CN113493758A - 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113493758A
CN113493758A CN202110598376.7A CN202110598376A CN113493758A CN 113493758 A CN113493758 A CN 113493758A CN 202110598376 A CN202110598376 A CN 202110598376A CN 113493758 A CN113493758 A CN 113493758A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tyrosol
sequence
escherichia coli
gene
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110598376.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113493758B (zh
Inventor
梁一晨
张锦雯
沈微
陈献忠
杨海泉
夏媛媛
陈磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202110598376.7A priority Critical patent/CN113493758B/zh
Publication of CN113493758A publication Critical patent/CN113493758A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113493758B publication Critical patent/CN113493758B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01043—Phenylpyruvate decarboxylase (4.1.1.43)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01051—Prephenate dehydratase (4.2.1.51)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99005—Chorismate mutase (5.4.99.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用，属于发酵工程技术领域。其公开了一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为大肠杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC NO：M2021358。将该菌株应用于酪醇的摇瓶发酵或发酵罐发酵获取。本发明提供的菌株发酵水平与现有技术公开的产酪醇菌株相当，但发酵速度显著高于现有技术的同类型菌株。

Description

一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用，属于发酵 工程技术领域。
背景技术
酪醇是一种具有特殊药理作用的酚类有机化合物。酪醇的生产有植物提取、 化学合成和微生物发酵等方法。由于化学合成法成本较低，因此其为目前酪醇 的主要生产方法。
采用微生物发酵法生产酪醇主要以葡萄糖为原料，原料成本低且可再生， 生产过程不易形成有毒物质，是一种有发展前景的酪醇制备方法。现有技术中， 酪醇微生物发酵法的主要缺点是酪醇产量较低和发酵周期较长，已报道的酪醇 发酵方法中产量最高为3.9g/L，发酵时间为48hr(Xu W,Yang C,Xia Y,et al. High-level production oftyrosol with noninduced recombinant Escherichia coli by metabolicengineering.Agricultural and Food Chemistry,2020,68:4616-4623)。
由于使用合适的宿主菌是提高发酵速度的有效方法，因此从自然界中筛选 大肠杆菌，进一步构建产酪醇重组大肠杆菌，最终获得发酵时间显著短于已见 报道的同类菌种的重组大肠杆菌是十分有效的手段。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株缩短发酵周期的产酪醇重组 大肠杆菌及其应用，所述菌株用于酪醇发酵，具有较短的发酵周期。
本发明的技术方案，一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，分类命名为大肠 杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号 CCTCC NO：M2021358。
所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的构建方法如下：
(1)自然界筛选：首先以大肠杆菌标准株K12为参照，选择菌落与K12 菌株相近的菌落，测序后与MG1655基因序列比较，得到同源性高的197株菌 株；
(2)高生物量宿主菌筛选：将步骤(1)所得197株大肠杆菌培养后制备 为电转化感受态细胞，将重组质粒pKK223-3-ARO10*转入上述大肠杆菌感受态 细胞中，筛选其中能够获得转化子并且转化子具有产酪醇和高菌体浓度特点的 宿主菌YEC039、YEC104和YEC166；
(3)宿主菌改造：对步骤(2)所得高菌体浓度宿主菌YEC039、YEC104 和YEC166进行产酪醇竞争途径基因feaB、pheA、tyrB和芳香族全局调控阻遏 蛋白基因tyrR的敲除，最终得到能够完成敲除工作的宿主菌YEC166，敲除基 因后得到的重组菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR；
(4)缩短发酵周期的产酪醇重组菌的获得：取步骤(3)获得的大肠杆菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR再进一步通过电转化转入控制酪醇合成的 关键酶基因ARO10*表达的重组质粒pKK223-3-ARO10*，即获得缩短发酵周期 的产酪醇重组大肠杆菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔ tyrR/pKK223-3-ARO10*，该菌株简称为YC166。
