CN117511832A - 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511832A CN117511832A CN202311224640.6A CN202311224640A CN117511832A CN 117511832 A CN117511832 A CN 117511832A CN 202311224640 A CN202311224640 A CN 202311224640A CN 117511832 A CN117511832 A CN 117511832A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- positive clone
- promoter
- genetically engineered
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 105
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 7
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150090235 aroB gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 241001167018 Aroa Species 0.000 claims abstract description 19
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101100174653 Dictyostelium discoideum g6pd-2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150085516 ZWF1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150026856 zwf2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101100537319 Escherichia coli (strain K12) tktA gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101100170068 Mus musculus Ddr2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 92
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 8
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 2
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 7
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 description 19
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 102100033055 Transketolase Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000812677 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100039306 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- -1 phenolic aromatic compound Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC=C1O WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Natural products COC1=CC(O)=CC(C(O)=O)=C1 TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/10—Bacillus licheniformis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请涉及生物合成原儿茶酸的技术领域，具体涉及合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用。实施例公开的基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株。该基因工程菌株能够利用葡萄糖从头合成原儿茶酸，合成原料绿色环保，价格低廉，合成水平显著高于大肠杆菌。该基因工程菌株为提供了一种利用廉价的培养基来高水平生产PCA的绿色制造方法，适用于原儿茶酸大规模的工业化生产。
Description
技术领域
本申请涉及生物合成原儿茶酸的技术领域，具体涉及合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
长期以来，大多数芳香族化合物是使用传统的化石能源生产的。然而，化石能源的消耗是不可逆的，且污染环境，这促使研究人员找寻和开发新的技术，以可持续的绿色生产芳香族化合物，比如具有工艺环保、可持续发展等特点的生物精炼。原儿茶酸(PCA)是一种天然的酚酸类芳香族化合物。PCA可作为合成高性能聚合物和生物环保型塑料的构建块，PCA还具有多种药理活性，比如抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒等，从而可作为医药、功能性食品和化妆品的原料。
