CN108676080B

CN108676080B - 出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用

Info

Publication number: CN108676080B
Application number: CN201810508449.7A
Authority: CN
Inventors: 邹祥; 阳静; 杨雯雯; 李天夫; 张园
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108676080A

Abstract

本发明涉及一种出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用，该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，基因组序列如SEQ ID NO.3所示；过表达出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8后聚苹果酸产量明显提高，约为10‑30％，对进一步提高聚苹果酸产量具有重要意义，同时对提高出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖、短梗霉素等的发酵产量也具有指导意义。

Description

出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8，还涉及含有该转录因子的重组表达载体和应用。

背景技术

聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可用于生物医学材料、营养强化剂、食品包装等领域，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单体为L-苹果酸，是一种优良的食品酸化剂，市场年需求在10万吨以上。

聚苹果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)代谢产生，前期研究发现，聚苹果酸通常在碳限制条件下高效合成(Zou X，et a1.Microbial Cell Fact，2016)，同时发现在高糖底物条件(葡萄糖＞120g/L)菌体细胞生长明显放缓，存在葡萄糖效应，其他快速碳源如果糖也存在抑制作用，此现象为碳源代谢抑制效应(carbon cataboliterepression，CCR)。已知Cat8在酵母等真菌中是作为碳代谢响应的全局性转录调控因子，高度参与碳源代谢调控，但Cat8基因是否在出芽短梗霉中存在，以及如何参加调控聚苹果酸合成以及响应基因不清楚。因此，研究调控聚苹果酸合成基因对提高出芽短梗霉聚苹果酸含量具有重要意义，同时也适用于出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖、短梗霉素、黑色素等的合成。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8；本发明的目的之二在于提供含有编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因的重组过表达载体；本发明的目的之三在于提供上述重组表达载体的构建方法；本发明的目的之四在于提供出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用；本发明的目的之五在于提供含有编码所述出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8，其特征在于：所述碳响应转录因子Cat8的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，编码碳响应转录因子Cat8的基因组序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述编码碳响应转录因子Cat8的编码区序列如SEQ ID NO.4所示。

2.含有所述出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因的重组表达载体。

优选的，编码所述碳响应转录因子Cat8基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3、所述重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：扩增编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPE1的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8和trpC终止子的表达框，连入pk2-hyg的EcoR I酶切位点处即可。

优选的，扩增编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因组序列的方法如下：以SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示序列为引物，出芽短梗霉基因组DNA为模板PCR扩增而得；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8和trpC终止子的表达框的引物如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示。

4、所述出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。

5、所述表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明成功获得了出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因，并获得了该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，基因组序列如SEQ ID NO.3所示；过表达出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8后聚苹果酸产量明显提高，约为10-30％，对进一步提高聚苹果酸产量具有重要意义，同时对提高出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖、短梗霉素等的发酵产量也具有指导意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1Snf1信号通路(Snf1：Sucrose non-fermenting，蔗糖非酵解蛋白；Cat8：Catabolite repression，碳源分解代谢阻遏因子；Mig1：Multicopy inhibitor ofGALgene expression，半乳糖基因表达的多拷贝抑制因子；Adr1：Alcohol dehydrogenase IIsynthesis regulator，乙醇脱氢酶II合成调控因子；Rds2：Regulator of drugsensitivity，药物敏感性调节因子；Sip4：SNF1-interacting protein，Snf1作用蛋白；UAS：Upstream active sequence，上游激活序列；CRSE：Carbon source-responsiveelements，碳源响应元件；FBP1：Fructose-1，6-biosphosphatase，1，6-二磷酸果糖；MLS1：Malate synthase，苹果酸合成酶；ICL1：Isocitrate lyase，异柠檬酸裂解酶)。

图2为所用载体图谱(A.pBAGPE I结构图；B.pK2-gus载体图谱；C.pK2-hyg载体结构)。

图3为出芽短梗霉敲除转化子的PCR引物设计原理图。

图4为出芽短梗霉敲除转化子载体谱图(A：载体pk2-gus-5arm-HygL；B：载体pk2-gus-HygR-3arm)。

图5为pBARGPE1-Cat8和pk2-hyg-Cat8的载体结构图(A：pBARGPE1-Cat8结构图；B：pk2-hyg-Cat8载体结构图)。

图6为出芽短梗霉Cat8基因扩增和过表达菌株的PCR、表达量验证(A：Cat8基因CDS序列扩增；B：pK2-hyg-Cat8菌液筛选验证；C：Cat8表达盒扩增；D：过表达菌株PCR验证；E：过表达菌株中Cat8基因表达量验证)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

在前期研究中发现，Cat8能够有效促进聚苹果酸合成，上调乙醛酸通路的关键基因表达(图1)。因此，可作为一种有效的调控策略，调剂碳代谢流。

实施例1、克隆出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因

根据出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)全基因组测序结果，利用生物信息学软件分析碳响应转录因子Cat8并设计编码CDS序列扩增引物，上游引物为Cat8-F：5’-atgccaggcatcctaccc-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物Cat8-R：5’-tcacgaggcttgaagaacag-3’(SEQ ID NO.2)，然后以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因组cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸5min；4℃保温10min。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片段，回收产物连接pMD 19-T Vector，经测序获得如SEQ ID NO.3所示序列，其开放阅读框序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例2、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因敲除

(1)出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因敲除载体的构建

利用同源重组的方法，以潮霉素抗性标记hyg替换掉碳响应转录因子Cat8中2706bp的一段序列，包括从ATG开始的706bp和ATG上游的200bp，以破坏其表达，其原理如图3所示。具体是以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因组为模板，使用phataMax Super-Fidelity DNA polymerse高保真Taq酶，以5arm-F：5’-agtggatcccccggggaattcttggcatcttgctaaacgactc-3’(SEQ ID NO.6)；5arm-R：5’-gtacgtacagaaccaagtgtgg-3’(SEQ ID NO.7)扩增上游同源臂5arm，同时以3arm-F：5’-gtttagaggtaatccttcttggcacctgccagacttgaatcc-3’(SEQ ID NO.8)；3arm-R：5’-acagctatgacatgattacgggtcatggcgatcgaaggg-3’(SEQ ID NO.9)为引物扩增下游同源臂3arm；获得的上游同源臂5arm如SEQ IDNO.10所示，下游同源臂3arm如SEQ ID NO.11所示。

