KR940005654B1 - L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법 - Google Patents

L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법 Download PDF

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Description

L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법
본 발명은 제초활성(herbicidal activities)을 나타내며, 제초제로서 유용한것으로 알려진 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산(일본국 특허공번 제86-56210호 또는 미국특허 제4,265,654호 명에서 참조)의 제조방법에 관한 것이다.
다음식(I)으로 나타낸 L-2-아미노-4-(히드록시 메틸포스피닐)-부티르산(아래에서는 "L-AMPB"로 함)의 공지된 제조방법으로는 L-AMPB를 항생물질 SF-1293 분자중의 구성성분으로 함유하며, 제초활성을 가진 항생물질 SF-1293, 즉 L-2-아미노-4-(히드록시 메틸포스피닐)-부티릴-L-알라닐-L-알리닌("bialaphos"라고도 함, 일본국 특공 1976-639호 공보 및 미국특허 제4,309,208호 명세서 참조)을 가수분해(hydrolysis)하는 방법(일본국 특허공개 1973-85538호 공고), 또는 항생물질 SF-1293물질을 미생물 효소로 분해하는 방법(일본국 특허공개 1974-31890공보)이 있다.
Figure kpo00001
그밖에, 화학적방법에 의해(일본국 특허공개 1973-91019공보) 우선 라세미체(racemic mixture)형으로 AMPB를 얻은다음, 이것을 미생물효소에 의해 광학분할(optical resolution)하여 L-AMPB을 생산하는 방법은 공지되었다.
또, 근년에는 본 발명자에 의해 보고된 방법으로서, 스트렙토미세스(streoptomyces)속에 속하는 L-AMPB 생산균주를 배양하여 그 배양액(culture broth)에서 직접 L-AMPB를 채취(recover)하는 방법(일본극 특허공개 1982-47485호 공보)이 공지되었다. L-AMPB와 같은 재초활성을 가진 물질이 제초제로서 연구개발하여 제조되고 이것이 제초제상품으로서 시중에서 실용화되기 위해서는 그 물질의 안정성과 제초효력을 강화시키기 위한 상당한 개발연구를 하여 염가의 다량생산에 적합한 제조방법을 개량하는 연구가 필수적으로 필요하다.
위에서 설명한 화학적 합성방법으로 제조한 AMPB는 L-AMPB와 D-AMPB의 혼합물이나, D-AMPB 그 자체는 거의 제초활성이 없다. 더우기, D-AMPB는 비천연형물질(non-natural substance)이므로 토양에 사용할 경우 토양세균에 의한 분해가 늦어 토양내에 용이하게 남게 되어 어느면에서는 환경오염의 원인이 된다. 또, L-AMPB를 그 합성방법으로 제조할 경우 라세미체형의 AMPB가 우선 얻어질수가 있어 그 라세미체에서 광학분할등에 의해 서로 각각 L-AMPB와 D-AMPB로 분리하는 것이 필요하게 된다. 따라서, 이 합성방법을 복잡하고 번잡하며 L-AMPB의 수율은 낮다.
그러나, 미생물 또는 효소를 사용하는 L-AMPB의 제조방법은 천연형의 물질인 L-AMPB만을 제조할 수 있다.
그 천연형의 L-AMPB는 제초작용에 관여하지 않으며 토양중에 남아있는 그 L-AMPB 성분이 토양세균에 의해 용이하게 분해되어 대사되며(metabilyze) 장기간 토양에 남아있지 않도록 하기때문에 환경 오염의 우려가 없는 이상적인 제초제로 생각되었다.
본 발명자들은 위와같은 문제점을 깊이 고려하여 다량으로 AMPB를 제조할 수 있는 AMPB의 화학적 합성제조방법의 잇점과, L-AMPB만이 제조될 수 있는 미생물에 의한 L-AMPB 제조방법의 잇점을 조합하는 방법을 시도하여 다량으로 그리고 선택적으로 L-AMPB를 제조할 수 있는 L-AMPB의 제조방법의 개량을 연구하였다. L-AMPB은 α-아미노산의 일종의 유도체로 볼수 있다.
한편, 일반적으로 단백질을 구성하는 통상의 α-아미노산에 대해서는 α-아미노산이 트랜스 아미나제(transami-nases)의 작용으로 그 대응되는 2-옥소-산의 아미노기 전이(transamination)에 의해 생성될 수 있다는 것은 공지되었다. 따라서, 본 발명자들은 L-AMPB에 대응하는 2-옥소-산에 주목하여 광범위한 연구를 하였다.
그 결과, 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산(아레에서는 OMPB라함)을 적어도 하나의 아미노기 공여체화합물(amino donor)의 존재하에서, 어느 종류의 트랜스아미나제(transaminase)로, 또는 그 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 어느 종류의 미생물로 처리할때 비광학활성의 OMPB를 알맞은 짧은 반응시간에 실질적인 수율로서 광학활성의 L-AMPB로 전환시킬 수 있다는 사실을 의외로 발견하혔다. 따라서, 본 발명에 의해 다음식(I)로 나타낸 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산의 제조방법을 제공한다.
Figure kpo00002
즉, 하나 또는 그 이상의 아미노기공여체의 존재하에서 하나 또는 그 이상의 트랜스아미나제로 또는 하나 또는 그 이상의 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 하나 또는 그 이상의 미생물로 다음식(II)으로 나타낸 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 처리시킴을 특징으로 하는 상기 식(I)의 화합물의 제조방법을 제공한다.
Figure kpo00003
본 발명의 방법을 실시할 경우 OMPB와 아미노기공여체 화합물로서 작용하는 화합물을 용해시켜 함유한 수용성액 반응매질중에서 OMPB와 아미노기공여체화합물에 트랜스아미나제 또는 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 미생물을 반응시킨다.
본 발명의 방법에서 일반적으로 OMPB를 L-AMPB로 변환시키는 효소반응은 그 반응매질액의 PH를 7.5이상, 바람직하게는 8.0-9.0의 범위로 조성하는 것이 바람직하다. 그 PH의 조정은 소듐 히드록시드 또는 적당한 완충액을 첨가시켜 행할 수 있다.
그 반응조건은 그 반응에 첨가하는 트랜스아미나제 또는 그 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 미생물의 작용에 가장 적합한 온도와 PH의 범위에 있도록 하는것이 바람직하다. 일반적으로 반응은 실온-60℃, 바람직하게는 25-50℃의 범위에서 실시하는것이 바람직하다.
상기 출발화합물(원료)로 사용되는 OMPB는 공지물질이다. 예로서, OMPB의 제조법 및 물리화학적 특성은 일본국 특허공개 공번 제81-92897호 명세서 또는 미국특허 제4,399,287호 명세서 기재되어 있다.
본 발명의 방법에서, 그 출발물질인 OMPB 화합물은 그 반응개시 시점에서 일반적으로 그 반응매질에 용해되는데 초기의 OMPB 화합물농도는 0.10-100㎎/㎖의 범위가 바람직하다.
본 발명의 방법에 쓰여지는 미생물에는 방선균(sctino-mycetes), 박테리아, 효모 및 균류(fungi)(molds)가 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 대표적 방서균 예로는 스트렙토미세스 알버스(streptomyces albus), 스트렙토미세스 그리제우스(sterptomyces griseus), 스트렙토미세스 하이드로스코피커스(streptomyces hygroscopicus), 스트필토미세스 리비단스(streptomyces lividans), 스트렙토미세스 비리도크로모겐스(sterptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 모로오카엔시스(sterptomyces morookaensis), 스트렙토버티실륨 신나모네움(stretoverticllium cinnamoneum), 노카르디아 메디테르라네이(nocardia mediterranei), 노카르디오쓰시스 다스손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 삭카르폴리스포타 히드수타(saccharopolyspora hirsuta), 키타사토스 포리아 포살라시나아(kitasatosporia phosalacinea) 미크로모노스포라 카르보나시애(Micromonospora carbonaceae), 스트렙토스포란기움 프레우도불가레(streptosporanigium pseudovulgare)등이 있다.
본 발명의 방법에 쓰여질 수 있는 박테리아의 구체적예로는 바실루스섭필리스(Bacillus subtilis), 미크로콕커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로콕커스 아우레우스(staphylococcus aureus), 에쉐리시아콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사(pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스세파시아(pseudomonas cepacia), 세르라티아 마르세스센스(serratia marcescens), 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum)등이 있다.
본 발명의 방법에 쓰여지는 대표적인 효모(yeasts) 예로는 삭카로미세스 세레비시애(saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(candida albicans), 크립토콕커스 네오포르만스(cryptococcus neoformans), 데바리오미세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) 한세눌라 쉬비기(Hansenula schneggi)등이 있다.
본 발명의 방법에 쓰여지는 균류(fungi)의 대표적 예로는 아스퍼르길러스플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼르길러스 테트레우스(Aspergillus terreus), 무코 스피네스센스(Mucor spinescens), 아우레오바시듐 풀루란스(Aureobasidium pullulans), 카에토뮴 클로브섬(chaetomium globosum), 페니실륨 푸니컬로섬(penicillium funiculosum), 글리오 클라듐 비레우스(Gliocladium vireus)등이 있다.
상기의 방선균, 박테리아, 균류 및 효모의 각 균종은 공지의 미생물보존기탁 기관에 기탁되어 있는 타입의 배양물 균주(oulture)이며 이들의 기탁기관에서 자유롭게 구입할 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 미생물의 바람직한 예로는 스트렙토미세스 히르고르코피커스(sterptomyces hygroscopicus) SF-1293주(FERM BF-130 또는 ATCC21705)(일본국 특공제 1976-639호 공보 명세서 또는 미국특허 제3,832,394호 명세서참조), 또는 그변이주(mutant strain)인 스트렙토미세스 히그로스 코피커스(sterptomyces hygroscopicus) NP-50주 한국과학 기술원에 1987.7.14. 기탁하였음. 미생물수탁번호 KCTC 8273P(RERM P-7804 또는 FERM BP-1368)(일본국 공개특허 공번 제1986-58589호 명세서 또는 유럽특허공개 제0173327호 공보참조), 또는 스트렙토미세스 리비단스(sterptomyces lividans) 66주 한국과학기술원에 1987.7.14. 기탁하였음, 미생물수탁번호 KCTC 8274P(FERM BP-737)(일본국 공개 특허공번 제1984-175889호 공보 또는 유럽특허공개 제 0193675호 공보참조)가 있다.
또, 아미노기공여체의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환시킬 수 있는 트랜스아미제활성을 가진 효소를 각각 생산할 수 있는 미생물이면 어떠한 미생물이라도 사용할 수 있다.
상기의 스트렙토미세스 히그로스코피커스(sterptomyces hygroscopicus) SF-1293주의 균학적 특성은 일본국 특허공번 제1976-639호 공보 또는 미국특허 제3,832,394호 명세서에 기재되어 있다.
또, 그 스트렙토미세스 히크로스코피커스 NP-50주(FMRM BP-1368)의 균학적특성은 상기의 SF-1293주와 동일하나 SF-1293물질(일본국 공개특허공보 제1986-58589호 공보 또는 유럽특허공개 제0173327호 공보참조)을 생산할 수 있는 생합성력(biosynthetic ability)이 없다는점(lack)에서 그 NP-50주의 유전형질(genetic charater)이 그 SF-1293주와 다르다.
이에 또, 상기 스트렙토미세스리비단스(sterptomyces lividans) 66주(RERM BP-737)의 균학적 특징은 일본국 공개특허공보 제1984-175889호 공보에 기재되어 있다.
상기의 열거한 균종(microbial species)중에서, FERM BP 번호를 가진 균종은 부다페스트조약의 규정에 의해 일본극 공공기탁기관으로 미공연(Fermen-tation Ressarch Justitute)에 기탁한 것이다. 본발명의 방법에 쓰여지는 효소, 트랜스아미나제는 아미노기 공여체의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환시킬 수 있는 트랜스아미나제활성을 가진 효소라면 어떠한 트랜스아미나제라도 가능하다.
본 발명의 방법에 쓰여질 수 있는 트랜스아미나메의 바람직한 예로는 시판되는 글루타민산-옥사로아세트산-트랜스아미나제(일반적으로 GOT로 나타냄)(효고 국제분류번호 EC 2, 6, 1, 1), 또는 시판되는 글루타민산-피루빈산(pyruvicacid)-트랜스아미나제(일반적 GPT로 나타냄)(효소국제분류번호 EC 2,6,1,2), 또는 아미노기공여체로서 L-글루타민산의 존재하에서 OMPB를 L-AMPB로 전환시킬 수 있는 트랜스아미나제활성을 가진 효소가 있다. 이들의 트랜스아미나제를 단독으로, 2종 또는 그 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 그 중에서도, 가장 바람ㅈ기하게는 조합한 그 트랜스아미나제는 아미노기공여체로서 아스파라긴산의 존재하에서 2-카토글루타르산을 글루타민산으로 전환하는 효소활성, 즉, GOT 활성을 가진 트랜스아미나제와, 아미노기 공여체로서 글루타민산의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환하는 트랜스아미나제활성을 가진 제 2 효소의 조합이다.
예로서, 이와같이 GOT 활성을 가진 트랜스아미나제로서 시판되는 글루타민산-옥살로아세트산-트랜스아미나제(효소 국제분류번호 EC 2, 6, 1, 1)를 사용할 수 있고, 또 GOT 활성을 가진 미생물, 예로서 스트렙토미세스 히그로스코피커스 SF-1293주(일본국 공개특허 공번 제1982-47485호 공보 ; FERM BP-130 ; ATCC 21705)에서 공지된 통상의 방법으로 추출된 GOT 활성을 가진 트랜스아미나제를 사용할 수 있다.
이들의 GOT 활성을 가진 트랜스아미나제는 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또, 아미노기공여체로서 L-글루타민산의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환시킬 수 있고, 또 상기 GOT 활성을 가진 트랜스아미나제와 조합하여 사용되는 제 2 의 트랜스아미나제로서 L-글루타민산의 존재하에서 OMPB를 L-AMPB로 전환시킬 수 있는 트랜스아미나제라면 어떠한 아미나제라도 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 쓰여질 수 있는 아미노기공여체화합물로는 생화학실험강좌 11[「아미노산대사와 상체아민」, 일본생화학회편, 토코 카가쿠도진회사 또는 「Journal of Biological chemistry」, 247,2486(1972)]에 기재된 바와같은 공지된 아미노기공여체에서 어느것이나 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 사용할 수 있는 아미노기공여체화합물의 바람직한 예로는 L-글루타민산, L-아스파라긴산, L-알라닌, L-메티오닌, L-글루타민등의 직쇄 지방족 L-α-아미노산, L-로이신, L-이소로이신, L-발린등의 분기체인 지방족 L-α-아미노산; L-리진, L-오르니틴, L-히스티딘등의 염기성 아미노산; L-페딜알라닌, L-리로신, L-트립토판 등의 방향족 아미노산 및 이들의 아미노산의 소듐 또는 포타슘염등이 알칼리금속염이 있다.
그밖에 또, 상기 L-아미노산에 대응하는 D-아미노산도 동일하게 본 발명의 방법에서 아미노기공여체로서 사용할 수 있다.
이들의 아미노기공여체는 단독으로 또는 2종 또는 그 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
그 아미노기공여체로서, 글루타민산 또는 그염과, 아스파라긴산 또는 그염을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 반응을 시작하기전에 반응매질중에 있는 아미노기공여체양과 OMPB양의 몰비는 10:1-1:10의 범위에 있는것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 아미노기공여체로서 글루타민산 또는 및 아스파라긴산을 사용할 경우 이들의 아미노산은 시판되는 글루타민산 또는 아스파리긴산을 사용할 수 있다.
일반적으로, 이들의 아미노산은 각각 D-이성체(ISOMER)와 L-이성체의 혼합물형태로 할 수 있으나, L-이성체가 더 바람직하다. 글루타민산 및 아스파라긴산의 염으로서 알칼리금속염, 특허 소듐 또는 포타슘을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서, 아미노기공여체로서 글루타민산(또는 그염)과 아스파라긴산(또는 그염)을 조합하여 사용할 수 있으나, 이 경우 이들의 아미노기공여체화합물의 각각의 농도와, 아미노기공여체화합물과 OMPB의 비율을 아래에 설명한다.
이들의 아미노기공여체가 OMPB보다 비율이 높아지고 그 반응속도에서 OMPB보다 그 아미노기공여체의 양이 더 많아지면 OMPB을 L-AMPB로 전환시키는 전환율과 반응속도가 높아진다.
그러나, 경제적관점에서 그 아미노기공여체화합물과 OMPB의 적당한 비율을 정할 수 있다. 일반적으로, 글루타민산 또는 그염의 농도(또는 참가량)의 몰비는 0.2:1-3.0-1의 범위에 있는것이 바람직하다.
한편, 아스파라긴산 또는 그 염의 농도(또는 첨가량)와 OMPB의 농도(또는 첨가량)의 몰비는 1.0:1-3.0:1의 범위에 있는것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 트랜스아미나제 생산미생물식(II)의 OMPB와 아미노기공여체에 작용시킬 경우 본 발명의 방법을 다음과 같은 방법으로 하여 실시할 수 있다. 즉, 상기 미생물을 통상의 미생물배양에 사용할 수 있는 영양물을 함유한 배지(culture medium)에서 일차적으로 배양한다.
그 배양원으로는 통상의 미생물배양에 이용되고 있는 공지의 어떠한 영양원이라도 사용할 수 있다. 예로서, 영양원으로서 탄소원은 글루코오스, 전분, 글리세린, 스크로오스, 물엿(thich malt syrup), 당밀(molasses)이 있다.
이들은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또, 질소원으로는 예로서 콩가로(soybean meal), 밀씨 눈(wheat germs), 고기추출물(meat extrac), 펩톤, 건조효소(dry yeast), 옥수수침지액(corn steepliquor), 암모늄술페이트등이 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 기타 필요에 따라 칼슘카르보네이트, 소듐클로리드, 포타슘클로리드 및 포스페이트등의 무기염을 그 배지에 첨가할 수도 있다. 그 미생물의 배양법으로는 액체배양법(liquid cultivation method), 특히 심부배양법(submerged cultivation method)이 가장 적합하다. 그 미생물의 배양은 호기적조건하에서 행하여지며, 그 배양에 적합한 온도는 25-40℃의 범위이다. 그 배양일수는 방선균의 경우 1-4일이 적합하고, 박테리아의 경우에는 1-2일, 효모의 경우 1-2일 및 균류(곰팡이류)의 경우에는 1-4일이 적합하다.
이와같이 배양한 트랜스아미나제 생산미생물의 배양액 그 자체를 사용하나 필요에 따라 그 배양액에서 균체(microbial cells)를 분리한 다음 물 또는 생리 식염수로 세척한다.
그 다음 이와같이 세척하여 얻어진 생균체(intact cells)를 알맞은 균체농도에서 물, 생리식염수 또는 적당한 완충액중에, 현탁시켜 즉시 사용될 균체현탁액을 얻을 수 있다. 사용되는 미생물의 균체를 포함하는 배양액 또는 기타 균체현탁액에, OMPB(제 1 기질임)와 아미노기공여체(효소용으로 제 2 기질임)를 동시에 또는 차례로 첨가한다. 그 다음 그 미생물이 OMPB와 아미노기공여체에 작용하여 OMPB를 L-AMPB로의 전환반응을 진행시켜 처리하도록한 상태에서 상기 반응에서 얻어진 혼합액을 유지한다.
이와같은 방법으로, OMPB와 아미노기공여체를 그 미생물에 처리하여 L-AMPB로 전환시키는 수용성반응매질액중의 OMPB와 아미노기공여체의 균체농도와 OMPB 및 아미노기 공여체의 농도, 그리고 반응온도와 PH 조건은 OMPB를 L-AMPB로의 전환반응이 효율좋게 진행되고, 또 그 미생물이 그 기능을 발휘하도록 하는 상태로 그 반응매질을 유지하는 범위에서 알맞게 조정된다. 그 반응시간도 그 반응혼합액에서 L-AMPB의 실제적인 양을 생산, 축적시키도록 조정된다.
또, 본 발명의 방법에서 OMPB와 아미노기공여체 화합물을 트랜스아미나제로 처리할 경우 적당한 트랜스아미나제의 수용액, 또는 완충액에 용해한 효소용액에 OMPB와 아미노기공여체를 첨가하여 용해시킨 다음 OMPB의 효소반응을 행한다. 그 반응계(reaction system)중에서 트랜스아미나제, OMPB와 아미노기공여체의 각각의 농도와 반응온도, PH 조건은 OMPB를 L-AMPB로의 전환반응이 효율좋게 진행되는 적정범위로 알맞게 조정된다.
상기 트랜스아미나제로는 시판되는 효소제품의 것을 사용할 수 있다. 또 본 발명에 사용할 수 있는 트랜스아미나제 생산미생물로서, 방선균, 세균, 균류 또는 효모의 배양액중에서 그 배양액중의 균체를 파쇄(DISINTEGRATING)시켜 직접 만들어진 조효소수용액(aqueous, crude enzyme solution) 또는 조효소(crude enzyme peroduct)를 물에 용해한 수용액을 사용할 수도 있다. 또 조효소수용액을 그 균체의 파쇄추출액형태로 사용할 수도 있다.
상기 미생물 또는 그 배양액에서 균체의 초음파처리 또는 리소집처리(lysozyme treatment)등 공지방법으로 추출하여 만든 조효소액도, 그 조소액이 아미노기 공여체의 존재하에 OMPB에서 L-AMPB를 생산할 수 있는 능력을 갖고 있으면 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 또, 정제된 효소수용액을 사용할 수 있음은 물론이다. 효소나 미생물을 유기용제, 기교제 및 담체등으로 고정화(immohilizing)함으로써 그 안정성과 조작능률을 높힐 수 있다는 것은 공지되었다.
이와같은 공지의 고정화방법으로 처리한 고정화 트랜스아미나제 생산미생물 또는 고정화아미나제는 그 아미나제가 OMPB에서 L-AMPB를 생산할 수 있는 능력을 가지면 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 트랜스아미나제를 사용하여 OMPB를 L-AMPB로 전환시키는 효소반응은 PH 7.5 이상, 바람직하게는 PH 8.0-9.0의 범위에서 실시하는 것이 바람직하다. 반응조건은 효소반응에 참가하는 트랜스아미나제의 활성(작용)에 가장 적합한 온도와 PH의 범위에서 선택하는 것이 적합한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서, 4-(히드록시메틸-포스피닐)-2-옥소-부티르산 즉, OMPB를 아미노기공여체로서 L-글루타민산 또는 그 염과, L-아스파라긴산 또는 그 염의 양자의 존재에서 하나 또는 그 이상의 트랜스아미나제 또는 트랜스아미나제 생산미생물로 처리한다. 이 실시예에서 쓰여지는 트랜스아미나제는 아미노기공여체로서 L-아스파라긴산의 존재하에서 2-케토글루타르산을 글루타민산으로 전환하는 트랜스아미나제활성을 가진 효소, 즉 GOT 활성의 범주내에 있는 트랜스아미나제활성을 가진 효소와, 아미노기공여체로서 L-글루타민산의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환하는 트랜스아미나제활성을 가진 제 2 효소(second enzyme)의 조합으로 구성된 효소계(enzyme system)를 사용하는 것이 바람직하다.
또, 본 발명의 방법의 실시예에서 쓰여지는 미생물은 아미노기공여체로서 L-아스파라긴산의 존재하에 2-케토글루타르산을 글루타민산으로 전환시키는 효소활성, 즉 GOT 활성과, 아미노기공여체로서 L-글리타민산의 존재하에 OMPB를 L-AMPB로 전환시키는 트랜스아미나제활성을 가진 효소계(enzyme system)를 생산할 수 있는 미생물이 바람직하며, 상기 미생물은 예로서 스트렙토미세스 히그로스코피커스 SF-1293주(FERM BP-130 또는 ATCC 21705) 또는 그 변이주(mutant strain)인 스트렙토미세스 히그로스코피커스 NP-50주(일본국 공개특허공보 제 1986-58589호 공보참조 ; FERM P-7804 또는 FERM BP-1368)이다.
상기 실시예에서, 상기 트랜스아미나제계 또는 상기 미생물의 작용에 의해 아미노기공여체의 하나로서 글루타민산(또는 그염)에서 아미노기를 OMPB가 공여하여 그 아미노기의 공여에 의해 OMPB는 L-AMPB로 되며, 아미노기를 주는 글루타민산은 2-케토글루타르산으로 되고, 한편 다른 아미노기공여체로서 아스파라긴산(또는 그염)은 GOT 활성을 가진 트랜스아미나제의 작용에 의해 2-케토글루타르사에 아미노기를 공여하여 2-케토글루타르산을 글루타민산으로 재생시키며 아스파라긴산(또는 그염) 그 자체는 옥살로아세트산으로 전환되며 또 최종적으로는 피르빈산(pyruvic acid)으로 전환되는 것으로 볼 수 있다.
이와같이 하여, 본 발명의 방법에서는 생성된 L-AMPB를 함유하는 반응액을 제공한다. 따라서, 요약하면 본 발명의 방법은 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 적어도 하나의 아미노기공여체화합물의 존재하에, 바람직하게는 L-글루타민산과 L-아스파라긴산양자 또는 이들 양자의 소듐염의 존재하에서 PH 7.5-9.0과 온도 실온 -60℃의 알칼리상태하에 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체 화합물 그리고 트랜스아미나제가 용해한 수용성반응매질액(aqueous liquid reaction medium)중에 적어도 하나의 트랜스아미나제와 처리 또는 반응시키는 방법으로 하여 알맞게 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 방법은 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 적어도 하나의 아미노기 공여체 화합물의 존재하에, 바람직하게는 L-글루타민산과 L-아스파라긴산 양자 또는 이들 양자의 소듐염의 존재하에, PH 7.5-9.0과 온도 실온 -60℃의 알칼리 상태하에, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기 공여체화합물을 용해시키며 상기 미생물의 균체를 현탁시킨 수용성 반응매질액중에 적어도 하나의 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 처리 또는 반응시키는 방법으로 알맞게 실시할 수 있다.
트랜스아미나제 생산 미생물의 균체를 사용하여 본 발명의 방법을 실시할때, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체화합물을 상기 미생물의 생균체(intact cells)가 현탁되어 있는 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 미생물이 있는 배양액에 첨가시킨 다음, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-브티르산, 아미노기공여체화합물과 상기 미생물을 서로 작용시킨다.
이에 또, 본 발명의 방법은 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 적어도 하나의 아미노기공여체 화합물의 존재하에 바람직하게는 L-글루타민산과 L-아스파라긴산 양자 또는 이들 양자의 소듐염의 존재하에서, PH 7.5-9.0과 온도 실온 -60℃의 알칼리 상태하에, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체 화합물 그리고 상기 미생물의 추출액 함유 트랜스아미나제를 용해시킨 수용성반응매질액중에, 적어도 하나의 트랜스아미나제를 생산할 수 있고 그 트랜스아미나제를 함유할 수 있는 미생물의 추출액과 처리시키는 방법으로 실시하는 것이 적합하다.
본 발명의 방법을 실시할 수 있는 어떤 방법이든간에 4-(히드록시메틸-포스피닐)-2-옥소-부티르산은 효소반응이 개시되어 진행되기전에 수용성 반응매질액중에서 초기농도를 0.1-100㎎/㎖로 용해시킬 수 있다. 그리고, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체화합물은 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산으로 전환시키는 효소반응을 발생하기전에 수용성 반응매질액중에서 초기에 1:10-10:1의 몰비로 조성시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 4-(히드록시메틸 포스피닐)-2-옥소-부티르산(즉, OMPB), 아미노기공여체 화합물 및 트랜스-아미나제 또는 트랜스아미나제 생산미생물 의 균체를 서로 작용시킬때, 생성한 L-2-아미노-4-(히드록시-메틸포스피닐)-부티르산(즉, L-AMPB)의 양, 반응하지 않은 OMPB의 양, 사용한 트랜스아미나제 또는 사용한 미생물의 균체의 양이 함유되어 있는 수용성 반응액 또는 혼합액을 구성한다.
상기 반응액 또는 혼합액에서 L-AMPB를 채취하기에 앞서 그 반응액이 사용한 상기 미생물의 균체를 함유할때 그 반응액 또는 혼합액을 원심분리할 수 있다.
이와같은 원심분리에 의해 그 미생물균체는 그 반응액 또는 그 혼합액에서 제거시킬 수 있고, 또 L-AMPB를 포함하는 상징액을 얻으며 그 미생물균체를 제거한다. 그 L-AMPB 제품을 그 수용액에서의 회수를 아래에 설명한다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 L-AMPB 함유 수용액에서 L-AMPB의 채취 및 정제는 공지의 L-AMPB 발효제조방법에 의해 얻어진 L-AMPB 생산 미생물의 균배양액에서 L-AMPB를 채취, 정제하는 공지방법과 동일하게 하여 실시할 수 있다.
L-AMPB의 채취와 정제에 대한 구체적 처리내용은 일본국 공개특허 제 1982-47485호 공보에 기재되어 있다. 예로서, 본 발명의 방법에서 얻을 수 있는 바와같이 그 반응액에서 L-AMPB의 채취와 정제는 L-AMPB 함유 반응액을 DOWEX 50W(Rohm & Hass 사 제품, 미국)의 양이온 교환수지컬럼(columm)에 통과시켜 이 수지에 L-AMPB를 흡착시킨 다음, 이 수지컬럼을 물 또는 묽은 암모니아수로 전개하여 용출시켜 L-AMPB 함유 용출액의 분액을 얻음으로써 달성할 수 있다. 그 다음, L-AMPB 함유 용출애그이 분액을 같이 모아 감압하여 농축시켜 L-AMPB의 건조분말을 얻는다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 L-AMPB는 일본국 공개 특허공고 제 1982-47485호 공보에 기재되어 있는 바와같이 공지의 발효법에 의해 얻을 수 있는 L-AMPB의 생성물과 동일한 물리화학적 특성을 나타낸다.