由于PCA具有广泛的应用价值，从而近些年其的有效生产受到越来越多的关注。虽然PCA可直接从洋葱等植物中提取获得，但其产量低，生产成本高，导致其不适合工业化生产模式。而通过香草酸的脱甲基化等化学合成法来生产PCA，存在环境污染，生产条件苛刻等缺点。因此，具有环境友好性，经济可行性和可持续的等特点的微生物发酵法是实现PCA工业化生产的必要选择之一。目前，大肠杆菌重组菌株的PCA产量仍保持在较低水平，且PCA的微生物从头合成水平有限，从而需要进一步开发新的PCA生产菌株。
发明内容
本申请发明人创造性地利用地衣芽孢杆菌作为微生物底盘细胞，构建了一株能够从头合成原儿茶酸的基因工程菌株。该基因工程菌株能够利用葡萄糖从头合成原儿茶酸，合成原料绿色环保，价格低廉，合成水平显著高于大肠杆菌。该基因工程菌株为提供了一种利用廉价的培养基来高水平生产PCA的绿色制造方法，适用于原儿茶酸大规模的工业化生产。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种地衣芽孢杆菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株。
第二方面，实施例公开了一种地衣芽孢杆菌的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株，所述构建方法包括：
获得所述出发菌株DW2，构建用于表达qsuB的表达质粒，转入所述出发菌株DW2，筛选得到第一阳性克隆，所述出发菌株的保藏号为CCTCCM2011344；
构建用于敲除bsdBCD的第一敲除质粒，转入所述第一阳性克隆，筛选得到第二阳性克隆；
构建用于敲除pyk的第二敲除质粒，转入所述第二阳性克隆，筛选得到第三阳性克隆；
构建tkt启动子替换的第一置换质粒，转入所述第三阳性克隆，筛选得到第四阳性克隆；
构建eno启动子替换的第二置换质粒，转入所述第四阳性克隆，筛选得到第五阳性克隆；
构建zwf启动子替换的第三置换质粒，转入所述第五阳性克隆，筛选得到第六阳性克隆；
构建aroA启动子替换的第四置换质粒，转入所述第六阳性克隆，筛选得到第七阳性克隆；
构建aroB启动子替换的第五置换质粒，转入所述第七阳性克隆，筛选得到第八阳性克隆；
构建aroC启动子替换的第六置换质粒，转入所述第八阳性克隆，筛选得到第九阳性克隆；
构建aroD启动子替换的第七置换质粒，转入所述第九阳性克隆，筛选得到所述地衣芽孢杆菌的基因工程菌株。
第三方面，实施例公开了一种生物合成原儿茶酸的方法，其包括：
获得第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株；
将所述基因工程菌株接入含有葡萄糖的培养基中进行发酵；
从发酵液中回收所述原儿茶酸。
第四方面，实施例公开了第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株在合成原儿茶酸中的应用。
附图说明
图1为实施例提供的第一阳性克隆(A)、第二阳性克隆(B)、第三阳性克隆(C)、第四阳性克隆(D)、第五阳性克隆(E)和第六阳性克隆(F)的菌落PCR验证电泳结果图；M:DL5000Marker(5000,3000,2000,1500,1000,750,500,250,100bp)。
图2为实施例提供的第七阳性克隆(A)、第八阳性克隆(B)、第九阳性克隆(C)和第十阳性克隆(D)的菌落PCR验证电泳结果图；M:DL5000Marker(5000,3000,2000,1500,1000,750,500,250,100bp)。
图3为实施例提供的基因工程菌株(P-1和P-20)的发酵PCA结果。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
地衣芽孢杆菌具有生物安全性、快速生长、遗传操作简单和抗逆性强等特点，使其已成为一个优良的微生物底盘细胞工厂来生产多种重要的生化物质。本申请中，利用地衣芽孢杆菌作为微生物底盘细胞，构建了一株能够从头利用葡萄糖作为碳源合成原儿茶酸的基因工程菌株。该基因工程菌株能够利用葡萄糖从头合成原儿茶酸，合成原料绿色环保，价格低廉，合成水平显著高于大肠杆菌。该基因工程菌株为提供了一种利用廉价的培养基来高水平生产PCA的绿色制造方法，适用于原儿茶酸大规模的工业化生产。
术语“从头合成”，意为以微生物为合成催化剂进行生物合成，以葡萄糖作为主要碳源，通过葡萄糖的碳代谢导向目标产物的合成。例如，在以地衣芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的基因工程菌的生物代谢途径合成原儿茶酸；其中，地衣芽孢杆菌的基因工程菌为野生型地衣芽孢杆菌(例如DW2)为出发菌株进行基因工程改造得到的菌株，其中，基因工程改造包括对细胞核基因组或细胞核外基因进行改造。
为此，第一方面，实施例公开了一种地衣芽孢杆菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株。在一些实施例中，出发菌株为杆菌肽工业生产菌株地衣芽孢杆菌DW2，菌株保藏号为CCTCCM2011344。
在一些实施例中，所述qsuB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述bsdBCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述pyk的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述tkt的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述eno的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述aroA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述aroB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述aroC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述aroD的核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
