CN112795603B

CN112795603B - 一种制备(s)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法

Info

Publication number: CN112795603B
Application number: CN202011467085.6A
Authority: CN
Inventors: 李家全; 魏庚辉; 孟宪强
Original assignee: Shandong Jincheng Medicine Chemical Co ltd; Hengxin Yongji Technology Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shandong Jincheng Medicine Chemical Co ltd; Hengxin Yongji Technology Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112795603A; WO2022127310A1

Abstract

本发明中提供了一种制备(S)‑2‑(3‑吡啶)‑吡咯烷的方法，利用亚胺还原酶(IRED)或表达该酶的工程菌制备手性2‑吡啶吡咯烷化合物。利用葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系实现辅酶的再生。更具体的本发明提供了一种利用来源于Myxococcus fulvus的亚胺还原酶及其基因工程菌将2‑吡啶‑1‑吡咯啉化合物还原成(S)‑2‑(3‑吡啶)‑吡咯烷的方法，所述的Myxococcus fulvus来源的亚胺还原酶活性较高，反应底物浓度、反应产率以及产物的光学纯度较高，反应过程中操作简单，能耗低，符合绿色化学要求，可应用于工业生产(S)‑2‑(3‑吡啶)‑吡咯烷化合物的生物转化制备。

Description

一种制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法

技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种利用来源于粘球菌属的亚胺还原酶为生物催化剂，以NADP(H)为辅酶，还原2-吡啶-1-吡咯啉生成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，产物光学纯度>98％。

背景技术

手性胺及其衍生物是单一对映体药物的重要分支，是众多医药中间体及农用化学品的结构单元，目前有超过70％的药物都是手性胺及其衍生物，包括神经类、抗高血压及心脑血管等药物[Mitsukura K,Kuramoto T,Yoshida T,et al.[J].Appl MicrobiolBiotechnol,2013,97：8079-8086.]。

X＝C,O,N,S；

R＝Cl,F,Br,I,CH₃,OCH₃,OH,NO₂

X＝C,N；

R＝Cl,F,Br,I,CH₃,OCH₃,OH,NO₂

光学纯的2-芳(杂)基吡咯烷是重要的结构单元，常见于天然产物、药物分子以及合成中间体中，功能化的手性吡咯烷类化合物最近被证明具有多种生物活性，特别是作为治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和图雷特综合征方面的潜在的有益化合物前体[Viswanath A,Joseph L,[J]ACS Comb.Sci.2017,19,286-298]。此外，许多手性2-芳(杂)基吡咯烷是天然产物，可用作手性碱、手性助剂和手性配体。因此，近年来对光学纯的2-芳(杂)基吡咯烷衍生物的合成受到了广泛的关注[Andres,J.M,Sierra,I.H,et al.[J]European Journal of Inorganic Chemistry 2000,9,1719-1726.]。

手性胺的不对称合成方法主要包括化学法合成或生物酶催化法合成，使用化学法合成手性2-芳(杂)基吡咯烷需要多步反应，期间会用到手性衍生试剂或者金属催化剂等才能完成，条件苛刻，污染严重，光学纯度难以达到98.0％以上，收率较低，在实际大规模生产中有诸多限制[Charles H.M.,Steven J.Q.[J]Journal of Medicinal Chemistry,2017,19,286-298]。因此，探索更加绿色高效的生物酶催化法显得尤为重要。

手性胺的生物酶催化法常用的酶主要包括转氨酶[Fuchs M,Kozelewski D,etal.[J].Chem Commun,2010,46(30)：5500-5502]、单胺氧化酶[Ghislieri D,Turner N.[J].Topics in Catalysis,2014,57(5)：284-300]、脱氢酶[Abrahamson MJ,Wong JW,[J].Advanced Synthesis&Catalysis,2013,355(9)：1780-1786]和亚胺还原酶[Mangassanchez J,France SP,Montgomery SL,et al.[J].Current Opinion inChemical Biology,2016,37：19-25.]等。相比其他几种酶，亚胺还原酶具有催化合成手性仲胺和叔胺的独特优势[Lenz M,Borlinghaus N,Weinmann L,et al.[J].World JMicrobiol Biotechnol,2017,33(11)：199]，近几年来逐渐成为生物催化合成手性胺的研究热点。2018年，黄冈等人利用重组亚胺还原酶催化合成了R构型的吡咯烷，(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐[CN201811582029.X]。