进一步地，步骤(1)中以大肠杆菌标准株K12为参照，选择菌落与K12 菌株相近的菌落，得到800株菌株，全部进行16s rDNA测序，将测序结果与 大肠杆菌MG1655的基因组序列中的16s rDNA基因序列(GeneID:944897)进行 比较，以序列同源性高于98.5％为标准用于下一步实验；最后获得197株菌株， 编号为YEC001-YEC197，上述大肠杆菌分别在江南大学中国高校工业微生物 资源信息平台(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)和无锡先秦生物科技有限公 司进行保藏后用于后续实验。
所述大肠杆菌MG1655的基因组序列公布于美国国家生物技术信息中心网 站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，登陆号:NC_000913。
其中16s rDNA基因序列分析的方法首先按文献[隋新华.原核生物进化与 系统分类学实验教程.北京:科学出版社,2011:62页-69页]获取菌株的16s rDNA基因的PCR产物，PCR产物送上海生工生物技术服务公司测序，获得序 列后再按上述文献的方法进行序列同源性分析。
进一步地，步骤(2)中将在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯丙酮酸脱羧 酶基因表达的重组质粒pKK223-3-ARO10*转入YEC001-YEC197菌株培养后制 备所得电转化感受态细胞中，用质粒pKK223-3-ARO10*电转化上述筛选获得的 大肠杆菌的感受态细胞，获得转化子的是其中81株菌株；将上述81株转化子 分别接种M9Y培养基，摇瓶发酵并间隔12小时检测菌体浓度，发酵至48小 时检测酪醇产量，筛选出宿主菌编号为YEC039、YEC104和YEC166的三株宿 主菌。
所述重组质粒pKK223-3-ARO10*为在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯 丙酮酸脱羧酶基因表达的重组质粒，公开于CuiYang,Xianzhong Chen, Junzhuang Chang,LihuaZhang,Wei Xu,Wei Shen,You Fan.Reconstruction of tyrosolsynthetic pathways inEscherichia coli.中国化学工程学报:英文版.2018, 26(12):2615-2621。该质粒转入大肠杆菌后可以控制大肠杆菌合成酪醇，可能由 于ARO10*基因的高表达影响了菌株氨基酸代谢的正常进行，转入上述质粒的 大肠杆菌转化子的生长一般比较慢，明显慢于转入了空质粒的对照菌株。
进一步地，步骤(3)中feaB基因的敲除中，参考美国国家生物技术信息 中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录号: NC_000913)中的feaB基因序列(GeneID:8115427)以及该基因上下游约各500 碱基的序列，设计feaB基因敲除的引物PfeaB01、PfeaB02。引物序列如下：
引物PfeaB01序列(SEQ ID NO:1)：5’-CAGCGAAAAA AGTGACTTTT CTTGTCGCTGCGTACACTGA AATCACACTG GGGGCTGGAG CTGCTTC-3’；
引物PfeaB02序列(SEQ ID NO:2)：5’-TTAATACCGT ACACACACCG ACTTAGTTTCACACCAACCG TCCAGCCAGT ATTCCGGGGA TCCGTCGACC-3’；
同时设计用于基因敲除重组菌鉴定的引物PfeaBU(SEQ ID NO:3)、PfeaBD (SEQID NO:4)和Pkan02(SEQ ID NO:5)，其序列如下：
PfeaBU序列：5’-GACTATAGGA AATAAGTC-3’；
PfeaBD序列：5’-CTCTGCTGAA ACCATGG-3’；
Pkan02序列：5’-TGAACAAGAT GGATTGCACG-3’。
进一步地，步骤(3)中pheA基因敲除中，参考大肠杆菌MG1655的基因 组序列(登录号:NC_000913)中的pheA基因序列(GeneID:8114416)以及该基因 上下游约各500碱基的序列，设计pheA基因敲除的引物PpheA01(SEQ ID NO: 6)、PpheA02(SEQ ID NO:7)。引物序列如下：
引物PpheA01序列：5’-AGGCAACACT ATGACATCGG AAAACCCGTT ACTGGCGCTGCGAGAGAAAA GGCTGGAGCT GCTTC-3’；
引物PpheA02序列：5’-CAGACGGGTC ATAATCAGAT TGTGGTTGCG CAGTACCAGCAACGCTTCAA CCAATTCCGG GGATCCGTCG ACC-3’；
同时设计用于pheA基因敲除重组菌鉴定的引物PpheAU(SEQ ID NO:8)、 PpheAD(SEQ ID NO:9)，其序列如下：
引物PpheAU序列：5’-TCCTTTATAT TGAGTGTATC G-3’；
引物PpheAD序列：5’-TGGCCTGAAT ATCCAGATAG-3’。
进一步地，步骤(3)中tyrB基因的敲除中，参考大肠杆菌MG1655的基 因组序列(登录号:NC_000913)中的tyrB基因序列(GeneID:8115375)以及该基 因上下游约各500碱基的序列，设计tyrB基因敲除的引物PtyrB01(SEQ ID NO: 10)、PtyrB02(SEQ ID NO:11)。引物序列如下：
PtyrB01引物序列：5’-GCTTATGGAG CGTTTTAAAG AAGACCCTCG CAGCGACAAAGTGAATTTAA GTATGGCTGG AGCTGCTTC-3’；
PtyrB02引物序列：5’-TTACATCACC GCAGCAAACG CCTTTGCCAC ACGTTGTACATTTGCCGATT CCGGGGATCC GTCGACC-3’；
同时设计用于tyrB基因敲除重组菌鉴定的引物PtyrBU(SEQ ID NO:12)、 PtyrBD(SEQ ID NO:13)，其序列如下：
引物PtyrBU序列：5’-TGACGCCTAC GCTGG-3’
引物PtyrBD序列：5’-TTTCACTGCA GGCTGGGTAG-3’
进一步地，步骤(3)中tyrR基因的敲除中，参考大肠杆菌MG1655的基 因组序列(登录号:NC_000913)中的tyrR基因序列(GeneID:945879)以及该基因 上下游约各500碱基的序列，设计tyrR基因敲除的引物PtyrR01(SEQ ID NO: 14)、PtyrR02(SEQ ID NO:15)。引物序列如下：
PtyrR01引物序列：5’-TTTTCAGGTG AAGGTTCCCA TGCGTCTGGA AGTCTTTTGTGAAGAGGCTG GAGCTGCTTC-3’；
PtyrR02引物序列：5’-TTACTCTTCG TTCTTCTTCT GACTCAGACC ATATTCCCGCAACTTATTGG CATTCCGGGG ATCCGTCGAC C-3’；
同时设计用于tyrR基因敲除重组菌鉴定的引物PtyrRU(SEQ ID NO:16)、 PtyrRD(SEQ ID NO:17)，其序列如下：