第二方面，实施例公开了一种地衣芽孢杆菌的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株。
所述构建方法包括：获得所述出发菌株DW2，构建用于表达qsuB的表达质粒，转入所述出发菌株DW2，筛选得到第一阳性克隆，所述出发菌株的保藏号为CCTCCM2011344；构建用于敲除bsdBCD的第一敲除质粒，转入所述第一阳性克隆，筛选得到第二阳性克隆；构建用于敲除pyk的第二敲除质粒，转入所述第二阳性克隆，筛选得到第三阳性克隆；构建tkt启动子替换的第一置换质粒，转入所述第三阳性克隆，筛选得到第四阳性克隆；构建eno启动子替换的第二置换质粒，转入所述第四阳性克隆，筛选得到第五阳性克隆；构建zwf启动子替换的第三置换质粒，转入所述第五阳性克隆，筛选得到第六阳性克隆；构建aroA启动子替换的第四置换质粒，转入所述第六阳性克隆，筛选得到第七阳性克隆；构建aroB启动子替换的第五置换质粒，转入所述第七阳性克隆，筛选得到第八阳性克隆；构建aroC启动子替换的第六置换质粒，转入所述第八阳性克隆，筛选得到第九阳性克隆；构建aroD启动子替换的第七置换质粒，转入所述第九阳性克隆，筛选得到所述地衣芽孢杆菌的基因工程菌株。
在一些实施例中，所述用于表达qsuB的表达质粒携带如SEQ ID NO.1所示的qsuB基因。
在一些实施例中，所述第一敲除质粒为携带bsdBCD的基因敲除片段的基因编辑质粒。
在一些实施例中，所述第二敲除质粒为携带pyk的基因敲除片段的基因编辑质粒。
在一些实施例中，所述第一置换质粒为携带启动子置换为PbacA的tkt基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第二置换质粒为携带启动子置换为PUTR12的eno基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第三置换质粒为携带启动子置换为PbacA的zwf基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第四置换质粒为携带启动子置换为PbacA的aroA基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第五置换质粒为携带启动子置换为PbacA的aroB基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第六置换质粒为携带启动子置换为R55的aroC基因表达单元的表达质粒。
在一些实施例中，所述第七置换质粒为携带、aroD基因的上游同源臂、终止子TamyL、启动子R47和aroD基因的下游同源臂的aroD基因表达单元的表达质粒。
第三方面，实施例公开了一种生物合成原儿茶酸的方法，其包括：
获得第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株；
将所述基因工程菌株接入含有葡萄糖的培养基中进行发酵；
从发酵液中回收所述原儿茶酸。
第四方面，实施例公开了第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株在合成原儿茶酸中的应用。
下方将以更加具体的实施例阐述本申请，但不构成对本申请实施方式的限制。
实施例1第一阳性克隆的获得
在本步骤中，获得出发菌株DW2，构建用于表达qsuB的表达质粒，转入所述出发菌株DW2，筛选得到第一阳性克隆，所述出发菌株的保藏号为CCTCCM2011344。具体包括步骤：
(1)以质粒pHY-R27-GFP(DOI:10.1016/j.ymben.2023.06.004)和谷氨酸棒状杆菌的基因qsuB(SEQ ID NO.1所示)为模板，通过引物T5-F(tgatccttcctcctttagatctg)和T5-R(aagagcagagaggacggatttcc)PCR扩增载体架pHY-R27，通过引物qsuB-F(ctaaaggaggaaggatcaatgcgtacatccattgccactg)和qsuB-R(tccgtcctctctgctcttctagttggggattccccgctcgag)PCR扩增片段qsuB，并进行DNA回收。
(2)利用DpnI酶对载体骨架pHY-R27中残留的pHY-R27-GFP模板进行消化。
(3)采用Vazyme的同源重组酶(ExnaseII)对载体骨架pHY-R27和片段qsuB进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架pHY-R27和片段qsuB相连；得到重组质粒pHY-R27-qsuB。
(4)将得到的重组质粒pHY-R27-qsuB电转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环抗生素作为筛选标记。
(5)通过引物pHY-F(gtttattatccatacccttac)和pHY-R(cagatttcgtgatgcttgtc)菌落PCR筛选得到阳性转化子，即为第一阳性克隆，结果如图1(A)所示，命名为地衣芽孢杆菌R27-qsuB-TamyL(P-1)。
实施例2第二阳性克隆的获得
在本步骤中，构建用于敲除bsdBCD的第一敲除质粒，转入所述第一阳性克隆，筛选得到第二阳性克隆。具体包括步骤：