但是由于胺类底物独特的性质，导致在还原过程中底物浓度往往不能过高，否则反应转化率会明显降低，为了提高底物浓度，需要增加昂贵辅酶NAD(P)H的用量，生产成本较高。因此寻找更高活性的亚胺还原酶通成为了高效还原亚胺底物2-吡啶-1-吡咯啉的关键因素。

发明内容：

本发明中提供了一种制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，利用亚胺还原酶(IRED)或表达该酶的工程菌制备手性2-吡啶吡咯烷化合物。利用葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系实现辅酶的再生。

2-吡啶-1-吡咯啉化合物结构式

本发明中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对来源于Myxococcus fulvus的MsIR1(WP_074958336.1)基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上Nde I和EcoR I酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转化入受体菌，即分别得到所述的产亚胺还原酶的基因工程菌M1；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了亚胺还原酶的高效异源表达。

本发明中所述产亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。

本发明中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。

在本发明中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的亚胺还原酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的亚胺还原酶即可。

用于制备本发明的手性2-(3-吡啶)-吡咯烷的亚胺还原酶可以是上述亚胺还原酶基因工程重组菌的培养物，也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液、或者对提取物亚胺还原酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。

本发明还涉及全细胞或粗酶液转化合成手性2-(3-吡啶)-吡咯烷化合物的方法，所述方法为：通过亚胺还原酶催化2-吡啶-1-吡咯啉化合物得到(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将亚胺还原酶基因工程菌在发酵培养基中扩增培养，诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；

(b)将收集的重组菌体细胞或对重组菌体破菌得到的粗酶液加入到缓冲液中，并加入2-吡啶-1-吡咯啉进行反应；

(c)反应完全后从反应体系中收集上层清液，并使用无机碱调节pH值；

(d)使用有机溶剂萃取，单次或合并多次的有机相；

(e)使用干燥剂干燥有机相，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。

本发明将所述产亚胺还原酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，进行高压破碎，在pH值为6.0～10.0的缓冲液，2-吡啶-1-吡咯啉化合物底物10～100g/L，反应温度20～40℃，转速200rpm反应条件下转化2～24小时，反应完全后经离心、碱化、萃取、脱溶后得到(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷，收率大于80％。

进一步地，所述碱化用的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中一种或两种以上组合物。

进一步地，所述萃取用的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基中一种或两种以上组合物。

进一步地，所述干燥用的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁等。

反应中适用的介质可以是水、发酵液或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可以是水中加入磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐等中一种或两种以上组合物。

本发明所述的pH值优选能够保持在亚胺还原酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH值为6.0～10.0。反应温度优选保持在亚胺还原酶可以表达其活性的温度范围内，优选20～40℃。

本发明所述的底物浓度并没有限制，通常底物为10～90g/L，考虑到反应效果，底物浓度优选大于等于50g/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加底物。反应产物也可以在反应结束后分离或通过原味分离的方法不断的将产物移走。

本发明涉及一种生物催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，更具体的本发明提供了一种利用来源于Myxococcus fulvus的亚胺还原酶及其基因工程菌将2-吡啶-1-吡咯啉化合物还原成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，所述的Myxococcus fulvus来源的亚胺还原酶活性较高，反应底物浓度、反应产率以及产物的光学纯度较高，反应过程中操作简单，能耗低，符合绿色化学要求，可应用于工业生产(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷化合物的生物转化制备。