引物PtyrRU序列：5’-GTGCCCGTTT TTCCGTC-3’；
引物PtyrRD序列：5’-GATTACGAAG CAGCTCTGGC-3’。
所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的应用，将其应用于酪醇的摇瓶发酵或发 酵罐发酵获取。
进一步地，采用产酪醇重组大肠杆菌YC166进行发酵，接种量为1％，培 养基为M9Yb发酵培养基；30℃、200r/min发酵，发酵时间为24h。
本发明的有益效果：本发明提供的产酪醇重组大肠杆菌YC166相对于现有 微生物发酵法制备酪醇的过程发酵水平相当，但发酵时间显著缩短，具有良好 的工业化应用前景，具备产业化价值。
生物材料样品保藏：一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，分类命名为大肠 杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号 CCTCC NO：M2021358。
附图说明
图1是feaB基因删除的PCR验证电泳图；
M:分子量标准DL2000；1:出发菌YEC166的PCR鉴定；2:YEC166 ΔfeaB 的PCR鉴定。
图2是pheA，tyrB，tyrR基因删除的PCR验证；
M:分子量标准DL2000；3:YEC166 ΔfeaB；4:YEC166 ΔfeaB ΔpheA； 5:YEC166ΔfeaB ΔpheA；6:YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB；7:YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB；8:YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB ΔtyrR
图3是重组大肠杆菌YC166的发酵罐发酵酪醇时间-细胞密度/酪醇产量示 意图。
具体实施方式
以下实施例中用于液相检测的酪醇标样为Sigma公司产品。其他试剂均购 自国药集团化学试剂公司。分子生物学操作试剂均为大连宝生物工程有限公司 产品。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化及胶回收试剂盒等均为爱思进生物技术 (杭州)有限公司产品。
实施例1产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备
(1)从自然界中筛选大肠杆菌：在自然界中收集各种野生动物的粪便。适 当稀释后在LB固体培养基上划线分离，以大肠杆菌标准株K12为参照，选择 菌落与K12菌株相近的菌落，进一步镜检，保藏镜检结果为杆菌的菌落共计约 800株。全部进行16s rDNA基因序列分析，将测序结果与美国国家生物技术信 息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录 号:NC_000913)中的16s rDNA基因序列(GeneID:944897)进行比较，以序列同源 性为高于98.5％为标准用于下一步实验。其中16s rDNA基因序列分析的方法首 先按文献[隋新华.原核生物进化与系统分类学实验教程.北京:科学出版社, 2011:62页-69页]获取菌株的16s rDNA基因的PCR产物，PCR产物送上海生 工生物技术服务公司测序，获得序列后再按上述文献的方法进行序列同源性分 析。根据上述标准，共计鉴定获得大肠杆菌197株，编号为YEC001～YEC197。
上述大肠杆菌分别在江南大学中国高校工业微生物资源信息平台 (http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)和无锡先秦生物科技有限公司进行保藏后 用于后续实验。
(2)高生物量宿主菌的筛选：按照文献(周海岩.L-苯丙氨酸生产菌株的 构建、代谢调控和发酵条件优化[D].博士学位论文,无锡,江南大学,2011)中 的电转化感受态细胞制备及转化方法所述，将上述197株大肠杆菌分别培养后 制备为电转化感受态细胞。
培养大肠杆菌JM109/pKK223-3-ARO10*大量提取质粒 pKK223-3-ARO10*。大肠杆菌JM109/pKK223-ARO10*公开于[Yang C,Chen X Z, Chang J Z,et al.Reconstructionof tyrosol synthetic pathways in Escherichia coli[J]. 中国化学工程学报:英文版,2018(7):23-27.]。
用质粒pKK223-3-ARO10*电转化上述筛选获得的197株大肠杆菌的感受 态细胞。经多次转化，其中81株菌获得了转化子。其余菌株有部分菌株自身具 有氨苄青霉素抗性，其余菌株经过多次转化始终未能得到转化子，这些菌株做 放弃处理。将上述81株转化子分别接种M9Y培养基，摇瓶发酵并间隔12小 时检测菌体浓度，发酵至48小时检测酪醇产量。剔除完全不产酪醇的菌株后， 筛选最终菌体浓度最高菌株作为后续研究的材料。
所述M9Y培养基具体组成如下：磷酸二氢钾3g/L、十二水磷酸氢二钠17.1 g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉0.25g/L，115℃灭 菌15min。单独配置1.25mol/L的硫酸镁溶液母液，单独灭菌，使用时在每L 上述培养基中加入硫酸镁母液4mL。
经筛选，81株转化子中有14株菌的发酵液未检测到酪醇，其余67株菌的 发酵液中均能检测到酪醇，浓度在0.1～0.5之间。所有菌株均在培养至24hr时 达到最高菌浓，其中宿主菌编号为YEC039、YEC104和YEC166的三株宿主菌 的转化子的菌浓明显高于其它菌株，以OD600计算分别达到12.9，11.2和11.6。
其中，YEC039菌株在后续工作中始终未能实现基因敲除，最终被放弃。 YEC166及其转化子被用于后续实验。大肠杆菌YEC166已分别保藏在江南大 学中国高校工业微生物资源信息平台(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)和本 项目合作企业无锡先秦生物科技有限公司，该菌株在两家单位的保藏编号为 CICIM B6943和XQ05159B。
(3)宿主菌的改造：根据前述研究，产酪醇竞争途径基因feaB、pheA、tyrB 和芳香族全局调控阻遏蛋白基因tyrR的敲除可以大幅度提高酪醇的产量。按照 文献报导的方法(CuiYang,Xianzhong Chen,Junzhuang Chang,Lihua Zhang,Wei Xu,Wei Shen,YouFan.Reconstruction of tyrosolsynthetic pathways in Escherichia coli.中国化学工程学报:英文版.2018,26(12):2615-2621)将宿主菌YEC166的 上述4个基因敲除。具体操作方法如下：
