CN102827851B

CN102827851B - 一种酮还原酶基因及其应用

Info

Publication number: CN102827851B
Application number: CN2012103274165A
Authority: CN
Inventors: 陈峻青; 蔡进; 吉民; 尹晓龙; 漆志文; 石利平; 徐春涛
Original assignee: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL CO Ltd; Southeast University
Current assignee: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd.; Southeast University
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN102827851A

Abstract

本发明公开了一种酮还原酶基因及其应用。本发明酮还原酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的酮还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种生产酮还原酶的基因工程菌，其中包含本发明所述的酮还原酶基因。一种酮还原酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明生产酮还原酶的基因工程菌，获得重组表达的酮还原酶。以该重组表达制备的酮还原酶为催化剂，不对称还原酮类化合物制备光学活性手性醇，底物转化率达96.8%，还原产物的ee大于99%。

Description

一种酮还原酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种酮还原酶基因及其应用。

背景技术

阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)，商品名立普妥(lipitor)，化学名(3R,5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-异丙基-3-苯基-4-（苯氨基甲酰基）吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸钙盐，它能够强效抑制羟甲基戊二酰单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，阻断HMG-CoA还原成羟甲戊酸，进而大大降低总胆固醇和低密度脂蛋白的含量，可有效改善动脉粥样硬化，降低血液中的脂蛋白浓度，不仅是治疗高胆固醇血脂症和混合型高血脂症的首选药物，还能有效防治冠心病和脑中风等疾病。由于阿托伐他汀钙具有起效快，降脂作用强，作用时间长等优点，该药一经推出，就取得了很好的销售业绩。

(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯（分子式为C(CH₃)₃OCOCH₂CH(OH)CH₂CH(OH)CH₂CN，分子量为229.27，CAS号：125971-93-9），带有两个具有手性结构的羟基，是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体，该部分结构也是HMG-CoA还原酶特异性结合的关键部位，其合成方法有多种，常见的方法主要有化学法和生物法两种。与化学法相比，生物法具有反应条件温和：常温、常压、中性或接近中性pH，设备要求不高，投入资金相对较少，且反应转化率高、对映体选择性高等多种优点，更受研究人员和生产企业的青睐。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种酮还原酶基因及其编码的酮还原酶。

本发明的另一目的是提供含有该基因的载体和基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该酮还原酶基因及其编码的酮还原酶的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种酮还原酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的酮还原酶基因编码的酮还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有本发明所述的酮还原酶基因的重组表达载体，优选将本发明所述的酮还原酶基因插入到Puc18中所得到的重组表达载体。

一种生产酮还原酶的基因工程菌，其中包含本发明所述的酮还原酶基因。

所述基因工程菌的宿主细胞优选大肠埃希氏菌（Escherichia coli），进一步优选大肠埃希氏菌BL21(DE3)或大肠埃希氏菌Mc 1061，最优选保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月29日，保藏编号为CCTCC NO：M 2012319的基因工程菌BL21（DE3）KRED06。

一种酮还原酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的生产酮还原酶的基因工程菌，获得重组表达的酮还原酶。

所述的培养包括摇瓶培养或发酵罐培养。

其中发酵培养基成分为：酵母膏20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 6g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾11.5g/L，磷酸二氢钾6.5g/L，硫酸铵1.0g/L，硫酸镁七水合物0.6g/L，柠檬酸铁80mg/L，硫酸锌七水合物50mg/L，氯化铜四水合物20mg/L，钼酸铵四水合物50mg/L。

其中所述发酵罐培养的发酵条件是：DO 30%以上，空气流量1:1.5vvm，葡萄糖残余量1%以下。

发酵过程采用常规的两阶段控制策略：发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH 7.0左右，罐温35-37℃；发酵后期即添加IPTG之后的酮还原酶诱导表达阶段，控制发酵液pH 7.0-7.2左右，罐温为28℃。以使发酵前期菌体大量繁殖，发酵后期卤醇脱卤酶大量表达。

本发明所述的酮还原酶基因在不对称还原酮类化合物中的应用，通过基因工程手段构建含有权利要求1所述的酮还原酶基因的基因工程菌，表达制备酮还原酶，以所得的酮还原酶为催化剂，不对称还原酮类化合物，以制备光学活性手性醇。

其中，所述的酮类化合物结构式为：

其中，R₁为烷基，苯基或带有取代基的苯基，卤素，CN；

R₂为烷基，苯基或带有取代基的苯基。

反应方程式如下

本发明所述的酮还原酶作为催化剂在不对称还原酮类化合物中的应用。

所述的应用按下述方法进行：在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，在NADP⁺、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖存在下，在权利要求2所述的酮还原酶作用下，不对称还原酮类化合物，制得光学手性醇。

所述的酮类化合物结构式为：

其中，R₁为烷基，苯基或带有取代基的苯基，卤素，CN；

R₂为烷基，苯基或带有取代基的苯基。

反应方程式如下：

有益效果：

本发明以NCBI登录号为851974的酮还原酶基因为基础，通过基因突变，获得一个SEQ IDNO.1所示的新的酮还原酶基因。以该基因构建基因工程菌，结合发酵工艺优化，重组表达制备的酮还原酶酶活为792.6U（野生型酮还原酶酶活为96.2U），且发酵过程无需额外添加辅酶。以该重组表达制备的酮还原酶为催化剂，不对称还原酮类化合物制备光学活性手性醇，底物转化率达96.8%，还原产物的ee大于99%。

生物材料保藏信息

大肠杆菌BL21（DE3）KRED06（Escherichia coli BL21（DE3）KRED06），保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月29日，保藏编号为CCTCC NO：M 2012319。

具体实施方式

实施例1基因工程菌的建立

通过NCBI查阅酮还原酶的基因（NCBI登录号为851974）；人工合成酮还原酶基因片段，以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展酮还原酶的基因片段（片段两端加Hind3和EcoR1内切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；并利用Hind3和EcoR1内切酶位点将基因插入至Puc18质粒中，将连接后载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因工程菌。其中PCR扩增酮还原酶基因的引物为：正向引物F1：TGCCTGCTACGTTAAAGAA（SEQ IDNO.4），反向引物F2：AAAATTGGGAAGGATCCCCAC（SEQ ID NO.5）。

实施例2酮还原酶突变体基因的获得

本研究利用易错PCR随机突变的方法，对酮还原酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本研究采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率。

100μL PCR体系如下:10×PCR Buffer 10μL，dATP(100mmol/L)0.2μL，dGTP(100mmol/L)0.2μL，dCTP(100mmol/L)1μL，dTTP(100mmol/L)1μL，MgCl₂(5mmol/L)20μL，MnCl₂(0.2mmol/L)1μL，F1Primer(10μmol/L)1μL，F2Primer(10μmol/L)1μL，大量抽提Puc18-KRED质粒DNA 1μL，Taq DNA Polymerase 2U，再加入灭菌超纯水到100μL。

PCR反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性45s，55℃变性45s及72℃变性90s进行30个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。

实验流程：

按照实施例1的方法PCR扩增酮还原酶基因并利用Hind3和EcoR1内切酶位点将基因插入至Puc18质粒中，作为基因突变模板；

易错PCR扩增酮还原酶的基因，扩增后基因片段链接至Puc18-T载体，将连接后载体转入之大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因突变文库；

利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，Puc18质粒为载体，表达扩展酮还原酶，高通量筛选高活性突变株；

突变后高活性酮还原酶基因进行鉴定。筛选出的高活性酮还原酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

酮还原酶基因引物为：正向引物F1：TGCCTGCTACGTTAAAGAA（SEQ ID NO.4）

反向引物F2：AAAATTGGGAAGGATCCCCAC（SEQ ID NO.5）

按实施例1所述方法构建表达该酮还原酶突变体的基因工程菌，并将其命名为E.ColiBL21(DE3)KRED 06。

实施例3酮还原酶的摇瓶制备

将实施例1或实施例2所得的重组大肠杆菌接种至含卡拉霉素(或氨苄青霉素)的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0）中，于30℃，200rpm的摇床中振荡培养16小时以上。转接2mL菌体培养液于50mL含卡拉霉素(或氨苄青霉素)的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。当菌液的OD600值在0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，将培养液置于20℃，200rpm的摇床中诱导表达10h。此后通过5000G离心10min收集菌体，经细胞破碎、离心、浓缩、冷冻干燥等处理得到卤醇脱卤酶或卤醇脱卤酶突变体的粉末。

实施例4重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶活力的测定

通过检测反应过程中340nm处NADPH吸光值的变化计算酮还原酶的活力。酮还原酶活力测定方法为：于1mL反应体系（50mmol，pH 8.0Tris-HCl缓冲液）中，加入0.2mmol NADPH，0.3mmol 5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，30℃保温2min后，加入实施例3制备的50μL重组酮还原酶，迅速混匀，检测340nm处吸光度的变化。每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟催化氧化0.1mmol NADPH所需的酶量。

据此测定野生型酮还原酶的酶活为96.2U，实施例3制备的酮还原酶突变体的酶活为364.9U。

葡萄糖脱氢酶活力测定方法：于1mL反应体系（100mmol磷酸钠缓冲溶液中，pH7.0）中，加入10mmol/L葡萄糖，1mmol/L NADP⁺，30℃保温2min后加入适量葡萄糖脱氢酶粗酶液（自制），迅速混匀，检测340nm处吸光度的变化。每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟催化还原0.1mmol NADP⁺所需的酶量。

实施例5重组酮还原酶的发酵生产

发酵培养基成分为：酵母膏20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 6g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾11.5g/L，磷酸二氢钾6.5g/L，硫酸铵1.0g/L，硫酸镁七水合物0.6g/L，柠檬酸铁80mg/L，硫酸锌七水合物50mg/L，氯化铜四水合物20mg/L，钼酸铵四水合物50mg/L。发酵液pH 7.0，搅拌转速800rpm左右，发酵过程中控制DO 30%以上，空气流量1:1.5vvm，葡萄糖残余量1%以下。接入种子液的OD600为1.2，接入量为发酵液体积的5%，发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH 7.0左右，罐温35-37℃，发酵液OD600达50时加入IPTG至终浓度1mmol/L以诱导酮还原酶的表达，控制发酵液pH 7.0-7.2左右，罐温为28℃左右，此后继续发酵15小时。发酵过程中当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过流加含葡萄糖300g/L、氯化铵12g/L、硫酸锌七水合物50mg/L、氯化铜四水合物20mg/L、钼酸铵四水合物50mg/L、柠檬酸铁80mg/L，pH 7.0的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。

将保存的发酵液经6000G离心40min、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到卤醇脱卤酶冻干粉并于-80℃保存。测得酮还原酶突变体酶活为792.6U。

实施例6重组酮还原酶催化5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的不对称还原

在5000L反应釜中，加入5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的水溶液（氰基含量1.95kmol），NADPNa₂ 20kg，葡萄糖脱氢酶（1×10⁷U）12.8kg，葡萄糖60kg，异丙醇50L，期间始终控制温度在30℃以下，并用硫酸调节溶液的pH值至5.0-6.0，之后向釜内投加实施例5方法制备的重组酮还原酶冻干粉（1×10⁷U）12.8kg，搅拌反应38小时。至底物含量降至1%以下时终止反应。反应终止后经脱色、离心、萃取等操作，得到产物（3R，5R）-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯（¹H-NMR(CDCl₃,400MHz/ppm);1.47(9H,s),1.72(2H,dd),2.43(2H,dd),2.55(2H,dd),3.96(1H,dd),4.21(1H,bt),4.23-4.34(1H,m),4.25(1H,bs);¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz/ppm);25.8,28.1,40.8,41.9,67.9,68.7,82.1,117.4,172.1）。经气相色谱分析，确定底物转化率96.8%，还原产物的ee 99.5%。

产物ee值的具体分析条件为：色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，FID检测器。色谱柱温度120℃，气化和检测温度均为280℃，载气为N₂。

Claims

1.一种酮还原酶基因，其特征在于序列如SEQ ID NO.1 所示。

2. 权利要求1所述的酮还原酶基因编码的酮还原酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3. 含有权利要求1所述的酮还原酶基因的重组表达载体。

4. 一种生产酮还原酶的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含权利要求1所述的酮还原酶基因。

5. 根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。

6. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌BL21(DE3) 或大肠埃希氏菌MC1061。

7. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月29日，保藏编号为CCTCC M 2012319的基因工程菌BL21（DE3）KRED06 。

8. 一种酮还原酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养权利要求4所述的基因工程菌，获得重组表达的酮还原酶。

9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的培养包括摇瓶培养或发酵罐培养。

10. 根据权利要求9所述的制备方法，其中所述发酵罐培养的发酵条件是：DO 30%以上，空气流量1:1.5 vvm，葡萄糖残余量1% 以下。

11. 权利要求1所述的酮还原酶基因在不对称还原酮类化合物中的应用，其特征在于通过基因工程手段构建含有权利要求1所述的酮还原酶基因的基因工程菌，表达制备酮还原酶，以所得的酮还原酶为催化剂，不对称还原5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，以制备光学活性手性醇。

12. 权利要求2所述的酮还原酶作为催化剂在不对称还原5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯中的应用。

13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的应用按下述方法进行：在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，在NADP⁺、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖的存在下，在权利要求2所述的酮还原酶作用下，不对称还原5R-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，制得光学手性醇。