再以pk2-hyg载体为模板(图2，C)(参见文献“涂光伟，王永康，冯俊，李晓荣，郭美锦，邹祥.农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株.生物工程学报，2015，31(7)：1063-1072”)以HYGL-F：5’-ccacacttggttctgtacgtacgtcgacagaagatgacattgaag-3’(SEQ ID NO.12)和HYGL-R：5’-acagctatgacatgattacgtgctccatacaagccaacc-3’(SEQ ID NO.13)扩增潮霉素抗性标的左端HYG-L(如SEQ ID NO.14所示)；同时以HYGR-F：5’-agtggatcccccggggaattacctgcctgaaaccgaact-3’(SEQ ID NO.15)和HYGR-R：5’-aagaaggattacctctaaacaagtgt-3’(SEQ ID NO.16)扩增潮霉素抗性标的右端HYG-R(如SEQID NO.17所示)，其中HYG-L的右端和HYG-R的左端有427bp的同源序列。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收备用。

使用一步克隆试剂盒(ClonExpress^TM MultiS One Step Cloning Kit)将上游同源臂5arm和潮霉素抗性标记的左端HYG-L连接至pk2-gus的EcoRI酶切位点处(图2，B)。具体原理是：将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)，这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。具体操作是：将pk2-gus载体在EcoR I酶切位点处酶切线性化，在5arm的正向PCR引物5arm-F(SEQID NO.6)5’端引入线性化载体pk2-gus上游末端20bp序列，使得5arm的PCR产物5’端带有和线性化载体pk2-gus上游末端对应的完全一致的序列(20bp)；同理在HYG-L的正向引物HYGL-F(SEQ ID NO.12)5’端引入5arm片段的下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR产物5’端带有和5arm下游末端完全一致的20bp序列；在HYG-L的反向引物HYGL-R(SEQ ID NO.13)5’端引入线性化载体pk2-gus下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR产物3’端带有和线性化载体pk2-gus下游末端完全一致的20bp序列；然后以线性化载体pk2-gus和插入片段5arm、HYG-L的PCR产物配制重组反应体系，37℃反应30min实现将片段5arm和HYG-L顺序拼接并克隆至载体pk2-gus的EcoRI酶切位点处，构建敲除载体pk2-gus-5arm-HygL(图4，A)，转化E.coli DH5α感受态细胞；采用同样的方法，将潮霉素抗性标记的右端HYG-R和下游同源臂3arm连接至pk2-gus的EcoRI酶切位点处，构建敲除载体pk2-gus-HygR-3arm(图4，B)，转化E.coli DH5α感受态细胞。然后分别以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R引物PCR验证转化子，经测序验证无误后备用。

(2)敲除载体遗传转化出芽短梗霉

将构建好的敲除载体pk2-gus-5arm-HygL和pk2-gus-HygR-3arm测序无误后，同时转化根癌农杆菌(A.tumefaciens)AGL-1感受态细胞，分别以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R引物PCR验证农杆菌转化子，验证无误即获得含有敲除载体AGL-1-pk2-gus-5arm-HygL和AGL-1-pk2-gus-HygR-3arm的根癌农杆菌。挑取含有敲除载体的根癌农杆菌单菌落于YCK培养基(YCK培养基(g/L)：酵母提取物10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH 7.0，固体加琼脂至质量分数为2％，115℃高温蒸汽灭菌30min。灭菌后加卡那霉素(50mg/mL)1000μL，羧苄青霉素(50mg/mL)1000μL中28℃培养，同时挑取出芽短梗霉单菌落于HC培养基(HC培养基(g/L)：葡萄糖10g/L，酵母提取物3g/L，牛肉膏1g/L，蛋白胨10g/L，麦芽浸出物3g/L，pH 5.7；115℃高温蒸汽灭菌30min)中25℃培养。将上述处理好的农杆菌和出芽短梗霉按体积比1:1混合，25℃共培养48h后转膜至含有头孢他啶和潮霉素B的M100平板上培养5～7天至转化子长出。将长出的转化子挑至M100平板(M-100培养基(g/L)：葡萄糖10g/L，KNO₃ 3g/L，M-100SS 62.5mL/L，加ddH₂O至1L，固体加琼脂至质量分数为1.5％，115℃高温蒸汽灭菌30min。灭菌后加入头孢他啶(500mg/mL)1000μL和潮霉素B(50mg/mL)2000μL)上复筛，以P5/P6引物做菌液PCR，若P5/P6引物验证正确，则提取基因组。以基因组做模板，分别以P1/P2、P3/P4、P7/P8和P9/P10引物PCR验证，具体引物序列如表1所示，结果显示，PCR产物大小与预期相符，表明Cat8基因中906bp的序列被成功敲除，成功得到了出芽短梗霉的Cat8基因破坏株ΔCat8，命名为出芽短梗霉敲除转化子。同时将验证正确的出芽短梗霉敲除转化子在不含潮霉素B的平板上连续传3代，考察其遗传稳定性。

表1、出芽短梗霉敲除转化子检测引物

(3)发酵试验

将上述获得的出芽短梗霉敲除转化子在摇瓶发酵96小时，然后提取聚苹果酸。结果显示，出芽短梗霉敲除转化子(pk2-gus-5arm-HygL)的聚苹果酸发酵产量为15.3±0.18g/L，比原始菌株降低了43.6％；出芽短梗霉敲除转化子(pk2-gus-HygR-3arm)的生物量为13.3±0.05g/L，比原始菌株降低了27.1％。表明敲出Cat8基因后能够影响出芽短梗霉的生物量和聚苹果酸的产量(发酵方法和聚苹果酸提取方法见公开号为102827778A的中国专利)。

实施例3、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8基因过表达

(1)Cat8过表达载体构建

以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)cDNA为模板，OE-Cat8-F：5’-gacctcgactctagaggatcatgccaggcatcctaccc-3’(SEQ ID NO.28)和OE-Cat8-R：5’-gataagcttg atatcgaatttcacgaggcttgaagaacag-3’(SEQ ID NO.29)为引物扩增出芽短梗霉Cat8基因编码区的基因组序列(图6，A)。真菌表达载体pBARGPE1(图2，A)分步进行EcoR I、BamH I双酶切，在设计Cat8基因扩增引物时，分别在两端引入与pBARGPE1-EcoR I-BanH I双酶切位点上下游末端20bp序列(下划线部分)。将回收的目的基因Cat8与pBARGPE1载体骨架采用一步克隆试剂盒(ClonExpress^TM MultiS One Step Cloning Kit)连接，获得出芽短梗霉Cat8基因过表达载体，命名为pBARGPE1-Cat8(图5，A)，其含有构巢曲霉PgpdA启动子和TtrpC终止子。将获得的重组表达载体转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性菌株，经测序验证正确后保存备用。