a、feaB基因的敲除：参考美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录号: NC_000913)中的feaB基因序列(GeneID:8115427)以及该基因上下游约各500碱 基的序列，设计feaB基因敲除的引物PfeaB01、PfeaB02。引物序列如下：
引物PfeaB01序列：
5’-CAGCGAAAAA AGTGACTTTT CTTGTCGCTG CGTACACTGA AATCACACTG GGGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:1)；
引物PfeaB02序列:
5’-TTAATACCGT ACACACACCG ACTTAGTTTC ACACCAACCG TCCAGCCAGT ATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQ ID NO:2)；
同时设计用于基因敲除重组菌鉴定的引物PfeaBU、PfeaBD和Pkan02，其 序列如下：
PfeaBU序列：5’-GACTATAGGA AATAAGTC-3’(SEQ ID NO:3)；
PfeaBD序列：5’-CTCTGCTGAAACCATGG-3’(SEQ ID NO:4)；
Pkan02序列：5’-TGAACAAGAT GGATTGCACG-3’(SEQ ID NO:5)。
以pKD13为模板，以PfeaB01、PfeaB02为引物进行PCR扩增获得feaB 基因敲除盒。取大肠杆菌YEC166菌株，制备电转化感受态细胞。取质粒pKD46 电转化上述YEC166感受态细胞。进一步按照[Yang C,Chen X Z,Chang J Z,et al.Reconstruction of tyrosolsynthetic pathways in Escherichia coli[J].中国化学工 程学报:英文版,2018(7):23-27.]所述的方法进行feaB基因敲除、标记基因弹出 和辅助质粒消除。最终获得已经删除了feaB基因并且不含任何标记基因和重组 质粒的大肠杆菌YEC166ΔfeaB。
图1是重组菌的电泳鉴定图。鉴定引物PfeaBU和PfeaBD分别与feaB基 因被敲除部分的上游和下游序列对应，基因删除前引物间基因片段长度约为 1789bp，删除基因并弹出标记基因后引物PfeaBU和PfeaBD引物间长度大约 为407bp。由图1可见，PCR产物大小与预计的一致，可见重组菌YEC166 Δ feaB构建成功。
b、pheA基因的删除：参考大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录号: NC_000913)中的pheA基因序列(GeneID:8114416)以及该基因上下游约各500碱 基的序列，，设计pheA基因敲除的引物PpheA01、PpheA02。引物序列如下：
引物PpheA01序列：
5’-AGGCAACACT ATGACATCGG AAAACCCGTT ACTGGCGCTG CGAGAGAAAAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:6)；
引物PpheA02序列：
5’-CAGACGGGTC ATAATCAGAT TGTGGTTGCG CAGTACCAGC AACGCTTCAA CCAATTCCGGGGATCCGTCG ACC-3’(SEQ ID NO:7)；
同时设计用于pheA基因敲除重组菌鉴定的引物PpheAU、PpheAD，其序 列如下：
引物PpheAU序列：5’-TCCTTTATAT TGAGTGTATC G-3’(SEQ ID NO:8)；
引物PpheD序列：5’-TGGCCTGAAT ATCCAGATAG-3’(SEQ ID NO:9)；
以pKD13为模板，以PpheA01、PpheA02为引物进行PCR获得pheA基因 敲除盒。取上一步骤获得的重组大肠杆菌YEC166 ΔfeaB菌株，制备电转化感 受态细胞。取质粒pKD46电转化上述YEC166 ΔfeaB感受态细胞。进一步按照 材料方法中方法6的方法用上述pheA基因敲除盒进行pheA基因敲除、标记基 因弹出和辅助质粒消除。最终获得不含任何标记基因和重组质粒的大肠杆菌 YEC166 ΔfeaB ΔpheA。图2a是重组菌的电泳鉴定图。鉴定引物PpheAU和 PpheAD分别与pheA基因被敲除部分的上游和下游序列对应，基因删除前 PpheAU和PpheAD引物间基因片段长度约为1294bp，删除基因并弹出标记基 因后大约为493bp。由图2a可见，PCR产物大小与预计的一致，可见重组菌 YEC166 ΔfeaB ΔpheA构建成功。
c、tyrB基因的敲除
参考大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录号:NC_000913)中的tyrB基因序 列(GeneID:8115375)以及该基因上下游约各500碱基的序列，，设计tyrB基因敲 除的引物PtyrB01、PtyrB02。引物序列如下：
PtyrB01引物序列：
5’-GCTTATGGAG CGTTTTAAAG AAGACCCTCG CAGCGACAAA GTGAATTTAA GTATGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:10)；
PtyrB02引物序列：
5’-TTACATCACC GCAGCAAACG CCTTTGCCAC ACGTTGTACA TTTGCCGATT CCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQ ID NO:11)；
同时设计用于tyrB基因敲除重组菌鉴定的引物PtyrBU、PtyrBD，其序列 如下：
引物PtyrBU序列：5’-TGACGCCTAC GCTGG-3’(SEQ ID NO:12)；
引物PtyrBD序列：5’-TTTCACTGCA GGCTGGGTAG-3’(SEQ ID NO:13)；
以PtyrB01和PtyrB02为引物，以pKD13为模板进行PCR扩增，获得tyrB 基因敲除盒。按照上述敲除feaB基因的方法敲除上一步骤获得的重组菌大肠杆 菌YEC166 ΔfeaBΔpheA的tyrB基因，并消除辅助质粒同时弹出基因敲除标 记基因，获得重组菌大肠杆菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB。鉴定引物PtyrBU 和PtyrBD分别与tyrB基因被敲除部分的上游和下游序列对应，基因删除前引 物间基因片段长度约为1220bp，删除基因并弹出标记基因后大约为261bp。由 图2b可见，PCR产物大小与预计的一致，可见重组菌YEC166 ΔfeaBΔpheA ΔtyrB构建成功。