(1)根据地衣芽孢杆菌基因组DNA序列中基因bsdBCD的序列(SEQ ID NO.2所示)为模板，合成△bsdBCD-AF1(ctgcagcccgggggatcctggaaaggcgttgtcgtg)和△bsdBCD-AR1(cggatgcctccctttagattccctcttggtgcttcag)引物对进行PCR扩增bsdBCD的上游同源臂，合成△bsdBCD-BF2(ctgaagcaccaagagggaatctaaagggaggcatccg)和△bsdBCD-BR2(gatcttttctacgagctccaattggctgtaccttggc)引物对进行PCR扩增bsdBCD的下游同源臂，并通过SOE-PCR将bsdBCD的上游同源臂和bsdBCD的下游同源臂连接到一起，得到bsdBCD的基因敲除片段(如SEQ ID NO.11所示)。
(2)以本实验室保存的质粒T2(2)-ori(DOI:10.1007/s00253-019-10110-y)为模板，合成引物T2-T5-F(ggatcccccgggctgcaggaattc)和T2-T5-R(gagctcgtagaaaagatcaaagga)作为引物对，PCR扩增得到T2(2)-ori的线性骨架片段。
(3)使用南京诺唯赞一步克隆试剂盒将步骤(1)和(2)得到的基因敲除片段和T2(2)-ori的线性骨架片段进行连接，通过氯化钙转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α，在经含有kanr的培养基平板进行培养后，利用验证引物T2-F/T2-R对转化子进行菌落PCR验证，以获得第一敲除质粒(命名为T2△bsdBCD)，用于敲除bsdBCD。然后，将质粒T2△bsdBCD电转入地衣芽孢杆菌DW2中，在经含有kanr的培养基平板进行培养后，利用验证引物T2-F(,atgtgataactcggcgta)/T2-R(gcaagcagcagattacgc)对转化子进行菌落PCR验证。
(4)将步骤3得到的转换子在45℃条件下，含有kanr的液体培养基上，转接培养3次，每次培养10-12h。并以T2-F与△bsdBCD-YR为验证引物进行菌落PCR检测。接着，将其在37℃、不含有kanr的液体培养基中经过数次转接培养，用双交换验证引物△bsdBCD-YF(gagtgaaagtgatggacgacc)和△bsdBCD-YR(cgtgttttccgtctgcgctg)对挑选的转化子进行菌落PCR验证，以得到双交换成功的菌株，即为第二阳性克隆，如图1(B)所示，命名为地衣芽孢杆菌△bsdBCD。
实施例3第三阳性克隆的获得
在本步骤中，构建用于敲除pyk的第二敲除质粒，转入所述第二阳性克隆，筛选得到第三阳性克隆。具体步骤同实施例2。其中，第二敲除质粒为携带pyk的基因敲除片段的基因编辑质粒，pyk的基因敲除片段为pyk的上游同源臂和pyk的下游同源臂连接形成。
其中，基因pyk的序列如SEQ ID NO.3所示，合成pyk的上游同源臂引物(ctgcagcccgggggatccaccgttatcgatgccatcg)和9(gccggcccaattgtacaaatcctcctcgggttttacactag)所示，合成pyk的下游同源臂引物如(ctagtgtaaaacccgaggaggatttgtacaattgggccggc)和(gatcttttctacgagctccatccgacggacggcgcacaaaa)所示。pyk的基因敲除片段如SEQ IDNO.12所示。
采用相同T2(2)-ori作为基础质粒。对第三阳性克隆进行PCR验证的引物为△pyk-YF(aaagctgacagaacacgg)和△pyk-YR(tgtgctcttcaagaagttcgc)，验证结果如图1(C)所示，第三阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌△pyk。
第四阳性克隆的获得
在本步骤中，构建tkt启动子替换的第一置换质粒，转入所述第三阳性克隆，筛选得到第四阳性克隆。具体包括：
(1)以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计引物TKT-AF1(ctgcagcccgggggatccaacttgagctttccgaagcg)/AR1(ctgcagcccgggggatccaacttgagctttccgaagcg)、TKT-BF2(caaaaaggagaatttttatatgaaaacgattgaattaaaatctg)/BR2(gatcttttctacgagctcttcaaatgtcccgcaagcg)和AT-F(ccaggaatatcttcaaggcgtcctgcgatttcggcgagattca)/AT-R(cagattttaattcaatcgttttcatataaaaattctcctttttg)分别扩增tkt的上游同源臂、tkt的下游同源臂和强启动子PbacA(SEQ ID NO.13所示)，并通过SOE-PCR将tkt的上游同源臂、启动子PbacA和tkt的下游同源臂依次连接成一体，即为tkt基因表达单元(如SEQ ID NO.14所示)。
(2)设计引物T2-T5-F(ggatcccccgggctgcaggaattc)/T2-T5-R(gagctcgtagaaaagatcaaagga)，以质粒T2(2)-ori为模板，PCR扩增得到T2(2)-ori的线性骨架片段。
(3)使用南京诺唯赞一步克隆试剂盒将步骤(1)和(2)得到的基因敲除片段和T2(2)-ori的线性骨架片段进行连接，通过氯化钙转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α，在经含有kanr的培养基平板进行培养后，利用验证引物T2-F/T2-R对转化子进行菌落PCR验证，以获得tkt启动子置换质粒T2-PbacA-tkt。然后，将质粒T2-PbacA-tkt电转入地衣芽孢杆菌DW2△pyk△bsdBCD中，在经含有kanr的培养基平板进行培养后，利用验证引物T2-F/T2-R对转化子进行菌落PCR验证。
