CN117987481A - 一种基于重组菌的1,6-己二胺发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组菌的1,6‑己二胺发酵生产方法，以6‑氨基己酸为底物，采用同时表达羧酸还原酶突变体MAB CAR L342E、转氨酶PatA和转氨酶VFTA的重组菌代谢合成1,6‑己二胺。本发明基于同时表达羧酸还原酶和双转氨酶基因的1,6‑己二胺生物合成菌株DAH37，成功地以6‑氨基己酸为起始底物生物发酵合成1,6‑己二胺。本发明对菌株的发酵工艺中的底物浓度、初始糖浓度、诱导时间以及摇瓶发酵时间进行了优化，进一步提高了1,6‑己二胺的产量。在最佳发酵条件下，1,6‑己二胺的产量达到了153.9mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物合成1,6-己二胺技术领域，特别涉及一种基于重组菌的1,6-己二胺发酵生产方法。
背景技术
目前，1,6-己二胺(1,6-hexanediamine)是三大尼龙原材料之一，常温常态下为无色透明的结晶体，是一种强碱性有机物。作为重要的化工生产中间体,1,6-己二胺主要用于生产尼龙66，同时也可用于制成1,6-己二异氰酸酯(HDI)和有机交联剂等。
目前，尽管有部分研究利用生物酶催化构建了1,6-己二胺的人工合成途径，例如文献1(LAU M K.Methods and microorganisms for the biological synthesis of(s)-2-amino-6-hydroxypimelate,hexamethylenediamine and 6-aminocaproate[Z].GooglePatents.2015)公开了谷氨酸至1,6-己二胺的生物催化途径；文献2(FEDORCHUK T P,KHUSNUTDINOVAA N,EVDOKIMOVA E,et al.One-Pot Biocatalytic Transformation ofAdipic Acid to 6-Aminocaproic Acid and1,6-Hexamethylenediamine UsingCarboxylic Acid Reductases and Transaminases[J].JAm Chem Soc,2020,142(2):1038-48.)公开了己二酸至1,6-己二胺的生物转化途径，成功在体外实现了己二酸至1,6-己二胺的生物转化，并获得了3mM的产量；文献3(ZHANG Z,FANG L,WANG F,etal.Transforming Inert Cycloalkanes intoα,ω-Diamines by Designed EnzymaticCascade Catalysis[J].Angewandte Chemie International Edition,2023,62(16):e202215935.)构建了三个不同的模块，分别以环己烷和环己醇为底物，合成了7.6mM和16.5mM的1,6-己二胺。但是，上述现有技术均依赖于人工酶催化建立人工合成途径，并没有公开天然的1,6-己二胺生物合成途径，即现有技术中没有依赖于重组菌代谢合成1,6-己二胺的发酵工艺路线，也没有以6-氨基己酸为起始底物发酵合成1,6-己二胺的技术路线。
此外，重组微生物的发酵特性迥异，适当的发酵条件可以最大程度的发挥重组微生物的生产优势，然而现有技术中并没有公开合成1,6-己二胺的重组微生物，因此无法进一步开发一种基于重组微生物的1,6-己二胺高产发酵工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种1,6-己二胺的生物合成方法，所要解决的技术问题是如何基于全新构建的重组菌以6-氨基己酸为底物发酵合成1,6-己二胺。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种基于重组菌的1,6-己二胺发酵生产方法，以6-氨基己酸为底物，采用同时表达羧酸还原酶突变体MAB CAR L342E、转氨酶PatA和转氨酶VFTA的重组菌代谢合成1,6-己二胺。
优选地，所述重组菌的保藏编号为CCTCC NO：M20231767，保藏名称为Escherichiacoli DAH37，所述重组菌于2023年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
优选地，所述羧酸还原酶MAB CAR L342E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述转氨酶PatA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述转氨酶VFTA的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
优选地，所述重组菌的培养方法为：将重组菌接种于含6-氨基己酸和葡萄糖的LB液体培养基中，摇菌培养1.5-4.0h后进行IPTG诱导，继续摇菌培养至72-120h。
优选地，所述LB液体培养基中葡萄糖的初始浓度为0-6g/L。
优选地，所述LB液体培养基中6-氨基己酸的初始浓度为4-10g/L。
优选地，所述IPTG诱导前的培养温度为37℃，诱导后的培养温度为30℃，所述摇菌的转速为250r/min。
优选地，所述重组菌在接种前进行活化培养制备种子液，方法为：将冷冻保藏的重组大肠杆菌划线接种于LB固体培养基中，37℃培养12h后，挑取单菌落接种到10mL的LB液体培养基中，在37℃,250r/min的条件下培养10-12h即为种子液。
优选地，所述种子液在LB液体培养基中的接种量为2％体积分数。
本发明获得的有益效果：本发明基于同时表达羧酸还原酶和双转氨酶基因的1,6-己二胺生物合成菌株DAH37，成功地以6-氨基己酸为起始底物生物发酵合成1,6-己二胺。本发明对菌株的发酵工艺中的底物浓度、初始糖浓度、诱导时间以及摇瓶发酵时间进行了优化，进一步提高了1,6-己二胺的产量。在最佳发酵条件下，1,6-己二胺的产量达到了153.9mg/L。
附图说明
图1为底物浓度对1,6-己二胺产量的影响；
图2为初始糖浓度对1,6-己二胺产量的影响；
图3为诱导时间对1,6-己二胺产量的影响；
图4为发酵时间对1,6-己二胺产量的影响。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：按如下方法培养重组菌：
1、培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L；LB固体培养基按2％(质量分数)添加琼脂粉，根据需要加入相应浓度抗生素(AmpR)。
以上培养基灭菌条件为121℃,20min。
2、菌种
保藏编号为CCTCC NO：M20231767，保藏名称为Escherichia coli DAH37，所述重组菌于2023年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
该菌种同时表达转氨酶PatA、转氨酶VFTA和羧酸还原酶突变体MAB CAR L342E三种外源功能性蛋白。所述羧酸还原酶MAB CAR L342E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述转氨酶PatA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述转氨酶VFTA的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
3、培养条件
种子液培养:将冷冻保藏的重组大肠杆菌划线接种于LB固体培养基中，37℃培养12h后，挑取单菌落接种到10mL的LB液体培养基中，在37℃,250r/min的条件下培养10～12h即为种子液。
摇瓶发酵培养:将培养好的种子液，按照2％的接种量转接到50ml的LB发酵培养基中，在37℃,250r/min的摇床中培养3.0h。随后，添加IPTG进行诱导，并将培养温度降至30℃，继续培养至72h。LB发酵培养基为含8g/L 6-氨基己酸，初始葡萄糖浓度为2g/L的LB液体培养基。
4、检测方法
本实施例所用的液相色谱为安捷伦高效液相色谱(HPLC,Agilent 1260InfinityII,Santa Clara,California,USA)，配备紫外检测器(Agilent 1260VWD,G7114A)，示差检测器(Agilent Refractive Index(RI),G7162A)，进样器(Agilent1260vial sampler,G7129A)和四联泵(Agilent 1260Quat Pump VL,G7111A)。二元胺经由安捷伦porpshell120EC-C18(4.6×150mm,4μm particle size)色谱柱分离检测。
取发酵液500μL,12000rpm/min离心5-10min,取上清液30μL,用去离子水稀释10倍至300μL,加入300μL饱和NaHCO3,3ul 10mg/L的1，7-庚二胺(TCI,98.0％(GC&T))作为内标。用15g/L NaOH溶液调pH至9.4。加5mg/ml丹黄酰氯丙酮溶液600μL后，在60℃条件下避光水溶30min进行衍生化反应。衍生化结束后，加150μL饱和NaCl终止反应。分别用2ml和1ml无水乙醚两次萃取，得上层液氮吹，除去乙醚。随后用300μL乙腈复溶，用0.22μm有机相膜过滤。丁二胺(100mg/L,from TCI with purity 98.0％(GC&T))和戊二胺(100mg/L,from TCIwith purity 98.0％(GC&T))标准品也用相同的方法进行处理。HPLC检测条件为：柱温设定为30℃，紫外线检测波长设定为254nm，进样体积为10μL，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱方案设定为：0-4min流动相B从55％升至70％；然后保持70％的比例2min；6-11分钟流动相B从70％升至95％；然后保持95％的比例1min；12-13分钟，流动相B从95％降至55％；最后维持55％的比例2min，流速设定为0.7mL/min。
实施例2：对实施例1的培养方法进行底物浓度优化：
为了优化底物浓度对1,6-己二胺生产的影响，控制底物6-氨基己酸添加浓度，分别在诱导后添加底物终浓度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L生产1,6-己二胺，发酵72h。然后，分别于0h、12h、24h、48h、72h取样，并使用HPLC对发酵液进行分析，每次实验设置3个平行，最终结果计算其平均值。
底物在生物合成产物的过程中具有促进反应进行的作用，然而，过量的底物会抑制微生物的生长和发育，进而对产物的积累产生影响。根据图1的结果显示，在底物6-氨基己酸浓度为8g/L时，1,6-己二胺的产量达到最高值，而随着6-氨基己酸浓度的进一步增加，1,6-己二胺产量呈下降趋势。DAH37菌株在72h 1,6-己二胺产量达到了20.85mg/L，相比之下提高了2.59倍。因此，初始底物浓度对发酵产量有着显著的影响，并确定了1,6-己二胺发酵的最佳底物浓度为8g/L。
实施例3：对实施例1的培养方法进行初始糖浓度优化:
在现有优化基础上，设置葡萄糖浓度梯度为0g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L进行摇瓶发酵生产1,6-己二胺，发酵72h。然后，分别于0h、12h、24h、48h、72h取样，并使用HPLC对发酵液进行分析，每次实验设置3个平行，最终结果计算其平均值。
葡萄糖作为一种快速碳源，容易被菌体吸收和利用，通常添加在发酵培养基中以促进菌体的生长和目的产物的合成。然而，葡萄糖过量供给可能引发“葡萄糖效应”，对菌体的生长产生负面影响，并可能导致大量杂酸的产生，从而抑制目的产物的合成[ZHANG Y,DAI X,JIN H,et al.The effect of optimized carbon source on the synthesis andcomposition of exopolysaccharides produced by Lactobacillus paracasei[J].JDairy Sci,2021,104(4):4023-32.]。因此，需要研究最适合1,6-己二胺合成的初始葡萄糖浓度。如图2所示，在初始糖浓度为2g/L时，1,6-己二胺的产量达到最高值，随着初始糖浓度的进一步增加，1,6-己二胺产量呈下降趋势，并且下降趋势明显。DAH37菌株在72h 1,6-己二胺产量达到44.1mg/L，提高了1.12倍，比单转氨酶菌株高出了8.2％。因此，研究发现初始糖浓度对发酵产量有着显著影响，并确定了1,6-己二胺发酵的最佳初始糖浓度为2g/L。
实施例4：对实施例1的培养方法进行诱导时间优化:
在现有优化基础上，调整菌体诱导时间分别在0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h诱导生产1,6-己二胺，发酵72h。然后，分别于0h、12h、24h、48h、72h取样，并使用HPLC对发酵液进行分析，每次实验设置3个平行，最终结果计算其平均值。
异源蛋白表达的启动对宿主细胞的正常代谢会带来负担，对菌体浓度、蛋白表达和质粒稳定性都会产生负面影响。过早的诱导会不利于菌体的生长，因为此时菌体浓度较低，无法提供足够的菌体量来进行蛋白表达。相反，如果添加诱导剂的时间太晚，菌体会积累过多的代谢产物，导致菌体老化并且产酶能力减弱。一般情况下，蛋白质的表达需要使菌体处于适当的生长水平。
从图3中可以观察到，DAH37菌株的1,6-己二胺产量随着诱导时间的延后先增加后降低。在DAH37菌株中，将诱导时间延后到3.5h时(OD600约为1.8)时，1,6-己二胺产量达到最高值，72h达到65.7mg/L，提高了0.49倍，比单转氨酶菌株高出了47.6％。因此，确定了菌株DAH37在摇瓶发酵中1,6-己二胺的最佳诱导时间为3.5h。
实施例5：对实施例1的培养方法进行发酵时间优化:
在现有优化基础上，延长菌体发酵时间至120h，生产1,6-己二胺。然后，分别于72h、96h、120h取样，并使用HPLC对发酵液进行分析，每次实验设置3个平行，最终结果计算其平均值。
不同发酵时间对1,6-己二胺产量的影响如图4所示。随着摇瓶发酵时间的增加，1,6-己二胺的产量持续积累，在96h达到最高产量，并且在120h时1,6-己二胺的产量基本保持不变。在DAH37菌株中，96h的1,6-己二胺产量达到153.9mg/L，相比于72h的67.3mg/L，提高了1.29倍，比单转氨酶菌株高出了139.3％。因此，研究发现发酵时间对1,6-己二胺产量有明显影响，并确定了1,6-己二胺发酵的最佳发酵时间为96h。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
Claims (9)
1.一种基于重组菌的1,6-己二胺发酵生产方法，其特征在于：以6-氨基己酸为底物，采用同时表达羧酸还原酶突变体MAB CAR L342E、转氨酶PatA和转氨酶VFTA的重组菌代谢合成1,6-己二胺。
2.根据权利要求1所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于，所述重组菌的保藏编号为CCTCC NO：M20231767，保藏名称为Escherichia coli DAH37，所述重组菌于2023年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心。
3.根据权利要求1中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述羧酸还原酶MAB CAR L342E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述转氨酶PatA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述转氨酶VFTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述重组菌的培养方法为：将重组菌接种于含6-氨基己酸和葡萄糖的LB液体培养基中，摇菌培养1.5-4.0h后进行IPTG诱导，继续摇菌培养至72-120h。
5.根据权利要求4中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述LB液体培养基中葡萄糖的初始浓度为0-6g/L。
6.根据权利要求4中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述LB液体培养基中6-氨基己酸的初始浓度为4-10g/L。
7.根据权利要求4中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述IPTG诱导前的培养温度为37℃，诱导后的培养温度为30℃，所述摇菌的转速为250r/min。
8.根据权利要求4中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述重组菌在LB液体培养基中的接种量为2％体积分数。
9.根据权利要求4中所述1,6-己二胺的生物合成方法，其特征在于：所述重组菌在接种前进行活化培养制备种子液，方法为：将冷冻保藏的重组大肠杆菌划线接种于LB固体培养基中，37℃培养12h后，挑取单菌落接种到10mL的LB液体培养基中，在37℃,250r/min的条件下培养10-12h即为种子液。
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