WO2020213374A1 - ペルオキシダーゼの組換え生産 - Google Patents

ペルオキシダーゼの組換え生産 Download PDF

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WO2020213374A1
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cryptococcus
gene
peroxidase
horseradish
derived
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裕 川南
川井　淳
岸本　高英
正木　和夫
家藤　治幸
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東洋紡株式会社
独立行政法人酒類総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • Peroxidase is an enzyme that is abundantly contained in horseradish (Aromorasia rusuticana) and is used in a wide range of fields such as analysis, clinical examination, immunochemistry, histochemistry, and cell chemistry. In recent years, its demand has been increasing not only for analytical chemistry but also for its usefulness in wastewater treatment and environmental purification. However, when peroxidase is extracted from horseradish, it is not easy to obtain stable quality peroxidase because the peroxidase content and isozyme abundance ratio fluctuate significantly depending on various factors such as variety, cultivation conditions, and climate.
  • Patent Document 1 In order to efficiently produce peroxidase of stable quality, production of peroxidase by gene recombination technology has been proposed so far.
  • Patent Document 1 it is attempted to produce peroxidase using Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastriz as a host.
  • the productivity is improved to some extent by the introduction of the peroxidase gene mutation, but the molecular weight is increased due to the excessive sugar chain binding called hypermannose, the specific activity is decreased accordingly, and the enzyme characteristics are changed by the mutation introduction.
  • Patent Document 2 describes Cryptococcus sp., which reduces the production of extracellular polysaccharides.
  • a method for producing a heterologous protein using the S-2 strain as a host is described.
  • Patent Document 3 describes the production of peroxidase using the host expression system.
  • the recombinant peroxidase obtained by large-scale culture using a fermenter still had a sugar chain bond of hypermannose, and was not put into practical use.
  • Item 1 A Cryptococcus mutant strain in which the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene are disrupted.
  • Item 2. The Cryptococcus mutant strain according to Item 1, which has been transformed with a gene encoding horseradish-derived peroxidase.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. Item 3. The Cryptococcus mutant strain according to any one of Items 1 to 3, which produces horseradish-derived peroxidase having a molecular weight of about 45 kDa measured by SDS-PAGE.
  • Item 5. A method for producing a Cryptococcus mutant strain, which comprises disrupting the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene of Cryptococcus spp.
  • Item 5 The method according to Item 5, wherein the Cryptococcus spp. Is transformed with a gene encoding horseradish-derived peroxidase.
  • Item 8. The method according to any one of Items 5 to 7, which comprises destroying the URA5 gene and / or the ADE1 gene before disrupting the ALG3 gene, the ALG11 gene, and the OCH1 gene.
  • Item 9. Item 8. The method according to any one of Items 5 to 8, further comprising disrupting the ALG gene, the ADE1 gene, and / or the KU70 gene.
  • Item 11. A method for producing a horseradish-derived peroxidase, which comprises culturing the Cryptococcus genus mutant strain according to any one of Items 1 to 4.
  • a Cryptococcus spp. With a controlled glycosylation capacity is provided. In one embodiment, it is possible to recombine peroxidase produced by horseradish and peroxidase containing a sugar chain having the same molecular weight.
  • Cryptococcus sp The base sequences of the ALG3 gene of the S-2 strain and the base sequences before and after it are shown.
  • Cryptococcus sp The base sequence of the ALG11 gene of the S-2 strain and the base sequences before and after it is shown.
  • Cryptococcus sp The nucleotide sequences of the OCH1 gene of the S-2 strain and the nucleotide sequences before and after it are shown.
  • An example of the breeding process of a sugar chain synthase gene-disrupted strain is shown.
  • the molecular weight of the recombinantly produced peroxidase measured by SDS-PAGE is shown.
  • the results of measuring the optimum temperature of the recombinantly produced peroxidase are shown.
  • the result of measuring the optimum pH of the recombinantly produced peroxidase is shown.
  • the results of measuring the temperature stability of the recombinantly produced peroxidase are shown.
  • the results of measuring the optimum temperature of the recombinantly produced peroxidase are shown.
  • the results of measuring the Km value of the recombinantly produced peroxidase with respect to hydrogen peroxide are shown.
  • the results of comparing the reaction curves when creatinine was measured using hydrogen peroxide of recombinantly produced peroxidase and peroxidase obtained from horseradish are shown.
  • the Cryptococcus mutant strain preferably has the ALG3 gene, the ALG11 gene, and the OCH1 gene disrupted.
  • the disruption of the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene means a state in which these genes are not expressed.
  • the method for disrupting these genes is arbitrary and is not particularly limited. In one embodiment, gene disruption is preferably carried out using homologous recombination, and can be carried out, for example, by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-100232.
  • the ALG3 gene encodes ⁇ 1,3 mannosyltransferase involved in the synthesis of lipid-bound sugar chains.
  • the ⁇ 1,3 mannosyltransferase uses mannose dricol phosphate as its donor substrate.
  • An example of the base sequence of the ALG3 gene is shown in FIG.
  • the ALG11 gene encodes ⁇ 1,2 mannosyltransferase involved in the synthesis of lipid-bound sugar chains.
  • ⁇ 1,2 mannosyltransferase uses GDP mannose as its donor substrate.
  • An example of the base sequence of the ALG11 gene is shown in FIG.
  • the OCH1 gene encodes an ⁇ 1,6 mannosyltransferase that works in the Golgi apparatus.
  • An example of the base sequence of the OCH1 gene is shown in FIG.
  • Glycosylation to proteins is controlled by disrupting the ALG3, ALG11, and OCH1 genes of Cryptococcus spp.
  • peroxidase derived from horseradish is recombinantly produced using this as a host, the molecular weight containing the sugar chains is increased.
  • the horseradish-derived peroxidase recombinantly produced using the mutant Cryptococcus spp. Is preferably having a molecular weight (measured by SDS-PAGE) of about 45 kDa including the sugar chain.
  • the various enzyme properties of the peroxidase recombinantly produced in this way are equivalent to those of the peroxidase produced by horseradish. Therefore, the Cryptococcus mutant strain is useful as a host for producing peroxidase equivalent to that produced by horseradish.
  • the Cryptococcus mutant strain is preferably transformed with a gene encoding the horseradish-derived peroxidase so that it can be produced.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding horseradish-derived peroxidase (SEQ ID NO: 10) is known.
  • it is preferable that the nucleotide sequence of the gene encoding horseradish-derived peroxidase is optimized for codon usage so as to be suitable for expression in the genus Cryptococcus as described in Patent Document 2.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding horseradish-derived peroxidase is 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or the base sequence of SEQ ID NO: 10. It is preferable to have 99% or more identity.
  • identity can be calculated using a commercially available analysis tool available through a telecommunication line (Internet). For example, specifically, in Advanced BLAST 2.1, the value (%) of nucleotide sequence identity can be calculated by using blastn in the program, setting various parameters to default values, and performing a search. it can.
  • the gene encoding horseradish-derived peroxidase preferably has a signal sequence upstream so that the peroxidase produced by its expression is secreted outside the cells.
  • the signal peptide for example, those described in Patent Documents 2 or 3 can be used.
  • the signal peptide is Cryptococcus sp. It is preferably a secretory signal peptide of the acidic xylanase of the S-2 strain.
  • it is preferable that the gene encoding the horseradish-derived peroxidase has the vacuolar retention signal peptide removed so that the residual amount in the cells is reduced.
  • the transformation method is not particularly limited, and it can be carried out by incorporating the DNA having the base sequence into an appropriate vector and introducing it into Cryptococcus spp. Transformation can also be performed using homologous recombination. In one embodiment, transformation with a gene encoding horseradish-derived peroxidase can also be performed after disrupting the ALG3, ALG11, and OCH1 genes.
  • the Cryptococcus spp. (Hereinafter, also referred to as "gene-undestructed Cryptococcus spp.") Target for disrupting the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene are arbitrary and are not particularly limited.
  • a gene-undisrupted Cryptococcus sp. Cryptococcus sp. Examples include S-2, Cryptococcus liquefaciens, Cryptococcus flavus, and Cryptococcus curvatus.
  • the preferred gene-undisrupted Cryptococcus spp is Cryptococcus sp. It is S-2. Cryptococcus sp. The S-2 strain was internationally deposited at the Patent Organism Depositary Center on September 5, 1995 under the deposit number FERM BP-10961.
  • the gene-undisrupted Cryptococcus spp. Is preferably uracil-requiring. Gene disruption can be performed efficiently by utilizing uracil requirement.
  • Uracil-requiring Cryptococcus spp. Can be obtained by any method.
  • the uracil-requiring Cryptococcus spp. Can be obtained by irradiating the Cryptococcus spp. With ultraviolet rays to cause mutation, as described in Patent Document 1 or 2. Specifically, it can be obtained by irradiating Cryptococcus spp. With ultraviolet rays, culturing in a medium containing 5-fluoroorotic acid, and selecting a growing strain.
  • the KU70 gene is disrupted in the gene-undisrupted Cryptococcus spp.
  • the frequency of homologous recombination can be increased, and the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene can be disrupted more efficiently by homologous recombination.
  • the disruption of the KU70 gene can be carried out, for example, by the method described in Patent Document 3.
  • the gene-undisrupted Cryptococcus spp. Is preferably adenine-requiring. Gene disruption can be performed efficiently by utilizing the adenine requirement.
  • Adenine-requiring Cryptococcus spp. Can be obtained by any method.
  • the adenine-requiring Cryptococcus spp. Can be obtained by disrupting the ADE1 gene encoding Phosphoribosyl-aminoimidazole synthese, as described in Patent Documents 2 or 3.
  • the preferred adenine-requiring gene-undisrupted Cryptococcus spp is Cryptococcus sp.
  • S-2 D11 strain Cryptococcus sp. The S-2 D11 strain has been internationally deposited at the Patent Organism Depositary Center under the deposit number FERM BP-11482.
  • the gene-undisrupted Cryptococcus spp. Is uracil-requiring, adenine-requiring, and the KU70 gene is disrupted.
  • a Cryptococcus mutant strain can be produced by disrupting the ALG3 gene, ALG11 gene, and OCH1 gene of Cryptococcus spp.
  • the ALG3 gene, ALG11 gene, OCH1 gene, Cryptococcus spp., And the method for disrupting the gene are as described above.
  • the gene disruption may be carried out on Cryptococcus spp. That have been transformed with a gene encoding horseradish-derived peroxidase, or on Cryptococcus spp. That have not been transformed. In the latter case, Cryptococcus spp. Can be transformed with a gene encoding horseradish-derived peroxidase during the gene disruption step or after gene disruption.
  • the Cryptococcus genus that carries out the above-mentioned gene disruption has the uracil-requiring, adenine-requiring, and / or KU70 gene disrupted.
  • a horseradish-derived peroxidase can be produced by culturing a mutant strain of the genus Cryptococcus transformed with the gene encoding the horseradish-derived peroxidase described above.
  • the culture conditions may be appropriately selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, and are usually liquid cultures, preferably aeration stirring cultures.
  • a nutrient source those usually used for culturing microorganisms can be widely used.
  • the nitrogen source for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline decomposition product and the like are used.
  • Examples of the carbon source include glucose, sucrose, lactose, maltose, xylose, molasses, and pyruvic acid.
  • Other nutrient sources include salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc, amino acids, vitamins and the like.
  • the culture temperature can be appropriately selected within the range in which the Cryptococcus mutant strain grows and produces peroxidase. Usually, it is about 20 to 25 ° C.
  • the culturing time may be about 60 to 120 hours, and the culturing may be terminated at an appropriate time in anticipation of the time when the peroxidase reaches the maximum yield.
  • the pH of the medium can be appropriately selected within the range in which the Cryptococcus mutant strain grows and produces peroxidase, and is usually about pH 3.0 to 9.0.
  • the culture solution containing the cells obtained by culturing the above-mentioned mutant strain of Cryptococcus can be collected as it is and used as peroxidase.
  • the culture solution is filtered or centrifuged in advance according to a conventional method to peroxidase. It is preferable to separate.
  • purify and use peroxidase from the peroxidase-containing culture solution include, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., fractional precipitation with hydrophilic organic solvents such as methanol, ethanol, acetone, etc., heating treatment, isoelectric spot treatment, adsorbent.
  • treatments such as gel filtration with a gel filter agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and the like can be mentioned.
  • the horseradish-derived peroxidase produced using a Cryptococcus mutant strain as a host has the same characteristics as the peroxidase produced by horseradish.
  • the characteristics include the molecular weight including the sugar chain, the optimum active temperature, the optimum active pH, the temperature stability, the pH stability, the Km value, and the like.
  • horseradish-derived peroxidase produced using a mutant strain of Cryptococcus as a host has a molecular weight (measured by SDS-PAGE) of about 45 kDa including its sugar chain, and an optimum activity temperature of about 45 ° C.
  • the optimum active pH is about 6.5, which is stable at temperatures below 50 ° C. and stable at pH 5.0 to 10.0.
  • the horseradish-derived peroxidase preferably has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 does not include a secretory signal peptide and a vacuolar retention signal peptide.
  • Test 1 Cryptococcus sp. Acquisition of sugar chain synthesis genes (ALG3 gene, ALG11 gene, OCH1 gene) of S-2 strain 1-1.
  • Cryptococcus sp. Preparation of S-2 strain genomic DNA 50 ml of YM medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, polypeptone 0.5%, glucose 1.0%) was placed in a 500 mL Sakaguchi flask and sterilized in an autoclave. , The medium was prepared.
  • Cryptococcus sp. Reconstructed in advance with YM plate medium.
  • the S-2 strain was inoculated on a YM medium with a single platinum loop, cultured with shaking at 25 ° C.
  • Cryptococcus sp Determination of S-2 strain genome sequence 1-1.
  • the genomic DNA obtained in the above was fragmented using the Nextera XT Sample prep kit (manufactured by Illumina) and tagged. Fragmented fragmented genomic DNA was clustered on a flow cell using the Miseq Reagent kit v2 300 cycle (Illumina) and data acquisition was performed using the Miseq (Illumina).
  • Cryptococcus sp. Cryptococcus sp. Is performed by performing de novo assembly according to a conventional method using CLC GENEMICS Workbench Ver7.5. Whole genome information of S-2 strain was acquired.
  • Cryptococcus sp Acquisition of sugar chain synthesis genes derived from S-2 strain (ALG3 gene, ALG11 gene, OCH1 gene) Based on the whole genome information acquired in 1-2, perform BLAST search using the existing sugar chain synthesis gene derived from aspergillus as a query. Then, the nucleotide sequences of the ALG3 gene, the ALG11 gene, and the OCH1 gene were identified.
  • the base sequence of the ALG3 gene SEQ ID NO: 1 and its upstream and downstream base sequences on the genomic DNA are shown in FIG.
  • the ALG11 gene SEQ ID NO: 2) and its upstream and downstream nucleotide sequences on genomic DNA are shown in FIG.
  • the OCH1 gene (SEQ ID NO: 3) and its upstream and downstream nucleotide sequences on genomic DNA are shown in FIG.
  • Test 2 Acquisition of sugar chain synthase gene disrupted strain Cryptococcus sp., which is a recombinant peroxidase-producing strain.
  • the breeding process in which the OC106 strain was acquired is shown in FIG. First, Cryptococcus sp.
  • the S-2 strain was subjected to displacement treatment by ultraviolet irradiation, and Cryptococcus sp. Acquired U5 shares.
  • the ADE1 gene was removed from the U5 strain by the Pop in-Pop out method described in JP-A-2015-100327, and Cryptococcus sp. Acquired A1U5 shares.
  • the KU70 gene was removed by the Pop in-Pop out method targeting the uracil marker in order to increase the homologous recombination efficiency, and Cryptococcus sp.
  • Cryptococcus sp. A horseradish-derived peroxidase gene was introduced into AK223 by the Pop in method targeting an adenine marker, and Cryptococcus sp.
  • the ADE1-PEO strain was acquired.
  • Cryptococcus sp For the ADE1-PEO strain, the ALG3 gene and the ALG11 gene were removed by the Pop in-Pop out method targeting the uracil marker, and Cryptococcus sp.
  • the AK223 ( ⁇ alg3, ⁇ alg11) strain was acquired. Cryptococcus sp.
  • the AK223 ( ⁇ alg3, ⁇ alg11) strain was subjected to mutation treatment by ultraviolet irradiation, and the productivity of peroxidase was used as an index to obtain Cryptococcus sp.
  • the 3u-4P11G strain was acquired. Cryptococcus sp.
  • the OCH1 gene was disrupted by the Pop in method using the sugar chain content given to peroxidase as an index, targeting the uracil marker, and Cryptococcus sp. Acquired OC106 shares.
  • Test 3 Acquisition of recombinant peroxidase Cryptococcus sp. OC106 strain on SC (-ura) agar medium (1.34% Yeast Nitrogen Base w / o Amino acids, 0.154% -ura DO supplement, 4% D-Glucose, 3% agar powder) at 25 ° C. for 3 days It was cultured and colonies were obtained. The obtained colonies were cultivated in a 60 mL liquid medium (1% glufinal, 0.3% bactoeast extract, 0.5% bactopeptone, 0.3% malt extract, 0.04% adeacanol LG-126, 0.002. % Tetracycline hydrochloride) was cultured at 25 ° C. for 48 hours to prepare a seed culture medium.
  • the production medium (7% meast P1G, 0.011% ferrous sulfate, 0.035% hemron 2HiWS, 0.04% adecanol LG-126, 4.0% Xylose, 0.002% tetracycline hydrochloride, and 50% xylose were added at 6 mL / hr) at 25 ° C. for 6 days. After filtering the cultured cells, the culture supernatant was obtained as a crude enzyme solution.
  • Recombinant peroxidase was isolated and purified from the above crude enzyme solution by the following steps (1) to (4).
  • (1) Concentrated / desalted crude enzyme solution is permeated through a microfiltration membrane having a molecular weight cut off of 100,000, further concentrated with a microfiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000, and replaced with 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.5). A crude enzyme concentrate was obtained.
  • Test 4 Enzyme characterization The enzyme properties of the recombinant peroxidase purified in Test 3 were evaluated. As a comparative control, the characteristics of wild-type peroxidase derived from horseradish (PEO-302 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were similarly evaluated.
  • a mixed solution of 5.8 mM H 2 O 2 aqueous solution measurement process tubes to the 1.5ml 1mMABTS / 100mM sodium acetate buffer with (pH 4.5) in 1.5ml of peroxidase activity was prepared, about 5 minutes preliminary at 25 ° C. Warm.
  • To this reaction solution add 0.1 ml of a peroxidase enzyme solution appropriately diluted with (50 mM phosphate buffer (pH 6.0) /0.1% Triton-X100), mix gently, and then control the temperature to 25 ° C. for water.
  • the change in absorbance at 405 nm is recorded for 5 minutes, and the change in absorbance per minute ( ⁇ OD test ) is measured from the linear portion.
  • 1 unit (U) in peroxidase activity is defined as the amount of enzyme that oxidizes 1 micromol of ABTS per minute under the conditions of pH 4.5 and 25 ° C.
  • U / ml ( ⁇ OD test - ⁇ OD blank ) ⁇ dilution ratio ⁇ 3.1 / (34.7 ⁇ 0.1 ⁇ 1.0)
  • 3.1 is the amount of reaction reagent + enzyme solution (ml)
  • 34.7 is the mmol extinction coefficient (cm 2 / micromol) under the present activity measurement conditions
  • 0.1 is the amount of enzyme solution.
  • Ml and 1.0 indicate the optical path length (cm) of the cell.
  • Lane 1 Molecular Weight Marker (Benchmark Protein Ladder, manufactured by Thermo Scientific)
  • Lane 2 PEO-302 (manufactured by Toyobo Co., Ltd., wild-type peroxidase purified enzyme derived from horseradish)
  • Lane 3 rPEO (recombinant peroxidase purification enzyme, derived from ADE1-PEO strain)
  • Lane 4 rPEO (recombinant peroxidase purification enzyme, derived from Cryptococcus sp. OC106 strain)
  • pH stability Wild-type peroxidase derived from horseradish and Cryptococcus sp. Recombinant peroxidase derived from OC106 strain was added to 100 mM acetate buffer (pH 3.5-6.0), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5-8.0), and 100 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0), respectively. ⁇ 12.0), the concentration was adjusted to 2 U / ml, and the mixture was treated at 25 ° C. for 20 hours to calculate the residual activity. As a result, as shown in FIG. 9, wild-type peroxidase derived from horseradish and Cryptococcus sp. Recombinant peroxidases derived from the OC106 strain both maintained 90% or more activity in the pH range of 5.0 to 10.0.
  • Km value with respect to hydrogen peroxide The Km value of each purified enzyme was calculated by appropriately adjusting the concentration of hydrogen peroxide. As a result, as shown in FIG. 10, the Km value of the wild-type peroxidase derived from horseradish was 1.5 mM, whereas Cryptococcus sp. The Km value of the recombinant peroxidase derived from the OC106 strain was 1.6 mM, which was equivalent.
  • a Hitachi 7060 automatic analyzer was used. 270 ⁇ L of the first reagent was added to 6 ⁇ L of the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to prepare the first reaction. Then, 90 ⁇ L of the second reagent was added and incubated for 5 minutes to obtain a second reaction. The absorbance at 546 nm was measured by a two-endpoint method in which the absorbances of the first reaction and the second reaction were corrected by the amount of liquid and the difference between the absorbances was taken. As a result, the reaction curves when creatinine was measured using the creatinine reagent prepared after storing each enzyme at 4 ° C. for 1 week were equivalent as shown in FIG. 11A. The reaction curves were also the same as shown in 11B when the creatinine reagent prepared after storing each enzyme at 37 ° C. for 3 weeks was used.

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Abstract

糖鎖を含む分子量が西洋ワサビから取得されるペルオキシダーゼと同等であるペルオキシダーゼを組換え生産で得る手段の提供。　ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子が破壊された、クリプトコッカス属菌変異株。

Description

ペルオキシダーゼの組換え生産
　ペルオキシダーゼの組換え生産に関する技術が開示される。
　ペルオキシダーゼは西洋ワサビ（Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ　ｒｕｓｕｔｉｃａｎａ）に豊富に含まれる酵素であり、分析、臨床検査、免疫化学、組織化学、及び細胞化学など幅広い分野で利用されている。近年では分析化学用途に留まらず、廃水処理、環境浄化における有用性から、その需要はますます拡大している。しかしながらペルオキシダーゼをワサビ大根から抽出する場合、品種、栽培条件、気候など様々な要因によってペルオキシダーゼ含量やアイソザイム存在比率に著しい変動があるため安定した品質のペルオキシダーゼを得ることは容易ではない。
　安定した品質のペルオキシダーゼを効率的に生産するため、これまでに遺伝子組換え技術によるペルオキシダーゼの生産が提案されている。例えば、特許文献１では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｒｉｓを宿主として使用してペルオキシダーゼを生産することが試みられている。この場合、ペルオキシダーゼ遺伝子の変異導入により、ある程度生産性は向上するが、ハイパーマンノースと呼ばれる過剰な糖鎖結合による分子量増大、それに伴う比活性の低下、及び変異導入による酵素特性の変化が認められる。
　特許文献２には細胞外多糖の生産を低減したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２菌株を宿主とした異種タンパク質の製造方法が記載されている。特許文献３には当該宿主発現系を使用したペルオキシダーゼの製造が記載されている。しかしファーメンターを用いた大規模スケールの培養で得られた組換えペルオキシダーゼは、依然としてハイパーマンノースの糖鎖結合が認められ、実用化には至っていなかった。
特表２００３－５０３００５号公報 特許第５５８８５７８号公報 特許第５２４５０６０号公報
　糖鎖を含む分子量が西洋ワサビから取得されるペルオキシダーゼと同等であるペルオキシダーゼを組換え生産で得ることが一つの課題である。
　クリプトコッカス属の特定の糖鎖合成酵素を破壊したクリプトコッカス属菌変異株を用いることにより、西洋ワサビが生産するペルオキシダーゼと同等の分子量（糖鎖を含む）を有する西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを生産できることが見出された。係る知見に更なる研究と検討を重ね、下記に代表される手段が提供される。
項１．
　ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子が破壊された、クリプトコッカス属菌変異株。
項２．
　西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、項１に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項３．
　更にＵＲＡ５遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、及び／又はＫＵ７０遺伝子が破壊されている、項１又は２に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項４．
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された分子量が約４５ｋＤａである西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを生産する、項１～３のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項５．
　クリプトコッカス属菌のＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊することを含む、クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法。
項６．
　西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することを更に含む、項５に記載の方法。
項７．
　クリプトコッカス属菌が西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、項５に記載の方法。
項８．
　ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊する前に、ＵＲＡ５遺伝子及び／又はＡＤＥ１遺伝子を破壊することを含む、項５～７のいずれかに記載の方法。
項９．
　更に、ＡＬＧ遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、及び／又はＫＵ７０遺伝子を破壊することを含む、項５～８のいずれかに記載の方法。
項１０．
　クリプトコッカス属菌変異株が、項１～４のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株である、項５～９のいずれかに記載の方法。
項１１．
　項１～４のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株を培養することを含む、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造する方法。
　一実施形態において、糖鎖付加能力が制御されたクリプトコッカス属菌が提供される。一実施形態において、西洋ワサビが生産するペルオキシダーゼと糖鎖を含む分子量が同等であるペルオキシダーゼを組換え生産することが可能である。
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株のＡＬＧ３遺伝子及びその前後の塩基配列の塩基配列を示す。 Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株のＡＬＧ１１遺伝子及びその前後の塩基配列の塩基配列を示す。 Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株のＯＣＨ１遺伝子及びその前後の塩基配列の塩基配列を示す。 糖鎖合成酵素遺伝子破壊株の育種過程の一例を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼのＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した分子量を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの至適温度を測定した結果を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの至適ｐＨを測定した結果を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの温度安定性を測定した結果を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの至適温度を測定した結果を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの過酸化水素に対するＫｍ値を測定した結果を示す。 組換え生産したペルオキシダーゼの過酸化水素と西洋ワサビから取得したペルオキシダーゼを用いてクレアチニンを測定した際の反応曲線を比較した結果を示す。
１．クリプトコッカス属菌変異株
　クリプトコッカス属菌変異株は、ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子が破壊されていることが好ましい。ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子が破壊されているとは、これらの遺伝子が発現しない状態を意味する。これらの遺伝子を破壊する手法は任意であり、特に制限されない。一実施形態において、遺伝子破壊は、相同組換えを利用して行うことが好ましく、例えば、特開２０１５－１００３２７に開示された手法で実施することができる。
　ＡＬＧ３遺伝子は、脂質結合型糖鎖の合成に関わるα１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードする。α１，３マンノシルトランスフェラーゼはドリコールリン酸マンノースをその供与体基質として用いる。ＡＬＧ３遺伝子の塩基配列の一例を図１に示す。ＡＬＧ１１遺伝子は、脂質結合型糖鎖の合成に関わるα１，２マンノシルトランスフェラーゼをコードする。α１，２マンノシルトランスフェラーゼはＧＤＰマンノースをその供与体基質として用いる。ＡＬＧ１１遺伝子の塩基配列の一例を図２に示す。ＯＣＨ１遺伝子は、ゴルジ体で働くα１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする。ＯＣＨ１遺伝子の塩基配列の一例を図３に示す。
　クリプトコッカス属菌のＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊することにより、タンパク質に対する糖鎖付加が制御され、これを宿主として西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを組換え生産すると、その糖鎖を含む分子量が、西洋ワサビにおいて生産される当該ペルオキシダーゼの糖鎖を含む分子量と同等になる。一実施形態において、変異型クリプトコカス属菌を宿主として組換え生産した西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは、その糖鎖を含む分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定したもの）が約４５ｋＤａであることが好ましい。また、そのようにして組換え生産されたペルオキシダーゼの各種酵素特性は、西洋ワサビが生産するペルオキシダーゼと同等である。よって、当該クリプトコッカス属菌変異株は、西洋ワサビが生産するペルオキシダーゼと同等のペルオキシダーゼを生産する宿主として有用である。
　一実施形態において、クリプトコッカス属菌変異株は、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを生産できるように、それをコードする遺伝子で形質転換されていることが好ましい。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１０）は公知である。一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、特許文献２に記載されるように、クリプトコッカス属を宿主とした発現に適するようにコドンユーセッジが最適化されていることが好ましい。
　一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１０の塩基配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有することが好ましい。ここで、「同一性」は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。例えば、具体的には、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢＬＡＳＴ　２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値（%）を算出することができる。
　一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、その発現により生産されるペルオキシダーゼが菌体外に分泌されるように、上流にシグナル配列を有することが好ましい。シグナルペプチドとしては、例えば、特許文献２又は３に記載されるものを使用することができる。一実施形態において、シグナルペプチドは、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株の酸性キシラナーゼの分泌シグナルペプチドであることが好ましい。また、一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、菌体内への残存量が低減されるように液胞滞留シグナルペプチドが除去されていることが好ましい。
　形質転換の手法は特に制限されず、当該塩基配列を有するＤＮＡを適当なベクターに組み込み、クリプトコッカス属菌に導入することで実施できる。形質転換は相同組換えを利用して行うこともできる。一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子による形質転換は、ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊した後に、行うこともできる。
　ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊する対象となるクリプトコッカス属菌（以下、「遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌」ともいう。）は、任意であり、特に制限されない。遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌の具体例として、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓなどをあげることができる。一実施形態において、好ましい遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２である。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株は、特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６１として平成７年９月５日に国際寄託されている。
　一実施形態において、遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、ウラシル要求性であることが好ましい。ウラシル要求性を利用して効率的に遺伝子破壊を行うことができる。ウラシル要求性のクリプトコッカス属菌は、任意の手法で得ることができる。例えば、ウラシル要求性クリプトコッカス属菌は、特許文献１又は２に記載されるように、クリプトコッカス属菌に紫外線を照射し、突然変異を生じさせて得ることができる。具体的には、クリプトコッカス属菌に紫外線を照射し、、５－フルオロオロト酸を含む培地で培養し、生育する株を選抜することにより取得することができる。一実施形態において、好ましいウラシル要求性遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２　Ｕ５株である。
　一実施形態において、遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、ＫＵ７０遺伝子が破壊されていることが好ましい。ＫＵ７０遺伝子を破壊することにより、相同組換えの頻度を高め、より効率に相同組換えによってＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊することができる。ＫＵ７０遺伝子の破壊は、例えば、特許文献３に記載される手法で行うことができる。
　一実施形態において、遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、アデニン要求性であることが好ましい。アデニン要求性を利用して効率的に遺伝子破壊を行うことができる。アデニン要求性クリプトコッカス属菌は、任意の手法で得ることができる。例えば、アデニン要求性クリプトコッカス属菌は、特許文献２又は３に記載されるように、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ－ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅをコードするＡＤＥ１遺伝子を破壊することにより得ることができる。一実施形態において、好ましいアデニン要求性遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２　Ｄ１１株である。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２　Ｄ１１株は、特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４８２として国際寄託されている。
　一実施形態において、遺伝子未破壊クリプトコッカス属菌は、ウラシル要求性であり、アデニン要求性であり、且つ、ＫＵ７０遺伝子が破壊されていることが好ましい。
２．クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法
　クリプトコッカス属菌のＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊することにより、クリプトコッカス属菌変異株を製造することができる。ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子、クリプトコッカス属菌、並びに、前記遺伝子を破壊する手法は上述したとおりである。遺伝子の破壊は、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されているクリプトコッカス属菌に対して行ってもよく、当該形質転換がされていないクリプトコッカス属菌に対しておこなってもよい。後者の場合、遺伝子破壊工程の途中又は遺伝子破壊の後に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することができる。
　一実施形態において、上述したように、上記遺伝子破壊を行うクリプトコッカス属菌は、ウラシル要求性、アデニン要求性、及び／又はＫＵ７０遺伝子が破壊されていることが好ましい。
３．西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの製造方法
　上述の西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されたクリプトコッカス属菌変異株を培養することにより、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造することができる。
　培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常、液体培養であり、通気攪拌培養が好ましい。栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものを広く使用することができる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。
　炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などを挙げることができる。その他の栄養源としては、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、アミノ酸、及びビタミン類などを挙げることができる。
　培養温度は、クリプトコッカス属菌変異株が発育してペルオキシダーゼを生産する範囲で適宜選択できる。通常は２０～２５℃程度である。培養時間は、ペルオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６０～１２０時間程度である。培地のｐＨは、クリプトコッカス属菌変異株が発育しペルオキシダーゼを生産する範囲で適宜選択でき、通常はｐＨ３．０～９．０程度である。
　上記クリプトコッカス属菌変異株を培養して得られる菌体を含む培養液をそのまま採取し、ペルオキシダーゼとして利用することができるが、一般には、常法に従って、予め培養液を濾過、遠心分離などによりペルオキシダーゼを分離することが好ましい。
　一実施形態において、ペルオキシダーゼ含有培養液からペルオキシダーゼを精製して利用することが好ましい。精製方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の処理を挙げることができる。
　一実施形態において、クリプトコッカス属菌変異株を宿主として生産される西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼは、西洋ワサビが生産するペルオキシダーゼと同等の特性を有する。ここで、特性には、糖鎖を含む分子量、至適活性温度、至適活性ｐＨ、温度安定性、ｐＨ安定性、及びＫｍ値などが含まれる。例えば、クリプトコッカス属菌変異株を宿主として生産される西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼは、その糖鎖を含む分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定）は約４５ｋＤａであり、至適活性温度は約４５℃であり、至適活性ｐＨは約６．５であり、５０℃以下の温度で安定であり、ｐＨ５．０～１０．０で安定である。一実施形態において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは、配列番号１１のアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号１１のアミノ酸配列は、分泌シグナルペプチド及び液胞滞留シグナルペプチドを含まない。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
試験１．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株の糖鎖合成遺伝子（ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、ＯＣＨ１遺伝子）の取得
１－１．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株ゲノムＤＮＡの調製
　５０ｍｌのＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、培地を調製した。予めＹＭプレート培地で復元したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株をＹＭ培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養し、ミラクロス（メルク社製）により濾過することで菌体を取得した。取得した菌体を液体窒素中で凍結破砕し、５ｍｌのフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ７．２）の混合液を加え、十分に懸濁した後、室温にて３０００ｒｐｍ２０分遠心し、水層約４ｍｌを試料とした。本試料を、ＭａｇＥｘｔｏｒａｃｔｏｒ―ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｅ－（東洋紡製）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
１－２．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株ゲノム配列の決定
　１－１．で取得したゲノムＤＮＡをＮｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　Ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（イルミナ社製）を用いて断片化し、タグメンテーションを実施した。タグメンテーションした断片化されたゲノムＤＮＡをＭｉｓｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　ｖ２　３００サイクル（イルミナ社）を使用して、フローセル上にクラスタリングし、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社）を用いてデータ取得を実施した。取得したＦＡＳＴＱファイルを元に、ＣＬＣ　ＧＥＮＯＭＩＣＳ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ　Ｖｅｒ７．５を使用し定法にそってデノボアッセンブルを行うことで、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株のホールゲノム情報を取得した。
１－３．Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株由来糖鎖合成遺伝子（ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、ＯＣＨ１遺伝子）の取得
　１－２で取得したホールゲノム情報をもとに、既存の麹菌由来糖鎖合成遺伝子をＱｕｅｒｙとしてＢＬＡＳＴサーチを実施し、ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子の塩基配列を同定した。ＡＬＧ３遺伝子の塩基配列（配列番号１）並びにゲノムＤＮＡ上のその上流及び下流の塩基配列を図１に示す。ＡＬＧ１１遺伝子（配列番号２）並びにゲノムＤＮＡ上のその上流及び下流の塩基配列を図２に示す。ＯＣＨ１遺伝子（配列番号３）並びにゲノムＤＮＡ上のその上流及び下流の塩基配列を図３に示す。
試験２．糖鎖合成酵素遺伝子破壊株の取得
　組換えペルオキシダーゼ生産菌株であるＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株を取得した育種過程を図４に示す。まずＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２株を紫外線照射による変位処理に供し、ウラシル要求性となったＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｕ５株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｕ５株に対し、特開２０１５－１００３２７に記載されたＰｏｐ　ｉｎ-Ｐｏｐ　ｏｕｔ法によってＡＤＥ１遺伝子を除去し、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ａ１Ｕ５株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ａ１Ｕ５株に対し、相同組換え効率を高めるためにウラシルマーカーをターゲットとしてＫＵ７０遺伝子をＰｏｐ　ｉｎ-Ｐｏｐ　ｏｕｔ法によって除去し、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ２２３株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ２２３に対し、アデニンマーカーをターゲットとして西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ遺伝子をＰｏｐ　ｉｎ法によって導入し、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＤＥ１-ＰＥＯ株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＤＥ１-ＰＥＯ株に対し、ＡＬＧ３遺伝子及びＡＬＧ１１遺伝子をウラシルマーカーをターゲットとしてＰｏｐ　ｉｎ-Ｐｏｐ　ｏｕｔ法によって除去し、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ２２３（Δａｌｇ３、Δａｌｇ１１）株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ２２３（Δａｌｇ３、Δａｌｇ１１）株に対し、紫外線照射による変異処理を行って、ペルオキシダーゼの生産性を指標にして、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．３ｕ－４Ｐ１１Ｇ株を取得した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．３ｕ－４Ｐ１１Ｇ株に対して、ペルオキシダーゼに付与される糖鎖含有量を指標に、ＯＣＨ１遺伝子をウラシルマーカーをターゲットとしてＰｏｐ　ｉｎ法によって破壊し、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株を取得した。
試験３．組換えペルオキシダーゼの取得
　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株をＳＣ（－ｕｒａ）寒天培地（１．３４％ Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１５４％－ｕｒａ　ＤＯ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、４％　Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ、３％寒天粉末）で２５℃、３日間培養し、コロニーを取得した。得られたコロニーを６０ｍＬ液体培地（１％グルファイナル、０．３％バクトイーストエキストラクト、０．５％バクトペプトン、０．３％マルトエキストラクト、０．０４％アデアカノールＬＧ-１２６、０．００２％テトラサイクリン塩酸塩）で２５℃、４８ｈｒ培養し、種培養液とした。種培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、生産培地（７％ミーストＰ１Ｇ、０．０１１％硫酸第一鉄、０．０３５％ヘムロン２ＨｉＷＳ、０．０４％アデカノールＬＧ-１２６、４．０％キシロース、０．００２％テトラサイクリン塩酸塩、５０％キシロースを６ｍＬ／ｈｒで流加）で２５℃、６日間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を粗酵素溶液として取得した。
　上記の粗酵素溶液から、以下のステップ（１）～（４）により、組換えペルオキシダーゼを単離精製した。
（１）濃縮・脱塩
　粗酵素溶液を分画分子量１０００００の限界濾過膜を透過させ、さらに、分画分子量３００００の限界濾過膜で濃縮し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
（２）ＳＰセファロース（ＧＥヘルスケア社製）による精製
　１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化させたＳＰ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗカラムに粗酵素濃縮液を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
（３）Ｏｃｔｙｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）による精製
　活性画分を、６０％硫酸アンモニウム飽和（ｐＨ４．５）になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。６０％飽和硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化させたＯｃｔｙｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
（４）濃縮・脱塩
　活性画分を分画分子量１００００の限界濾過膜で濃縮し、イオン交換水に置換した。
試験４．酵素特性評価
　試験３で精製した組換えペルオキシダーゼの酵素の特性を評価した。比較対照として、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ―３０２）についても同様に特性を評価した。
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
　試験管に１．５ｍｌの１ｍＭＡＢＴＳ／１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）と１．５ｍｌの５．８ｍＭ Ｈ２Ｏ２水溶液の混合溶液を調製し、２５℃で約５分間予備加温する。この反応液に（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）で適宜希釈したペルオキシダーゼ酵素溶液０．１ｍｌを添加し緩やかに混和後、水を対象に２５℃に制御された分光光度計で、４０５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｔｅｓｔ）を測定する。盲検はＰＯＤ溶液の代わりにペルオキシダーゼを溶解、希釈する溶液を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。これらの値から以下の式に従ってペルオキシダーゼ活性を求める。ここで、ペルオキシダーゼ活性における１単位（Ｕ）は、ｐＨ４．５、２５℃条件下で１分間に１マイクロモルのＡＢＴＳを酸化する酵素量として定義している。
 
Ｕ／ｍｌ＝（ΔＯＤｔｅｓｔ－ΔＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率×３．１／（３４．７×０．１×１．０）
 
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、３４．７は本活性測定条件におけるミリモル吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
４－１．分子量
　Ｎｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気動により、各精製酵素の分子量を求めた。泳動サンプルは以下の通りである。
　レーン１：分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ）
　レーン２：ＰＥＯ－３０２（東洋紡社製、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ精製酵素）
　レーン３：ｒＰＥＯ（組換えペルオキシダーゼ精製酵素、ＡＤＥ１-ＰＥＯ株由来）
　レーン４：ｒＰＥＯ（組換えペルオキシダーゼ精製酵素、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来）
　図５に示すとおり、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼの糖鎖を含んだ分子量は約４５ｋＤａであり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼと同等の分子量を有していることが明らかとなった。一方で糖鎖合成遺伝子を破壊していないＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＤＥ１-ＰＥＯ株由来の組換えペルオキシダーゼの糖鎖を含んだ分子量は約５５ｋＤａであり、過剰な糖鎖が付着して高分子量化している可能性が示唆された。
４－２．至適温度
　２０℃から７０℃における酵素活性を測定した。その結果は、図６に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼは共に至適温度は４５℃であった。
４－３．至適ｐＨ
　西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０～６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０～８．０）、で1Ｕ／ｍｌ濃度に調製した後、相対活性を算出した。その結果、図７に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼの至適ｐＨは共にｐＨ６．５の範囲であった。
４－４．熱安定性
　西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、３７℃～８０℃の温度で１０分間処理し、残存活性を算出した。その結果、図８に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼは共に５０℃まで９０％以上の活性を維持していた。
４－５．ｐＨ安定性
　西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５～６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５～８．０）、１００ｍＭグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０～１２．０）、で２Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、２５℃で２０時間処理し、残存活性を算出した。その結果、図９に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼは共にｐＨ５．０～１０．０の範囲で９０％以上の活性を維持していた。
４－６．過酸化水素に対するＫｍ値
　過酸化水素の濃度を適宜調整して、各精製酵素のＫｍ値を算出した。結果、図１０に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ぺルオキシダーゼのＫｍ値は１．５ｍＭに対して、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来組換えペルオキシダーゼのＫｍ値は１．６ｍＭあり同等であった。
４－７．キット評価
　２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼと西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼを１０Ｕ／ｍＬに調製した後、４℃、１週間および３７℃、３週間で保存した。その後、下記の試薬を調製し、５ｍｇ／ｄＬクレアチニンを測定した。
＜第一試薬＞
２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
０．３９ｇ／ｄＬ　ＥＤＴＡ／３Ｎａ
３．３ｇ／ｄＬ  ＮａＣｌ
１．０ｇ／ｄＬ　トリトンＸ－１００　
５０Ｕ／ｍＬ　クレアチンアミジノヒドロラーゼ　(東洋紡社製ＣＲＨ－２２１) 
１２Ｕ／ｍＬ　ザルコシンオキシダーゼ　(東洋紡社製ＳＡＯ－３５１)
＜第二試薬＞
２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
０．２５ｇ／ｄＬ　ＮａＮ３
０．０４５ｇ／ｄＬ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｆｅｒｒｏｃｙａｎａｄｅ
１．０ｇ／ｄＬ　トリトンＸ－１００　
３００Ｕ／ｍＬクレアチニンアミドヒドロラーゼ(東洋紡社製ＣＮＨ－３１１)
０．０～１．２Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ
　日立７０６０形自動分析機を用いた。試料６μＬに第一試薬２７０μＬを添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし、第一反応とした。その後、第二試薬９０μＬを添加し５分間インキュベーションし、第ニ反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２エンドポイント法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。結果、各酵素を４℃、１週間保存した後に調製したクレアチニン試薬を用いてクレアチニンを測定した際の反応曲線は、図１１Ａに示すとおり同等であった。また各酵素を３７℃、３週間保存した後に調製したクレアチニン試薬を用いた場合も１１Ｂに示すとおり反応曲線は同等であった。
　このことから西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＯＣ１０６株由来の組換えペルオキシダーゼは同等の性能を有していると考える。

Claims (7)

  1. 　ＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子が破壊された、クリプトコッカス属菌変異株。
  2. 　西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、請求項１に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
  3. 　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された分子量が約４５ｋＤａである西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを生産する、請求項１又は２に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
  4. 　クリプトコッカス属菌のＡＬＧ３遺伝子、ＡＬＧ１１遺伝子、及びＯＣＨ１遺伝子を破壊することを含む、クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法。
  5. 　西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することを更に含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　クリプトコッカス属菌が西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、請求項４に記載の方法。
  7. 　請求項２に記載のクリプトコッカス属菌変異株を培養することを含む、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造する方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2015144585A (ja) * 2014-02-04 2015-08-13 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
JP2018061520A (ja) * 2018-01-26 2018-04-19 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
JP2019033764A (ja) * 2018-12-06 2019-03-07 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法

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