4.将步骤3得到的转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的液体培养基上，转接培养3次，每次培养10～12h。并以T2-F与TKT-YR为验证引物进行菌落PCR检测。接着，将其在37℃、不含有卡那青霉素的液体培养基中经过数次转接培养，用双交换验证引物TKT-YF(tgcgatttcggcgagattc)/TKT-YR(agcacttcccaattcatcg)对挑选的转化子进行菌落PCR验证，以得到双交换成功的菌株，即为第四阳性克隆，如图1(D)所示，命名为地衣芽孢杆菌PbacA-tkt(Down)。
第五阳性克隆的获得
在本步骤中，构建eno启动子替换的第二置换质粒，转入所述第四阳性克隆，筛选得到第五阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，eno如SEQ ID NO.5所示，扩增eno上游同源臂的引物ENO-F1(ctgcagcccgggggatcctgaagcagcttcgcatcg)和ENO-12R1(tatatattcctcctttctaatatacttatttttgaattaatgacg)，扩增eno下游同源臂的引物ENO-12F2(gtatattagaaaggaggaatatataatgccatacattgttgatg)和ENO-R2(gatcttttctacgagctcttgtgctcccatgcgaagtg)。其中，启动子PUTR12的核苷酸序列为5’-GTATATTAGAAAGGAGGAATATATA-3’如SEQ ID NO.23所示，通过SOE-PCR将启动子eno上游同源臂、启动子PUTR12和eno下游同源臂连接成一体，即为eno基因表达单元，序列如SEQ ID NO.16所示。
采用T2(2)-ori作为基础质粒，对第五阳性克隆进行PCR验证，验证引物序列Eno-12YF(gctttaaaggagagaaac)和Eno-YR(tgtttgaagcgcttcttcg)。验证结果如图1(E)所示，第五阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌eno(Up)-PUTR12-eno(Down)。
第六阳性克隆的获得
在本步骤中，构建zwf启动子替换的第三置换质粒，转入所述第五阳性克隆，筛选得到第六阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，zwf序列如SEQ ID NO.6所示，扩增zwf上游同源臂的引物ZWF-AF1(ctgcagcccgggggatcctcttcacattctcgcatgg)和ZWF-AR1(gaatctcgccgaaatcgcaggtttgactgcggggaggc)，扩增zwf下游同源臂的引物ZWF-BF2(caaaaaggagaatttttatttgaaaaaagatcaaatgg)和ZWF-BR2(gatcttttctacgagctctctgcaccatttgctttcc)，扩增启动子PbacA的引物AZ-F(gcctccccgcagtcaaacctgcgatttcggcgagattc)和AZ-R(ccatttgatcttttttcaaataaaaattctcctttttg)。通过SOE-PCR将zwf的上游同源臂、启动子PbacA和zwf的下游同源臂依次连接成一体，即为zwf基因表达单元(SEQ ID NO.17)。
采用T2(2)-ori作为基础质粒，对第六阳性克隆进行PCR验证，验证引物序列ZWF-YF(taatagtctccggcaagc)和ZWF-YR(tgtttgtccaaagcggctc)。验证结果如图1(F)所示，第六阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌zwf(Up)-PbacA-zwf(Down)。
第七阳性克隆的获得
在本步骤中，构建aroA启动子替换的第四置换质粒，转入所述第六阳性克隆，筛选得到第七阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，aroA序列如SEQ ID NO.7所示，扩增aroA上游同源臂的引物序列AroA-AF1(ctgcagcccgggggatccgatgagttgaacactg)和AroA-AR1(tctcgccgaaatcgcaggccttatcatcggcatgttcg)，扩增aroA下游同源臂的引物序列AroA-AF2(caaaaaggagaatttttatatgagcaacactgaacttg)和AroA-AR2(gatcttttctacgagctccggcaagatcatactcatc)，扩增启动子PbacA的引物AA-F(cgaacatgccgatgataaggcctgcgatttcggcgaga)和AA-R(caagttcagtgttgctcatataaaaattctcctttttg)。通过SOE-PCR将启动子aroA的上游同源臂、启动子PbacA和aroA的下游同源臂依次连接成一体，即为aroA基因表达单元(SEQ ID NO.18)。
采用T2(2)-ori作为基础质粒，对第七阳性克隆进行PCR验证，验证引物序列AroA-YF(ttgcctcatggaaatgcct)和AroA-YR(tggcttcttcaatatgctgcg)。验证结果如图2(A)所示，第七阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌aroA(Up)-PbacA-aroA(Down)。
第八阳性克隆的获得
在本步骤中，构建aroB启动子替换的第五置换质粒，转入所述第七阳性克隆，筛选得到第八阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，aroB序列如SEQ ID NO.8所示，扩增aroB上游同源臂的引物AB-F1(ctgcagcccgggggatccgaatcgtcgaggtgattg)和AB-R1(gaatctcgccgaaatcgcaggttaaaactccctcgcaagctttc)，扩增aroB下游同源臂的引物AB-F2(tcaaaaaggagaatttttatatgaaatcacttcaaatcgaaaccg)和AB-R2(gatcttttctacgagctcaagcgtgctcaagcattcgg)，扩增启动子PbacA的引物AB-AF(gaaagcttgcgagggagttttaacctgcgatttcggcgagattca)和AB-AR(cggtttcgatttgaagtgatttcatataaaaattctcctttttga)。通过SOE-PCR将启动子aroB的上游同源臂、启动子PbacA和aroB的下游同源臂依次连接成一体，即为aroB基因表达单元(SEQ ID NO.19)。
采用T2(2)-ori作为基础质粒，对第八阳性克隆进行PCR验证，验证引物AAroB-YF(cctgcgatttcggcgagattc)和AAroB-YR(acaccatttcactgagctgg)。验证结果如图2(B)所示，第八阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌PbacA-aroB(Down)。
第九阳性克隆的获得
在本步骤中，构建aroC启动子替换的第六置换质粒，转入所述第八阳性克隆，筛选得到第九阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，aroC序列如SEQ ID NO.9所示，扩增aroC上游同源臂的引物AroC-AF1(ctgcagcccgggggatccgtccaaatggagcttttttca)和AroC-AR1(gcgaaaacataccacctatcagcttgtaaaaaatcggcatg)，扩增aroC下游同源臂的引物AroC-BF2(caaagggggagatttgtgtgaatacggttaagata)和AroC-BR2(gatcttttctacgagctcgcaacaccagcacatctgcc)，扩增启动子R55的引物55C-F(catgccgattttttacaagctgataggtggtatgttttcgc)和55C-R(tatcttaaccgtattcacacaaatctccccctttg)。通过SOE-PCR将aroC的上游同源臂、启动子R55和aroC的下游同源臂依次连接成一体，即为aroC基因表达单元(SEQ ID NO.20)。
采用相同的T2(2)-ori作为基础质粒，对第九阳性克隆进行PCR验证，验证引物AroC-YF(tcttcgagcacagcgcaaac)和AroC-YR(tcgtgataatcggccgcttcg)。验证结果如图2(C)所示，第九阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌aroC(Up)-R55-aroC(Down)。
第十阳性克隆的获得
在本步骤中，构建aroD启动子替换的第七置换质粒，转入所述第九阳性克隆，筛选得到第十阳性克隆。具体步骤同实施例4。
其中，aroD序列如SEQ ID NO.10所示，扩增aroD上游同源臂的引物47AD-AF1(ctgcagcccgggggatcctctcaatatccggggacaacg)和47AD-AR1(aactctctccccttagcac)，扩增aroD下游同源臂的引物47AD-BF2(catataagaatgtcgcttctcaatgaaaccgatgtacggactg)和47AD-BR2(gatcttttctacgagctcagtctgcttctgcttcctg)，扩增终止子TamyL和启动子R47的引物47AD-TTF(gtgctaaggggagagagttaagagcagagaggacggatttcc)和47AD-TTR(gcgaaaacataccacctatcaccccgccttacctatgcg)、47AD-47F(cgcataggtaaggcggggtgataggtggtatgttttcgc)和47AD-47R(cagtccgtacatcggtttcattgagaagcgacattcttatatg)。通过SOE-PCR将aroD的上游同源臂、终止子TamyL、启动子R47和aroD的下游同源臂依次连接成一体，即为aroD基因表达单元(SEQ ID NO.21)。
采用相同的T2(2)-ori作为基础质粒，对第十阳性克隆进行PCR验证的，验证引物47aroD-YF(tcttgctaaagcggccaagg)和47aroD-YR(ttcgatgttcgggtgcatc)。验证结果如图2(D)所示，第十阳性克隆命名为地衣芽孢杆菌R47-aroD(Down)，即为从头合成原儿茶酸的最终生产菌株P-20。
从头合成原儿茶酸
本实施例公开了一种生物合成原儿茶酸的方法。其包括：获得第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株；将所述基因工程菌株接入含有葡萄糖的培养基中进行发酵；从发酵液中回收所述原儿茶酸。
在一些实施例中，对基因工程菌进行种子活化，得到其种子活化液。具体包括：从甘油管以体积百分比1％将高水平原儿茶酸生产的重组地衣芽孢杆菌PCA20和对照菌株PCA1接种于装有5mLLB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按2％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养的菌液。
