CN111206011B

CN111206011B - 一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产l-谷氨酸中的应用

Info

Publication number: CN111206011B
Application number: CN202010147933.9A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 乔郅钠; 徐美娟; 龙梦飞; 杨套伟; 张显; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2020-03-05
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-03-05
Also published as: CN111206011A

Abstract

本发明公开了一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L‑谷氨酸中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产L‑谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW‑10‑ppc，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW‑10‑ppc接种至5‑L发酵罐中发酵48h，即可使发酵液中L‑谷氨酸的产量高达136.09±5.53g/L、糖酸转化率高达58.9％，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01提高了45.5％和13.7％。

Description

一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，在多个领域均具有广泛应用。例如，L-谷氨酸具有较浓的鲜味，可作为调味剂应用于食品行业；L-谷氨酸可用于合成表面活性剂，在化妆品领域具有重要的应用；L-谷氨酸被人体吸收后，易与血氨形成谷酰胺，能解除代谢过程中氨的毒害作用，可作为肝脏病患者的辅助药物在医药领域具有重要的应用，并且，L-谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。

L-谷氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法这三种，其中，蛋白水解法具有操作复杂、费时费力、成本高和产物产量低等缺陷，化学合成法则存在严重的环境污染问题，因此，两者都不适合大规模的生产。与蛋白水解法和化学合成法相比，利用微生物发酵法生产L-谷氨酸具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优势，因此，目前工业上常利用微生物发酵法生产L-谷氨酸。

但是，现有的微生物发酵法仍具有一定缺陷，其中，产量低是限制L-谷氨酸的工业化生产进程的缺陷之一。例如，王楠楠等人将重组菌株SNW201接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达46.7g/L(具体可见参考文献：Wang,N.,Ni,Y.,Shi,F.,Deletion of odhA or pyc improves production of gamma-aminobutyric acid andits precursor L-glutamate in recombinant Corynebacteriumglutamicum.BiotechnolLett.2015,37,1473-1481.)；鲍杰等人将C.glutamicum XW6菌株接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达65.2g/L(具体可见参考文献：Jingbai,Wen,Jie,et al.Engineering Corynebacterium glutamicum triggersglutamic acid accumulation in biotin-rich corn stover hydrolysate.[J].Biotechnology for biofuels,2019.)；吴新世等人将LG-01接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中L-谷氨酸的产量达106.10g/L(具体可见参考文献：吴新世,王楠,彭湲,等.一株产谷氨酸菌株的复合诱变选育及突变株的生物学特性[J].天津理工大学学报,2012,28(1):83-88.)。因此，急需找到一种可高产L-谷氨酸的L-谷氨酸生产菌株以克服现有微生物发酵法缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。

在本发明的一种实施方式中，所述α-酮戊二酸复合体E3亚基的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQID No.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且以pJYW-4质粒、pEC-XK99E质粒或pDXW-10质粒为载体表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。

本发明还提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法为先将上述重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为28～31℃、转速为500～600rpm、pH为7.0～7.2。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600rpm、pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、三水合磷酸氢二钾1.0～1.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.6g/L、玉米浆2.5～5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005～0.008g/L、一水合硫酸锰0.005～0.008g/L以及尿素5.5～7.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L以及尿素7.0g/L。

本发明还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌或上述方法在生产L-谷氨酸中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种可高产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc接种至5-L发酵罐中发酵48h，即可使发酵液中L-谷氨酸的产量高达136.09±5.53g/L、糖酸转化率高达58.9％，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01提高了45.5％和13.7％。

附图说明

图1：敲弱质粒pFSC-dCas9-S3的构建示意图。

图2：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中α-酮戊二酸复合体E3亚基LDP的酶活水平。

图3：不同谷氨酸棒杆菌的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc的转录水平。

图4：不同谷氨酸棒杆菌的菌落PCR验证结果；其中，M为10000bp核酸Marker，1～2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01，泳道条带为dCas9-Ptrc-S3融合片段。

图5：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液的菌体量。

图6：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量。

图7：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中葡萄糖的含量。

图8：不同谷氨酸棒杆菌的菌落PCR验证结果；其中，M为10000bp核酸Marker，1～2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc，泳道条带为ppc基因。

图9：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的细胞破碎上清液的凝胶电泳图；其中，M为蛋白Marker，1为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01，2为重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumG01/pDXW-10-ppc。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的pFSC-dCas9、pFST质粒、pDXW-10质粒、pJYW-4质粒和pEC-XK99E质粒均购自BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01记载于文献“Efficient one-steppreparation ofγ-aminobutyric acid from glucose without an exogenous cofactorby the designed Corynebacterium glutamicum”中，保藏编号为CCTCC No:M 2013418；下述实施例中涉及的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01记载于公开号为CN103215198A的专利申请文本中(谷氨酸棒杆菌G01已进行过保藏，无需再次进行专利程序上的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

LBG液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖。

LBG固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖、琼脂粉15g/L。

谷氨酸棒杆菌感受态培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖、1g/L吐温-80、3g/L甘氨酸。

种子培养基：25g/L葡萄糖、1.5g/L K₂HPO₄·3H₂0、0.6g/LMgSO₄、30g/L玉米浆、2.5g/L尿素、0.005g/L FeSO₄.·7H₂O、0.005g/L MnSO₄·4H₂O，pH为7.0。

发酵培养基：葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L、尿素7.0g/L，pH为7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

葡萄糖含量、L-谷氨酸含量和糖酸转化率的测定：采用Bio-SBA生物分析仪分析发酵液中葡萄糖和L-谷氨酸的含量，吸取25μL的标准液SBA进行标定，标定结束，取1mL发酵液进行稀释后，吸取25μL稀释后的发酵液进行测定，记录数据；

糖酸转化率的计算公式如下：

式中：η：糖酸转化率；C_L-谷氨酸：发酵结束后发酵罐中L-谷氨酸的浓度，g/L；C₀：初糖浓度，g/L；C_葡萄糖：发酵结束后发酵罐中葡萄糖浓度，g/L；V₁：消耗80％葡萄糖溶液的体积，L；V：下罐前发酵液体积，L。

菌体浓度的测定：使用UV-2000Z紫外可见分光光度计测定在600nm处的吸光值。

LPD酶活的测定方法：在EP管中加入2.7mL浓度为50mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液，将磷酸盐缓冲液于30℃水浴锅中保温10min后，依次在磷酸盐缓冲液中加入0.1mL浓度为0.003mol/L硫辛酰胺、0.1mL浓度为0.002mol/LNADH和0.1mL粗酶液，立即混匀，用紫外可见分光光度计于340nm处检测吸光度，每5min读数1次，连续测15min，根据340nm处吸光度的变化值得到酶活；

其中，LPD酶活的计算公式如下：

式中：ΔA₃₄₀：吸光度变化；V：反应体系的体积，mL；V₀：加入的粗酶液体积，mL；6.22为摩尔吸光系数；0.5为比色皿光程；

LPD酶活的定义为：将在上述反应条件下每min氧化1μmol NADH所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。

PEPC酶活测定方法：采用苹果酸脱氢酶偶联测定法，构建1mL反应体系，反应体系含5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸PEP、5mmol/LNaHCO₃、50mmol/LHEPES、10mmol/LMgCl₂、4mmol/LNADH、8U/mL苹果酸脱氢酶和1mL粗酶液；用紫外分光光度计于340nm处检测吸光度，并根据340nm处吸光度的变化值得到酶活；

其中，PEPC酶活的计算公式如下：

PEPC酶活的定义为：在上述反应条件下每min氧化1μmol NADH所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。

实施例1：敲弱质粒的构建及选择

构建过程见图1，具体步骤如下：

(1)分别从甘油管中蘸取谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的菌液接种至种子培养基中，于30℃、180r/min的条件下培养18h至对数生长期，得到培养液；将培养液于-4℃、6000r/min离心10min，收集菌体；将菌体液氮冻存10min后，置于-80℃冰箱储存，送苏州金唯智有限公司进行总RNA提取、总RNA-seq和重测序分析；对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的中心代谢路径相关基因进行集中分析，发现α-酮戊二酸脱氢酶复合体ODHC的E3亚基编码基因lpd和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc在转录水平和基因水平上均发生变化，且谷氨酸中产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01中lpd基因表达量明显高于谷氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01；根据集中分析的结果，选定谷氨酸中产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01进行lpd基因弱化实验。

(2)以质粒pFSC-dCas9为模板，以dCas9-F和dCas9-Ptrc-R1为引物进行PCR，扩增出含Ptrc部分片段的dCas9基因(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)片段；以pFST质粒为模板，分别以sgRNA-F和sgRNA-R为引物进行PCR，扩增获得含不同N20序列(N20:1～N20:5)的sgRNA片段；将扩增得到的含不同N20序列(N20:1～N20:5)的sgRNA片段胶回收后分别与经EcoRI酶切获得的pFST线性化载体在同源重组酶的作用下进行连接，得到连接产物；将各连接产物分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pFST-S1、pFST-S2、pFST-S3、pFST-S4、pFST-S5；其中，引物如下：

dCas9-F:GAAACAGAATTAATT

AAAGGAGGACAACTAATGGATAAAAAGTATTCCATTGGCCTGGCA(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)；

dCas9-Ptrc-R1:TGCACCGTGCAGTCGTTAGTCGCCACCCAG(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)；

sgRNA-F:AGGAAACAGACCATG

-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)；

sgRNA-R:TCCGCCAAAACAGCC

AAAAAAGCACCGACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTT(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)；

N20:1-TAGTACTCGGAGCCGGCCCC(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)；

N20:2-CGGATGCACGACAATGACCC(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)；

N20:3-ACACCTGCATTTCTGTGCCC(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)；

N20:4-AAACACGTATCCTTGAATGC(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)；

N20:5-ATGGAAAACCAACCGCACCC(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)；

dCas9-P_trc-F1:CTGGGTGGCGACTAACGACTGCACGGTGCA(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)；

dCas9-P_trc-R:CAAAACAGCCAAGCT

AAAAAAGCACCGACCGACTCGG(核苷酸序列如SEQ ID No.16所示)。

(3)分别以含P_trc部分片段的dCas9基因片段和pFST-S1重组质粒、含P_trc部分片段的dCas9基因片段和pFST-S2重组质粒、含P_trc部分片段的dCas9基因片段和pFST-S3重组质粒、含P_trc部分片段的dCas9基因片段和pFST-S4重组质粒、含P_trc部分片段的dCas9基因片段和pFST-S5重组质粒为模板进行融合PCR，获得含dCas9-P_trc-sgRNA的融合片段；将含dCas9-P_trc-sgRNA的融合片段胶回收后的各融合片段与经EcoRI和HindIII双酶切获得的pFSC-dCas9线性化载体在同源重组酶的作用下进行连接，得到连接产物；将各连接产物分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至含50μg·mL^-1氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pFSC-dCas9-S1、pFSC-dCas9-S2、pFSC-dCas9-S3、pFSC-dCas9-S4和pFSC-dCas9-S5。

(4)将重组质粒pFSC-dCas9-S1、pFSC-dCas9-S2、pFSC-dCas9-S3、pFSC-dCas9-S4和pFSC-dCas9-S5分别电谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01，得到转化产物；将转化产物涂布于含50μg·mL^-1氯霉素的LBG固体培养基平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子在含50μg·mL^-1氯霉素的LBG固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；将单菌落进行PCR验证，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5。

(5)以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01为对照，将重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5接种至LBG培养基中，于30℃、180r/min的条件下培养18h至对数生长期，得到发酵液；根据FastPure Cell/Tissue Total RNAIsolation Kit的使用说明书提取发酵液中的RNA；使用HiScript Q Setect RT SuperMix for qPCR试剂盒提取得到的RNA(1μg)转录成cDNA；使用ABI QuantStudio^TM3D通过实时PCR定量lpd基因mRNA转录水平；以RNase-free ddH₂O作为阴性对照，验证Mix和引物有无污染，以基因组DNA作为阳性对照，验证提取的cDNA有无污染，以确保数据准确可靠；

其中，实时PCR定量的反应体系(20μL)含有：10μL 2×ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix和各0.4μL基因的上下游引物；

实时PCR定量的引入如下：

lpd-F:CGTTGGAGGCGTTCATTA(核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)；

lpd-R:GGAGACTTCAGCATCTTCAT(核苷酸序列如SEQ ID No.18所示)。

检测重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5发酵获得的发酵液中LPD的酶活(检测结果见图2)，并且，通过RT-qPCR检测重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5中lpd基因的相对mRNA转录水平(检测结果见图3)。

从图2中可以看出，LPD敲弱后的重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5发酵获得的发酵液中LPD酶活分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01下降了3.1％、5.4％、21.1％、3.0％和6.0％。

从图3中可以看出，LPD敲弱后的重组谷氨酸棒杆菌CG1、CG2、CG3、CG4、和CG5中lpd基因的表达水平均较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01呈现一定程度的降低，其中，重组谷氨酸棒杆菌CG3中lpd基因转录水平最低。

综合图2-3可以看出，sgRNA-3对lpd基因的弱化程度更高，应选择sgRNA-3来实现lpd基因在C.glutamicum G01中的弱化，即应以pFSC-dCas9-S3作为敲弱质粒。

实施例2：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01的构建与发酵

具体步骤如下：

将实施例1获得的敲弱质粒pFSC-dCas9-S3电转谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01，得到转化产物；将转化产物涂布于添加氯霉素的LBG培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子在添加氯霉素的LBG培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；以dCas9-F和sgRNA-R为引物进行菌落PCR验证(验证结果见图4)，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01；以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01的单菌落接种至种子培养基中，于温度为30℃、转速为180r/min的条件下摇床培养18h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，于温度为30℃、转速为600r/min的条件下发酵48h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔6h检测发酵液中的菌体量(检测结果见图5)，并且，检测发酵液中L-谷氨酸的产量(检测结果见图6)以及葡萄糖含量(检测结果见图7)，检测结果为：野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为93.53±4.52g/L、糖酸转化率为45.2％；重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为123.86±4.75g/L、糖酸转化率为56.1％，均较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01有了明显的提高，但菌体生长速率较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01慢。可见，lpd基因的弱化表达减弱了野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的α-酮戊二酸下游代谢通量，影响了野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的生长，降低了野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的耗糖速率，提高了野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的糖酸转化率，同时，使得野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01中更多的α-酮戊二酸用于进行L-谷氨酸的生产，L-谷氨酸产量得到改善。

实施例3：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc的构建与发酵

具体步骤如下：

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的基因组为模板，以pDXW-10-ppc-F、pDXW-10-ppc-R为引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如如SEQ ID No.4所示的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc；将此编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc与pDXW-10质粒经限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒pDXW-10-ppc；其中，引物如下：

pDXW-10-ppc-F:TTCACACAGGAAACA

AAAGGAGGGAAATCATGACTGATTTTTTACGCGATGACA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)；

pDXW-10-ppc-R:CATCCGCCAAAACAG

TTAGCCGGAGTTGCGCAGCGCA(核苷酸序列如SEQ ID No.20所示)。

将重组质粒pDXW-10-ppc电转谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，得到转化产物；将转化产物涂布于含50μg·mL^-1卡那霉素的LBG培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子在含50μg·mL^-1卡那霉素的LBG培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；将单菌落进行PCR验证(验证结果见图8)，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc。

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc的单菌落接种至LBG液体培养基中，于30℃、180r/min培养18h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)接种量接种至LBG液体培养基中，于30℃、180r/min培养5h后，在LBG液体培养基中添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于30℃、180r/min诱导表达12h，得到发酵液；发酵液4℃下离心，收集菌体；将菌体用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，重新悬浮于浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液至菌体浓度为OD₆₀₀＝15，得到菌液；将菌液利用超声破碎仪破碎，得到破碎液；将破碎液在4℃下离心20min，收集上清，此上清即为细胞破碎上清液。

对细胞破碎上清液进行SDS-PAGE分析(分析结果见图9)，检测PEPC的的表达情况与酶活，发酵过程中，间隔6h检测发酵液中的菌体量，并且，检测发酵液中L-谷氨酸的产量以葡萄糖含量，检测结果为：在控制菌体浓度一致的条件下，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc发酵获得的细胞破碎上清液中，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc发酵获得的细胞破碎上清液中PEPC的表达量均明显高于野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，其发酵获得的细胞破碎上清液中PEPC蛋白的大小约为103.2kDa，即PEPC在C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc中成功表达；重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc发酵获得的细胞破碎上清液PEPC的酶活为172.89±7.23U/mL，较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的38.52±2.87U/mL提高了3.5倍；重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc的菌体生长速率较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01有所提高；野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为93.53±4.52g/L、糖酸转化率为45.2％，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pDXW-10-ppc发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为108.31±1.72g/L、糖酸转化率为48.5％，均较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01有了明显的提高。可见，ppc基因的表达改善了野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的L-谷氨酸产量。

实施例4：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc的构建与发酵

具体步骤如下：

将重组质粒pDXW-10-ppc电转重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01，得到转化产物；将转化产物涂布于添加卡那霉素和氯霉素的LBG培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子在添加卡那霉素和氯霉素的LBG培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；将单菌落进行PCR验证，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc。

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc的单菌落接种至LBG液体培养基中，于30℃、180r/min培养18h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)接种量接种至LBG液体培养基中，于30℃、180r/min培养5h后，在LBG液体培养基中添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于30℃、180r/min诱导表达12h，得到发酵液；发酵液4℃下离心，收集菌体；将菌体用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，重新悬浮于浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液至菌体浓度为OD₆₀₀＝15，得到菌液；将菌液利用超声破碎仪破碎，得到破碎液；将破碎液在4℃下离心20min，收集上清，此上清即为细胞破碎上清液。

检测细胞破碎上清液中LPD和PEPC的酶活，并且，检测发酵液中L-谷氨酸的产量以及糖酸转化率，检测结果为：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc发酵获得的细胞破碎上清液PEPC的酶活为162.64±5.18U/mL，较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的38.52±2.87U/mL提高了3.2倍；重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc发酵获得的细胞破碎上清液LPD的酶活为58.7U/mL，较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的72.3U/mL下降了18.8％。

实施例5：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc的应用

具体步骤如下：

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，挑取实施例1获得的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc的单菌落接种至种子培养基中，于温度为30℃、转速为180r/min的条件下摇床培养18h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，于温度为30℃、转速为600r/min、通气量为1vvm的条件下发酵96h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔6h检测发酵液中的菌体量(检测结果见图5)，并且，检测发酵液中L-谷氨酸的产量(检测结果见图6)以及葡萄糖含量(检测结果见图7)，检测结果为：C.glutamicum DL01/pDXW-10-ppc发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量高达136.09±5.53g/L、糖酸转化率高达58.9％，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01提高了45.5％和13.7％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Glu His Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Ser Ala Ile Arg Ala Ala Gln Leu Gly Lys Lys Val Ala Val

20 25 30

Ile Glu Lys Gln Tyr Trp Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile

35 40 45

Pro Ser Lys Ser Leu Ile Lys Asn Ala Glu Val Ala His Thr Phe Thr

50 55 60

His Glu Arg Lys Thr Phe Gly Ile Asn Gly Glu Val Thr Phe Asn Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Ala His Lys Arg Ser Arg Gly Val Ser Asp Lys Ile Val Gly

85 90 95

Gly Val His Tyr Leu Met Lys Lys Asn Lys Ile Thr Glu Ile His Gly

100 105 110

Leu Gly Asn Phe Lys Asp Ala Lys Thr Ile Glu Val Ala Asp Gly Lys

115 120 125

Asp Ala Gly Lys Thr Val Thr Phe Asp Asp Cys Ile Ile Ala Thr Gly

130 135 140

Ser Val Val Asn Thr Leu Arg Gly Val Glu Phe Ser Glu Asn Val Val

145 150 155 160

Ser Tyr Glu Glu Gln Ile Leu Asn Pro Val Ala Pro Lys Lys Met Val

165 170 175

Ile Val Gly Ala Gly Ala Ile Gly Met Glu Phe Ala Tyr Val Leu Gly

180 185 190

Asn Tyr Gly Val Asp Val Thr Val Ile Glu Phe Met Asp Arg Val Leu

195 200 205

Pro Asn Glu Asp Ala Glu Val Ser Lys Val Ile Ala Lys Ala Tyr Lys

210 215 220

Lys Met Gly Val Lys Leu Leu Pro Gly His Ala Thr Thr Ala Val Arg

225 230 235 240

Asp Asn Gly Asp Phe Val Glu Val Asp Tyr Gln Lys Lys Gly Ser Asp

245 250 255

Lys Thr Glu Thr Leu Thr Val Asp Arg Val Met Val Ser Val Gly Phe

260 265 270

Arg Pro Arg Val Glu Gly Phe Gly Leu Glu Asn Thr Gly Val Lys Leu

275 280 285

Thr Glu Arg Gly Ala Ile Asp Ile Asp Asp Tyr Met Arg Thr Asn Val

290 295 300

Pro Gly Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Val Thr Ala Lys Leu Gln Leu Ala

305 310 315 320

His Val Ala Glu Ala Gln Gly Ile Val Ala Ala Glu Thr Ile Ala Gly

325 330 335

Ala Glu Thr Gln Ala Leu Gly Asp Tyr Met Met Met Pro Arg Ala Thr

340 345 350

Phe Cys Asn Pro Gln Val Ala Ser Phe Gly Tyr Thr Glu Glu Gln Ala

355 360 365

Lys Gln Lys Trp Pro Asp Arg Glu Ile Lys Val Ala Ser Phe Pro Phe

370 375 380

Ser Ala Asn Gly Lys Ala Val Gly Leu Ala Glu Thr Asp Gly Phe Ala

385 390 395 400

Lys Ile Val Ala Asp Ala Glu Phe Gly Glu Leu Leu Gly Ala His Leu

405 410 415

Val Gly Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ile Asn Glu Leu Val Leu Ala Gln

420 425 430

Asn Trp Asp Leu Thr Thr Glu Glu Ile Ser Arg Ser Val His Ile His

435 440 445

Pro Thr Leu Ser Glu Ala Val Lys Glu Ala Ala His Gly Ile Ser Gly

450 455 460

His Met Ile Asn Phe

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgactgaac attatgacgt agtagtactc ggagccggcc ccggtggcta tgtctccgcc 60

atccgtgcag cgcagcttgg caagaaggtt gctgtaattg agaagcagta ctggggtggt 120

gtttgcctaa acgtgggctg cattccttcc aagtctctga tcaaaaacgc tgaagttgcc 180

cataccttta cccatgagag gaagaccttc ggcatcaatg gcgaagtgac cttcaactat 240

gaggatgctc acaagcgttc ccgtggcgtt tccgacaaga tcgttggagg cgttcattac 300

ttgatgaaga agaacaagat caccgaaatt catggtcttg gaaacttcaa ggatgctaag 360

actattgagg tcgccgacgg taaggatgct ggcaagaccg tcacctttga tgactgcatc 420

atcgcaaccg gttcggtagt caacaccctc cgtggcgttg aattctcaga gaacgttgtg 480

tcttatgaag agcagattct taaccctgtt gcgccaaaga agatggtcat tgttggtgca 540

ggcgcaattg gaatggaatt cgcctacgtt cttggtaact acggtgtaga tgtaaccgtc 600

atcgagttca tggatcgtgt gcttccaaat gaagatgctg aagtctccaa ggttattgca 660

aaggcctaca agaagatggg cgttaagctt cttcctggcc atgcaaccac tgctgttcgg 720

gacaacggtg actttgtcga ggttgattac cagaagaagg gctctgacaa gacagagact 780

cttactgttg atcgagtcat ggtttccgtt ggtttccgtc cacgcgttga gggatttggt 840

cttgaaaaca ctggcgttaa gctcaccgag cgtggcgcaa tcgacatcga tgattacatg 900

cgtaccaacg ttcctggcat ttacgccatc ggtgacgtga ccgccaagct tcagcttgct 960

cacgtcgcag aagcacaggg cattgttgcc gcagagacta ttgctggtgc agaaactcag 1020

gctcttggtg attacatgat gatgccacgt gcaaccttct gcaacccaca ggttgcttcc 1080

tttggttaca ccgaagagca ggccaagcag aagtggccag atcgtgagat caaggttgct 1140

tccttcccat tctctgcaaa cggtaaagca gttggcctgg cagaaactga tggtttcgca 1200

aagatcgttg ctgatgcaga attcggtgag ctgctcggtg cacacctggt tggagcaaat 1260

gcatcagagc tcatcaatga attggtgctt gctcagaact gggatctcac cactgaagag 1320

atctctcgta gcgtccatat tcacccaacg ctatctgagg cagttaagga agctgcacac 1380

ggtatctctg gacacatgat caacttctag 1410

<210> 3

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Arg Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu His Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Gly Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr Arg Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Glu Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Glu Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Thr Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Thr Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Gly Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Lys Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

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Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Thr

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Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Phe Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile His Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915

<210> 4

<211> 2759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc gaatcctcgg tgaggtaatt 60

gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120

gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180

ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240

gcggaagacc tccacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300

ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360

gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420

gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480

cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540

gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600

cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660

gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720

gatgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780

aacccttatg tcaccgcggg cacagttgag tattccactc gccgcgctgc ggaaaccgtg 840

ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900

atgaatgagg tcaccccgca gctgcttgag ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960

agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020

acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080

ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140

gaatccactg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200

agctttggat tcaaccttta ctcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260

gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccacaa actaccgcga gctgtctgaa 1320

gaagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380

ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440

gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500

tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560

aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620

ctccgggccg gcgccggaat cctcggcgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680

ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740

ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800

tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860

ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca agggggctgt ccaaggttcc 1920

gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980

cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040

gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100

aagaagtaca cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160

acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220

acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280

gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcatttg agcagtggat tggcgaaggg 2340

gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400

acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460

ctctacgcag acctgatccc agatagggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccac 2520

gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580

gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640

aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700

tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggcta 2759

<210> 5

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggataaaa agtattccat tggcctggcg atcggcacca attctgtggg ttgggcagtc 60

atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tgctcggtaa taccgatcgc 120

cactctatca agaaaaacct gatcggcgcc ctgctcttcg actccggcga aaccgcagaa 180

gcaacccgtc tcaagcgtac cgcacgtcgc cgctacaccc gccgtaagaa tcgcatctgc 240

tacctccagg aaatcttctc taatgagatg gcaaaggtgg atgactcctt tttccaccgc 300

ctcgaagagt ccttcctggt ggaagaggac aagaaacacg agcgccatcc tatcttcggc 360

aatattgtcg atgaagtcgc atatcatgaa aaatacccaa ccatttacca tctccgtaaa 420

aaactcgtcg attccaccga taaggcagat ctccgcctga tctatctggc actggcccac 480

atgatcaagt ttcgtggcca cttcctgatc gaaggtgacc tcaatccaga caattccgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcaa acctacaacc agctctttga ggaaaaccca 600

atcaacgcat ctggcgtcga cgcaaaagcc atcctgtccg cccgtctctc caagtctcgt 660

cgcctcgaaa acctcattgc ccagctccct ggcgagaaga aaaacggtct gttcggcaat 720

ctgatcgccc tgtctctggg tctgacccca aatttcaaat ccaactttga tctcgcagaa 780

gatgccaagc tgcagctctc taaggacacc tacgatgatg acctggataa cctcctcgcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgatctcttc ctcgcagcca agaacctctc tgacgcaatt 900

ctgctgtccg acatcctgcg cgtgaacacc gaaatcacta aggcaccact ctctgcctcc 960

atgattaagc gctacgacga gcatcatcag gatctcactc tcctcaaagc cctggtccgc 1020

cagcagctcc cagagaagta caaggaaatc tttttcgacc aatccaaaaa cggctacgca 1080

ggttacatcg atggcggcgc ctctcaggaa gagttttaca aattcattaa gccaatcctc 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctg gtgaaactca accgtgaaga tctcctgcgc 1200

aaacagcgca ccttcgacaa cggttccatt cctcaccaga tccacctggg cgaactgcac 1260

gcaatcctcc gccgtcaaga ggacttctac ccattcctga aggacaaccg tgaaaagatc 1320

gaaaagattc tcaccttccg catcccttac tacgtgggtc ctctcgcccg tggcaattcc 1380

cgcttcgcct ggatgactcg caaatctgaa gagaccatca ccccttggaa ctttgaggaa 1440

gtcgtcgata aaggcgcctc tgcccaatcc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctcccaa acgagaaagt gctgcctaag cattccctcc tgtacgagta ctttactgtc 1560

tacaatgagc tgactaaggt gaagtatgtc actgaaggca tgcgtaagcc agcctttctc 1620

tccggcgagc agaaaaaggc aatcgtcgac ctcctgttta aaaccaaccg caaagtgact 1680

gtgaaacagc tcaaggaaga ttactttaaa aaaatcgaat gcttcgattc tgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aggatcgttt caacgcctcc ctgggtacct atcacgacct cctgaagatt 1800

atcaaggaca aagattttct ggataacgag gaaaacgagg acattctcga ggacattgtg 1860

ctgaccctga ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctatgcc 1920

cacctctttg acgacaaggt catgaagcaa ctcaagcgcc gccgctatac cggttggggc 1980

cgtctctccc gtaagctcat caatggtatc cgcgacaagc aatccggcaa gactatcctg 2040

gactttctga agtctgacgg cttcgccaac cgcaatttta tgcaactgat ccacgacgat 2100

tccctgacct tcaaagagga catccagaaa gcccaagtgt ccggtcaagg cgactccctg 2160

cacgaacaca tcgccaatct ggcaggttcc ccagcaatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtcaaggtgg tggacgaact cgtcaaagtg atgggtcgcc acaaaccaga aaacatcgtc 2280

atcgagatgg cccgtgagaa ccagaccacc cagaaaggcc agaaaaactc ccgtgagcgc 2340

atgaagcgca ttgaagaagg cattaaagag ctcggctctc agatcctgaa agagcatcct 2400

gtcgagaaca cccaactgca gaatgagaag ctgtatctgt attatctcca gaacggccgc 2460

gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aaccgtctct ctgattacga tgtggacgcg 2520

atcgtccctc agtctttcct gaaagacgac tctattgaca acaaagtcct cacccgctcc 2580

gacaagaacc gcggcaagtc cgataacgtg ccatccgagg aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctgct caacgccaag ctgatcactc agcgcaagtt cgataacctg 2700

accaaggccg aacgtggtgg tctctccgag ctcgacaagg caggctttat caagcgccaa 2760

ctcgtggaga ctcgccaaat cactaaacac gtcgcccaga tcctcgactc ccgcatgaat 2820

accaagtacg atgaaaatga caagctcatc cgcgaagtga aagtcattac cctgaagtcc 2880

aaactggtct ctgactttcg caaggatttc cagttctaca aggtccgcga gattaataac 2940

tatcatcatg cacacgatgc atacctcaac gcagtcgtgg gtaccgcact gatcaagaag 3000

taccctaaac tggagtccga gttcgtctat ggcgactaca aggtgtacga cgtccgcaaa 3060

atgattgcca agtccgagca ggagatcggc aaagcaactg ccaaatattt cttttactcc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accctcgcca acggtgaaat ccgcaaacgt 3180

ccactcatcg agactaatgg tgaaaccggc gagatcgtct gggacaaggg ccgtgacttc 3240

gcaaccgtcc gcaaggtcct ctccatgcca caggtcaaca tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

caaaccggcg gcttctccaa ggagtctatc ctgcctaaac gcaattccga taagctcatt 3360

gcacgcaaaa aggactggga ccctaaaaaa tacggcggtt tcgactcccc aactgtcgca 3420

tattctgtgc tcgtggtcgc caaagtggaa aagggcaaat ccaaaaagct caagtccgtc 3480

aaggaactcc tgggtatcac catcatggaa cgctcctcct ttgagaagaa ccctatcgat 3540

ttcctcgaag caaaaggtta caaggaggtg aagaaagatc tgatcatcaa gctccctaaa 3600

tactccctct tcgagctcga gaacggccgc aagcgtatgc tggcctccgc aggtgaactg 3660

caaaaaggta acgagctggc actcccatcc aagtatgtca actttctcta cctggcctcc 3720

cactacgaaa agctgaaagg ttccccagaa gacaacgagc agaaacagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gagcagatct ccgagttctc taaacgcgtc 3840

attctggccg atgccaacct cgataaagtg ctctccgcct acaataagca tcgtgataag 3900

ccaatccgtg agcaggcaga gaacatcatt cacctgttca ctctcaccaa cctgggtgca 3960

ccagccgcct ttaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctatac ctccactaag 4020

gaggtgctcg atgcaaccct gatccaccag tctatcaccg gcctctacga gactcgcatc 4080

gatctctccc agctgggtgg cgactaa 4107

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaacagaat taattaagct taaaggagga caactaatgg ataaaaagta ttccattggc 60

ctggca 66

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcaccgtgc agtcgttagt cgccacccag 30

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

aggaaacaga ccatggaatt cngttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 60

tcc 63

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tccgccaaaa cagccaagct taaaaaagca ccgaccgact cggtgccact ttttcaagtt 60

gataacggac tagccttatt t 81

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tagtactcgg agccggcccc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggatgcacg acaatgaccc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acacctgcat ttctgtgccc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaacacgtat ccttgaatgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atggaaaacc aaccgcaccc 20

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctgggtggcg actaacgact gcacggtgca 30

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caaaacagcc aagctgaatt caaaaaagca ccgaccgact cgg 43

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgttggaggc gttcatta 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggagacttca gcatcttcat 20

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcacacagg aaacagaatt caaaggaggg aaatcatgac tgatttttta cgcgatgaca 60

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catccgccaa aacagaagct tttagccgga gttgcgcagc gca 43

Claims

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以保藏编号为CCTCCM 2013418的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）G01为宿主，敲弱编码α-酮戊二酸复合体E3亚基的基因lpd，且以pDXW-10质粒为载体表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc；所述α-酮戊二酸复合体E3亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。

3.如权利要求2所述的一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为28~31℃、转速为500~600 rpm、pH为7.0~7.2。

4.如权利要求2所述的一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600 rpm、pH为7.0。

5.如权利要求2-4任一所述的一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120~150g/L、三水合磷酸氢二钾1.0~1.5 g/L、七水合硫酸镁0.2~0.6 g/L、玉米浆2.5~5.0 g/L、七水合硫酸亚铁0.005~0.008 g/L、一水合硫酸锰0.005~0.008 g/L以及尿素5.5~7.0 g/L。

6.如权利要求2-4任一所述的一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5 g/L、七水合硫酸镁0.6 g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005 g/L、一水合硫酸锰0.005 g/L以及尿素7.0 g/L。

7.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌或权利要求2-6任一所述的方法在生产L-谷氨酸中的应用。