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1：高表达基因工程菌的获得

全基因合成由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

根据细菌(Myxococcus fulvus)的亚胺还原酶MsIR1(WP_074958336.1),并对其进行密码子优化，以期使基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达。并在基因两端加上Nde I和EcoR I酶切位点，构建到pET-28a(+)载体中，得到基因工程菌M1。

将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构建重组亚胺还原酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

实施例2基因工程菌的培养和粗酶液的制备

挑取平板上单菌落接种至5ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15h左右作为种子液，按照1％的接种量接种至含600ml的发酵培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导10h以上，以8000rpm离心培养液收集菌体，进行高压破碎，得到亚胺还原酶的粗酶液。

实施例3利用亚胺还原酶的全细胞催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

10ml磷酸缓冲液(pH7.5)，30mg/ml菌体，2eq葡萄糖,0.2mg/ml NADP⁺,10mg GDH粉末，底物浓度50mg/ml，28℃反应，TLC点板判断反应进程。12小时后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品，HPLC检测。

序号	pH	转化率	ee
				1	6.0	26.1	99.7
2	6.5	48.9	99.8
				3	7.0	84.6	99.7
4	7.5	98.7	99.8
				5	8.0	89.1	99.8
6	8.5	80.3	99.7
				7	9.0	72.6	99.7
8	9.5	55.8	99.7

根据上表可知，缓冲液pH7.0-9.0时具有较高的转化率，尤其pH7.5-8.0时转化率效果非常显著。

实施例4利用亚胺还原酶的全细胞催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

10ml磷酸缓冲液(pH 7.5)，60mg/ml菌体，2eq葡萄糖,0-0.8mg/ml NADP⁺,10mgGDH粉末，底物浓度10-90mg/ml，28℃反应，TLC点板判断反应进程。24小时后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品，HPLC检测。

根据上表可知，底物浓度和辅酶NADP⁺比例范围为10-20：0.2时具有较高的转化率，尤其30-60：0.4-0.6时转化率效果非常显著。

实施例5利用亚胺还原酶的粗酶液催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

10ml磷酸缓冲液(pH 7.5)，60mg/ml亚胺还原酶菌体破菌粗酶液，2eq葡萄糖,0-0.8mg/ml NADP⁺,10mg GDH粉末，底物浓度10-90mg/ml，30℃反应，TLC点板判断反应进程。24小时后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品，HPLC检测。

序号	底物浓度	辅酶NADP<sup>+</sup>	转化率	ee
					1	10	0	21.6	99.7
2	10	0.2	99.2	99.8
					3	20	0.2	97.8	99.7
4	30	0.3	94.5	99.8
					5	30	0.4	99.3	99.8
6	40	0.4	99.2	99.7
					7	50	0.4	83.4	99.7
8	50	0.6	89.4	99.7
					9	60	0.6	88.5	99.7
10	70	0.8	76.3	99.7
					11	80	0.8	64.9	99.7

实施例6利用亚胺还原酶的全细胞催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

1l磷酸缓冲液(pH 7.5)，40mg/ml亚胺还原酶菌体，2eq葡萄糖,0.4mg/ml NADP⁺,100mg GDH粉末，分批补加底物，底物终浓度50mg/ml，28℃反应，TLC点板判断反应进程。反应完全后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品。收率96％，纯度98％，e.e.值99.8％。

实施例7利用亚胺还原酶的全细胞催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

1l磷酸缓冲液(pH 7.5)，40mg/ml亚胺还原酶菌体，2eq葡萄糖,0.5mg/ml NADP⁺,100mg GDH粉末，分批补加底物，底物终浓度70mg/ml，30℃反应，TLC点板判断反应进程。反应完全后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品。收率93％，纯度98％，e.e.值99.6％。

实施例8利用亚胺还原酶的粗酶液催化合成(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷

1l磷酸缓冲液(pH 7.5)，60mg/ml亚胺还原酶菌体破菌粗酶液，2eq葡萄糖,0.5mg/ml NADP⁺,100mg GDH粉末，分批补加底物，底物终浓度50mg/ml，30℃反应，TLC点板判断反应进程。反应完全后，加氢氧化钠饱和溶液调节pH值至10以上，离心除去变性的蛋白，上清液用二氯甲烷萃取，干燥，旋干收集产品。收率94％，纯度98％，e.e.值99.7％。

序列表

<110> 山东金城医药化工有限公司

恒信永基科技（深圳）有限公司

<120> 一种制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> Myxococcus fulvus

<400> 1

Met Lys Pro His Ile Ser Ile Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Ala Phe Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn

20 25 30

Arg Thr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Ile

35 40 45

Ala Asp Ser Val Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Ser Val Val Ile Val

50 55 60

Asn Val Asn Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Ala Leu Leu Arg Gln Asp Glu

65 70 75 80

Val Thr Gln Glu Leu Arg Gly Lys Val Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly

85 90 95

Ser Pro Lys Leu Ala Arg Glu Gln Ala Thr Trp Ala Arg Arg His Gly

100 105 110

Ile Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Leu Ile Gly

115 120 125

Arg Pro Asp Cys Thr Leu Leu Tyr Ala Gly Pro Lys Ala Leu Tyr Asp

130 135 140

Lys His Gln Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Asn Thr Gln His Val

145 150 155 160

Ser Glu Asp Glu Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Ile Leu Phe

165 170 175

Gln Leu Trp Gly Ser Leu Phe Ser Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ile Cys

180 185 190

Arg Ala Glu Gly Ile Ala Leu Asp Ala Leu Gly Pro His Leu Glu Ala

195 200 205

Val Ala Ala Met Ile Gln Phe Ser Met Lys Asp Leu Leu Gln Arg Ile

210 215 220

Gln Lys Glu Gln Phe Gly Ala Asp Thr Glu Ser Pro Ala Thr Leu Asp

225 230 235 240

Thr His Asn Val Ala Phe Gln His Leu Leu His Leu Cys Glu Glu Arg

245 250 255

Asn Ile His Arg Ala Leu Pro Glu Ala Met Asp Ala Leu Ile Gln Thr

260 265 270

Ala Arg Lys Ala Gly His Gly Gln Asp Asp Phe Ser Val Leu Ala Arg

275 280 285

Phe Leu Arg

290

Claims

1.一种制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，通过亚胺还原酶催化2-吡啶-1-吡咯啉化合物得到(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将亚胺还原酶基因工程菌在发酵培养基中扩增培养，诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；所述的亚胺还原酶来源于Myxococcus fulvus，其氨基酸序列为SEQ ID.NO 1；

(d)使用有机溶剂萃取，合并有机相；

2.如权利要求1所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列为pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列或pTYB系列。

3.如权利要求2所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述的亚胺还原酶的基因工程菌的宿主菌为BL21系列、Rosetta系列、Origami系列或Tuner系列。

4.如权利要求1所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述步骤(b)在pH值为6.0～10.0的缓冲液，2-吡啶-1-吡咯啉底物浓度为10～100g/L，反应温度20～40℃，转速200rpm反应条件下转化2～24小时。

5.如权利要求1所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述步骤(c)反应完全后经离心、碱化、萃取、脱溶后得到(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷，收率大于80％。

6.如权利要求4所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述2-吡啶-1-吡咯啉底物浓度为70g/L。

7.如权利要求4所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐中一种或两种以上组合物。

8.如权利要求5所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述碱化用的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中一种或两种以上组合物。

9.如权利要求5所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述萃取用的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基中一种或两种以上组合物。

10.如权利要求1所述的制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法，其特征在于，所述干燥用的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁。

11.亚胺还原酶或亚胺还原酶的基因工程菌在制备(S)-2-(3-吡啶)-吡咯烷中的应用，所述亚胺还原酶来源于Myxococcus fulvus，其氨基酸序列为SEQ ID.NO 1。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列为pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列或pTYB系列。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的亚胺还原酶的基因工程菌的宿主菌为BL21系列、Rosetta系列、Origami系列或Tuner系列。