在一些实施例中，将该基因工程菌的种子活化液接入含葡萄糖的发酵培养基中进行发酵。具体包括：向500mL三角瓶中装入50mL原儿茶酸液体发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养72小时，得到原儿茶酸发酵生产的菌液。
在一些实施例中，从发酵液中回收所述原儿茶酸。具体包括：收获发酵液，12000rpm离心2min除菌体，从离心所得上清液中回收所述原儿茶酸。
在一个检测例中，利用蒸馏水将离心上清液稀释适量的倍数，再经0.22μm水相滤膜过滤，进行HPLC检测。具体包括：检测样品采用高效液相色谱(HPLC)检测原儿茶酸。检测条件为：使用Agilent1260高效液相色谱仪，色谱柱为C18柱(4.6mmID×250mm，5μm)，流动相为100％甲醇/0.1％甲酸＝1/4，流速0.6mL/min，柱温30℃，进样量10.0μL，检测波长为224nm，洗脱20min。根据原儿茶酸标准品制作的标准曲线计算出发酵液中原儿茶酸的产量，检测结果如图3所示。最终得到基因工程菌株P-20的原儿茶酸产量达到17.5g/L，是第一阳性克隆(P-1)的原儿茶酸产量的10倍，并显著高于以大肠杆菌作为底盘细胞的生物合成方法(DOI:10.3389/fbioe.2021.695704)。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基因工程菌株，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，所述出发菌株的保藏号为CCTCCM2011344。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，所述qsuB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述bsdBCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的pyk核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述tkt的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述eno的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述aroA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述aroB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述aroC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述aroD的核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
4.一种基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株是以地衣芽孢杆菌DW2为出发菌株，转入了表达qsuB的表达质粒，敲除了bsdBCD和pyk，上调了tkt、eno、zwf、aroA、aroB、aroC，以及下调了aroD得到的菌株，所述构建方法包括：
获得所述出发菌株DW2，构建用于表达qsuB的表达质粒，转入所述出发菌株DW2，筛选得到第一阳性克隆，所述出发菌株的保藏号为CCTCCM2011344；
构建用于敲除bsdBCD的第一敲除质粒，转入所述第一阳性克隆，筛选得到第二阳性克隆；
构建用于敲除pyk的第二敲除质粒，转入所述第二阳性克隆，筛选得到第三阳性克隆；
构建tkt启动子替换的第一置换质粒，转入所述第三阳性克隆，筛选得到第四阳性克隆；
构建eno启动子替换的第二置换质粒，转入所述第四阳性克隆，筛选得到第五阳性克隆；
构建zwf启动子替换的第三置换质粒，转入所述第五阳性克隆，筛选得到第六阳性克隆；
构建aroA启动子替换的第四置换质粒，转入所述第六阳性克隆，筛选得到第七阳性克隆；
构建aroB启动子替换的第五置换质粒，转入所述第七阳性克隆，筛选得到第八阳性克隆；
构建aroC启动子替换的第六置换质粒，转入所述第八阳性克隆，筛选得到第九阳性克隆；
构建aroD启动子替换的第七置换质粒，转入所述第九阳性克隆，筛选得到所述地衣芽孢杆菌的基因工程菌株。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述用于表达qsuB的表达质粒携带如SEQ IDNO.1所示的qsuB基因。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述第一敲除质粒为携带bsdBCD的基因敲除片段的基因编辑质粒，所述第二敲除质粒为携带pyk的基因敲除片段的基因编辑质粒。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述第一置换质粒为携带启动子置换为PbacA的tkt基因表达单元的表达质粒；
所述第二置换质粒为携带启动子置换为PUTR12的eno基因表达单元的表达质粒；
所述第三置换质粒为携带启动子置换为PbacA的zwf基因表达单元的表达质粒；
所述第四置换质粒为携带启动子置换为PbacA的aroA基因表达单元的表达质粒；
所述第五置换质粒为携带启动子置换为PbacA的aroB基因表达单元的表达质粒；
所述第六置换质粒为携带启动子置换为R55的aroC基因表达单元的表达质粒。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述第七置换质粒为携带、aroD基因的上游同源臂、终止子TamyL、启动子R47和aroD基因的下游同源臂的aroD基因表达单元的表达质粒。
9.一种生物合成原儿茶酸的方法，其包括：
获得权利要求1～3任一所述的基因工程菌株、或权利要求4～8任一所述的构建方法得到的基因工程菌株；
将所述基因工程菌株接入含有葡萄糖的培养基中进行发酵；
从发酵液中回收所述原儿茶酸。
10.权利要求1～3任一所述的基因工程菌株、或权利要求4～8任一所述的构建方法得到的基因工程菌株在合成原儿茶酸中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311224640.6A CN117511832A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311224640.6A CN117511832A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511832A true CN117511832A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89748430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311224640.6A Pending CN117511832A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511832A (zh) |
-
2023
- 2023-09-21 CN CN202311224640.6A patent/CN117511832A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103667371B (zh) | 一种丹参素的生物生产方法 | |
| CN115029257B (zh) | 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用 | |
| CN105647844B (zh) | 一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN111100832B (zh) | 合成丙酮酸与d-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN115851559A (zh) | 一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4-二羟基丁酸的方法 | |
| CN110904014B (zh) | 一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用 | |
| CN109593702B (zh) | 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成l-苯乳酸的方法 | |
| CN106032525A (zh) | 一种合成白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法 | |
| CN112080452B (zh) | 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用 | |
| CN111154705B (zh) | 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用 | |
| CN117625504A (zh) | 一组合成6,6’-二溴靛蓝的工程菌及其制备方法与应用 | |
| KR102473375B1 (ko) | 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용 | |
| CN107058365B (zh) | 同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN113493758B (zh) | 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN117511832A (zh) | 合成原儿茶酸的基因工程菌、构建方法及应用 | |
| CN115725484A (zh) | 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用 | |
| CN116574623A (zh) | 一种利用双菌共培养体系生产羟基酪醇的方法 | |
| CN107513525A (zh) | 一种d‑扁桃酸脱氢酶、基因、基因工程菌及其应用 | |
| CN109370969B (zh) | 一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用 | |
| CN105755028A (zh) | 产4-羟基扁桃酸的工程菌及构建方法 | |
| CN114196609B (zh) | 从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN118325755B (zh) | 一种生产s-羟丙基四氢吡喃三醇的工程菌及其构建方法 | |
| CN107338263B (zh) | 一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法 | |
| CN118064345A (zh) | 一种从头合成靛蓝的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
| CN118620813A (zh) | 一种高产聚乳酸的重组大肠杆菌和构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |