CN110016444B - 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 - Google Patents

不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不动杆菌ZJPH1806及其制备咪康唑手性中间体的应用，2,2',4'‑三氯苯乙酮经不对称还原制备(R)‑2‑氯‑1‑(2,4‑氯苯基)乙醇，所得产物的光学纯度高。在pH 7.6的磷酸缓冲液体系中，以甘油为辅助底物，加入2g/L的底物反应26h，R‑型产物的产率为83.2％，e.e.值>99.9％。

Description

不动杆菌ZJPH1806及其制备咪康唑手性中间体的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种咪康唑手性中间体的制备，特别涉及一种利用新菌株--不动杆菌ZJPH1806生物催化不对称合成咪康唑手性中间体的方法。
(二)背景技术
2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇(分子量：225.48，CAS号：11446-57-0)是制备咪康唑(Miconazole)的关键手性中间体。其中R构型化合物，即式(Ⅰ-a)为本发明述及的制备咪康唑关键手性中间体。式(Ⅲ)的化学名称为1-[2-(2,4-二氯苯基)-2-[(2,4-二氯苯基)甲氧基]乙基]-1H-咪唑，也称双氯苯咪唑。
Figure BDA0002018532480000011
式(Ⅰ)为2,2',4'-三氯苯乙酮，式(Ⅱ)为2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇，式(Ⅲ)为咪康唑。
Figure BDA0002018532480000012
式(Ⅰ-a)为式(Ⅰ)的(R)-异构体，式(Ⅰ-b)为式(Ⅰ)的(S)-异构体。
咪康唑是一类抗真菌范围广泛、安全有效的抗真菌剂，用于治疗人和动物皮肤中的真菌感染疾病，药理学研究发现R-(-)-咪康唑的抗真菌活性高于相应的S-构型异构体和外消旋体，能明显提高药效，降低毒副作用。咪康唑合成的关键是制备得到其重要手性中间体(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇，即式(Ⅰ-a)，根据该手性中间体的合成方法不同，可分为化学法和生物法两类。
采用化学法制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇，需要使用手性恶唑硼烷和重金属钌的配合物作为催化剂，会对环境造成污染且收率不高。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。
Juan Mangas-Sanchez(Bioorg Med Chem Lett.2008,18,1820-1824.)等报道了采用商品酶催化还原的制备方法，分别以市售醇脱氢酶ADH A或醇脱氢酶ADH T为催化剂，加入NADH(或NADPH)作为辅助因子，1.0mM 2,2',4'-三氯苯乙酮为底物，30℃转化24h，产率分别为74％和65％。Yue-Peng Shang(Adv.Synth.Catal.2017,359,426-431.)等从Scheffersomyces stipitis CBS 6045中克隆酮还原酶Ss CR，在重组大肠杆菌中表达，在不额外添加NADP+的情况下，加入300mM 2,2',4'-三氯苯乙酮转化6h，转化率为99％，ee值为99％，反应放大至1L时，产率为88.2％。唐云平(CN108396040A.X[P].2018-08-14.)等人将来自Candida macedoniensis AKU 4588羰基还原酶的基因通过重组，得到重组菌株E.coli BL21/pET21c-cr2。当重组羰基还原酶添加量为20-100U/L时，在pH 7.6-8.8缓冲液中，30-40℃、Zn2+存在的条件下催化底物2,2',4'-三氯苯乙酮反应合成咪康唑中间体(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇，产物ee值为99％。
利用微生物全细胞生物催化不对称反应可制备得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。该方法可利用微生物自身所含有的完整酶系，使反应过程中的羰基还原酶催化体系与辅酶再生体系偶联，无需额外添加价格昂贵的辅因子(NADP+或NAD+)，使生物催化工艺更经济；并且羰基还原酶处于细胞内相对稳定的环境，使该酶抵抗环境因素干扰的能力更强。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产羰基还原酶的微生物新菌株-不动杆菌ZJPH 1806，以及利用该菌株全细胞催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的应用，相较于化学法合成路线，该方法的立体选择性高，催化剂制备成本低廉，且转化过程对环境友好。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株-不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：2019214，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
本发明还涉及所述的不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用，具体所述应用的方法为：以不动杆菌ZJPH1806经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以2,2',4'-三氯苯乙酮为底物，加入二甲基亚砜(DMSO)，以pH 5～9(优选pH 6～8，最优选7.6)的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃(优选25～40℃，最优选40℃)、150～250rpm(优选200rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，将转化液分离纯化，获得(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。所述转化体系中，底物用量以缓冲液体积计为0.1～10g/L(优选1～3g/L，最优选1.5g/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为100～450g/L(优选100～300g/L，最优选150g/L)。
进一步，为促进还原过程中的辅酶再生，提高反应效率，所述转化体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乙醇、异丙醇、甘油；辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油时，加入量为20～300g/L缓冲液，辅助底物为乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％。最优选的，所述辅助底物为甘油，甘油添加量以缓冲液体积计为200g/L，此时所得产物的光学纯度和产率最高。
进一步，所述缓冲液pH 6.0～8.0的常规缓冲液，离子强度范围为0.01～0.2M，优选0.1M、pH 7.6的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4)。
进一步，所述湿菌体细胞可按照常规方法由菌株经发酵后分离获得，优选的，所述湿菌体细胞由如下方法获得：将不动杆菌ZJPH1806接种至发酵培养基，30℃、200rpm摇床培养24h，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～40g/L，玉米浆40～70g/L，KH2PO4 0.5～2g/L，溶剂为水，pH 6.0～9.0。优选发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖27.62g/L，玉米浆57.35g/L，KH2PO4 0.90g/L，溶剂为水，pH8.0。
更进一步，所述湿菌体在发酵前先进行活化和扩大培养，具体为：
(1)斜面培养：将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基，30℃恒温培养箱培养1～2d，获得斜面菌种，4℃冰箱保存；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO42g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h，将发酵液于4℃，9000rpm条件下离心15min，弃去上清，并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次，再次离心分离获得湿菌体，备用。
本发明所述不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用最优选为：取0.1M pH为7.6的磷酸盐缓冲液，加入不动杆菌ZJPH1806湿菌体细胞，底物，二甲基亚砜(DMSO)和甘油构成转化体系，30℃、200rpm摇床振荡转化24h，反应结束后将转化液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇；所述湿菌体细胞浓度以湿重计为100g/L缓冲液，底物浓度为2g/L，DMSO体积加入量10％(v/v)，甘油加入量为200g/L。
Figure BDA0002018532480000041
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株可用于高立体选择性不对称还原潜手性酮底物(Ⅰ)制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇(式(Ⅰ-a)化合物)的微生物菌株--不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806，利用该菌株制备所得产物的光学纯度高。在pH 7.6的磷酸缓冲液体系中，加入2g/L的底物反应26h，R-型产物的产率为83.2％，e.e.值>99.9％。
(四)附图说明
图1为不动杆菌ZJPH1806的平板培养菌落形态。
图2为式(Ⅰ-a)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图3为式(Ⅰ-b)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图4为式(Ⅰ)化合物的HPLC色谱检测图谱。
图5为不动杆菌ZJPH1806菌株生物还原反应萃取液的液相检测色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、不动杆菌ZJPH1806菌株的筛选及鉴定
1、菌株筛选
1)富集培养及初筛：将从浙江省金华市婺城区尖峰山果园附近采集的新鲜土样1g，加入至装有50mL富集培养基的250mL摇瓶中，30℃、200rpm，培养5d，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续富集培养5d，如此重复富集2次。富集培养基组成为：(NH4)2SO42g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，2,2',4'-三氯苯乙酮(2g/L)为唯一碳源，溶剂为水，pH 6.5。
2)平板培养：富集培养液用生理盐水稀释104-106倍后涂布于含筛选培养基的平板，30℃培养2d，经多次转接分离培养后，获得单菌落菌株。挑取单菌落进行平板划线，经2次划线分离培养后获得纯化单菌落。平板筛选培养基终浓度组成为：(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO42g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，2,2',4'-三氯苯乙酮2g/L，20g/L琼脂粉，溶剂为水，pH 6.5。
3)斜面培养：挑取平板培养基中获得的单菌落至斜面培养基，30℃恒温培养箱培养1～2d，4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5。
4)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
5)发酵培养：将种子液以体积浓度为10％的接种量接种至发酵培养基中，装液量为100mL/250mL摇瓶，30℃、220rpm培养24h，获得发酵液。发酵培养基组成为：葡萄糖27.62g/L，玉米浆57.35g/L，KH2PO4 0.90g/L，溶剂为水，pH 8.0。其中玉米浆购自河南鑫洋实业有限责任公司。
6)生物转化反应：将发酵液离心得到的湿菌体悬浮于K2HPO4-KH2PO4(0.1M，pH6.5)磷酸盐缓冲液中，加入2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮底物和100g/L葡萄糖，置30℃摇床中转化24h。转化结束后，转化液用等体积乙酸乙酯萃取，经离心后得到上清液，采用手性液相色谱法分析目的产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇对映体过量值(ee值)和产率，反应后残留底物的含量，从而筛选得到菌株ZJPH1806，产率为49.4％，ee值为99.9％(图5)。
7)分析检测：反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析。取1mL萃取液烘干后用无水乙醇溶解，稀释100倍后进行分析检测。液相色谱条件：日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；日本大赛璐多糖衍生物类手性色谱柱OB-H(250mm×4.6mm×5μm)。色谱条件如下：流动相为正己烷/异丙醇＝97：3(v/v)；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：220nm。
液相色谱法定性及定量分析：检测转化反应后产物及残留底物的含量，并计算相关物质浓度、产率、酶活和e.e.值。
Figure BDA0002018532480000061
公式(1)中C产物、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)表征。
Figure BDA0002018532480000062
公式(2)中：CS和CR分别为(S)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的摩尔浓度。
羰基还原酶酶活力定义：在30℃，200rpm转化条件下，每分钟还原2,2’,4’-三氯苯乙酮底物生成1μmol产物(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
菌株的羰基还原酶活力以细胞所含酶的比活力(U/g)表示。
2、菌株ZJPH1806的鉴定
(1)菌株ZJPH1806生理生化特征：
革兰氏染色阴性，菌落呈白色，圆形，边缘整齐，表面光滑。显微镜下呈短杆状，可以利用酪氨酸芳胺酶和柠檬酸盐(钠)，可使L-苹果酸盐同化、L-乳酸盐碱化和琥珀酸盐碱化。
(2)菌株ZJPH1806的16S rDNA序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物27F(5’AGTTTGATCMTGGCTCAG3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’)扩增菌株的16SrDNA基因，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株ZJPH1806的16SrDNA基因序列(1467bp)如SEQ ID NO.1所示：
tcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgggggaggttgcttcggtaattgacctagcggcggacgggtgagtaatacttaggaatctgcctattaatgggggacaacatctcgaaagggatgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcacttgtgaccttgcgttaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatggggggaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctcctgtagttaatacctacagagagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactgggaagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatagtaagaactttccagagatggattggtgccttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcacttcgggtgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtaggtagtctaaccgtaaggaggacgcttaccacggtgtggccgatgactggggtgaa。
将菌株ZJPH1806的16S rRNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：菌株ZJPH1806与菌株Acinetobacter sp.PAMU-1.11(GenBank登录号为44885679)的序列同源性为95％。
根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该菌株ZJPH1806被鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：2019214，保藏日期2019年3月29日，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例2优化培养基组成
1、优化发酵培养基中碳源、氮源和无机盐种类
发酵培养基组成：碳源15g/L、氮源含氮量1.8g/L、无机盐1mM，溶剂为水，pH6.5。
将不动杆菌ZJPH1806接种至不同碳源、氮源和无机盐组成的发酵培养基中，培养条件为：初始pH值6.5，摇瓶装液量100mL/250mL锥形瓶，培养温度30℃、摇床转速200rpm，体积接种量10％，培养时间24h，采用实施例1方法测定酶活及ee值。
通过考察不同种类碳源、氮源和无机盐种类的单因素实验(表1-表3、表5所示)，得到最佳碳源、氮源和无机盐的种类分别为葡萄糖、玉米浆和KH2PO4。
表1不同碳源种类对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000081
表2葡萄糖添加量对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000082
表3不同氮源种类对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000083
表4玉米浆添加量对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000084
表5不同无机盐种类对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000085
Figure BDA0002018532480000091
备注：(-)表示与初始发酵培养基相比，培养基中未添加该组份
表6不同K+添加量对菌体酶活及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000092
由表2，表4，表6得到不动杆菌ZJPH1806菌株的发酵培养基组成为：葡萄糖20～40g/L，玉米浆30～70g/L，KH2PO4 0.5～5.0g/L，溶剂为水，pH 6.0～9.0。
2、采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法，对发酵培养基中影响产酶的三个显著因素，即葡萄糖、玉米浆和KH2PO4浓度进行优化(表7、8)：
得到不动杆菌ZJPH1806菌株的发酵培养优选组成为：葡萄糖20～35g/L，玉米浆50～70g/L，KH2PO4 0.5～2.5g/L，溶剂为水，pH 6.0～9.0，最优发酵培养基配方：葡萄糖27.62g/L，玉米浆57.35g/L，KH2PO4 0.90g/L，溶剂为水，pH 8.0。
表7最陡爬坡实验设计及结果
Figure BDA0002018532480000093
表8 Box-Behnken旋转中心组合实验设计及酶活
Figure BDA0002018532480000094
Figure BDA0002018532480000101
实施例3：湿菌体细胞的获得
(1)斜面培养：将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基，30℃恒温培养箱培养1～2d，获得斜面菌种，4℃冰箱保存。斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5。
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO42g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5。
(3)发酵培养：将种子液以10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h，将发酵液于4℃，9000rpm条件下离心15min，弃去上清，并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次，再次离心分离获得湿菌体细胞，备用。
发酵培养基配方：葡萄糖27.62g/L，玉米浆57.35g/L，KH2PO4 0.90g/L，溶剂为水，pH 8.0。
实施例4：辅助底物对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH6.5)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，再分别加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，乙醇、异丙醇、甘油作为辅助底物，以不添加任何辅助底物为对照，置于30℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表9。在优选实施方案中，加入100g/L甘油作为辅助底物时，产物产率为50.1％，e.e.值>99.9％。
表9添加不同辅助底物对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000111