d、tyrR基因的敲除：参考大肠杆菌MG1655的基因组序列(登录号: NC_000913)中的tyrR基因序列(GeneID:945879)以及该基因上下游约各500碱基 的序列，，设计tyrR基因敲除的引物PtyrR01、PtyrR02。引物序列如下：
PtyrR01引物序列：5’-TTTTCAGGTG AAGGTTCCCA TGCGTCTGGA AGTCTTTTGTGAAGAGGCTG GAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:14)；
PtyrR02引物序列：5’-TTACTCTTCG TTCTTCTTCT GACTCAGACC ATATTCCCGCAACTTATTGG CATTCCGGGG ATCCGTCGAC C-3’(SEQ ID NO:15)；
同时设计用于tyrR基因敲除重组菌鉴定的引物PtyrRU、PtyrRD，其序列 如下：
引物PtyrRU序列：5’-GTGCCCGTTT TTCCGTC-3’(SEQ ID NO:16)；
引物PtyrRD序列：5’-GATTACGAAG CAGCTCTGGC-3’(SEQ ID NO: 17)；
以pKD13为模板，以PtyrR01和PtyrR02为引物，PCR获得tyrR基因敲除 盒。按照上述敲除feaB基因的方法敲除上一步骤获得的重组大肠杆菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB的tyrR基因，并消除辅助质粒同时弹出基因敲除标记基因， 获得重组菌大肠杆菌YEC166ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB ΔtyrR。鉴定引物PtyrRU和 PtyrRD分别与tyrR基因被敲除部分的上游和下游序列对应，基因删除前引物 PtyrRU和PtyrRD间基因片段长度约为1730bp，删除基因并弹出标记基因后大 约为355bp。由图2c可见，PCR产物大小与预计的一致，可见重组菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB ΔtyrR构建成功。
最后将重组质粒pKK223-ARO10*转化上述重组菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrBΔtyrR的感受态细胞，获得重组菌YEC166 ΔfeaB Δphe ΔtyrB Δ tyrR/pKK223-3-ARO10*，为便于叙述，该重组菌命名为大肠杆菌YC166，用于 后续产酪醇发酵的研究。
上述基因敲除PCR模板质粒pKD13(含基因其敲除专用的卡那霉素抗性基 因)，Red重组辅助质粒pKD46、pCP20为前述文献公开后保藏。
上述菌株命名为缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已保藏于中 国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，分类命名为大肠杆菌YC166 (Escherichiacoli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC NO： M2021358。
以下实施例中细胞浓度的检测过程如下：
紫外分光光度计在600nm处检测细胞密度OD600；需要检测细胞干重是 按以下方法进行：取1mL待测菌液，12000r/min离心10min，弃上清，去离 子水重复洗涤3次后烘箱烘干至恒重；称重，根据前期研究结果YC166细胞 干重DCW(y)与OD600(x)的比值为：0.382:1。
HPLC法检测发酵液中酪醇含量
样品处理：将发酵液在100℃中加热10min，去除蛋白，离心收集上清， 水系微孔滤膜过滤。
液相条件：以1mL/min的80％的0.1％甲酸和20％纯甲醇作为流动相；色 谱柱为博纳艾杰尔C18色谱柱(4.6×250mm，孔径为5μm)；柱温30℃；检 测波长为276nm紫外检测器，进样量为10μL。
标曲测定：通过标样倍比稀释，通过上述条件进行检测，以酪醇浓度为横 坐标，酪醇标品的HPLC峰面积为纵坐标，测定得到酪醇浓量(g·L-1)标准 曲线为：y＝7054x-564.5(R2＝0.9998)。
HPLC的检测仪器为：高效液相色谱安捷伦，型号为1260HPLC。
实施例2产酪醇重组大肠杆菌YC166的摇瓶发酵
将重组菌YEC166/pKK-223-3-ARO10*、YC166按如下步骤进行摇瓶发酵：
(1)在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板划线分离培养获得单菌落；
(2)选取单菌落，接种20mL LB液体培养基，37℃过夜培养；
(3)上述菌液，接种(1％接种量接种)50mL M9Yb发酵培养基，30℃、 200r/min发酵48h。每隔24h取样一次，用于检测酪醇产量和细胞浓度。
M9Yb培养基(一种改良的M9Y培养基用于产酪醇重组菌的初筛)：磷酸 二氢钾3g/L、十二水磷酸氢二钠17.1g/L、氯化铵1.3g/L、氯化钠0.5g/L、葡 萄糖2.5g/L、酵母粉0.25g/L，115℃灭菌15min。单独配置1.25mol/L的硫酸 镁溶液母液，单独灭菌，使用时在每L上述培养基中加入硫酸镁母液5mL。
结果显示两株菌均在发酵至24h时达到最高菌体浓度和酪醇产量。其中以 OD600计算的菌体浓度分别为12.3和11.3，酪醇产量分别为0.16g/L和1.9g/L。 这个实验可见，宿主菌YC166中feaB等四个基因的敲除可以大幅度提高酪醇 的产量。
Xu等报道的YMG5A*在摇瓶发酵条件下酪醇的最高发酵水平为10.92mM (大约为1.84g/L)(Xu W,Yang C,Xia Y,et al.High-level production of tyrosol withnoninduced recombinant Escherichia coli by metabolic engineering.Agricultural and Food Chemistry,2020,68:4616-4623)，YC166摇瓶发酵最终水平 比YMG5A*提高不明显，但YC166的发酵时间只有24h而YMG5A*需要48h。 YMG5A*在进行摇瓶发酵时必须添加碳酸钙以中和菌株产生的副产物有机酸， 其中醋酸是主要副产物，估计可以达到0.5mM，而YC166在摇瓶发酵时产酸 很少，其副产物主要也是醋酸，总量在0.1mM以下。摇瓶发酵时在YC166的 发酵液中添加碳酸钙对发酵影响不明显，我们采用Xu等报道的添加碳酸钙的 摇瓶发酵方法同样进行YC166的发酵，结果酪醇产量依然在1.9g/L左右，发 酵时间为24h，这可能是由于YC166很少产生，碳酸钙作为一种中和剂在发酵 过程中作用不明显。
本实施例中YC166的发酵培养基是M9Yb，其成分中葡萄糖和氯化铵的量 相比Xu等采用的M9Y要略高一点，这个差异对酪醇的最终产量可能会有影响， 对缩短发酵周期一般不可能有明显的作用。为谨慎起间我们YMG5A*也进行了 同样的实验，结果显示YMG5A*在M9Yb培养基中的最终发酵水平依然在1.8 g/L左右而发酵周期反而有所延长，超过了48h。
实施例3重组大肠杆菌YC166的发酵罐发酵
将重组大肠杆菌YC166按如下步骤进行发酵罐发酵：
(1)将所需发酵的菌株在固体LB培养基上培养获得单菌落；
(2)选取单菌落，接种20mL LB培养基，37℃过夜培养；
(3)上述菌液，接种(一般按1％接种量接种)装有50mL LB培养基的 500mL三角瓶(一般需要同时接种6瓶)，控制初始菌浓在OD600＝0.05，在37℃ 按200r/min进行摇瓶培养，一般是2-3h左右可以达到OD600＝0.25左右，进行 菌体扩大培养；
(4)将上述培养的菌液以10％的接种量，接种至装有2L M9Y培养基的5 L发酵罐中。发酵过程以氨水作为中和剂，恒定pH＝7±0.5；
(5)发酵过程中每4h取样，取样时测定葡萄糖浓度。根据葡萄糖检测结 果，如果糖含量低于5g/L则加入补料培养基至葡萄糖浓度为5g/L。取出的样品 同时用于检测酪醇产量和细胞浓度。
结果如图3所示。采用Xu等报道的酪醇发酵罐发酵方法(同本发明处理 方法中的方法2)进行发酵罐发酵，结果如图3所示。由图3可见，YC166在 发酵至24h的时候达到酪醇最高水平，为3.3g/L。本课题组前期获得的产酪醇 重组菌YMG5A*在同样条件下发酵获得的酪醇最高水平为3.9g/L，但发酵时间 为48h。从Xu等的报道看，YMG5A*在发酵至24h的时候，其发酵液中酪醇 的含量大概在1.9g/L左右，显然YC166的发酵速度显著高于YMG5A*。
本实施例采用的发酵方法与Xu等报道的完全一致，从发酵结果看，YC166 的发酵水平与YMG5A*接近而发酵周期则大幅度缩短。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> PfeaB01(PfeaB01)
<400> 1
cagcgaaaaa agtgactttt cttgtcgctg cgtacactga aatcacactg ggggctggag 60
ctgcttc 67
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> PfeaB02(PfeaB02)
<400> 2
ttaataccgt acacacaccg acttagtttc acaccaaccg tccagccagt attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> PfeaBU(PfeaBU)
<400> 3
gactatagga aataagtc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> PfeaBD(PfeaBD)
<400> 4
ctctgctgaa accatgg 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Pkan02(Pkan02)
<400> 5
tgaacaagat ggattgcacg 20
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> PpheA01(PpheA01)
<400> 6
aggcaacact atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 7
<211> 73
<212> DNA
<213> PpheA02(PpheA02)
<400> 7
cagacgggtc ataatcagat tgtggttgcg cagtaccagc aacgcttcaa ccaattccgg 60
ggatccgtcg acc 73
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> PpheAU(PpheAU)
<400> 8
tcctttatat tgagtgtatc g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> PpheD(PpheD)
<400> 9
tggcctgaat atccagatag 20
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> PtyrB01(PtyrB01)
<400> 10
gcttatggag cgttttaaag aagaccctcg cagcgacaaa gtgaatttaa gtatggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> PtyrB02(PtyrB02)
<400> 11
ttacatcacc gcagcaaacg cctttgccac acgttgtaca tttgccgatt ccggggatcc 60
gtcgacc 67
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> PtyrBU(PtyrBU)
<400> 12
tgacgcctac gctgg 15
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> PtyrBD(PtyrBD)
<400> 13
tttcactgca ggctgggtag 20
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> PtyrR01(PtyrR01)
<400> 14
ttttcaggtg aaggttccca tgcgtctgga agtcttttgt gaagaggctg gagctgcttc 60
<210> 15
<211> 71
<212> DNA
<213> PtyrR02(PtyrR02)
<400> 15
ttactcttcg ttcttcttct gactcagacc atattcccgc aacttattgg cattccgggg 60
atccgtcgac c 71
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> PtyrRU(PtyrRU)
<400> 16
gtgcccgttt ttccgtc 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> PtyrRD(PtyrRD)
<400> 17
gattacgaag cagctctggc 20

Claims (10)

1.一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，分类命名为大肠杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC NO：M2021358。
2.权利要求1所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于步骤如下：
(1)自然界筛选：首先以大肠杆菌标准株K12为参照，选择菌落与K12菌株相近的菌落，测序后与MG1655基因序列比较，得到同源性高的197株菌株；
(2)高生物量宿主菌筛选：将步骤(1)所得197株大肠杆菌培养后制备为电转化感受态细胞，将重组质粒pKK223-3-ARO10*转入上述大肠杆菌感受态细胞中，筛选其中能够获得转化子的菌株，最终得到转入质粒pKK223-3-ARO10*后转化子具有产酪醇和高菌体浓度特点的宿主菌YEC039、YEC104和YEC166；
(3)宿主菌改造：对步骤(2)所得高浓度宿主菌YEC039、YEC104和YEC166进行产酪醇竞争途径基因feaB、pheA、tyrB和芳香族全局调控阻遏蛋白基因tyrR的敲除，最终得到能够完成敲除工作的宿主菌YEC166，完成上述基因敲除后得到的菌株为大肠杆菌YEC166 ΔfeaBΔpheA ΔtyrB ΔtyrR；
(4)缩短发酵周期的产酪醇重组菌的获得：对步骤(3)获得的大肠杆菌YEC166 ΔfeaBΔpheA ΔtyrB ΔtyrR再进一步转入控制酪醇合成的关键酶基因ARO10*表达的重组质粒pKK223-3-ARO10*，即获得缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166。
3.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(1)中以大肠杆菌标准株K12为参照，选择菌落与K12菌株相近的菌落，得到800株菌株，全部进行16s rDNA基因测序，将测序结果与大肠杆菌MG1655的基因组序列中的16s rDNA基因序列进行比较，以序列同源性为98.5％为标准用于下一步实验；最后获得197株菌株，编号为YEC001-YEC197，全部保藏于江南大学中国高校工业微生物资源信息平台。
4.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(2)中将在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯丙酮酸脱羧酶基因表达的重组质粒pKK223-3-ARO10*转入YEC001-YEC197菌株培养后制备所得电转化感受态细胞中，用质粒pKK223-3-ARO10*电转化上述筛选获得的大肠杆菌的感受态细胞，获得转化子的是其中81株菌株；将上述81株转化子分别接种M9Y培养基，摇瓶发酵并间隔12小时检测菌体浓度，发酵至48小时检测酪醇产量，筛选出宿主菌编号为YEC039、YEC104和YEC166的三株宿主菌。
5.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(3)中feaB基因的敲除中，采用的引物为PfeaB01、PfeaB02；PfeaB01序列如SEQ ID NO:1所示，PfeaB02序列如SEQ ID NO:2所示；
用于基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PfeaBU、PfeaBD和Pkan02；PfeaBU序列如SEQID NO:3所示，PfeaBD序列如SEQ ID NO:4所示，Pkan02序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(3)中pheA基因敲除中，采用的引物为PpheA01、PpheA02；PpheA01序列如SEQ ID NO:6；PpheA02序列如SEQ ID NO:7所示；
用于pheA基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PpheAU、PpheAD；PpheAU序列如SEQ IDNO:8所示，PpheD序列如SEQ ID NO:9所示。
7.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(3)中tyrB基因的敲除中，采用的引物为PtyrB01、PtyrB02；PtyrB01序列如SEQ ID NO:10所示，PtyrB02序列如SEQ ID NO:11所示；
用于tyrB基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PtyrBU、PtyrBD；PtyrBU序列如SEQ IDNO:12所示，PtyrBD序列如SEQ ID NO:13所示。
8.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程，其特征在于：步骤(3)中tyrR基因的敲除中，采用的引物为PtyrR01、PtyrR02；PtyrR01引物序列如SEQ ID NO:14；PtyrR02引物序列如SEQ ID NO:15所示；
用于tyrR基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PtyrRU、PtyrRD；PtyrRU序列如SEQ IDNO:16所示，PtyrRD序列如SEQ ID NO:17所示。
9.权利要求1所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的应用，其特征在于：将其应用于酪醇的摇瓶发酵或发酵罐发酵获取。
10.根据权利要求9所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的应用，其特征在于：采用产酪醇重组大肠杆菌YC166进行发酵，接种量为1％，培养基为M9Yb发酵培养基；30℃、200r/min发酵，发酵时间为24h。
CN202110598376.7A 2021-05-31 2021-05-31 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 Active CN113493758B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110598376.7A CN113493758B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110598376.7A CN113493758B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113493758A true CN113493758A (zh) 2021-10-12
CN113493758B CN113493758B (zh) 2022-08-02

Family

ID=77997642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110598376.7A Active CN113493758B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113493758B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881735A (zh) * 2021-11-02 2022-01-04 江南大学 一种麦芽糖浆的制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN106754607A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 江南大学 一种产酪醇的重组菌株及其构建方法
CN110452865A (zh) * 2019-08-15 2019-11-15 江南大学 一种产酪醇的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN110499260A (zh) * 2018-09-25 2019-11-26 成都薇合生物科技有限公司 一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用
CN112126608A (zh) * 2019-06-25 2020-12-25 枫杨生物研发(南京)有限公司 一种生产羟基酪醇的工程菌

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN106754607A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 江南大学 一种产酪醇的重组菌株及其构建方法
CN110499260A (zh) * 2018-09-25 2019-11-26 成都薇合生物科技有限公司 一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用
CN112126608A (zh) * 2019-06-25 2020-12-25 枫杨生物研发(南京)有限公司 一种生产羟基酪醇的工程菌
CN110452865A (zh) * 2019-08-15 2019-11-15 江南大学 一种产酪醇的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUI YANG，等: "Reconstruction of tyrosol synthetic pathways in Escherichia coli", 《CHINESE JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEERING》 *
WEI XU,等: "High-Level Production of Tyrosol with Noninduced Recombinant", 《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881735A (zh) * 2021-11-02 2022-01-04 江南大学 一种麦芽糖浆的制备方法及其应用
CN113881735B (zh) * 2021-11-02 2023-08-15 江南大学 一种麦芽糖浆的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113493758B (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105647844B (zh) 一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用
CN101748069B (zh) 一种重组蓝藻
CN113980993B (zh) Mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用
CN113493758B (zh) 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用
CN104630100A (zh) 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产r-乙偶姻的应用
CN112080452B (zh) 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN114525215B (zh) 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用
CN109628476B (zh) 一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法
CN105647958B (zh) 一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用
CN107988092B (zh) 具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌
CN115960808A (zh) 一种敲除基因的重组大肠杆菌及其构建方法
CN113249240B (zh) 一种高产羟基酪醇的酿酒酵母及其构建方法
CN111826372B (zh) 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用
CN110499259B (zh) 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
CN106148432B (zh) 一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺
CN116083379B (zh) 一种转运蛋白变体及其在r-泛解酸制备中的应用
CN115851511B (zh) 一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用
CN114456964B (zh) 一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用
CN112538451B (zh) 过表达atf基因的生产乙酸丁酯的拜氏梭菌
CN108676080B (zh) 出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用
CN110734909B (zh) 丙酮丁醇梭菌中的一个非编码rna及其应用
CN104593405A (zh) 一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法
CN118389381A (zh) 一株缩短色氨酸发酵周期的抗噬菌体大肠杆菌及其应用
CN117511832A (zh) 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant