KR0183447B1 - 신균주 바실러스 엘케이-1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력에 의해 새로운 D-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는 균주 바실러스 LK-1에 관한 것이다.

Description

신균주 바실러스 LK-1

본 발명은 신균주 바실러스 LK-1(Bacillus LK-1)에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력에 의해 새로운 D-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는 균주 바실러스 LK-1에 관한 것이다.

D-아미노산은 천연 단백질 중에는 포함되어 있지 않으나, 미생물의 세포벽 또는 펩티드계 항생물질의 구성성분으로 자연계에 널리 분포되어 있으므로 이러한 D-아미노산의 기능은 오랫 동안 미생물 생리분야의 중요한 연구대상이었다. 또한, 1960년대에 기존의 β-락탐계 물질을 범용 β-락탐인 6-아미노페니실란산(6-amino penicillanic acid ; 6-APA), 7-아미노세팔로스포란산(7-aminocephalosporanic acid ; 7-ACA), 7-아미노-3-데아세톡시세팔로스포란산 (7-amino-3-deacetoxycephalosporanic acid ; 7-ADCA)으로 전환하는 방법이 개발되어 이러한 β-락탐환을 D-아미노산과 결합시킨 새로운 반합성 항생제를 합성하는 길이 열림으로써 D-아미노산의 용도가 크게 다양해지고 있다. 최근에는 다양한 D-아미노산이 합성감미료, β-락탐계 항생제, 펩티드 호르몬, 살충제 등을 생산하기 위한 중간물질로서 식품 및 의약분야에서 널리 이용되고 있다.

종래에 D-아미노산을 생산하는 방법으로는 화학적 합성방법 및 미생물효소 히단토이나아제(D-hydantoinase, EC3.5.2.2)를 이용하는 방법이 알려져 있었다(참조: Yamada et al., 1978, J. Ferment. Technol. 56, 484). 이중 화학적 합성법은 아미노산이 라세믹혼합물(racemic mixture) 상태로 합성되기 때문에 까다로운 광학적 순수분리과정을 거쳐야 하는 어려움이 있고, D-히단토이나아제를 이용하는 방법은 히단토인 유도체로부터 생성된 N-카바모일-D-아미노산을 강한 산성 조건하에 아질산으로 처리하여 카바모일기 제거 반응(decarbamoylation)을 수행하여야 하는 단점이 있다.

한편, D-알라닌 아미노기전이효소(D-alanine aminotransferase ; EC 2.6.1.21)는 D-알라닌(alanine), D-아스파트산(aspatic acid), D-글루탐산(glutamicacid), D-아미노부티르산(aminobutyric acid) 등의 다양한 D-아미노산의 아미노기를 피루브산(pyruvic acid), α-케토글루타르산(ketoglutaric acid), α-케토이소발레르산(ketoisovaleric acid) 등의 케토산에 전이시킴으로써 새로운 D-아미노산을 합성할 수 있는 효소로 알려져 있다[참조: Soda et al., 1974, FEBS Lett., 46, 359-363). 이 효소는 바실러스(Bacillus) 속의 미생물에서 주로 발견되어 왔으며, 일본의 타니자와 등은 호열성 미생물로부터 상기 효소를 생산하는 호열성 바실러스 2종을 분리하였고(참조: Tanizawa et al., 1989, J. Biol. Chem., 264, 2445-2449), 최근에는 이 효소의 반응기작 및 단백질 구조에 관한 연구결과가 보고된 바 있다(참조 : Sugio et al., 1995, Biochemistry, 34, 9661-9669). 그러나, 타니자와 등이 고온균으로부터 분리한 D-아미노산 아미노기전이효소는 열안정성은 높은 반면, 기질특이성은 상온균인 바실러스 스패리쿠스 유래의 효소에 비해 좁아서 D-발린(valine) 등의 분지아미노산(branched amino acid)이나 방향족 아미노산(aromatic amino acid)에 대해서는 반응성이 거의 없는 것으로 보고되었다.(참조: J. Biol. Chem., 1989, 264, 2445-2449). 따라서, 안정성이 높은 동시에 폭넓은 기질특이성으로 인하여 다양한 D-아미노산을 생산할 수 있는 효소에 대한 요구가 점점 높아지고 있다.

이에 본 발명자들은 열에 안정하여 고온에서의 효소반응이 가능할 뿐 아니라 D-발린 등의 분지아미노산에도 높은 반응성을 나타내는 등 새로운 기질특이성을 갖는 D-아미노산 아미노기전이효소 생산 균주를 국내 각지의 고온균 서식지로부터 순수하게 분리하고자 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 천여종의 고온성 미생물로부터 D-아미노산 합성에 가장 적합한 것으로 판단된 1종의 미생물을 순수하게 분리하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 균주는 동정결과, 기존의 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)와 매우 유사한 생리적 특성을 갖는 고온성 바실러스 균주로 밝혀졌으므로 본 발명자들은 이를 바실러스 LK-1으로 명명하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력을 갖는 바실러스 LK-1 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 LK-1 균주를 분리하고 동정한 과정은 다음과 같다.

[균주의 분리]

전국 각지의 건초더미, 부식토, 하천, 폐수, 온천 등지에서 채취한 샘플을 MY 배지(1.5% 폴리펩톤(polypeptone), 0.2% 효모추출물(yeast extract), 0.2% 고기추출물(meat extract), 0.2% 글리세롤, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄, 0.026% NH₄Cl로 구성)에 접종하고 55 내지 60℃에서 부유배양(enrichment culture)하였다. 이 배양액을 2% 아가(agar)를 포함한 MY 평판배지(agar plate medium)에 접종하고 55 내지 60℃에서 배양하여 순수한 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주를 5㎖ MY 액체배지에서 8 내지 10 시간 배양한 후, 균체를 수확하여 소니케이터(sonicator)로 균체를 파쇄하여 조효소액으로 만든 다음 D-아미노산 아미노기전이효소 활성을 측정하였다.

D-아미노산 아미노기전이효소 활성을 측정하기 위한 반응액은 0.1M 트리스완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 0.2㎖에 각각 10mM의 D-알라닌, α-케토글루타르산과 배양액 0.1㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제되었으며, 50℃에서 1시간 동안 정치반응시켰다.

D-아미노산 아미노기전이효소의 반응에 의하여 생성된 피루베이트의 양은 반응액에 60% 수산화칼륨염 용액 0.2㎖ 및 2% 살리실알데히드(salicylaldehyde) 용액 0.1㎖를 가한 후 37℃에서 30분간 정치반응시켜 발색시킨 다음, 물로 2배 희석하고 480nm 에서 흡광도를 측정하는 방법으로 결정하였다(참조 : Berntsson S., 1955, Anal. Chem., 27, 1659-1660).

1차 균주 선별과정에서 D-아미노산 아미노기전이효소 활성을 나타낸 미생물 100여종에서 D-발린을 합성하는 활성이 높은 균주를 재선별하기 위한 실험은 다음과 같이 수행하였다. D-발린을 합성하기 위한 반응액은 0.05M 인산염완충액(pH 8.5) 0.2㎖에 각각 10mM 의 D-글루탐산, α-케토이소발레르산과 배양액 0.2㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제되었으며, 50℃에서 1시간 동안 정치반응을 수행한 후, 광학활성 TLC(chiral TLC) 분석을 통하여 생성된 D-발린을 분석하였다. 광학활성 TLC는 아세토니트릴(acetonitrile)/메탄올/물을 4/1/1의 부피비로 포함한 용매를 사용하여 20분 동안 전개한 후, 2% 닌히드린(ninhidrin)으로 발색시키는 방법을 사용하였다. 이 방법을 통하여 가장 높은 D-발린 합성능을 나타내는 1종의 미생물을 선별하였다.

[균주의 동정]

상기와 같이 분리된 미생물은 2% 아가평판배지에서 배양하였을 때 크림색의 반투명한 콜로니를 형성하였다. 또한, 30℃ 이상 60℃ 이하의 온도 및 호기조건에서는 잘 자라나 65℃에서는 자라지 못하며, 그람양성이고 내생포자를 형성하는 간균이어서 바실러스 속으로 분류되었다.

상기의 고온성 바실러스의 상세한 생리적 및 생화학적 동정결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

이상의 결과로부터 본 발명자들에 의해 분리된 균주는 포도당을 비롯한 당류를 탄소원으로 이용하지 못하는 특성을 가지는 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)와 매우 유사한 생리적 특성을 지닌 신규의 고온성 바실러스로 동정되었으며, 본 발명자들은 이를 바실러스 LK-1으로 명명하고 1995년 11월 24일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁완료하고 기탁번호(KCTC 8707P)를 부여받았다.

본 발명에 따른 상기 바실러스 LK-1 균주는 D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 능력을 가지고 있으므로 이를 적절하게 이용함으로서 새로운 D-아미노산을 효과적으로 합성할 수 있다.

바실러스 LK-1 균주에 의해 아미노기 공여용 기질로 이용될 수 있는 D-아미노산으로는 D-알라닌, D-아미노부티르산, D-아스파트산, D-글루탐산, D-n-발레르산 등을 언급할 수 있고, 아미노기를 받는 케토산으로는 피루브산, α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산, α-케토-n-발레르산 등을 들 수 있으며 이들을 기질로 사용하는 경우에 각 기질에 상응하는 D-아미노산이 제조된다.

본 발명의 균주로부터 얻어진 조효소액은 D-아미노산을 제조하는 반응의 촉매로 사용될 수 있으며, 조효소액은 균주의 배양액으로부터 균체를 수확한 후 파쇄하여 제조한다.

이하, 본 발명에 따른 균주의 유용성을 하기 참고예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.

[참고예 1]

본 발명에 따른 바실러스 LK-1(기탁번호 : KCTC 8707P) 균주가 생산하는 D-알라닌 아미노기전이효소를 이용하여 D-알라닌과 α-케토글루타르산으로부터 다음과 같이 D-글루탐산을 제조하였다.

D-알라닌 및 α-케토글루타르산의 농도가 각각 0.89g/ℓ, 2.26g/ℓ이고 바실러스 LK-1균주의 조효소액을 단백질 농도가 1g/ℓ가 되도록 첨가한 0.1M 인산염 완충액(pH 8.5)을 반응액으로 사용하였다. 이 반응액을 50℃ 에서 서서히 교반하면서 2시간 동안 반응시킨 후, 광학활성 TLC 로 분석한 결과, 40% 수율로 D-글루탐산이 생성됨을 확인하였다.

[참고예 2]

D-아미노산 및 케토산으로 각각 D-글루탐산 및 α-케토이소발레르산을 1.47g/ℓ, 1.38g/ℓ 농도로 사용하는 점을 제외하고는 참고예 1과 동일한 방법으로 실시하여 30% 수율로 D-발린을 제조하였다.

Claims (1)

1. D-글루탐산과 α-케토이소발레르산으로부터 D-발린을 합성하는 효소활성을 갖는 신균주 바실러스 LK-1(기탁번호 : KCTC 8707P).