KR20030006724A - 신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자,그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법 - Google Patents

신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자,그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 Ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법 및 이를 이용한 D-아미노산의 제조방법에 관한 것으로써, 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스(Brevibacillus borstelensis)으로부터 단리된 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 그의 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 클로닝벡터와 발현벡터, 이러한 벡터가 도입된 형질전환체, 이러한 형질전환체를 이용한 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 제조방법 및 이러한 제조방법에 의하여 얻어진 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용한 D-아미노산의 제조방법에 관한 것으로써, 본 발명에 따르면 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제가 제공되고, D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 유전공학적으로 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라, D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 DL-아미노산 아미드 혼합물로부터 산업적으로 유용한 다양한 D-아미노산을 순수하게 생산할 수 있다.

Description

신규한 Ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법, 이를 이용한 Ｄ-아미노산의 제조방법{Novel D-stereo specific amino acid amidase, gene thereof, preparation method thereof and production method of D-amino acid by using the same}
본 발명은 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스 (Brevibacillus borstelensis) 유래의 신규한 Ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 제조방법, 이를 이용한 D-아미노산의 제조방법에 관한 것으로써, 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스(Brevibacillus borstelensis)로부터 단리된 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 그의 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 클로닝벡터와 발현벡터, 이러한 벡터가 도입된 형질전환체, 이러한 형질전환체를 이용한 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 제조방법 및 이러한 제조방법에 의하여 얻어진 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용한 D-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 아미노산들은 대부분 광학활성을 나타내는 알파탄소를 가지고 있으며 입체특이성에 따라 L-아미노산과 D-아미노산으로 나뉜다. 자연계에존재하는 대부분의 단백질은 L-아미노산으로 구성되어 있으나, 예외적으로 미생물의 펩티도글리칸이나 펩티드계 항생물질의 구성성분 및 고등식물의 생리활성물질의 구성성분 등은 D-아미노산으로 구성되어 있다.
현재까지의 연구에 의하면, D-아미노산은 신경전달물질, 백신, 합성감미료, 항생제 및 호르몬 등의 생리활성물질을 합성하는 중간물질로서 식품과 의약분야에서 널리 이용되고 있으며, 이에 D-아미노산을 생산하는 방법들이 개발되어 왔다.
D-아미노산을 생산하는 방법은 크게 화학 합성법과 생물촉매로 사용하여 생산하는 방법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 의한 아미노산의 생산은 D- 또는 L-아미노산이 혼합된 상태(racemic mixture)로 생성물이 얻어지기 때문에, 순수한 D-아미노산을 얻기 위해서는 또 다른 복잡한 광학적 순수화 과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 이에 비해 미생물 생물촉매를 이용한 D-아미노산 생산방법은 광학적으로 순수한 D-아미노산만을 한 단계로 직접 생산할 수 있기 때문에 환경오염의 문제점을 가지고 있는 다단계 화학합성법을 대체할 수 있는 저공해 청정생산기술로서 주목받고 있다.
생물촉매를 이용한 D-아미노산 생산법으로는 DL-아미노산 혼합물로부터 D-아미노산만을 순수하게 분리하여 생산하는 방법이 연구되었는데, 상기 방법은 DL-아미노산 혼합물을 DL-아미노산 아미드로 만든 후, 여기에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 작용시켜 DL-아미노산 아미드에서 D-아미노산 아미드만을 선택적으로 가수분해하여 D-아미노산을 제조하는 것이다. 따라서 D-아미노산 생산에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 사용하면 비교적 저렴한 DL-아미노산 혼합물(racemic mixture)로부터 산업적으로 유용한 다양한 D-아미노산을 생산할 수 있다는 장점이 있다.
현재까지 이러한 D-아미노산 생산기술에 사용될 수 있을 것으로 알려진 생물촉매로서는, 중온성 미생물인 바실러스 쎄레우스(Bacillus cereus) 유래의 D-입체특이적 펩티다아제(Asano et al.,J. Biol. Chem.271: 30256-30262.1996)와 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi) 유래의 D-아미노산 아미다아제(Asano et al.,Biochem. Biophy. Res. Com.162: 470-474. 1989) 등이 알려져 있으나, 이들 효소를 이용한 D-아미노산의 생산에 관한 연구 보고는 아직까지 없는 상태이다. 또한 이들 균주가 생산하는 효소는 37℃ 이하에서 최적 효소활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 50℃ 이상의 높은 온도에서 효소활성을 유지하는 고온성 미생물 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 펩티다아제에 대한 연구는 진행되어 있지 않다.
효소를 생물촉매로 이용하는 생물전환공정에 있어서 생물촉매의 안정성은 효소전환 합성기술의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인이다. 일반적으로 고온의 생육환경에 서식하는 고온성 미생물들은 서식지의 고온 극한환경에 적응하여 열에 대하여 매우 안정한 내열성 효소를 생산한다. 그리고 이러한 내열성 효소는 열에 안정한 특징 이외에도 유기용매에 대한 안정성, pH에 대한 안정성 및 화학변성제 등에 대한 안정성도 가지고 있는 것으로 보고되고 있어 효소전환 합성기술에 사용되는 가장 적합한 생물촉매이다. 따라서 높은 온도에서 효소활성을 유지하는 고온성 미생물 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 펩티다아제에 대한 연구가 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 신규한 고온성 미생물인 브레비바실러스 보스틸렌시스 로부터 신규한 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코딩하고 있는 유전자를 단리하여 염기서열을 밝히고, D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 DL-아미노산 아미드 혼합물로부터 순수한 D-아미노산을 생산할 수 있는 방법을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제 1의 목적은 D-아미노산 아미드에 입체특이적으로 작용하여 D-아미노산을 생산할 수 있는 고온성 미생물로부터 단리된 신규한 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 그의 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2의 목적은 상기 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자를 포함하는 재조합 클로닝벡터와 발현벡터, 그의 형질전환체 및 이를 이용한 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3의 목적은 상기 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 산업적으로 유용한 D-아미노산의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1는 본 발명의 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자의 클로닝을 위한 재조합 플라스미드(pDAP)의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 2은 재조합 미생물에서 본 발명의 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 대량발현을 위한 벡터(pBDA)의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 3는 온도에 따른 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성과 열안정성을 나타낸 그래프이고,
● : 최적 온도, ○ : 열 안정성,
도 4는 pH에 따른 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성과 안정성을 나타낸 그래프이고,
□ : 메스(MES), ■ : 비스-트리스(Bis-Tris),
○ : 트리스(Tris), ● : 캡스(CAPS),
도 5은 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 의한 DL-페닐알라닌 아미드로부터 순수한 D-페닐알라닌을 생산하는 크로마토그래피의 그래프이고,
도 6은 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 의한 DL-페닐알라닌 아미드로부터 효소 전환반응에 의한 D-페닐알라닌 생산을 나타낸 그래프이다.
● : 0.674 unit, ■ : 1.348 unit, ▲ : 2.022 unit
본 발명은 상기 제 1의 목적을 달성하기 위하여, 고온성 미생물인 브레비바실러스 보스테렌시스(Brevibacillus borstelensis)으로부터 단리된 내열성의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 그의 유전자를 제공한다.
본 발명의 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는서열번호 1로 기재되는 N-말단 아미노산 서열을 포함하고 있으며서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하며, 그의 유전자는서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다. 그러나, 아미노산의 치환, 결실 및 첨가로 인한 새로운 서열의 단백질일지라도 본 발명의서열번호 1로 기재되는 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 물리, 화학적 특성이 유사한 경우 또한 본 발명의 범주에 해당함은 당연하며, 상기서열번호 3의 아미노산 서열과 90%의 상동성을 가지는 모든 아미노산 서열을 포함한다. 아울러,서열번호 2로 기재되는 염기서열 뿐만 아니라 번역(translation) 되었을 때서열번호 3또는 그의 유사체를 생산할 수 있는 모든 염기서열이 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에 있어서는 당연하다.
본 발명자들은 고온성 브레비바실러스 보스테렌시스로부터 염색체 DNA를 분리하고, 상기 분리한 DNA 단편들을 제한효소로 부분 가수분해하여 벡터 pUC118에 삽입하여 재조합 플라즈미드를 제조하고 이를 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 형질전환체 중 D-아미노산 아미다아제 활성을 갖는 형질전환체를 선별하고, 상기 형질전환체가 포함하는 재조합 플라즈미드를 "pDAP"라 명명하고(도 1참조), 위의 pDAP가 포함된 형질전환체를 DH5α/pDAP라 명명하였다. 상기 재조합 플라즈미드 pDAP는서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하고 있고, 이는서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩한다. 본 발명자들은 상기 형질전환체를 2001년 7월 11일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10009 BP).
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 약 85℃에서 최적의 활성을 나타내며, 열안정성은 약 90℃까지 비교적 안정한 특성을 보인다(도 3참조). 또한, pH7 - pH10까지 pH 안정성을 지니고 pH9에서 최적 효소활성을 나타내고, EDTA, DTT, 머캅토 에탄올 등은 효소활성에 저해효과를 나타낸다(도 4참조).
금속이온의 영향에서는 Cu2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cd2+, Li+, K+, Na+등은 효소활성에 큰 영향을 나타내지 않으나, Co2+와 Mn2+을 반응액에 첨가하면 효소활성이 크게 증가한다.
본 발명은 상기 제 2의 목적을 달성하기 위하여,서열번호 4의 염기서열로 구성된 유전자를 포함하는 발현벡터 pBDA, 이러한 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 이러한 형질전환체를 배양하고 그 배양액으로부터 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 회수하는 것을 특징으로 하는 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 재조합 플라즈미드 pDAP로부터 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코딩하는 부분을 pHCE 19T(Ⅱ) 발현벡터에 클로닝하여,서열번호 4의 염기서열로 구성된 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자를 포함하는 발현벡터를 "pBDA"라 명명하였다(도 2참조). pBDA 발현벡터를 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켜 상기 형질전환체를 XL1-Blue/pBDA라 명명하였다.
상기 형질전환체 XL1-Blue/pBDA를 대량 발현시키고 이 배양액을 열 처리한 후 이온 교환수지에 흡착시키고 소수성 결합수지에 흡착시켜 정제하여 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 얻는다.
또한, 본 발명은 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용한 D-아미노산의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 D-아미노산 아미드에 입체특이적으로 작용하여 D-아미노산과 암모니아를 생산한다. 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 상기와 같은 효소학적 특성 및 입체특이성을 이용하여 DL 형태가 혼합된 라세믹 형태의 아미노산 아미드로부터 직접 광학적으로 순수한 D-아미노산을 효소적으로 생산할 수 있다. 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제가 생산할 수 있는 D-아미노산에는 D-알라닌, D-루이신, D-노르루이신, D-노르발린, D-페닐알라니, D-티로신, D-발린, D-라이신, D-트립토판, D-글루타민, D-아스파라긴, D-메티오닌, D-프롤린 및 D-아스파르트산이 있다.
상기의 기질특이성을 가진 본 발명의 신규 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 저가의 DL-아미노산 아미드 혼합물로부터 다양한 D-아미노산을 생산하는데 유용한 생물촉매로 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<참고예 1> D-아미노산 아미다아제를 생산하는 신규한 고온성 미생물 균주의 분리 및 동정
본 발명자들은 내열성 D-아미노산 아미다아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 고온성 미생물이 생육할 수 있는 다양한 환경(건초더미, 부식토, 하천, 폐수, 온천) 등지에서 채취한 토양시료를 사용하였다.
구체적으로, 상기 토양시료를 1.5% 폴리펩톤, 0.2% 글리세롤, 0.2% 효모 추출액, 0.2% 고기 추출액, 0.2% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.026% NH4Cl의 조성을 갖는 MY 배지에 접종하고 55℃에서 배양한 후 상기 배양액을 2% 한천을 포함한 LB 배지(1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% 식염, pH 6.8)에 접종하고 55℃에서 배양하여 순수한 균 집락(colony)을 선별 분리하였다. 분리된 균주를 55℃에서 배양한 후 24시간 이내에 미생물의 성장이 관찰된 균 집락을 선별 분리하였고, 분리된 미생물을 5 ㎖ LB 액체배지에 접종하고 55℃에서 10시간 배양 후, 원심분리에 의해 균체를 회수하여 초음파 파쇄기로 균체를 파쇄하여 조효소액을 얻었다.
상기의 조효소액을 2 mM D-알라닐-파라-니트로아닐리드(D-AlaPNA)를 함유하는 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)에 0.1%(w/v)되게 가하여 55℃에서 항온 배양한 후 파라-니트로아닐리드(PNA) 생성에 의해 나타나는 노란색 발색을 405 nm에서 흡광도 측정하였고, 검증을 위해 D-아미노산 아미드를 기질로 하여 생성된 D-아미노산을 아미노산 분석기(Hitachi, 일본)를 이용하여 분석한 후 D-아미노산 아미다아제 생산균으로 선별하였다.
그 결과, 상기에서 분리한 고온성 미생물은 LB 한천 평판배지에서 배양하였을 때, 유백색의 균 집락을 형성하였으며 가장자리는 톱니모양을 가진 균 집락을 형성하였고, 55℃ 이상의 호기적 조건에서 잘 자라고 액체 및 고체 배지에서 장시간 배양시 필라멘트형의 균체 외각에서 포자낭(sporangium)이 돌출해 타원형의 내생포자를 형성하는 그램 양성 세균으로서 전형적인 바실러스 속(Bacillus genus)의 미생물로 확인되었으며, 탄소원의 이용에서는 프룩토스(fructose) 및 만노스(mannose) 등에서만 미약한 반응성을 보일 뿐 대부분의 탄소원에서는 음성반응을 나타내었다.
본 발명자들은 상기 고온성 미생물의 균체성장에 미치는 온도의 영향을 조사하고자 LB 액체배지(pH 6.8)를 이용한 다양한 온도범위(30-58℃)에서 균체의 성장속도를 확인한 결과, 균체의 비성장률(specific growth rate, μ)이 30℃에서 0.006, 37℃에서 0.016, 40℃에서 0.017, 45℃에서 0.019, 50℃에서 0.018, 55℃에서 0.007, 58℃에서 0.002을 나타내어, 본 발명의 분리균의 최적 성장온도는 45℃로 확인되었으며 최대 성장 가능온도는 58℃로 확인되었다.
일반적으로 본 발명의 분리균과 형태학적 및 생리학적 특성에서 유사성을 나타내는 바실러스 보스테렌시스(Bacillus borstelensis)는 최대 균체 성장온도가 30℃이고, 최대 성장가능 온도는 50℃로서(Shida et al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 1995, 45, 93-100) 본 발명의 분리균과는 상당한 차이를 보였으며, 또한 바실러스 보스테렌시스의 효소학적 특징이 연구된 바가 없으므로, 상기 균주는 현재까지 밝혀진 바가 없는 새로운 효소활성 보유의 신규 고온균으로 확인되었다. 이에, 본 발명자들은 상기 균주의 생리학적, 생화학적 특성을 확인한 결과 상기 고온균은 그램양성균이고, 트립토판 디아미다아제를 생산하는 신규한 균주임을 확인하였다(표 1).
생리학적 및 생화학적 특성 신규 미생물에서 얻어진 결과
생장온도 30-58℃
세포모양 막대모양
그램염색 양성
운동성 양성
내생포자 있음
보게스-프로스카우어(Voges-Proskauer) 양성
니트레이트 환원력 양성
글루코오즈로부터의 산 생성 음성
만니톨로부터의 산 생성 음성
아라비노스로부터의 산 생성 음성
베타-갈락토시다아제 생성 음성
트립토판 디아미다아제 생산 양성
카달라아제 생산 양성
젤라티나아제 생산 양성
pH5.7에서의 생장 약함
7% 식염내의 생장 음성
혐기적 조건에서의 생장 양성
상기표 1과 같은 미생물학적 특성을 갖는 본 발명에서 분리한 신규한 고온균의 보다 정확한 동정을 위해, 본 발명자들은 고온균의 16S rDNA의 유전자 분석을 하였다. 유전자 분석을 위해 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머를 사용하여 16S rDNA 유전자를 PCR로 증폭하여 플라스미드 pT7Blue (Novagen Inc., 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 결정하였으며, 상기 고온균의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 검색하여 기존에 보고된 여러 미생물의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 비교한 결과, 브레비바실러스 보스테렌시스(Brevibacillus borstelensis)와 99.7%의 상동성을 나타내어 가장 근접한 균주로 확인되어 상기 분리균을 브레비바실러스 보스테렌시스로 동정하고 "브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1"으로 명명하였다.
본 발명자들은 상기 브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1을 1999년 10월 21일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0673BP).
<실시예 1> 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 클로닝과 염기서열 분석
상기 참고예 1에서 분리한 본 발명의 고온성 브레비바실러스 보스테렌시스 로부터 염색체 DNA를 분리하고, 상기 염색체 DNA를 제한효소Sau3A1으로 부분 가수분해한 후에, 0.7% 아가로스 젤에서 전기영동하여 약 3-10 kb 크기의 DNA 밴드를 잘라내어 진클린 키트 II(Gene Clean Kit II)(Bio 101 Inc., 미국)로 분리 정제하였다. 상기 분리한 DNA 단편들을 제한효소Sau3A1으로 부분 가수분해하고, 벡터 pUC118 (TaKaRa Inc., 일본)을 제한효소BamH1으로 절단하여, 5'-말단의 인산을 제거한 다음 16℃에서 16시간 동안 T4 DNA 리가제(ligase)의 존재하에서 반응시켜 재조합 플라스미드를 제조하였고, 상기 플라스미드를 일렉트로포레이션법(electroporation)에 의해 대장균 DH5α에 형질전환 시켰다. 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균들은 앰피실린을 함유하는 LB 평판배지에서 유전적 상보방법(genetic complementation)으로 선별하였다. 상기 배지에서 분리한 대장균 DH5α를 상기 참고예 1과 동일한 방법으로 D-아미노산 아미다아제를 생산하는 형질전환체를 선별하였다.
그 결과, D-입체특이적 아미노산 아미다아제 활성을 갖는 형질전환체를 선별하고, 상기 형질전환체가 포함하는 재조합 플라스미드를 "pDAP"라 명명하고(도 1), 위의 pDAP가 포함된 형질전환체, DH5α/pDAP를 2001년 7월 11일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10009 BP).
상기의 선별과정을 통하여 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 활성을 갖는형질전환체를 얻었으며, 상기 형질전환체의 재조합 플라스미드로부터 삽입된 DNA 단편을 분리하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과 상기 재조합 플라스미드에포함된 DNA 단편은 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코드하는 약 800 bp 크기의 유전자를 포함하는 2,166 bp 크기의 염기배열로 구성되어 있음이 확인하였고, 상기 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자를 "bda"로 명명하였다. 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자를 포함하는 염기서열은서열번호 2로 기재된다.
상기에서 분석한 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의서열번호 4로 기재되는 염기서열은 기존의 알려진 다른 단백질의 유전자 서열과 비교한 결과, 바실러스 메타노리커스의 DppA(dipeptide transport protein)와 26%,바실러스 써브틸리스의 DppA(dipeptide transport system)와 24%의 상동성을 보이는 것으로 확인되었으나, 본 발명의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 유전자 배열상으로 현재까지 알려진바 없는 신규한 유전자임을 확인하였다.
<실시예 2> D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자 bda 를 포함하는 발현벡터 pBDA의 제조
상기 실시예 1에서 분석한 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코드하는 유전자의 염기서열을 참고로 하여서열번호 5으로 기재되는 N-말단 프라이머와서열번호 6로 기재되는 C-말단 프라이머를 각각 제작하고, 상기 프라이머를 이용하여 재조합 플라스미드 pDAP를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 DNA 단편을 증폭시켰다. 상기 증폭된 약 0.8 kb 크기의 서열번호 4로 기재되는 DNA 절편을 pHCE 19T(II) 벡터(TaKaRa Inc., 일본)에 클로닝하여 본 발명의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함하는 발현벡터를 제작하였다(도 2). 본 발명자들은 상기 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함하는 발현벡터를 "pBDA"라 명명하였다.
<실시예 3> 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 발현
본 발명자들은 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 생산하기 위해, 본 발명의 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자를 포함하는 발현벡터 pBDA를 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켰고, 상기 형질전환체를 XL1-Blue/pBDA라 명명하였다.
본 발명자들은 상기 형질전환체 XL1-Blue/pBDA에서 발현되는 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 조사하였다.
본 발명의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함하는 재조합 플라스미드 pBDA를 함유한 대장균 XL1-Blue/pBDA를 100 ㎎/ℓ 농도의 앰피실린과 1 mM의 D-알라닐-파라-니트로아닐리드을 함유하는 LB-앰피실린 평판배지에 도말한 결과, 균의 콜로니 주위에 노란색 환(파라-니트로아닐린의 생성으로 나타나는 환)이 나타났고, 상기 재조합 플라스미드의 염기서열을 분석하여 다시 한 번 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함하는 재조합 플라스미드 pBDA를 함유한 대장균 XL1-Blue/pBDA는 항시적으로 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제가 발현됨을 확인하였다.
<실시예 4> 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 순수분리 정제 및 물리화학적 특성조사
<4-1> 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 분리 정제
본 발명자들은 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 분리 정제하기 위해 실시예 4와 동일한 방법으로 재조합 대장균을 이용하여 대량 발현시켰다. 상기에서 회수한 조효소액을 55℃에서 20분간 열처리 한 후, 음이온 교환수지(Resource Q)에 흡착시키고, 1.0 M NaCl이 포함된 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)을 이용하여 염농도 기울기를 이용하여 용출하였다. 용출시킨 활성 분획물을 한외여과막으로 농축시키고 이를 1.0 M 유안이 포함된 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)에 넣어 소수성 결합수지(Phenyl Sepharose)에 흡착시킨 후 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)을 이용한 유안 농도 기울기로 용출하여 상기 효소를 순수하게 정제하였다.
그 결과, 최종 5.5배 더 정제되었으며, 정제수율은 25%로 확인되었고, 정제된 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 분자량은 SDS-PAGE에서 29 kDa으로 확인되었다. 각 단계별로 분리 정제된 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 수율 및 효소활성은표 2와 같다.
단계 총단백질(㎎) 총활성(units) 비활성(U/㎎) 수율(%) 정제배수
조효소액 288.0 5652.0 19.6 100 1.0
열처리 166.7 4295.8 25.8 76.0 1.3
이온교환 44.7 3734.3 83.5 66.1 4.3
소수성결합 13.3 1433.8 108.1 25.4 5.5
<4-2> D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 생화학적 특성 조사
본 발명자들은 상기 실시예 <4-1>에서 순수 정제한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 생화학적 특성을 조사하였다.
온도영향을 측정하기 위해 다양한 온도 범위(30-100℃)에서 정제효소의 최적 반응온도와 열안정성을 조사하였다. 정제효소의 최적 온도 측정은 각기 다른 온도에서 반응산물인 D-아미노산을 정량하여 상대효소활성을 측정하였으며, 열안정성은 상기의 다양한 온도범위에서 정제효소를 20분간 열처리한 후 이들의 잔존효소활성을 측정하였다. 효소활성에 미치는 최적온도 영향에서는 각각의 온도에서 30분간 효소반응 후 D-아미노산의 생성양을 측정하였다. 반응 최적온도에서는 약 85℃에서 최적의 활성을 보였으며, 열안정성은 여러 온도에서 30분씩 항온 처리한 후 각각에서 효소활성을 조사한 결과 약 90℃까지 비교적 안정한 특성을 보였다(도 3).
pH에 따른 효소활성에 대한 영향을 조사하고자 다양한 pH 범위의 완충액, 메스완충액(MES, pH 5.5-6.5), 비스-트리스완충액(Bis-Tris, pH 6.5-7.5), 트리스완충액(Tris-HCl, pH 7.0-9.0), 캡스완충액(CAPS, pH 9.0-11) 등을 이용하여 각각의 pH에서 효소를 50℃에서 10분간 반응시켜 생성된 D-아미노산 양으로부터 상대활성을 측정하였으며, pH에 대한 안정성은 상기 완충액에 효소액을 가해 4℃ 냉장고에서 4시간 정치시킨 후, 위와 같은 방법으로 상대효소활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 pH7 - pH10까지 pH 안정성을 지니고 pH9에서 최적 효소활성을 나타내었다.
효소활성에 미치는 저해제의 영향에서는 0.003 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)에서 95%, 0.004 mM DTT(dithiothreitol)에서 75%, 0.007 mM 머캅토 에탄올(mercaptoethanol)에서 37%의 저해효과를 나타내었다(도 4).
금속이온의 영향에서는 Cu2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cd2+, Li+, K+, Na+등은 효소활성에 큰 영향을 나타내지 않았으나, 1 mM Co2+와 Mn2+를 반응액에 첨가했을때 효소활성이 약 150배에서 62배 증가하는 현상을 나타내었다.
<4-3> D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 기질특이성 조사
본 발명의 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1 유래의 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 기질특이성과 입체특이성을 조사하고자 각종 D-아미노산 아미드를 이용하여 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 효소활성을 조사하였다.
구체적으로, D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 측정하기 위해 반응액을 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 0.5 ㎖에표 3에 기재된 각종 아미노산 아미드 5 mM과 효소액을 포함하여, 55℃에서 1시간 동안 정치 반응시켰다.D-입체특이적 아미노산 아미다아제 반응에 의하여 생성된 D-아미노산의 양은 20 mM 염산용액에 D-아미노산의 농도가 0.1 mM이 되도록 희석하여 자동 아미노산 분석기(Hitachi L-8500A, 일본)로 분석하였으며, D-아미노산 표준곡선에 준하여 정량하였다.
또한, 각종 L-아미노산 아미드에 대한 효소활성 측정을 위해 상기와 동일한 조건에서 반응을 수행하였는데, 기질로는 L-아미노산 아미드 및 지방족 아미드를 이용하였다. 이 때 효소의 활성(Unit)은 1분 동안 1 u㏖의 아미노산을 생산하는데 필요로 되는 효소량으로 정의하였다.
그 결과, 본 발명의 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 각종 D-아미노산 아미드와 L-아미노산 아미드에 대한 효소활성 측정결과는표 3에 나타낸 바와 같다.
기질 효소비활성(units/㎎ 단백질) 상대활성(%)
D-알라닌 아미드 93 100
D-루이신 아미드 35 38
D-노르루이신 아미드 20.7 22
D-노르발린 아미드 17.5 19
D-페닐알라닌 아미드 16.0 17.2
D-티로신 아미드 14.6 16
D-발린 아미드 14.1 15.2
D-라이신 아미드 13.8 15
D-트립토판 아미드 12.4 13
D-글루타민 아미드 9.5 10
D-아스파라긴 아미드 6.8 7.3
D-메티오닌 아미드 5.82 6.3
D-프로린 아미드 0.35 0.4
D-아스파르트산 아미드 0.18 0.2
Z-D-알라닌 아미드 - 0.0
Z-D-알라닌 에스테르 - 0.0
N-아세틸-D-페닐알라닌 - 0.0
N-아세틸-D-루이신 - 0.0
N-아세틸-D-메티오닌 - 0.0
L-알라닐-L-알라닌 - 0.0
D-알라닐-L-알라닌 - 0.0
- : 음성 반응
<실시예 5> 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용한 D-아미노산의 생산
본 발명자들은 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 D-아미노산을 생산하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 재조합 플라스미드 pBDA로 형질 전환된 대장균 균주 XL1-Blue/pBDA를 100 mg/ℓ 농도의 앰피실린을 첨가한 LB 배지에서 37℃, 180 rpm으로 10시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액은 5,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 0.1 M 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁하여 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 55℃에서 30분간 열처리한 후원심분리한 상층액을 조효소액으로 사용하였다.
D-페닐알라닌을 효소전환법으로 생산하기 위해 효소반응은 50 ㎖ 반응액에 0.1 M 트리스완충용액(pH 8.0), 0.2 M DL-페닐알라닌 아미드, 0.5 mM 코발트염을 가해 반응 혼합액을 만들고, 여기에 본 발명의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 각각 10 ㎕(0.67 unit), 20 ㎕(1.38 unit), 30 ㎕(2.02 unit)를 넣고 50℃에서 반응을 수행하면서 반응 전환율과 생성된 D-페닐알라닌의 광학적 순수도(optical purity)를 조사하였다.
D-페닐알라닌의 광학적 순수도를 조사하기 위하여 효소반응 생성물을o-프탈디알데히드(o-phthaldialdehyde)로 유도체화(Yasuda et al., Peptides, 1997, 18, 347-354)한 후, 역상 HPLC 칼럼(Rexchrome S5-100-ODS, Regis Chem. Co., 4.6 mm x 25 cm, 5 m)에 50 mM 아세테이트 완충액(sodium acetate, pH 6.8)과 메탄올을 55:45의 부피비로 섞은 용액을 유속(0.6 ㎖/min)으로 흘려주었으며, 형광검출기(fluorescence detector)를 이용한 파장범위(발광 342 nm, 소광 452 nm)에서 DL-페닐알라닌의 분리곡선을 확인하였다.
그 결과, 상기 반응에서 생성된 D-페닐알라닌은 전적으로 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 반응에 의해서만 생성될 수 있으며, 미반응의 아미드 형태의 화합물은 유도체화 되지 않은 형태로 잔존하게 되어 엷은 막 크로마토그래피와 아미노산분석기(Hitachi, 일본) 상에서 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 의해 생성되는 D-페닐알라닌만 분석되게 된다(도 5).
하기반응식 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 고온성 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 D-아미노산에 입체특이성을 가지고 있기 때문에 DL-페닐알라닌 아미드를 반응기질로 사용할 경우, D-페닐알라닌에만 특이적으로 작용하여 순수한 D-페닐알라닌을 생산하는 것을 볼 수 있다.
실험 결과 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 50℃에서 2시간 반응 후 D-페닐알라닌의 전환율을 확인한 결과 0.67 unit의 효소를 가했을 때 54%, 1.38 unit에서는 92%, 2.02 unit에서는 100%의 전환율을 나타내었으며, D-페닐알라닌의 생산을 수행한 결과 10 g/ℓ/h의 생산성으로 D-페닐알라닌을 생산할 수 있었다(도 6). 이때 D-페닐알라닌의 광학적 순수도를 나타내는 척도인 eep(enantiomeric excess of the product=[D-L]/[D+L])와 E(enantiomeric ratio=(kcat/Km)D/(kcat/Km)L)가 각각 99.0%와 592를 나타내었다. 본 발명의 결과로부터 생성된 재조합 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 DL-페닐알라닌 아미드를 광학 분할하여 D-페닐알라닌을 생산할 수 있는 매우 유용한 생물촉매임을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 본 발명의 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스 유래의 내열성 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 D-아미노산에만 특이적으로 작용하여 다양한 D-아미노산의 생산함을 알 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 D-아미노산 아미드에만 특이적으로 작용하며, 열, 유기용매, pH 및 화학 변성제 등에 대해 안정한 효소이므로, 이를 생물촉매로 이용한 D-아미노산 생산방법은 비교적 저렴한 DL-아미노산 아미드로부터 직접 광학적으로 순수한 D-아미노산을 효과적으로 생산할 수 있어 경제적이고 환경 친화적으로 이용될 수 있는 방법이다. 특히 의약용으로 널리 이용되는 방향족 아미노산인 D-페닐알라닌을 저렴한 DL-페닐알라닌 아미드로부터 대량으로 전환이 가능한 것으로 확인되어 고부가가치의 아미노산의 생산을 위한 유용한 생물촉매로 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 기재되는 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제.
  2. 제 1항에 있어서,서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제.
  3. 제 2항의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 코딩(coding)하는 유전자.
  4. 제 3항에 있어서,서열번호 2의 염기서열로 구성되는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자.
  5. 제 4항의 유전자를 포함하는 재조합 플라즈미드 pDAP.
  6. 제 5항의 재조합 플라즈미드가 도입된 형질전환체 DH5α/pDAP(수탁번호 : KCTC 10009 BP).
  7. 서열번호 4로 기재되는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pBDA.
  8. 제 7항의 발현벡터가 도입된 형질전환체 XL1-Blue/pBDA.
  9. 제 8항의 형질전환체를 배양하고 그 배양액으로부터 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 회수하는 것을 포함하는 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 제조방법.
  10. 제 9항의 방법에 의하여 얻어진 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 DL-아미노산 아미드로부터 D-아미노산을 제조하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, D-아미노산은 D-알라닌, D-루이신, D-노르루이신, D-노르발린, D-페닐알라니, D-티로신, D-발린, D-라이신, D-트립토판, D-글루타민, D-아스파라긴, D-메티오닌, D-프롤린 및 D-아스파르트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 D-아미노산을 생산하는 방법.
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