CN110272925B - 一种苏沃雷生关键中间体的酶法制备方法 - Google Patents

一种苏沃雷生关键中间体的酶法制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了来源于Streptomyces thermolilacinus的亚胺还原酶StIR(WP_023587323.1)或Kribbella catacumbae的亚胺还原酶KcIR(WP_020388085.1)或Streptomyces iranensis的亚胺还原酶SiIR(WP_044567941.1)或Leishmania major strain Friedlin的亚胺还原酶LmIR(CAJ03998.1)或Methylocaldum szegediense的亚胺还原酶MsIR(WP_026609689.1)或Microbulbifer的亚胺还原酶MbIR(WP_067084177.1)，并利用该亚胺还原酶作为生物催化剂制备抗失眠药苏沃雷生中间体5‑氯‑2‑((R)‑5‑甲基‑[1,4]二氮杂环庚‑1‑基)苯并恶唑。以相应亚胺还原酶可催化5‑100g/L的底物，转化率大于99％，本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点，有较大的工业应用前景。

Description

一种苏沃雷生关键中间体的酶法制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种重要医药中间体的制备方法，具体涉及5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的酶法制备方法。
背景技术
苏沃雷生(Suvorexant，商品名Belsomra)是由默克公司研发的抗失眠药，于2014年8月获FDA批准，这是首款用于治疗难以入睡或保持睡眠的食欲素受体拮抗剂，其结构式如下：
Figure GDA0001729689920000011
5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑是合成苏沃雷生的关键中间体，专利US20130331379A1采用酒石酸二苯甲酸酯拆分法制备了5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑，该方法的缺点是最高理论收率只有50％，且需要多次拆分结晶才能获得光学纯的产物。
文献(N.A.Strotman et al.,J.Am.Chem.Soc.2011,133,8362)报道了金属催化不对称还原的方法合成5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑，但是ee值只有94.5％且可能会有重金属残留。
文献(Ian K.Mangion,et al.,Org.Lett.2012,14,3458)利用转氨酶的方法制备5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑，实现了该中间体的绿色合成，但是该方法收率较低(62％)，且有副产物的产生，不利于分离纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的制备方法，以克服现有技术的缺陷。
所述的5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的制备方法，其特征在于：
利用亚胺还原酶催化式(1)化合物4-[(2-氨乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮或其盐或式(2)化合物5-氯-2-(5-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑或其盐不对称还原制备式(3)化合物，反应式如下：
Figure GDA0001729689920000021
所述的亚胺还原酶，其序列包含了与来源于Streptomyces thermolilacinus的亚胺还原酶StIR(WP_023587323.1)或Kribbella catacumbae的亚胺还原酶KcIR(WP_020388085.1)或Streptomyces iranensis的亚胺还原酶SiIR(WP_044567941.1)或Leishmania major strain Friedlin的亚胺还原酶LmIR(CAJ03998.1)或Methylocaldumszegediense的亚胺还原酶MsIR(WP_026609689.1)或Microbulbifer的亚胺还原酶MbIR(WP_067084177.1)具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述亚胺还原酶具有亚胺还原的活性。
本发明中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对Streptomyces thermolilacinus的亚胺还原酶StIR(WP_023587323.1)或Kribbellacatacumbae的亚胺还原酶KcIR(WP_020388085.1)或Streptomyces iranensis的亚胺还原酶SiIR(WP_044567941.1)或Leishmania major strain Friedlin的亚胺还原酶LmIR(CAJ03998.1)或Methylocaldum szegediense的亚胺还原酶MsIR(WP_026609689.1)或Microbulbifer的亚胺还原酶MbIR(WP_067084177.1)分别进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上相应的酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转入受体菌，即得到所述的产亚胺还原酶的基因工程菌IR1、IR2、IR3、IR4、IR5、IR6；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了亚胺还原酶的高效异源表达。
本发明中所述产亚胺还原酶的基因工程菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
本发明中所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
在本发明中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的亚胺还原酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的亚胺还原酶即可。
本发明的亚胺还原酶可以是上述亚胺还原酶基因工程重组菌的培养物，也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液、或者对提取物腈水解酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。
本发明涉及生物转化合成5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的方法，反应中适用的溶剂可以是水或含有不同缓冲液的水介质或含部分有机溶剂的水介质，其所用的缓冲液可以是水中加入一种或几种适当磷酸盐、Tris盐酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐等。
本发明所述的pH值优选能够保持在亚胺还原酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH值为6.5～9.0。反应温度优选保持在亚胺还原酶可以表达其活性的温度范围内，优选20～40℃。
本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物为5～100g/L，考虑到反应效果，底物浓度优选大于等于50g/L。
附图说明
图1产物5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的核磁氢谱
图2产物5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑的核磁碳谱
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：高表达基因工程菌的获得
全基因合成由上海旭冠公司完成。
根据Streptomyces thermolilacinus的基因StIR(WP_023587323.1)、Kribbellacatacumbae的基因KcIR(WP_020388085.1)、Streptomyces iranensis的基因SiIR(WP_044567941.1)、Leishmania major strain Friedlin的基因LmIR(CAJ03998.1)、Methylocaldum szegediense的基因MsIR(WP_026609689.1)与Microbulbifer的基因MbIR(WP_067084177.1)分别进行密码子优化后，以期使基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达。并在基因两端加上相应的酶切位点，构建到相应载体中，得到基因工程菌IR1、IR2、IR3、IR4、IR5、IR6。
将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami中，以构建重组亚胺还原酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
实施例2基因工程菌的培养和静息细胞的制备
挑取平板上单菌落接种至5ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15h左右作为种子液，按照1％的接种量接种至含600ml的发酵培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导10h以上，以8000rpm离心培养液收集菌体。
实施例3利用IR1的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR1的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(1g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(0.5g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.252g，收率90％，ee值>96％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.22(s,1H),7.06(d,J＝8.4Hz,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,1H),3.79-3.91(m,2H),3.59-3.72(m,2H),3.25(d,J＝13.9Hz,1H),2.96(t,J＝11.4Hz,1H),2.84-2.92(m,1H),1.94-2.02(m,1H),1.68-1.78(m,1H),1.17(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ162.98,147.51,144.80,129.27,120.09,116.15,109.14,55.05,49.29,47.27,45.82,36.34,22.40。如附图1,2所示。
实施例4利用IR2的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR2的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(2g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(1.0g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.476g，收率85％，ee值>96％。
实施例5利用IR2的静息细胞催化式(1)的不对称还原胺化
取2.5g IR2的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(2g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮(1.0g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.849g，收率90％，ee值>96％。
实施例6利用IR2的静息细胞催化式(2)的不对称还原胺化
取2.5g IR2的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(2g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、5-氯-2-(5-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑(1.0g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.877g，收率87％，ee值>96％。
实施例7利用IR3的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR3的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(2g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(1.0g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.515g，收率92％，ee值>96％。
实施例8利用IR3的静息细胞催化式(2)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR3的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(2g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、5-氯-2-(5-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑二(甲磺酸盐)(1.0g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，10％碳酸钠溶液调节pH至9.0，乙酸乙酯萃取(100mL*3)，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑0.536g，收率92％，ee值>96％。
实施例9利用IR4的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR4的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(20g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(10g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑4.872g，收率87％，ee值>96％。
实施例10利用IR5的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR5的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(10g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(5g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑2.520g，收率90％，ee值>96％。
实施例11利用IR6的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR6的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(10g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(5g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑2.464g，收率88％，ee值>96％。
实施例12利用IR4的静息细胞催化式(1)甲磺酸盐的不对称还原胺化
取2.5g IR4的静息细胞重悬于100mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.2)，加入葡萄糖(10g)、NADP+(5mg)、GDH酶粉(50mg)、4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮-二(甲磺酸盐)(5g)，使用10％碳酸钠溶液控制pH 7.0，于30℃下反应24小时，薄层层析检测显示反应完全，无水硫酸钠干燥后旋干，经柱层析分离纯化得到5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑2.660g，收率95％，ee值>96％。

Claims (9)

1.一种苏沃雷生中间体式（3）化合物（5-氯-2-((R)-5-甲基-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑）的酶法制备方法，其特征在于：
利用亚胺还原酶催化式（1）化合物（4-[(2-氨基乙基)(5-氯-2-苯并恶唑基)氨基]-2-丁酮）或其盐，或式（2）化合物（5-氯-2-(5-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-[1,4]二氮杂环庚-1-基)苯并恶唑）或其盐不对称还原制备式（3）化合物，反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
其中，所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces thermolilacinus的亚胺还原酶StIR，其氨基酸序列为WP_023587323.1或来源于Kribbella catacumbae的亚胺还原酶KcIR，其氨基酸序列为WP_020388085.1或来源于Streptomyces iranensis的亚胺还原酶SiIR，其氨基酸序列为WP_044567941.1或来源于Leishmania major strain Friedlin的亚胺还原酶LmIR，其氨基酸序列为CAJ03998.1或来源于Methylocaldum szegediense的亚胺还原酶MsIR，其氨基酸序列为WP_026609689.1或来源于Microbulbifer的亚胺还原酶MbIR，其氨基酸序列为WP_067084177.1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚胺还原酶是重组表达该酶的转化体培养物或重组表达该酶转化体培养物离心分离后的转化体细胞或转化体细胞加工制品。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转化体细胞加工制品是由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的亚胺还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应式的pH值为6.5～9.0。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述反应式的pH值为7.0；反应温度为20～40℃。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应温度为30℃；反应时间为10-40h。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应时间为24h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应式的底物浓度为5～100g/L。
9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述反应式的底物浓度为50～100g/L。
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