实施例5：甘油添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH6.5)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，分别加入50～250g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表10。在优选实施方案中，加入200g/L甘油浓度作为辅助底物时，产物产率为52.3％，e.e.值>99.9％。
表10不同甘油添加量对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000112
实施例6：缓冲液pH值对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL不同pH值(表7)K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，分别加入200g/L甘油作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表11。在优选实施方案中，K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M)pH为7.6时，产物产率为56.2％，e.e.值>99.9％。
表11缓冲液不同pH值对产物(Ⅰ-a)产率及ee值的影响
Figure BDA0002018532480000121
实施例7：转化温度对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的1g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH7.6)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，分别加入200g/L甘油作为辅助底物，置于不同温度(25～50℃，见表12)中，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表8。在优选实施方案中，优选反应温度为40℃时，产物产率为59.3％，e.e.值>99.9％。
表12不同转化温度下的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
Figure BDA0002018532480000122
实施例8：湿菌体添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备的湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH7.6)中，湿菌体以湿重计，添加不同量的湿菌体(50-300g/L见表5)，加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，分别加入200g/L甘油作为辅助底物，40℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的产率和e.e.值见表13。在优选实施方案中，优选湿菌体添加量为150g/L时(干重：26.7g/L)，产物产率为76.6％，e.e.值>99.9％。
表13不同湿菌体添加量的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
Figure BDA0002018532480000131
实施例9：底物添加量对还原产物的影响
将按照实施例3方法制备1.5g的湿菌体悬浮于10mLK2HPO4-KH2PO4缓冲液(0.1M，pH7.6)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入不同量(见表14)的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，加入200g/L甘油作为辅助底物，置于40℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯萃取。采用实施例1的检测方法，在优选实施方案中，优选底物添加量为1.5g/L时，产物产率为83.2％，e.e.值>99.9％。
表14不同底物添加量下的产物(Ⅰ-a)浓度及ee值
Figure BDA0002018532480000132
实施例10：
将按照实施例3方法制备的1.5g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.6)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入终浓度2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，加入200g/L甘油作为辅助底物，置于40℃，200r/min的摇床中转化26h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇浓度为1.66g/L，光学纯度ee值>99.9％，产率83.2％。
实施例11：
将按照实施例3方法制备的1.5g湿菌体悬浮于10mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.6)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入终浓度2.5g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮作为底物，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，加入200g/L甘油作为辅助底物，置于40℃，200r/min的摇床中转化26h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的浓度为1.63g/L，光学纯度ee值>99.9％，产率65.1％。
实施例12：
红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012对2,2',4'-三氯苯乙酮的生物还原能力考察
(1)红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M2013650，保藏日期2013年12月11日，该菌已在先前的专利申请(公开号为CN 103773724 A，申请日期2014年1月17日)中公开。
(2)红串红球菌(R.erythropolis)XS1012的来源和湿菌体的制备方法详见已申请的专利(CN103773724A，公开日期2014年5月7日)。
(3)2,2',4'-三氯苯乙酮的生物转化
将红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012湿菌体移入装有10mL，0.1M的pH 6.5磷酸盐缓冲液的250mL锥形瓶中，同时加入初始浓度为2g/L的2,2',4'-三氯苯乙酮底物，100g/L湿菌体，以10％(v/v)DMSO作为助溶剂，加入100g/L葡萄糖作为辅助底物构成转化体系，置于30℃，200r/min的摇床中转化24h。反应结束后，加入等体积的乙酸乙酯萃取，采用实施例1的方法检测转化产物中(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇的含量，未检测到有产物(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇生成。
结论：红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012不能转化2,2',4'-三氯苯乙酮制备得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 不动杆菌ZJPH1806及其制备咪康唑手性中间体的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter sp.)
<400> 1
tcagattgaa cgctggcggc aggcttaaca catgcaagtc gagcggggga ggttgcttcg 60
gtaattgacc tagcggcgga cgggtgagta atacttagga atctgcctat taatggggga 120
caacatctcg aaagggatgc taataccgca tacgccctac gggggaaagc aggggatcac 180
ttgtgacctt gcgttaatag atgagcctaa gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc 240
ctaccaaggc gacgatctgt agcgggtctg agaggatgat ccgccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg ggggaaccct 360
gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg 420
aggaggctcc tgtagttaat acctacagag agtggacgtt actcgcagaa taagcaccgg 480
ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac agagggtgcg agcgttaatc ggatttactg 540
ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggctttttaa gtcggatgtg aaatccccga gcttaacttg 600
ggaattgcat tcgatactgg gaagctagag tatgggagag gatggtagaa ttccaggtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa taccgatggc gaaggcagcc atctggccta 720
atactgacgc tgaggtacga aagcatgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
atgccgtaaa cgatgtctac tagccgttgg ggcctttgag gctttagtgg cgcagctaac 840
gcgataagta gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagacta aaactcaaat gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct 960
ggtcttgaca tagtaagaac tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa cttacataca 1020
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt ttccttattt gccagcactt cgggtgggaa ctttaaggat actgccagtg 1140
acaaactgga ggaaggcggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga ccagggctac 1200
acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgctacctag cgataggatg ctaatctcaa 1260
aaagccgatc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagaatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtttgttg caccagaagt aggtagtcta accgtaagga ggacgcttac 1440
cacggtgtgg ccgatgactg gggtgaa 1467

Claims (10)

1.不动杆菌(Acinetobacter sp.)ZJPH1806，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：2019214，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述不动杆菌ZJPH1806在催化2,2',4'-三氯苯乙酮不对称还原制备(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以不动杆菌ZJPH1806经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以2,2',4'-三氯苯乙酮为底物，加入二甲基亚砜，以pH 5～9的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃、150～250rpm条件下进行转化反应，反应结束后，将转化液分离纯化，获得(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物用量以缓冲液体积计为0.1～10g/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为100～450g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乙醇、异丙醇、甘油。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油时，加入量为20～300g/L缓冲液，辅助底物为乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为0.1M、pH 7.6的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体细胞由如下方法获得：将不动杆菌ZJPH1806接种至发酵培养基，30℃、200rpm摇床培养24h，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～40g/L，玉米浆40～70g/L，KH2PO4 0.5～2g/L，溶剂为水，pH 6.0～9.0。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述湿菌体在发酵前先进行活化和扩大培养，具体为：
(1)斜面培养：将不动杆菌ZJPH1806接种至斜面培养基，30℃恒温培养箱培养1～2d，获得斜面菌种，4℃冰箱保存；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养12h，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h，将发酵液于4℃，9000rpm条件下离心15min，弃去上清，并用pH 6.5磷酸缓冲液洗涤菌体两次，再次离心分离获得湿菌体。
10.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：取0.1M pH为7.6的磷酸盐缓冲液，加入不动杆菌ZJPH1806湿菌体细胞，底物，二甲基亚砜和甘油构成转化体系，30℃、200rpm摇床振荡转化24h，反应结束后将转化液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-2-氯-1-(2,4-氯苯基)乙醇；所述湿菌体细胞浓度以湿重计为100g/L缓冲液，底物浓度为2g/L，DMSO体积加入量10％，甘油加入量为200g/L。
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