CN110734909B

CN110734909B - 丙酮丁醇梭菌中的一个非编码rna及其应用

Info

Publication number: CN110734909B
Application number: CN201810794247.3A
Authority: CN
Inventors: 顾阳; 杨云鹏; 郎楠楠; 姜卫红
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN110734909A

Abstract

本发明公开了一种RNA分子，其序列为SEQ ID NO:1。该非编码RNA分子在丙酮丁醇梭菌中的过表达能够提高菌株的生长速率和有机溶剂生产能力。

Description

丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用，具体涉及一种RNA分子、及其用于提高丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂能力的用途。

背景技术

产溶剂梭菌是一类具有特殊分解与合成代谢途径的厌氧微生物，其底物谱宽泛，能够利用糖质原料、秸秆类木质纤维原料乃至一碳气体(CO，CO₂)，且产物种类丰富，可天然合成多种大宗化学品及燃料，包括丙酮、乙醇、丁醇、己醇、1，3-丙二醇和氢气等。因此，产溶剂梭菌作为重要的工业微生物受到广泛关注，例如发明专利CN201210163123.8报道了丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)用于生产丁醇、丙酮和乙醇的研究。

虽然利用产溶剂梭菌发酵生产有机溶剂和化学品具有广阔的应用前景，但与大肠杆菌、酿酒酵母等工业微生物相比，产溶剂梭菌在菌株生长速率、溶剂产物合成效率及产量方面仍有较大差距，亟待进一步改造和优化。造成产溶剂梭菌遗传改造进展缓慢的一个主要原因是我们对这类厌氧微生物的重要生理、代谢过程及其调控机制缺乏深入理解，对与细胞性能相关的功能基因缺乏全面、深入的发掘，从而无法为菌株改造提供有效信息和靶点。目前，产溶剂梭菌中被鉴定的与溶剂生成相关的功能基因数量极为有限，这远远满足不了产溶剂梭菌的代谢改造需求。

研究表明，非编码小RNA(small noncodingRNA，sncRNA)是生物体中重要的调控元件，其可以对细胞重要的代谢活动和生理过程发挥影响。近些年，随着研究的不断深入，越来越多的sncRNA被鉴定并应用到菌株的代谢改造中。然而，与植物和动物相比，微生物中针对sncRNA的研究主要局限在少数物种中，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等。至今，在产溶剂梭菌中只有少数几个sncRNA的功能被解析。

有鉴于此，发明人借助全基因组水平突变体库筛选的方法，经过大量的研究实验，发现丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum的cac2384基因的启动子(P₂₃₈₄)中包含一段小RNA(sRNA)的编码序列，该sRNA为一段94nt的功能序列，不具备编码蛋白的能力，因此是非编码小RNA(sncRNA)。该sncRNA(命名为sr2384)的编码序列位于基因cac2384上游非编码区，其上游部分序列与cac2383的编码框重叠。在此基础上，我们利用在线sRNA二级结构分析软件RNAfold WebServer对该sr2384进行二级结构预测，结果表明在sr2384二级结构中含有两段茎环结构。

通过抑制丙酮丁醇梭菌中sr2384的表达水平，菌株的生长及产溶剂能力均明显降低；相反，利用不同强度启动子强化sr2384表达后，菌株的生长优于对照菌株，同时产溶剂时间明显提前，这表明适量强化sr2384的表达可以显著改善菌株性能。

发明内容

发明人在丙酮丁醇梭菌中筛选得到的溶剂生成相关非编码小RNA(sr2384)的强化表达显著提升了菌株的发酵表型，表明其是一类重要的菌株遗传改造靶点，为后续产溶剂梭菌的代谢工程设计和改造提供了新思路，有助于构建更具工业化应用潜力的的产溶剂梭菌。上述发现构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种RNA分子，其序列为SEQ ID NO:1：

5’-UACCUUUCUAGCAUAUAUUACAUGCAAACCUUACCCUCCUUUCUAUCCAUAUCUAUACAAAUUUAUUCCUUAAAAAAAAAUAUAUGAAUGAAUA-3’(SEQ ID NO:1)。

根据本发明的第二个方面，提供了一种RNA表达框，其包含上述RNA分子的模板DNA序列SEQ ID NO:2：

5’-TACCTTTCTAGCATATATTACATGCAAACCTTACCCTCCTTTCTATCCATATCTATACAAATTTATTCCTTAAAAAAAAATATATGAATGAATA-3’(SEQ ID NO:2)。

优选上述表达框的DNA序列为SEQ ID NO:3：

5’-ACACAAAAAATTAAAAGAAAAATGGGAAAAAATAGCTTTTTCACGCATACCTTTCTAGCATATATTACATGCAAACCTTACCCTCCTTTCTATCCATATCTATACAAATTTATTCCTTAAAAAAAAATATATGAATGAATATAAAAAAAACACAAAAACTATTTATAGAATCATAGATAAAACTTAAGTTATCGTTGTTAAAACCTAAAGTATCTTTAACAGCATAACTTAATAAACATCTGATTCTCATATATCAAATTTTAAGGAGGTTACAAAATG-3’(SEQ ID NO:3)。

根据本发明的第三个方面，提供了一种质粒，其包含上述模板DNA序列SEQ ID NO:2、或者上述RNA表达框。

根据本发明的第四个方面，提供了一种丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，其是包含了上述质粒的转化子。

上述RNA分子或者上述丙酮丁醇梭菌能够用于生产有机溶剂，所述有机溶剂包括丁醇、丙酮和/或乙醇。

根据本发明的另一个方面，提供了一种提高丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂能力的方法，包括以下步骤：

A.构建用于表达上述RNA分子的质粒；

B.将步骤A中构建的质粒转化入丙酮丁醇梭菌中，筛选出过表达所述RNA的阳性克隆。

上述步骤B中所述转化为氯化钙转化法或电转化，优选电转化。

优选地，上述方法可以进一步包含步骤C.通过发酵实验，筛选验证得到有机溶剂生产能力提高的菌株，所述有机溶剂选自丁醇、丙酮和乙醇。

上述步骤C中所述发酵实验的条件是：P2培养基，8％(w/v)葡萄糖，5％(v/v)的接种量，37℃，厌氧发酵。

在一种优选的实施方式中，上述丙酮丁醇梭菌是Clostridium acetobutylicumATCC 824。

上述步骤A中的质粒骨架选自穿梭质粒pIMP1和pXY1。

在一种优选的实施方式中，上述质粒包含thl启动子SEQ ID NO:4、200-1启动子SEQ ID NO:5、或者1200-9-15启动子SEQ ID NO:6：

5’-TTTTTAACAAAATATATTGATAAAAATAATAATAGTGGGTATAATTAAGTTGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGATTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGAGTCGACTCTAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO:4)；

5’-TTTTTAACAAAATATTTTGAGAGACATGGATGCCCTATGCTATAATGTAGTTGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGATTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGAGTCGACTCTAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO:5)；

5’-TTTTTAACAAAAAGTATTGAAATTTGGTCTACCCAGGTATTATAATGTGGTTGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGATTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO:6)。

比如，上述质粒骨架可以是pIMP1-thl质粒，其在专利CN201210163123.8和文献(Xiao,H.,et al.,Confirmation and elimination of xylose metabolism bottlenecksin glucose phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system-deficientClostridium acetobutylicum for simultaneous utilization of glucose,xylose,andarabinose.Appl Environ Microbiol,2011.77(22):p.7886-95.)中已有描述；也可以是pXY1-P_thl、pXY1-P_200-1、pXY1-P_1200-9-15质粒，其在文献(Yang,G.H.,et al.,RapidGeneration of Universal Synthetic Promoters for Controlled Gene Expression inBoth Gas-Fermenting and Saccharolytic Clostridium Species.Acs SyntheticBiology,2017.6(9):p.1672-1678.)中已有描述。

本发明的RNA分子在丙酮丁醇梭菌中过表达可显著提升菌株的生长速率和产物合成能力。利用不同强度启动子强化RNA表达后，菌株的生长优于对照菌株，同时产溶剂时间明显提前。其中，采用相对较弱的200-1启动子来强化RNA的表达可以使菌株生长和产溶剂提前的表型进一步提升，表明强化该RNA的表达可以显著改善菌株性能。

附图说明

图1显示了通过5'及3'RACE实验以及sRNA二级结构预测软件对sRNA的序列和二级结构进行解析的示意图。其中A是通过5'及3'RACE实验对sr2384的长度进行精确验证的结果，TSS指特定基因或sRNA的转录起始位点；B是通过RNAfold WebServer对sRNA的二级结构进行预测的结果。

图2显示了强化sr2384表达的菌株CAC-smR和转入了pIMP1-thl空质粒的对照菌株Control的生长及产溶剂曲线。其中左图为生长曲线，右图为产溶剂曲线。

图3显示了丙酮丁醇梭菌中不同启动子进行sr2384强化表达的强度。

图4显示了在丙酮丁醇梭菌中采用不同强度启动子强化sr2384表达后菌株生长及产溶剂曲线。其中824-thl是Clostridium acetobutylicum ATCC 824中转入了pXY1-P_thl空质粒的对照菌株，824-thl-sRNA是Clostridium acetobutylicum ATCC 824中转入了强化sr2384表达的pXY1-P_thl质粒的菌株，824-thl200-1-sRNA是Clostridium acetobutylicumATCC 824中转入了强化sr2384表达的pXY1-P_200-1质粒的菌株，824-thl1200-15-sRNA是Clostridium acetobutylicum ATCC 824中转入了强化sr2384表达的pXY1-P_1200-9-15质粒的菌株。左图为生长曲线，右图为产溶剂曲线。

具体实施方式

在本文中，术语“RNA”、“RNA分子”、“sRNA”、“sncRNA”、“sr2384”表示相同的意义，都是指本发明的非编码小RNA分子SEQ ID NO:1。为描述方便起见，本文中有时也将RNA分子SEQ ID NO:1的转录模板序列SEQ ID NO:2称为“sncRNA”或“sr2384”，本领域技术人员根据具体的描述内容能够容易地区分它们的含义。

本发明在丙酮丁醇梭菌中鉴定得到一个新型的控制溶剂生成的非编码小RNA(sncRNA)，命名为sr2384。借助5'及3'RACE实验，我们发现该sncRNA为一段94nt的功能序列，该sncRNA主要位于cac2384上游非编码区，并且该sncRNA上游部分序列与cac2383的编码框重叠，如图1中A所示。进一步，以得到的sncRNA序列为模板，我们利用在线sRNA二级结构分析软件RNAfold WebServer对该sncRNA进行二级结构预测，结果表明，在sncRNA二级结构中含有两段茎环结构，如图1中B所示。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

主要培养基及缓冲液：

P2培养基配制：

溶液1：80g D-葡萄糖，加水定溶至850mL；

溶液2：2.2g NH₄Ac，0.5g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g KH₂PO₄，加水定容至100mL；

溶液3：2.0g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g NaCl，0.1g FeSO₄·7H₂O，加水定容至100mL；

溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg对氨基苯甲酸，100mg维生素B1，1mg生物素；

溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装，即得P2培养基。(固体培养基另加20g/L琼脂粉)。

CGM培养基：2g(NH₄)₂SO₄，1g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.015g FeSO₄·7H₂O，0.01g CaCl₂，0.01g MnSO₄·H₂O，0.002g CoCl₂，0.002g ZnSO₄，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，20g葡萄糖溶于1L水中。(固体培养基另加20g/L琼脂粉)。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉)。

有机溶剂检测：

气相色谱仪(型号：7890A,Agilent,Wilmington,DE,USA)；配备一根毛细管柱子(Alltech EC^TM-WAX)以及一个火焰离子化探针，测定发酵液上清总溶剂(丁醇、丙酮和乙醇)含量。

实施例1：sncRNA表达质粒的构建

1.1扩增丙酮丁醇梭菌基因组

以野生型丙酮丁醇梭菌基因组(基因组NCBI编号为NC_003030)为模板，用下述引物进行PCR扩增：

正向sr2384-F：5’-ACGCGTCGACTACCTTTCTAGCATATATTA-3’；

反向sr2384-R：5’-CGCGGATCCTTATGTTAATTTGTGTTTAA-3’。

PCR扩增条件(KOD酶)为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；68℃，30s后转95℃，30s，30个循环；68℃，10min；16℃，10min。

得到可转录出目标sncRNA的DNA片段。

1.2构建sncRNA表达质粒

将步骤1.1中扩增得到的DNA片段经SalI/BamHI酶切后连入在专利CN201210163123.8或文献(Xiao,H.,et al.,Confirmation and elimination of xylosemetabolism bottlenecks in glucose phosphoenolpyruvate-dependentphosphotransferase system-deficient Clostridium acetobutylicum forsimultaneous utilization of glucose,xylose,and arabinose.Appl EnvironMicrobiol,2011.77(22):p.7886-95.)中描述的pIMP1-thl质粒，即得到sncRNA表达质粒。

实施例2：包含sncRNA表达质粒的转化子构建

2.1质粒进行甲基化处理

作为宿主的野生型丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824具有较强的限制性酶切和修饰系统(RM system)，因此pIMP1-thl空质粒和包含sncRNA编码片段的pIMP1-thl质粒在电转化该菌株之前需要先进行甲基化。具体为：用1～2μl构建好的质粒转化ER2275/pANS1感受态，在氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的双抗LB平板上筛选转化子。分别挑单克隆接至氨苄青霉素和壮观霉素抗性LB培养基，摇匀后抽质粒即可用于电转。取1-4μg质粒用于电转，一般使用于电转的质粒的体积在10μl比较合适。

2.2制备菌种感受态

将野生型丙酮丁醇梭菌在CGM固体平板上进行划菌，厌氧箱中37℃培养过夜。挑取野生型丙酮丁醇梭菌单菌落接至CGM液体培养基中，37℃培养过夜。第二天早晨用5ml注射器按照5％(v/v)接种量转接至50ml CGM液体培养基中进行扩大培养(37℃)。当菌液OD₆₀₀值达到0.4-0.6(对数生长中期)时，立刻将菌液置于冰上迅速冷却使菌体停止生长。

将菌液冰浴20min后，装至50ml离心管，4℃，4000rpm离心10min。离心好后迅速将其进入厌氧箱，倒弃上清。向菌体中加入遇冷的ETM(270mM Saccharose，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄，10mM MgCl₂)，轻轻混匀打散菌体，之后4℃，4000rpm离心10min。离心后再次倒弃上清，加入适量ET(270mM Saccharose，0.6mM Na₂HPO₄，4.4Mm NaH₂PO₄)悬浮菌体，至此完成电转感受态制备。

2.3质粒转化

电转过程如下：吸取190μl感受态到装有10μl质粒的EP管中，混合均匀，冰上预冷10min。将200μl质粒和感受态的混合液加入到电转杯中准备电转。电转条件为1.8kV，200Ω，25uF Micropulser。电转完成后，迅速向电转杯中加入400μl CGM液体培养基，然后将其全部转入5ml EP管中，置于37℃复苏培养4-5h。

将复苏好的菌液取一定量涂相应的抗性板，37℃培养1-2天，平板上长出的菌落即为含有特定质粒的转化子。强化sr2384表达的菌株命名为CAC-smR；作为对照，包含pIMP1-thl空质粒的菌株命名为Control。

这两种菌株的生长和总溶剂数据见表1及附图2。

实施例3：含不同强度启动子质粒的转化子构建

3.1扩增丙酮丁醇梭菌基因组

按照实施例1中步骤1.1的方法扩增丙酮丁醇梭菌基因组，得到可转录出目标sncRNA的DNA片段。

3.2构建含不同强度启动子的sncRNA表达质粒

按照实施例1中步骤1.2的方法构建sncRNA表达质粒，所使用的质粒骨架是在文献(Yang,G.H.,et al.,Rapid Generation of Universal Synthetic Promoters forControlled Gene Expression in Both Gas-Fermenting and SaccharolyticClostridium Species.Acs Synthetic Biology,2017.6(9):p.1672-1678.)中已描述的pXY1-P_thl，pXY1-P₂₀₀-1、pXY1-P_1200-9-15，它们分别包含有thl启动子SEQ ID NO:4、200-1启动子SEQ ID NO:5、1200-9-15启动子SEQ ID NO:6。

3.3转化子构建

按照实施例2中的方法，构建含不同强度启动子的丙酮丁醇梭菌转化子，所不同的是sncRNA表达质粒不相同。其中Clostridium acetobutylicum ATCC 824中转入了pXY1-P_thl空质粒的对照菌株命名为824-thl，转入了强化sr2384表达的pXY1-P_thl质粒的菌株命名为824-thl-sRNA，转入了强化sr2384表达的pXY1-P_200-1质粒的菌株命名为824-thl200-1-sRNA，转入了强化sr2384表达的pXY1-P_1200-9-15质粒的菌株命名为824-thl1200-15-sRNA。

这四种菌株的生长和总溶剂数据见表2和图4。

实施例4：菌株发酵比较试验

将实施例2中构建的两种转化子Control和CAC-smR、以及实施例3中构建的四种转化子824-thl、824-thl-sRNA、824-thl200-1-sRNA和824-thl1200-15-sRNA均按照5％(v/v)的接种量接种至P2培养基(30ml)中进行发酵。P2培养基中碳源为8％(w/v)葡萄糖。发酵过程中向P2培养基中添加10μg/ml的红霉素，以防发酵过程中质粒严重丢失。发酵期间，对实施例2两株菌株分别在25h，36h，48h，62h，72h以及92h进行发酵取样，冻存于-20℃；对实施例3中四株菌株分别在24h，48h，64h，74h以及89h进行发酵取样，冻存于-20℃，待进行气相色谱测定发酵液中总溶剂(丁醇、丙酮和乙醇之和)含量。

表1、实施例2中sr2384过表达菌株与对照菌株的总溶剂生产比较

由表1中的实验数据和图2可以看出，本发明的RNA分子是丙酮丁醇梭菌中影响菌株生长和产溶剂的正调控因子，过表达该小RNA可显著提升菌株的生长速率和产物合成能力。

表2、实施例3中三种转化子与原始菌株的总溶剂生产比较

由表2中的实验数据和图4可以看出，在丙酮丁醇梭菌中利用不同强度启动子强化sr2384表达后菌株的生长均优于对照菌株，同时产溶剂时间明显提前。采用相对较弱的200-1启动子来强化sr2384的表达可以使菌株生长和产溶剂提前的表型进一步提升，这表明适量强化sr2384的表达可以提升菌株的发酵表型。

菌株生长和产溶剂的提前对于发酵而言是极为有利的，因为短时间的发酵就可以形成溶剂的有效积累，有助于实现工业化生产。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用

<130> SHPI1810880

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 94

<212> RNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 1

uaccuuucua gcauauauua caugcaaacc uuacccuccu uucuauccau aucuauacaa 60

auuuauuccu uaaaaaaaaa uauaugaaug aaua 94

<210> 2

<211> 94

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 2

tacctttcta gcatatatta catgcaaacc ttaccctcct ttctatccat atctatacaa 60

atttattcct taaaaaaaaa tatatgaatg aata 94

<210> 3

<211> 279

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 3

acacaaaaaa ttaaaagaaa aatgggaaaa aatagctttt tcacgcatac ctttctagca 60

tatattacat gcaaacctta ccctcctttc tatccatatc tatacaaatt tattccttaa 120

aaaaaaatat atgaatgaat ataaaaaaaa cacaaaaact atttatagaa tcatagataa 180

aacttaagtt atcgttgtta aaacctaaag tatctttaac agcataactt aataaacatc 240

tgattctcat atatcaaatt ttaaggaggt tacaaaatg 279

<210> 4

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tttttaacaa aatatattga taaaaataat aatagtgggt ataattaagt tgttagagaa 60

aacgtataaa ttagggataa actatggaac ttatgaaata gattgaaatg gtttatctgt 120

taccccgtat caaaatttag gaggttagtt agagtcgact ctagaggatc c 171

<210> 5

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tttttaacaa aatattttga gagacatgga tgccctatgc tataatgtag ttgttagaga 60

aaacgtataa attagggata aactatggaa cttatgaaat agattgaaat ggtttatctg 120

ttaccccgta tcaaaattta ggaggttagt tagagtcgac tctagaggat cc 172

<210> 6

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tttttaacaa aaagtattga aatttggtct acccaggtat tataatgtgg ttgttagaga 60

aaacgtataa attagggata aactatggaa cttatgaaat agattgaaat ggtttatctg 120

ttaccccgta tcaaaattta ggaggttagt tagaggatcc 160

Claims

1.一种RNA分子，其序列为SEQ ID NO:1。

2.一种RNA表达框，其包含如权利要求1所述RNA分子的模板DNA序列SEQ ID NO:2。

3.如权利要求2所述的RNA表达框，其特征在于，表达框的DNA序列为SEQ ID NO:3。

4.包含如权利要求2中所述模板DNA序列SEQ ID NO:2、或者如权利要求2或3所述RNA表达框的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的丙酮丁醇梭菌。

6.如权利要求1所述RNA分子、如权利要求4所述质粒或者如权利要求5所述丙酮丁醇梭菌在生产有机溶剂中的用途，所述有机溶剂选自丁醇、丙酮和乙醇。

7.一种提高丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂能力的方法，包括以下步骤：

A.构建用于表达如权利要求1所述RNA的质粒，所述质粒包含thl启动子SEQ ID NO:4、200-1启动子SEQ ID NO:5或者1200-9-15启动子SEQ ID NO:6；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌是Clostridiumacetobutylicum ATCC 824。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤A中的质粒骨架选自穿梭质粒pIMP1和pXY1。