将载体pk2-hyg使用EcoRI内切酶酶切线性化，在设计引物时分别在正向引物pK2-hyg-gpdA-F：5’-ctatgacatgattacgaattcggcatccgcttacagaca-3’(SEQ ID NO.30)的5’端引入线性化载体pk2-hyg-EcoRI上游末端20bp序列，在反向引物pK2-hyg-trpC-R：5’-tcatcttctgtcgacgaattcaggtattgctgttatctgatgagt-3’(SEQ ID NO.31)的5’端引入线性化载体pk2-hyg-EcoR I下游末端20bp序列，使得gpdA-Cat8-trpC的PCR产物5’端和3’端分别带有和线性化载体pk2-hyg-EcoR I上/下游末端完全一致的20bp序列，使用一步克隆试剂盒(ClonExpress^TM MultiS One Step Cloning Kit)将PgpdA-Cat8-TtrpC连接至pk2-hyg的EcoRI酶切位点处，转化E.coli DH5a感受态细胞，挑取转化子PCR验证并测序无误(图6，B)，即为Cat8的过表达载体pk2-hyg-Cat8(图5，B)。pK2-hyg-Cat8完整表达盒含有构巢曲霉PgpdA强启动子、Cat8、TtrpC终止子(图6，C；序列为SEQ ID NO.32所示)。

(2)过表达载体pk2-hyg-gpdA-Cat8-trpC遗传转化出芽短梗霉

构建好的过表达载体pk2-hyg-PgpdA-Cat8-TtrpC测序无误后，转化根癌农杆菌(A.tumefaciens AGL-1)感受态细胞，将根癌农杆菌和出芽短梗霉细胞培养后，按体积比1∶1混合，25℃共培养48h后转移至含有头孢他啶和潮霉素(50mg/mL培养基)的M100平板上培养5～7天至见转化子长出。将长出的转化子挑至M100平板上复筛，以PgpdA-test-F：5’-cggcatccgcttacagaca-3’(SEQ ID NO.33)和TtrpC-test-R：5’-caggtattgctgttatctgatgagt-3’(SEQ ID NO.34)为引物PCR验证能得到4300bp大小的条带(图6，D)，表明PgpdA-Cat8-TtrpC成功整合进出芽短梗霉的基因组中，同时将验证正确的过表达株在不含潮霉素的平板上连续传3代，考察其遗传稳定性，得到2株出芽短梗霉过表达菌株OE::Cat8，分别命名为过表达菌株OE::Cat8-1，过表达菌株OE::Cat8-2。

(3)发酵验证

将出芽短梗霉过表达菌株OE::Cat8-1摇瓶发酵96小时，聚苹果酸发酵产量为34.06±0.33g/L，比原始菌株提高了20.4％；过表达菌株OE::Cat8-2的细胞生物量为16.28±0.80g/L，比原始菌株18.24±0.91g/L降低了10.7％。5L发酵罐试验表明，OE::Cat8-1转化子发酵84小时，聚苹果酸产量为50.61±0.00g/L，比对照组提高了68.8％(发酵方法和聚苹果酸提取方法见公开号为102827778A的中国专利)。

结果表明，出芽短梗霉过表达Cat8后能够提高聚苹果酸的产量，表明碳响应转录因子Cat8参与并调控聚苹果酸合成。

(4)表达量验证

分别提取OE::Cat8和野生型总RNA并反转录得到cDNA，以β-Actin为内参基因通过qRT-PCR分析Cat8基因表达。结果表明OE::Cat8菌株中Cat8基因表达量是对照的9.86倍，差异极显著，表明Cat8基因成功过表达(图6，E)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<120> 出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccaggca tcctaccc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcacgaggct tgaagaacag 20

<210> 3

<211> 2958

<212> DNA

<213> 出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)

<400> 3

atgccaggca tcctacccat gaaggtcatc aaggttgggt cgagcgccca atcccgtatt 60

gcacaggcct gcgacaggta tgttggttga acccgtcctc tgccgcgtat gcttatgctc 120

ctggcagatg tcgaagcaag aagatcagat gcgacggtat tcgacctagc tgttcgcaat 180

gtactagcgt cgggttcgag tgcaagacca gcgacaaatt gagccgtcgc gccttcccca 240

gaggatacac agagtcgctt gaagaaagag tgcgcagtct agaagccgaa gtcagagaat 300

tgaaggagct gctcgacgag aaggacgaga agattgacat gctatcgaag ctgcactccg 360

catcctcaca atcagcattt cagaactcac cgcggcggcc gtcagcctca ccagcagctc 420

cctcaccaaa cacagtcagc gaagatgttt ttcaagttca acagacactc cagctcgacg 480

gcaatggcac aaacgcccat ttcgctggca actcaagcgg aaaggccttc tatggtgcag 540

tcatttccga ccgcgagcaa attcactgct aactgtatac agatgcctat tcaaaacgag 600

tacaggaact cggccgagca tcaccagcag tcaacgttca gaatcttcta cccggaagca 660

cccacatcgc acctcgcgac cccctctcag atcccatcgt ctggaaggca cctgccagac 720

ttgaatccga ccaattgatc ggcatcttct tccaggagtg ggcaccactc ttccccatcc 780

tgcatcgccc taccttcctc gagctctacc agtcttacat gtccgctcct gagaacgttg 840

tcgataattg cagccatgct cagcttaacc ttgtctttgg aattgctgct ttatctagtg 900

gtgtaagtag tactatcgat tatggaaaac catggctgac ttttgtattt cagtcacgcg 960

acacagctgg ccttcaatca ttcgagacac aatggcaggc cgctattgat acgatactgt 1020

ccgaccatag catgcctact ttgcagtgcc ttgtcttggc acagctatac tgcatgcagc 1080

gtggcgatta tgacaggctt ctaacttaca aggcactcgc cgtcactctt tcttctagac 1140

tagggctgca tcagtcacag aagcgtttcg ctcttggtgc atccaccagt gagatgagga 1200

agaaggtctt ctggtgcctg tacaccattg actggtatgt tgaagtgaac attcatctcg 1260

ttgacaacaa agactaatac ttaatagctt ctctgccgtc actttgggcc tgcctaagca 1320

gctcaaggat gaggacgtcc actgcgagga gcctcgtgat gctgatgagg agtacgttga 1380

cgagaccggg ttcaaggcac cctgccctgg tgagtacact agggtgtcta gtgcccttgc 1440

actcttccgt gctgctcgta ttctttctcg ggtgctggag gaaatctatc ctgctcgctc 1500

ttcatacgat ctctcgctgc aacagctttc ggcgttgtcg gaagaacttg atgcctggca 1560

caacggtctt gcgccacact tgcgccttcc tttcgcaaat gacaaaccca ccgccggaac 1620

cgtcagcagc cgctctcctt tgctggtatg tcactcaggc gtcacaacaa tgcaatcatt 1680

gactaattat cacagtcttt aacttaccat ttcatccgtg ctcttatcca ccgcccagca 1740

gtctgcgcct ctcttggccc gcgcgcttcc tcgtctgtac ttgcagtggc aggatcttct 1800

aaacacagca tccaaattat tgaattgctg agcgagaggg ggctaagttt ctcattctgt 1860

atcaacaaag atgagctcct cgttctatct ggattgggac ttcttttcca aagcctggaa 1920

ctcggagaga acagcaagct tgtcaaggac aaccagaaaa tgatttccac cgttgtcaag 1980

attctcaccc agaccaaggc accttccgca acagagttcc agaaactcac cccctcagtg 2040

ccggttgctt caccacaact tacgacgaag cagcaacaac ccagcttgtc gcgccataac 2100

tctgatggtg ctgttcatcc tgtgagcttg tcgaaccatg gaaatgcttc tccgacagaa 2160

aagaatcgat tcaaggcggc agctcagaga ctcatggcta agaacccctt cgatcgccat 2220

gaccaaagac gggcaacctt cccaaacatt tcgctgcatc acaatgcgat ccagacccag 2280

agccagccca atatacccca ggtcgcgact tctgaacccg catacagccc cgccaatcct 2340

tcccccgcac cactccccgt atccgcccga ccctcagcgc caccaaacct tagaccagtt 2400

cgatccttcc ctcagcagca gctcaaccta gactacctct ccttcagcaa cgttcctacc 2460

cgtacgcact cacctgattc tcacgcctcc atcaagcagg aaccttcgga ttgggaacgt 2520

ttgctcggct cgctggacaa cggacagact aatatcttcg acaacatcta tggcgggcca 2580

cctgttgagt tccttgacgc ccagcaccac caaaatgcaa agcacatgac gcccatggct 2640

tcaagcttac ccaacccggt tccccagtgg caccattcac cccctgacgt ctgggctgtc 2700

acaaattccg acatcaatgc catgacttgc agcatggctg gtagtatcgc gcatcccgaa 2760

agtgtcttca gcatcggcac cgacgacgat ggcactgcta ccggtgacga gctctttggc 2820

aatgattggg gcagtgccag cagcaccaac ggcgaagcct accatgcagg cattattatg 2880

ccacaactga ctcccgacga gcacagcatg ttgagcagca tgtggagcga gagcactgct 2940

gttcttcaag cctcgtga 2958

<210> 4

<211> 2706

<212> DNA

<213> 出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)

<400> 4

atgccaggca tcctacccat gaaggtcatc aaggttgggt cgagcgccca atcccgtatt 60

gcacaggcct gcgacagatg tcgaagcaag aagatcagat gcgacggtat tcgacctagc 120

tgttcgcaat gtactagcgt cgggttcgag tgcaagacca gcgacaaatt gagccgtcgc 180

gccttcccca gaggatacac agagtcgctt gaagaaagag tgcgcagtct agaagccgaa 240

gtcagagaat tgaaggagct gctcgacgag aaggacgaga agattgacat gctatcgaag 300

ctgcactccg catcctcaca atcagcattt cagaactcac cgcggcggcc gtcagcctca 360

ccagcagctc cctcaccaaa cacagtcagc gaagatgttt ttcaagttca acagacactc 420

cagctcgacg gcaatggcac aaacgcccat ttcgctggca actcaagcgg aaaggccttc 480

tatgatgcct attcaaaacg agtacaggaa ctcggccgag catcaccagc agtcaacgtt 540

cagaatcttc tacccggaag cacccacatc gcacctcgcg accccctctc agatcccatc 600

gtctggaagg cacctgccag acttgaatcc gaccaattga tcggcatctt cttccaggag 660

tgggcaccac tcttccccat cctgcatcgc cctaccttcc tcgagctcta ccagtcttac 720

atgtccgctc ctgagaacgt tgtcgataat tgcagccatg ctcagcttaa ccttgtcttt 780

ggaattgctg ctttatctag tggttcacgc gacacagctg gccttcaatc attcgagaca 840

caatggcagg ccgctattga tacgatactg tccgaccata gcatgcctac tttgcagtgc 900

cttgtcttgg cacagctata ctgcatgcag cgtggcgatt atgacaggct tctaacttac 960

aaggcactcg ccgtcactct ttcttctaga ctagggctgc atcagtcaca gaagcgtttc 1020

gctcttggtg catccaccag tgagatgagg aagaaggtct tctggtgcct gtacaccatt 1080

gactgcttct ctgccgtcac tttgggcctg cctaagcagc tcaaggatga ggacgtccac 1140

tgcgaggagc ctcgtgatgc tgatgaggag tacgttgacg agaccgggtt caaggcaccc 1200

tgccctggtg agtacactag ggtgtctagt gcccttgcac tcttccgtgc tgctcgtatt 1260

ctttctcggg tgctggagga aatctatcct gctcgctctt catacgatct ctcgctgcaa 1320

cagctttcgg cgttgtcgga agaacttgat gcctggcaca acggtcttgc gccacacttg 1380

cgccttcctt tcgcaaatga caaacccacc gccggaaccg tcagcagccg ctctcctttg 1440

ctgtctttaa cttaccattt catccgtgct cttatccacc gcccagcagt ctgcgcctct 1500

cttggcccgc gcgcttcctc gtctgtactt gcagtggcag gatcttctaa acacagcatc 1560

caaattattg aattgctgag cgagaggggg ctaagtttct cattctgtat caacaaagat 1620

gagctcctcg ttctatctgg attgggactt cttttccaaa gcctggaact cggagagaac 1680

agcaagcttg tcaaggacaa ccagaaaatg atttccaccg ttgtcaagat tctcacccag 1740

accaaggcac cttccgcaac agagttccag aaactcaccc cctcagtgcc ggttgcttca 1800

ccacaactta cgacgaagca gcaacaaccc agcttgtcgc gccataactc tgatggtgct 1860

gttcatcctg tgagcttgtc gaaccatgga aatgcttctc cgacagaaaa gaatcgattc 1920

aaggcggcag ctcagagact catggctaag aaccccttcg atcgccatga ccaaagacgg 1980

gcaaccttcc caaacatttc gctgcatcac aatgcgatcc agacccagag ccagcccaat 2040

ataccccagg tcgcgacttc tgaacccgca tacagccccg ccaatccttc ccccgcacca 2100

ctccccgtat ccgcccgacc ctcagcgcca ccaaacctta gaccagttcg atccttccct 2160

cagcagcagc tcaacctaga ctacctctcc ttcagcaacg ttcctacccg tacgcactca 2220

cctgattctc acgcctccat caagcaggaa ccttcggatt gggaacgttt gctcggctcg 2280

ctggacaacg gacagactaa tatcttcgac aacatctatg gcgggccacc tgttgagttc 2340

cttgacgccc agcaccacca aaatgcaaag cacatgacgc ccatggcttc aagcttaccc 2400

aacccggttc cccagtggca ccattcaccc cctgacgtct gggctgtcac aaattccgac 2460

atcaatgcca tgacttgcag catggctggt agtatcgcgc atcccgaaag tgtcttcagc 2520

atcggcaccg acgacgatgg cactgctacc ggtgacgagc tctttggcaa tgattggggc 2580

agtgccagca gcaccaacgg cgaagcctac catgcaggca ttattatgcc acaactgact 2640

cccgacgagc acagcatgtt gagcagcatg tggagcgaga gcactgctgt tcttcaagcc 2700

tcgtga 2706

<210> 5

<211> 901

<212> PRT

<213> 出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)

<400> 5

Met Pro Gly Ile Leu Pro Met Lys Val Ile Lys Val Gly Ser Ser Ala

1 5 10 15

Gln Ser Arg Ile Ala Gln Ala Cys Asp Arg Cys Arg Ser Lys Lys Ile

20 25 30

Arg Cys Asp Gly Ile Arg Pro Ser Cys Ser Gln Cys Thr Ser Val Gly

35 40 45

Phe Glu Cys Lys Thr Ser Asp Lys Leu Ser Arg Arg Ala Phe Pro Arg

50 55 60

Gly Tyr Thr Glu Ser Leu Glu Glu Arg Val Arg Ser Leu Glu Ala Glu

65 70 75 80

Val Arg Glu Leu Lys Glu Leu Leu Asp Glu Lys Asp Glu Lys Ile Asp

85 90 95

Met Leu Ser Lys Leu His Ser Ala Ser Ser Gln Ser Ala Phe Gln Asn

100 105 110

Ser Pro Arg Arg Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Pro Asn Thr

115 120 125

Val Ser Glu Asp Val Phe Gln Val Gln Gln Thr Leu Gln Leu Asp Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Asn Ala His Phe Ala Gly Asn Ser Ser Gly Lys Ala Phe

145 150 155 160

Tyr Asp Ala Tyr Ser Lys Arg Val Gln Glu Leu Gly Arg Ala Ser Pro

165 170 175

Ala Val Asn Val Gln Asn Leu Leu Pro Gly Ser Thr His Ile Ala Pro

180 185 190

Arg Asp Pro Leu Ser Asp Pro Ile Val Trp Lys Ala Pro Ala Arg Leu

195 200 205

Glu Ser Asp Gln Leu Ile Gly Ile Phe Phe Gln Glu Trp Ala Pro Leu

210 215 220

Phe Pro Ile Leu His Arg Pro Thr Phe Leu Glu Leu Tyr Gln Ser Tyr

225 230 235 240

Met Ser Ala Pro Glu Asn Val Val Asp Asn Cys Ser His Ala Gln Leu

245 250 255

Asn Leu Val Phe Gly Ile Ala Ala Leu Ser Ser Gly Ser Arg Asp Thr

260 265 270

Ala Gly Leu Gln Ser Phe Glu Thr Gln Trp Gln Ala Ala Ile Asp Thr

275 280 285

Ile Leu Ser Asp His Ser Met Pro Thr Leu Gln Cys Leu Val Leu Ala

290 295 300

Gln Leu Tyr Cys Met Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Arg Leu Leu Thr Tyr

305 310 315 320

Lys Ala Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Arg Leu Gly Leu His Gln Ser

325 330 335

Gln Lys Arg Phe Ala Leu Gly Ala Ser Thr Ser Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Val Phe Trp Cys Leu Tyr Thr Ile Asp Cys Phe Ser Ala Val Thr Leu

355 360 365

Gly Leu Pro Lys Gln Leu Lys Asp Glu Asp Val His Cys Glu Glu Pro

370 375 380

Arg Asp Ala Asp Glu Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Phe Lys Ala Pro

385 390 395 400

Cys Pro Gly Glu Tyr Thr Arg Val Ser Ser Ala Leu Ala Leu Phe Arg

405 410 415

Ala Ala Arg Ile Leu Ser Arg Val Leu Glu Glu Ile Tyr Pro Ala Arg

420 425 430

Ser Ser Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Gln Leu Ser Ala Leu Ser Glu Glu

435 440 445

Leu Asp Ala Trp His Asn Gly Leu Ala Pro His Leu Arg Leu Pro Phe

450 455 460

Ala Asn Asp Lys Pro Thr Ala Gly Thr Val Ser Ser Arg Ser Pro Leu

465 470 475 480

Leu Ser Leu Thr Tyr His Phe Ile Arg Ala Leu Ile His Arg Pro Ala

485 490 495

Val Cys Ala Ser Leu Gly Pro Arg Ala Ser Ser Ser Val Leu Ala Val

500 505 510

Ala Gly Ser Ser Lys His Ser Ile Gln Ile Ile Glu Leu Leu Ser Glu

515 520 525

Arg Gly Leu Ser Phe Ser Phe Cys Ile Asn Lys Asp Glu Leu Leu Val

530 535 540

Leu Ser Gly Leu Gly Leu Leu Phe Gln Ser Leu Glu Leu Gly Glu Asn

545 550 555 560

Ser Lys Leu Val Lys Asp Asn Gln Lys Met Ile Ser Thr Val Val Lys

565 570 575

Ile Leu Thr Gln Thr Lys Ala Pro Ser Ala Thr Glu Phe Gln Lys Leu

580 585 590

Thr Pro Ser Val Pro Val Ala Ser Pro Gln Leu Thr Thr Lys Gln Gln

595 600 605

Gln Pro Ser Leu Ser Arg His Asn Ser Asp Gly Ala Val His Pro Val

610 615 620

Ser Leu Ser Asn His Gly Asn Ala Ser Pro Thr Glu Lys Asn Arg Phe

625 630 635 640

Lys Ala Ala Ala Gln Arg Leu Met Ala Lys Asn Pro Phe Asp Arg His

645 650 655

Asp Gln Arg Arg Ala Thr Phe Pro Asn Ile Ser Leu His His Asn Ala

660 665 670

Ile Gln Thr Gln Ser Gln Pro Asn Ile Pro Gln Val Ala Thr Ser Glu

675 680 685

Pro Ala Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Ser Pro Ala Pro Leu Pro Val Ser

690 695 700

Ala Arg Pro Ser Ala Pro Pro Asn Leu Arg Pro Val Arg Ser Phe Pro

705 710 715 720

Gln Gln Gln Leu Asn Leu Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Asn Val Pro Thr

725 730 735

Arg Thr His Ser Pro Asp Ser His Ala Ser Ile Lys Gln Glu Pro Ser

740 745 750

Asp Trp Glu Arg Leu Leu Gly Ser Leu Asp Asn Gly Gln Thr Asn Ile

755 760 765

Phe Asp Asn Ile Tyr Gly Gly Pro Pro Val Glu Phe Leu Asp Ala Gln

770 775 780

His His Gln Asn Ala Lys His Met Thr Pro Met Ala Ser Ser Leu Pro

785 790 795 800

Asn Pro Val Pro Gln Trp His His Ser Pro Pro Asp Val Trp Ala Val

805 810 815

Thr Asn Ser Asp Ile Asn Ala Met Thr Cys Ser Met Ala Gly Ser Ile

820 825 830

Ala His Pro Glu Ser Val Phe Ser Ile Gly Thr Asp Asp Asp Gly Thr

835 840 845

Ala Thr Gly Asp Glu Leu Phe Gly Asn Asp Trp Gly Ser Ala Ser Ser

850 855 860

Thr Asn Gly Glu Ala Tyr His Ala Gly Ile Ile Met Pro Gln Leu Thr

865 870 875 880

Pro Asp Glu His Ser Met Leu Ser Ser Met Trp Ser Glu Ser Thr Ala

885 890 895

Val Leu Gln Ala Ser

900

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtggatccc ccggggaatt cttggcatct tgctaaacga ctc 43

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtacgtacag aaccaagtgt gg 22

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttagaggt aatccttctt ggcacctgcc agacttgaat cc 42

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagctatga catgattacg ggtcatggcg atcgaaggg 39

<210> 10

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtggatccc ccggggaatt cttggcatct tgctaaacga ctcagattgc tcgagagcga 60

gctattggag aaagcttaca gcttctacga agatcaggta agtcggcaac acagacccat 120

ttccgatgat ctgcacattg atatgggcgg cttccggcag gaccacggag cacatccatg 180

tttgctccac atgctaactg aatcgccttt tagaaacttc agctcatgca aagtgagact 240

gtgttgagat acttatcggg gccagacgtt gagcaagatg aagatttttc ctagtcttct 300

gagtcagtcg attattaaac atggacatag taaaatgcat ccccacgcag tagggtgctt 360

gaagctagaa gaagagatta ttgctctatg accagcggtc acgcacgtac acgcaacccc 420

acgcctacct tatctcctcc acgaggcagc atgtttgatt ggagatctga tgaccccttt 480

tcgtgatgct ccacggccgt ctactggccg cccaaacttt gcacggcctt atgacagctt 540

cccgagcggt acgagcctcc gcagcttgac agccgtgacc atctacgccc gtaattttca 600

gaacaggtcg ccgtctacag aagatctaca tcaacagtga tggcaagctt cgaaacgaaa 660

gaaccaatac aaattggcgc atcgaaaagg ccgcgctaca gggtcacgac atggctcaag 720

tttggtaggt atgactcagg tcttgggacg cctaattgcc gatactgggc gacgcccaag 780

ctttacctgt gtcatgatga ttgtttccca catgacggtc catcgaatca agctcatgtc 840

tgattgatat acatgcccaa ttacttggct ctggggagtt cggccgcaga tcttcttcac 900

tttatgtgac aaatctggtc atacgaagtc acgtatcacg tatgctgagc ttatgtacgc 960

cgatgattaa aaactcactc ggaactgtct ccccccggtt tctgcgatga cctgaagcct 1020

ggtctcgaac gcttccaaat tatgacgaac gtcttcgtta cgtcgctctg cttgtcggtc 1080

tcactgaaca gcacacgagc aattccaatt ggagactctt gaccattgac cgggactcaa 1140

gtgaagtcac agccatctcg atgtcttgca taggcaaagc aaatgtggtc ggaaattcgc 1200

gggagtaact gcgaagcagc gccgcctcaa actcggcgcc atcaataatg ttagacttta 1260

tgatcgtcca acgcgtccag ctctcccccg caactgcaga gagtaccggt catggcaggg 1320

ttgtcagtct tgcctgatca gaccaatcac aagggccctg aacgaaccgc cgacacaggt 1380

ccgaggcttt tgtctacgtt ttgggtctag ttggtgtctt caagaggctc gagagggatt 1440

tggcgtctgg gggttgccgc tgttgtgtgt gctctcccca gacttggact acgtttcgag 1500

tcccgcgctt ggttcgattt gtctctgttc tcttcgtcac gacgagatct ccacacttgg 1560

ttctgtacgt ac 1572

<210> 11

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcacctgcc agacttgaat ccgaccaatt gatcggcatc ttcttccagg agtgggcacc 60

actcttcccc atcctgcatc gccctacctt cctcgagctc taccagtctt acatgtccgc 120

tcctgagaac gttgtcgata attgcagcca tgctcagctt aaccttgtct ttggaattgc 180

tgctttatct agtggtgtaa gtagtactat cgattatgga aaaccatggc tgacttttgt 240

atttcagtca cgcgacacag ctggccttca atcattcgag acacaatggc aggccgctat 300

tgatacgata ctgtccgacc atagcatgcc tactttgcag tgccttgtct tggcacagct 360

atactgcatg cagcgtggcg attatgacag gcttctaact tacaaggcac tcgccgtcac 420

tctttcttct agactagggc tgcatcagtc acagaagcgt ttcgctcttg gtgcatccac 480

cagtgagatg aggaagaagg tcttctggtg cctgtacacc attgactggt atgttgaagt 540

gaacattcat ctcgttgaca acaaagacta atacttaata gcttctctgc cgtcactttg 600

ggcctgccta agcagctcaa ggatgaggac gtccactgcg aggagcctcg tgatgctgat 660

gaggagtacg ttgacgagac cgggttcaag gcaccctgcc ctggtgagta cactagggtg 720

tctagtgccc ttgcactctt ccgtgctgct cgtattcttt ctcgggtgct ggaggaaatc 780

tatcctgctc gctcttcata cgatctctcg ctgcaacagc tttcggcgtt gtcggaagaa 840

cttgatgcct ggcacaacgg tcttgcgcca cacttgcgcc ttcctttcgc aaatgacaaa 900

cccaccgccg gaaccgtcag cagccgctct cctttgctgg tatgtcactc aggcgtcaca 960

acaatgcaat cattgactaa ttatcacagt ctttaactta ccatttcatc cgtgctctta 1020

tccaccgccc agcagtctgc gcctctcttg gcccgcgcgc ttcctcgtct gtacttgcag 1080

tggcaggatc ttctaaacac agcatccaaa ttattgaatt gctgagcgag agggggctaa 1140

gtttctcatt ctgtatcaac aaagatgagc tcctcgttct atctggattg ggacttcttt 1200

tccaaagcct ggaactcgga gagaacagca agcttgtcaa ggacaaccag aaaatgattt 1260

ccaccgttgt caagattctc acccagacca aggcaccttc cgcaacagag ttccagaaac 1320

tcaccccctc agtgccggtt gcttcaccac aacttacgac gaagcagcaa caacccagct 1380

tgtcgcgcca taactctgat ggtgctgttc atcctgtgag cttgtcgaac catggaaatg 1440

cttctccgac agaaaagaat cgattcaagg cggcagctca gagactcatg gctaagaacc 1500

ccttcgatcg ccatgacc 1518

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccacacttgg ttctgtacgt acgtcgacag aagatgacat tgaag 45

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acagctatga catgattacg tgctccatac aagccaacc 39

<210> 14

<211> 1153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccacacttgg ttctgtacgt acgtcgacag aagatgacat tgaaggagca ctttttgggc 60

ttggctggag ctagtggagg tcaacaatga atgcctattt tggtttagtc gtccaggcgg 120

tgagcacaaa atttgtgtcg tttgacaaga tggttcattt aggcaactgg tcagatcagc 180

cccacttgta gcagtagcgg cggcgctcga agtgtgactc ttattagcag acaggaacga 240

ggacattatt atcatctgct gcttggtgca cgataacttg gtgcgtttgt caagcaaggt 300

aagtgaacga cccggtcata ccttcttaag ttcgcccttc ctccctttat ttcagattca 360

atctgactta cctattctac ccaagcatcg ataagcggcc gcatgaaaaa gcctgaactc 420

accgcgacgt ctgtcgagaa gtttctgatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctgatg 480

cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat 540

gtcctgcggg taaatagctg cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac 600

tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa gtgcttgaca ttggggagtt tagcgagagc 660

ctgacctatt gcatctcccg ccgttcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc 720

gaactgcccg ctgttctaca accggtcgcg gaggctatgg atgcgatcgc tgcggccgat 780

cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca 840

tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg 900

gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag 960

gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg 1020

gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa 1080

tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcacgtaatc 1140

atgtcatagc tgt 1153

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agtggatccc ccggggaatt acctgcctga aaccgaact 39

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagaaggatt acctctaaac aagtgt 26

<210> 17

<211> 467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agtggatccc ccggggaatt acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tacaaccggt 60

cgcggaggct atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 120

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 180

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 240

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 300

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 360

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 420

gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagc 467

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgccaggca tcctaccc 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttccagacga tgggatctga g 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtcgacagaa gatgacattg aag 23

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagaaggatt acctctaaac aagtgt 26

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgcttggttc gatttgtctc tg 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcccactcct ggaagaagat g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagctacaga acctctacgg g 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaatctgaaa taaagggagg aagg 24

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

attggacctc gcaaccctag 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctgctgagg gaaggatcg 19

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gacctcgact ctagaggatc atgccaggca tcctaccc 38

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gataagcttg atatcgaatt tcacgaggct tgaagaacag 40

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctatgacatg attacgaatt cggcatccgc ttacagaca 39

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcatcttctg tcgacgaatt caggtattgc tgttatctga tgagt 45

<210> 32

<211> 4300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 60

caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcaga gatctctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 120

gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcgg agagacggac 180

ggacgcagag agaagggctg agtaataagc gccactgcgc cagacagctc tggcggctct 240

gaggtgcagt ggatgattat taatccggga ccggccgccc ctccgccccg aagtggaaag 300

gctggtgtgc ccctcgttga ccaagaatct attgcatcat cggagaatat ggagcttcat 360

cgaatcaccg gcagtaagcg aaggagaatg tgaagccagg ggtgtatagc cgtcggcgaa 420

atagcatgcc attaacctag gtacagaagt ccaattgctt ccgatctggt aaaagattca 480

cgagatagta ccttctccga agtaggtaga gcgagtaccc ggcgcgtaag ctccctaatt 540

ggcccatccg gcatctgtag ggcgtccaaa tatcgtgcct ctcctgcttt gcccggtgta 600

tgaaaccgga aaggccgctc aggagctggc cagcggcgca gaccgggaac acaagctggc 660

agtcgaccca tccggtgctc tgcactcgac ctgctgaggt ccctcagtcc ctggtaggca 720

gctttgcccc gtctgtccgc ccggtgtgtc ggcggggttg acaaggtcgt tgcgtcagtc 780

caacatttgt tgccatattt tcctgctctc cccaccagct gctcttttct tttctctttc 840

ttttcccatc ttcagtatat tcatcttccc atccaagaac ctttaatcaa gcttatcgat 900

accgtcgacc tcgactctag aggatcatgc caggcatcct acccatgaag gtcatcaagg 960

ttgggtcgag cgcccaatcc cgtattgcac aggcctgcga cagatgtcga agcaagaaga 1020

tcagatgcga cggtattcga cctagctgtt cgcaatgtac tagcgtcggg ttcgagtgca 1080

agaccagcga caaattgagc cgtcgcgcct tccccagagg atacacagag tcgcttgaag 1140

aaagagtgcg cagtctagaa gccgaagtca gagaattgaa ggagctgctc gacgagaagg 1200

acgagaagat tgacatgcta tcgaagctgc actccgcatc ctcacaatca gcatttcaga 1260

actcaccgcg gcggccgtca gcctcaccag cagctccctc accaaacaca gtcagcgaag 1320

atgtttttca agttcaacag acactccagc tcgacggcaa tggcacaaac gcccatttcg 1380

ctggcaactc aagcggaaag gccttctatg atgcctattc aaaacgagta caggaactcg 1440

gccgagcatc accagcagtc aacgttcaga atcttctacc cggaagcacc cacatcgcac 1500

ctcgcgaccc cctctcagat cccatcgtct ggaaggcacc tgccagactt gaatccgacc 1560

aattgatcgg catcttcttc caggagtggg caccactctt ccccatcctg catcgcccta 1620

ccttcctcga gctctaccag tcttacatgt ccgctcctga gaacgttgtc gataattgca 1680

gccatgctca gcttaacctt gtctttggaa ttgctgcttt atctagtggt tcacgcgaca 1740

cagctggcct tcaatcattc gagacacaat ggcaggccgc tattgatacg atactgtccg 1800

accatagcat gcctactttg cagtgccttg tcttggcaca gctatactgc atgcagcgtg 1860

gcgattatga caggcttcta acttacaagg cactcgccgt cactctttct tctagactag 1920

ggctgcatca gtcacagaag cgtttcgctc ttggtgcatc caccagtgag atgaggaaga 1980

aggtcttctg gtgcctgtac accattgact gcttctctgc cgtcactttg ggcctgccta 2040

agcagctcaa ggatgaggac gtccactgcg aggagcctcg tgatgctgat gaggagtacg 2100

ttgacgagac cgggttcaag gcaccctgcc ctggtgagta cactagggtg tctagtgccc 2160

ttgcactctt ccgtgctgct cgtattcttt ctcgggtgct ggaggaaatc tatcctgctc 2220

gctcttcata cgatctctcg ctgcaacagc tttcggcgtt gtcggaagaa cttgatgcct 2280

ggcacaacgg tcttgcgcca cacttgcgcc ttcctttcgc aaatgacaaa cccaccgccg 2340

gaaccgtcag cagccgctct cctttgctgt ctttaactta ccatttcatc cgtgctctta 2400

tccaccgccc agcagtctgc gcctctcttg gcccgcgcgc ttcctcgtct gtacttgcag 2460

tggcaggatc ttctaaacac agcatccaaa ttattgaatt gctgagcgag agggggctaa 2520

gtttctcatt ctgtatcaac aaagatgagc tcctcgttct atctggattg ggacttcttt 2580

tccaaagcct ggaactcgga gagaacagca agcttgtcaa ggacaaccag aaaatgattt 2640

ccaccgttgt caagattctc acccagacca aggcaccttc cgcaacagag ttccagaaac 2700

tcaccccctc agtgccggtt gcttcaccac aacttacgac gaagcagcaa caacccagct 2760

tgtcgcgcca taactctgat ggtgctgttc atcctgtgag cttgtcgaac catggaaatg 2820

cttctccgac agaaaagaat cgattcaagg cggcagctca gagactcatg gctaagaacc 2880

ccttcgatcg ccatgaccaa agacgggcaa ccttcccaaa catttcgctg catcacaatg 2940

cgatccagac ccagagccag cccaatatac cccaggtcgc gacttctgaa cccgcataca 3000

gccccgccaa tccttccccc gcaccactcc ccgtatccgc ccgaccctca gcgccaccaa 3060

accttagacc agttcgatcc ttccctcagc agcagctcaa cctagactac ctctccttca 3120

gcaacgttcc tacccgtacg cactcacctg attctcacgc ctccatcaag caggaacctt 3180

cggattggga acgtttgctc ggctcgctgg acaacggaca gactaatatc ttcgacaaca 3240

tctatggcgg gccacctgtt gagttccttg acgcccagca ccaccaaaat gcaaagcaca 3300

tgacgcccat ggcttcaagc ttacccaacc cggttcccca gtggcaccat tcaccccctg 3360

acgtctgggc tgtcacaaat tccgacatca atgccatgac ttgcagcatg gctggtagta 3420

tcgcgcatcc cgaaagtgtc ttcagcatcg gcaccgacga cgatggcact gctaccggtg 3480

acgagctctt tggcaatgat tggggcagtg ccagcagcac caacggcgaa gcctaccatg 3540

caggcattat tatgccacaa ctgactcccg acgagcacag catgttgagc agcatgtgga 3600

gcgagagcac tgctgttctt caagcctcgt gaaattcgat atcaagctta tcgataccgt 3660

cgacctcgag ggggggcccg gtaccgcccc gtccggtcct gcccgtcacc gagatccact 3720

taacgttact gaaatcatca aacagcttga cgaatctgga tataagatcg ttggtgtcga 3780

tgtcagctcc ggagttgaga caaatggtgt tcaggatctc gataagatac gttcatttgt 3840

ccaagcagca aagagtgcct tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa gaataaaacg 3900

cgtttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcatgacgt tatttatgag 3960

atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 4020

atagcgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg 4080

ctcgaaggct ttaatttgca agctttgaag aaaaatgcgc cttattcaat ctttgctata 4140

aaaaatggcc caaaatctca cattggaaga catttgatga cctcatttct ttcaatgaag 4200

ggcctaacgg agttgactaa tgttgtggga aattggagcg ataagcgtgc ttctgccgtg 4260

gccaggacaa cgtatactca tcagataaca gcaatacctg 4300

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cggcatccgc ttacagaca 19

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caggtattgc tgttatctga tgagt 25

Claims

1.出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) 碳响应转录因子Cat8，其特征在于：所述碳响应转录因子Cat8的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因序列，其特征在于：所述编码碳响应转录因子Cat8的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因序列，其特征在于：所述编码碳响应转录因子Cat8的编码区序列如SEQ ID NO.4所示。

4.含有编码权利要求1所述出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：编码所述碳响应转录因子Cat8的基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.权利要求4或5所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因序列，然后连入过表达载体pBARGPE1的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8和trpC终止子的表达框，连入pk2-hyg的EcoR I酶切位点处即可。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：扩增编码出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8的基因序列的方法如下：以SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示序列为引物，出芽短梗霉基因组DNA为模板PCR扩增而得；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8和trpC终止子的表达框的引物如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示。

8.权利要求1~3任一项中所述出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。

9.权利要求4或5所述重组表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。