法构建得到的高产丁醇的重组菌株。
5.权利要求4所述的高产丁醇的重组菌株在以淀粉类或糖类为原料生产丁醇中的应用。
CN201210206766.6A 2012-06-20 2012-06-20 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法 Active CN102703493B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210206766.6A CN102703493B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210206766.6A CN102703493B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102703493A CN102703493A (zh) 2012-10-03
CN102703493B true CN102703493B (zh) 2016-08-17

Family

ID=46896540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210206766.6A Active CN102703493B (zh) 2012-06-20 2012-06-20 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102703493B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10150974B2 (en) 2013-06-28 2018-12-11 Green Biologics Limited Solvent production

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399215B (zh) * 2016-10-10 2021-09-03 大连理工大学 一种高效生产丁醇的重组梭菌、构建方法与应用
CN107245096B (zh) * 2017-05-15 2020-12-11 大连理工大学 一种fruC基因过表达的重组梭菌、其构建方法及应用
CN110734909B (zh) * 2018-07-19 2021-04-13 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 丙酮丁醇梭菌中的一个非编码rna及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935677A (zh) * 2009-07-02 2011-01-05 代谢探索者公司 以高产率生物生产正丁醇的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935677A (zh) * 2009-07-02 2011-01-05 代谢探索者公司 以高产率生物生产正丁醇的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cloning, sequencing, and molecular analysis of the sol operon of Clostridium acetobutylicum, a chromosomal locus involved in solventogenesis;R J Fischer;《Journal of Bacteriology》;19931231;第175卷(第21期);第6959-6969页 *
Genetic modification of critical enzymes and involved genes in butanol biosynthesis from biomass;He Huang;《Biotechnology Advances》;20100524;第28卷;第651-657页 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10150974B2 (en) 2013-06-28 2018-12-11 Green Biologics Limited Solvent production

Also Published As

Publication number Publication date
CN102703493A (zh) 2012-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vees et al. Towards continuous industrial bioprocessing with solventogenic and acetogenic clostridia: challenges, progress and perspectives
Atsumi et al. Metabolic engineering for advanced biofuels production from Escherichia coli
CN103339261B (zh) 通过重组微生物从一氧化碳产生丁醇
Ezeji et al. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors
Konur Propanediol production from glycerol: A review of the research
Zhang et al. Current progress on butyric acid production by fermentation
AU2007316189B2 (en) Process for the biological production of n-Butanol with high yield
Huang et al. Genetic modification of critical enzymes and involved genes in butanol biosynthesis from biomass
CN103502435B (zh) 重组微生物及其用途
Hou et al. Engineering Clostridium acetobutylicum for alcohol production
Gu et al. Ammonium acetate enhances solvent production by Clostridium acetobutylicum EA 2018 using cassava as a fermentation medium
CN104640977A (zh) 重组微生物制备生物柴油
Berezina et al. Microbial producers of butanol
Gao et al. Metabolic analysis of butanol production from acetate in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 using 13 C tracer experiments
Dong et al. Biobutanol
Mazzoli et al. Clostridium thermocellum: a microbial platform for high-value chemical production from lignocellulose
CN101952430A (zh) 增强的产乙醇和丁醇微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法
CN102703493B (zh) 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法
Amiri et al. Biobutanol production
Zhang et al. Biobutanol production from renewable resources: Recent advances
Wang et al. Fermentative biobutanol production: an old topic with remarkable recent advances
CN101130782B (zh) 以葡萄糖为底物产1,3-丙二醇重组酿酒酵母的构建方法
CN104789487A (zh) 分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法
CN104204206B (zh) 一种用于生产丁醇的方法
Panchasara et al. Biosynthetic pathway for production of renewable biofuels

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant