KR100190501B1 - D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 고온성 균주 바실러스 스티아로더모필러스 kl-01 - Google Patents

D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 고온성 균주 바실러스 스티아로더모필러스 kl-01 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 활성을 갖는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제(D-amino acid aminotransferase: EC 2.6.1.21)를 보유함으로써 새로운 D-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는 고온성 미생물균주, 좀더 구체적으로는 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(Bacillus stearother-mophilus KL-01)(KCTC 0285BP) 및 이 신규의 고온성 균주를 이용하여 새로운 D-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 고온성 균주 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01
제 1도는 D-AAT를 생산하는 호열성 미생물들 중에서 바실러스종(Bacillussp.) LK-1의 D-AAT와는 다른, 새로운 D-AAT를 생산하는 균주를 선택하기 위하여, 웨스턴 블롯팅(Western blotting)법을 이용한 항원-항체반응성을 비교한 결과도이다.
제 2도는 호열성 미생물들의 D-AAT유전자 탐색을 위하여 PCR 증폭시킨 결과 생성된 유전자 단편들의 아가로스젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
제 3도는 고온성 균주 바실러스 스티아로터모필러스 KL-01(Bacillus stearother-mophilus KL-01)(KCTC 0285BP)이 생산하는 D-AAT를 이용하여 D-알라닌과 α-케토글루타르산을 반응시킨 후 반응액을 HPLC로 분석한 결과도이다.
본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 활성을 갖는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제(D-amino acid aminotransferase: EC 2.6.1.21)(본 명세서를 통하여 D-AAT라 한다)를 보유함으로써 새로운 D-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는 고온성 미생물균주, 좀더 구체적으로는 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(Bacillus stearothermophilus KL-01)(KCTC 0285BP)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 신규의 고온성 균주를 이용하여 새로운 D-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
D-아미노산은 일반적으로 천연단백질중에는 포함되어 있지 않으나, 미생물의 세포벽 또는 펩티드계 항생물질의 구성성분으로서 자연계에 널리 분포되어 있으며, 산업적으로는 합성감미료, β-락탐계 항생제, 펩티드 호르몬, 살충제 등을 생산하기 위한 중간물질로 식품 및 의약분야에서 널리 이용되고 있다.
D-AAT는 D-알라닌, D-글루탐산, D-아미노부티르산 등의 다양한 D-아미노산으로부터의 아미노기를 피루브산, α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산 등의 케토산에 전이시킴으로써 새로운 D-아미노산을 합성하는 기능을 갖는 효소이다[참조: Soda et al.(1974)FEBS Lett. 46. 359-363]. D-AAT는 또한, 비교적 넓은 기질 특이성을 가지고 있어서 단일공정에 의해 다양한 D-아미노산을 합성할 수 있는 특징이 있다. 이 효소는 바실러스 속의 미생물에서 주로 발견되어 왔는데, 일본의 타니자와 등은 호열성 미생물로부터 상기 효소를 생산하는 호열성 바실러스 2종을 분리한 바 있고[참조:Tanizawa et al. (1989) J.Biol. Chem. 264, 2445-2449], 최근에는 이 효소의 반응기작 및 단백질 구조에 관한 연구결과가 보고되었다[참조: Sugio et al.(1995) Biochemistry, 34, 9661-9669].
또한, 본 발명자들도 국내 각지의 고온균 서식지로부터, 열에 안정하여 높은 온도에서의 효소반응이 가능할 뿐 아니라 D-발린 등의 분지아미노산에도 높은 반응성을 나타내는 새로운 기질특이성의 D-AAT를 생산하는 미생물을 탐색하였으며, 그 결과 한국토양으로부터 분리된 천여종의 고온성 미생물로부터 D-AAT활성을 나타낸 110여종의 고온성 미생물균주를 선별하고, 이들 고온성 미생물에 대하여 D- 알라닌과 α-케토글루타르산으로부터 D-글루탐산을 제조하는 반응을 촉매하는 속도를 비교함으로써, 최대의 활성을 나타낸 미생물 2종을 분리하였다. 이 두가지 종류의 미생물은 동정결과, 공지 균주인 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)와 매우 유사한 생리적 특성을 나타내었으나, 30내지 60℃에서 생육하는 고온성 미생물이라는 차이점이 있었으므로 각각 고온성 바실러스 sp. LK-1과 LK-2로 명명하고 신규의 균주로서 특허출원을 완료한 바 있다(참조: 대한민국 특허원 제 95-53557호 및 96-709호).
효소를 생물촉매로서 이용하는 생물공정에 있어서 생물촉매의 안정성은 효소전환반응의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인이다. 일반적으로 고온의 생육환경에 서식하는 고온성 미생물들은 서식지의 고온환경의 영향에 의해 열에 안정한 내열성 효소를 지니게 된다. 그리고, 이러한 내열성 효소는 열에 안정한 특징이외에도 유기용매에 대한 안정성, pH에 대한 안정성 및 화학변성제에 대한 안정성도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명자들에 의해 분리된 바 있는 바실러스 sp, LK-1 및 LK-2는 그 자체로도 상당한 정도의 내열성을 지니고 있으나, 앞에서도 언급하였듯이 생물촉매의 안정성은 효소전환반응의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인이므로 본 발명자들은 LK-1및 LK-2에 비하여 열안정성이 더욱 높아 D-아미노산을 합성하기 위한 효소전환공정에 더욱 유리하게 이용될 수 있는 새로운 D-AAT 생산균주를 분리하기 위해 게속하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 바실러스, sp, LK-1 및 LK-2 조차도 생육 불가능한 온도인 70℃의 고온에서도 생육이 가능하고 열안정성이 우수한 D-AAT 활성을 나타내는 신규한 고온성 미생물 20종을 분리하는데 성공하였다.
본 발명자들은 이와 같이 선별된 20종의 D-AAT 생산 호열성 미생물들 중에서 바실러스 sp. LK-1로 부터 유래되는 D-AAT 와는 다른, 새로운 D-AAT를 생산하는 균주를 선택하기 위하여, 웨스턴 블롯팅(Western blotting)법을 이용한 항원-항체 반응성의 비교 및 PCR법을 이용한 D-AAT유전자 염기배열의 상동성 비교연구를 수행하였으며, 그 결과 바실러스 sp, LK-1 유래의 D-AAT와 다른 특성을 갖는 새로운 D-AAT를 보유한 1종의 호열성 미생물을 분리하는데 성공하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력을 가짐으로써 새로운 D-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는 고온성 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 고온성 균주는 70℃의 고온에서도 생육이 가능한 특징을 가지고 있다.
본 발명은 또한, 상기 고온성 균주를 생물촉매로 사용하여 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시킴으로써 새로운 D-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들이 분리한 고온성 미생물에 대하여 통정연구를 수행한 결과, 이 균주는 65℃이상의 온도에서 호기적으로 생육하며, 그램양성이고 내생포자를 생성하는 바실러스 스티아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus)에 속하는 미생물로 확인되었다. 따라서, 획득된 신규 내열성 D-AAT 생산 고온균을 바실러스 스티아로더모필루스 KL-01로 명명하였다. 지금까지, 65℃이상의 고온에서 생육할 수 있는 고온성 바실러스 스티아로더모필루스 유래의 내열성 D-AAT를 사용하여 D-아미노산을 생산하는 것에 관한 연구는 전혀 보고된 적이 없다.
이하, 본 발명에 따른 신규한 균주의 분리, 선별과정 및 특성에 대하여 자세히 설명한다.
D-AAT 활성의 정량:
D-AAT 활성을 측정하기 위한 반응액으로는 0.1M 트리스완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 0.2㎖에 각각 10mM의 D-알라닌, α-케토글루타르산과 배양액 0.1㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제한 것을 사용하였으며, 50℃에서 1시간 동안 정치반응시켰다. 또한 D-AAT의 촉매반응에 의하여 생성된 피루베이트의 양은 반응액에 0.2㎖의 60% 수산화칼륨염 수용액과 2%살리실알데히드(salicyladehyde)0.1㎖를 가하고 37℃에서 30분간 정치반응시켜 발색시킨 후, 물로 2배 희석하고 480nm에서의 흡광도를 측정함으로써 정량하였다[참조:Berntsson S. (1995) Anal, Chem, 27,1659-1660].
토양분리 고온균으로부터 D-AAT 활성균주의 탐색:
먼저 전국 각지의 건초더미, 부식토, 하천, 폐수, 온천 등지에서 채취한 샘플을 1.5%폴리펩톤(polypeptone), 0.2% 효모추출물(yeast extract), 0.2% 고기추출물(meat extract), 0.2% 글리세롤(glycerol), 0.2% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.026% NH4Cl의 조성을 갖는 MY배지에 접종하고 55℃에서 부유배양(enrichment culture)하였다. 이 배양액을 2% 아가(agar)를 포함한 MY 평판배지(agar plate medium)에 접종하고 55℃에서 배양하여 순수한 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주를 5㎖ MY 액체배지에서 8 내지 10시간동안 배양한 후, 균체를 수확하고 소니케이터(sonicator)로 균체를 파쇄하여 조효소액으로 만들어 D-AAT 활성을 측정하였다.
1차 균주 선별과정에서 D-AAT 활성을 나타낸 미생물 110여종을 분리하였다.
70℃에서 생육가능한 내열성 D-AAT 생산균주의 선별:
분리된 110종의 D-AAT 활성보유 균주들 중에서 바실러스 sp, LK-1 및 LK-2에 비하여 열안정성이 더욱 높고, 지금까지 보고되지 않은 새로운 D-AAT를 생산하는 균주를 선별하고자 다음과 같이 실험하였다. 열안정성이 높은 D-AAT 생산균주의 선별과정은 앞서 분리한 미생물들을 70℃에서 배양하여 24시간 이내에 미생물의 생장이 관찰된 20종을 분리함으로써 수행되었다. 이 고온성 미생물 20종을 5㎖의 MY배지에 접종하고 60℃에서 8 내지 10시간동안 배양한 후, 균체를 파쇄하여 조효소액으로 만들고 D-AAT활성을 측정하였다. 이와같은 고온성 미생물들 중에서 D-AAT 활성이 높은 미생물은 하기 표1에 나타낸 바와 같았다.
[표 1]
선별된 D-AAT생산균주의 비교 및 새로운 D-AAT 생산 고온균의 분리:
앞 단계에서 선별한 20종의 D-AAT 생산 호열성균주중에서 바실러스 sp, LK-1 및 LK-2 유래의 D-AAT와는 다른, 새로운 D-AAT를 생산하는 균주를 선택하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 새로운 D-AAT 생산균주를 선택하고자 한 것은 열안정성의 향상 및 기질특이성의 변화를 목적으로 한 것이다.
먼저, 각 호열성균주의 조효소액(crude extract)을 SDS-PAGE로 전개한 후, LK-1의 D-AAT를 항원(antigen)으로 사용하여 제조한 토끼혈청(rabbit serum)의 항원-항체 반응을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 각 호열성 미생물로부터 생산된 D-AAT와 LK-1 유래의 D-AAT를 비교하였다. 이때, 사용된 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)는 바실러스 sp, LK-1 유래의 D-AAT를 토끼에 주사하여 면역반응을 유도함으로써 제조된 것이다. 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, 제1도에 나타낸 바와 같이 70℃에서 생육가능한 20종의 내열성 D-AAT생산균주들은 모두 바실러스 sp, LK-1 유래의 D-AAT와 동일한 분자량을 가지며 구조적으로도 유사한 D-AAT를 보유하고 있는 것으로 나타났다. 따라서, 항원-항체반응성의 차이를 이용하여 LK-1유래의 D-AAT와는 다른, 새로운 D-AAT를 보유하는 균주를 선별하기는 어렵다고 판단되었다.
다음에, 본 발명자들은 새로운 D-AAT를 탐색하고 검증하기 위한 또 하나의 방법으로 PCR(Polymerase chain reaction)법을 이용하였다. 즉, 바실러스 sp, LK-1 유래의 D-AAT유전자의 5'-말단 염기서열에 상보적인 N-프라이머와 3'-말단 염기서열에 상보적인 C-프라이머로, 각 호열균의 총염색체 중의 D-AAT 유전자를 PCR 증폭시키는 것이다. 이렇게하면, D-AAT 유전자 배열상의 상동성이 있는 경우에는 D-AAT유전자가 증폭되어 0.85kb 길이의 DNA 단편이 생산되나, 유전자배열의 상동성이 적은 경우에는 이 유전자의 증폭이 관찰되지 않으므로 앞서 선별된 20종의 D-AAT 생산 호열균이 보유하는 D-AAT가 바실러스 sp. LK-1의 D-AAT 유전자와 유사성이 있는지 여부를 판단할 수 있다. 이 방법에 사용된 2가지의 프라이머는 하기 표2에 나타내었다.
표2.
상기 프라이머를 사용하여 각 호열균의 총염색체에 대하여 D-AAT 유전자의 탐색을 위한 PCR을 수행한 후, 생산된 유전자 단편들을 아가로스젤 전기영동하여 분석한 결과는 제2도에 나타내었다. 제2도로부터 알 수 있듯이, 실험을 수행한 여러종류의 고온성 균주중에서 D-AAT를 코드화하는 0.85kb의 유전자단편이 나타나지 않는 호열성 미생물 No. 257을 찾아낼 수 있었다. 이 고온성 미생물 257이 생산하는 D-AAT는 웨스턴 블롯팅 결과에서는 LK-1이 생산하는 D-AAT와 동일한 크기로 단백질로 관찰되었으나, PCR 증폭을 통한 분석에서는 LK-1과 다른 염기서열을 가지는 D-AAT를 생산하는 미생물인 것으로 판단되었다. 따라서, 지금까지의 결과로부터, 고온성 미생물 유래의 D-AAT는 대부분 유사한 분자량과 유전자 염기서열을 보유하나, 본 발명에서 선별한 고온성 미생물 No. 257은 통상의 고온성 미생물로부터 유래한 D-AAT와는 전혀 다른 새로운 성질의 D-AAT를 생산하는 것으로 판단된다.
한편, 전술한 방법으로 분리 및 선별된 내열성 D-AAT 생산 호열균 No. 257을 동정하기 위한 분류학적 연구를 아래와 같이 수행하였다.
신균주 257의 동정:
분리된 미생물 No. 257은 2% 아가평판배지에서 배양하였을 때 크림색의 불투명한 콜로니를 형성하였다. 또한, 온도 30℃ 이상 70℃ 이하의 호기적인 조건에서 잘 성장하며, 그램양성이고 내생포자를 형성하는 간균이어서 바실러스 속으로 분류하였다.
고온성 바실러스 균주에 대해 생리적 및 생화학적 동정을 수행한 결과는 다음과 같다.
이상의 결과로부터, 본 발명에서 분리한 균주는 바실러스 스티아로더모필러스(Bacillus stearothermophilus)에 속하는 것으로 동정되었으며, 이에 따라 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01으로 명명되었다. 본 발명자들은 분리 및 동정된 이 신규 고온균을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자센타에 1996년 11월21일자로 기탁하였으며, KCTC0285BP의 수탁번호를 부여받았다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예1)
본 발명에서 분리, 동정된 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(KCTC 0285BP) 이 생산하는 D-AAT를 생물촉매로 이용하여 D-알라닌과 α-케토글루타르산으로부터 D-글루탑산을 다음과 같이 제조하였다. 반응액으로는 D-알라닌과 α-케토글루타르산을 각각 0.9g/ℓ, 2.3g/ℓ농도로 첨가하고, 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(KCTC 0285BP)의 조효소액을 단백질을 기준으로 1.0g/ℓ농도가 되도록 첨가한 0.1M 트리스완충액(pH 8.5)을 사용하였다. 이 반응용액을 55℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, Enantio L1광학활성 HPLC 칼럼(Tosoh, Japan)으로 반응산물을 분석한 결과, 제3도에 나타낸 바와 같이 D-글루탐산 뿐아니라 L-알라닌과 L-글루탐산도 생성된 것으로 확인되었다. L-알라닌은 알라닌에 특이적으로 작용하는 이성화효소(alanine racemase)에 의하여 D-알라닌으로부터 생성되고, L-글루탐산은 L-아미노산 아미노트랜스퍼라아제(L-AAT)의 작용에 의하여 L-알라닌과 α-케토글루타르산으로부터 생성되는 것으로 알려져 있다. 생성된 D-글루탐산은 전적으로 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제(D-AAT)의 작용에 의해서만 생성될 수 있으며, HPLC 분석결과는 본 발명에 따라 분리된 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(KCTC 0285BP)이 D-아미노산에 특이적으로 작용하여, 다양한 D-아미노산의 생산에 이용할 수 있는 D-AAT 효소를 생산하는 미생물임을 분명하게 나타내고 있다.
한편, 아미노기를 공여하는 아미노산으로서 D-알라닌, D-아미노부티르산, D-아스파트산, D-글루탐산 및 D-n-발레르산 중에서 선택된 1종을 사용하고, 아미노기를 받는 케토산으로서 피루브산, α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산 및 α-케토-n-발레르산 중에서 선택된 1종을 사용하여 실시예 1과 동일한 조건하에 실험을 수행함으로써 각각에 상응하는 D-아미노산을 수득할 수 있었다.
따라서, 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 바실러스 스티아로더로필러스 KL-01(KCTC 0285BP)균주는 D-아미노산의 효소적 합성에 적합하여 산업적으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (4)

  1. D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력을 갖는 바실러스 스티아로더모필러스 KL-01(Bacillus stearothermophilus KL-01) 균주 (KCTC 0285BP).
  2. 제 1항에 따른 균주를 이용하여 기질인 D-아미노산의 아미노기를 케토산으로 전이시켜 새로운 D-아미노산을 제조하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 기질인 D-아미노산이 D-알라닌, D-아미노부티르산, D-아스파트산, D-글루탐산 및 D-n-발레르산 중에서 선택된 1종인 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 케토산이 피루브산, α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산, 및 α-케토-n-발레르산 중에서 선택된 1종인 방법.
KR1019960068839A 1996-12-20 1996-12-20 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 고온성 균주 바실러스 스티아로더모필러스 kl-01 KR100190501B1 (ko)

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