또, 본 발명에 의해 제조된 L-AMPB는 제초효력방법에 의해 시험한 공지의 발효방법에 의해 얻어진 L-AMPB와 동일한 제초효력을 나타낸다는 것을 관측하였다. 아래에서는 실시예에 따라 본 발명을 다시 자세하게 설명하나 본 발명은 여기에 한정된 것은 아니다.
[실시예 1]
서로 다른 종류의 시판용 트랜스아미나제를 OMPB에 아미노기공여체화합물을 함유한 50mM의 포스페이트 완충액(PH 6)중에 작용시켜 L-AMPB를 제조하였다.
이와같이, 글루타민산-옥살로 아세트산-트랜스아미나제(GOT)(Boehringer Mannheim Co., Ltd 사 제품)를 트랜스아미나제효소로서 사용할때에는 L-아스파라긴산(Asp)과 L-글루타민산(Glu)을 아미노기공여체(아미노기공여기질)로 하여 그 수용성반응매질액에 첨가하여 용해시켰다.
또, 글루타민산-피루빈산-트랜스아미나제(GPT)(Boethringer Mannheim Co., Ltd 사제품)를 사용할 경우에는 아미노기공여체로서 L-알라닌(Ala)을 그 수용성반응매질액에 첨가시켜 용해하였다. 참고테스트로서 글루타민산 데히드로제나제(dehydrogenase)(GLDA)(Boehringer Mannheim Co., Ltd 사제품)를 사용할 경우에는 아미노공여체로서 암노늄클로리드와 NADH를 첨가하여 용해하였다. 비교하기 위하여 아미노화 반응의 대조기질로서 2-케토글루타르산(2-KG)와 사용한 트랜스아미나제를 반응시켜 글루타민산(Glu)의 생성을 관찰하였다. 그 효소반응을 30℃에서 50분간 각 실험에서 행다음 그 반응 혼합액을 100℃에서 3분간 가열하여 그 반응을 끝마쳤다.
그 반응혼합액 또는 그 반응액은 묽은 황산을 첨가시켜 PH 2로 조정시킨 다음 원심분리시켜 상징액을 얻었다. 그 상징액중의 L-AMPB와 글루타민산의 생성양은 아미노산 분석기에 의해 정량하였다.
그 실험결과를 다음 표 1 로 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00004
위 표 1 의 성적에서 볼때, 2-케토글루타르산에서의 글루타민산 생성량에 비하여 낮은 수율이나 효소반응에 의해 OMPB에서 L-AMPB가 유의성 있는 수율로 생성된다는 것을 명백하게 알수 있다.
[실시예 2]
표 2 에 나타낸 시험세균균주를 40㎖의 뉴트리엔트육즙(nutrient broth)(Difco 사제품)로 된 배지에 각각 접종하여 28℃에서 6시간 그 세균에 대하여 증식배양을 하였다. 그 결과 얻어진 배양액을 종모(seed culture)로서 사용하여 이것을 40㎖의 동일조성의 배지에 2$의 접종양으로 접종하였다. 그리고, 28℃에서 하루밤 배양하였다. 그 다음 균체를 함유한 그 배양액에 OMPB를 100㎍/㎖의 농도로 되도록 첨가하였다. 또, 아미노공여체로서 소듐 L-아스파르테이트(aspartate)를 100㎍/㎖의 농도로 되도록 OMPB를 함유한 배양액 각각에 첨가하였다. 그 배양액, OMPB와 소듐 L-아스파르테이트로 구성된 혼합액을 얻은 다음에 이 혼합액을 28℃, 24시간 유지시키면서 OMPB를 L-AMPB로 효소전환반응을 하였다. 그리고 다음 반응 혼합액을 25% 황산을 사용하여 PH 2로 조정하여 그 반응을 끝마쳤다. 원심분리에 의해 그 균체를 제거하였다. 얻어진 각 상징액중의 L-AMPB 생성량은 아미노산 분석기를 써서 정량하였다.
그 결과를 표 2 에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00005
표 2 에서 AMPB가 OMPB에서 상당한 수율로 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또, 28℃에서 상기의 하루밤 배양을 한다음 얻어진 배양액을 1초음파처리를 하여 그 균체를 파쇄시켜 균체추출액을 얻었다. 이와같이 하여 얻어진 그 균체차쇄액을 원심분리하여 수용성의 조효소액을 얻었다. 각각의 이 조효소액의 GOT 활성양을 측정하여 그 결과를 표 2 에 나타낸 것이다. 표 2 에 나타낸 것과 같이, L-AMPB의 생성량과 상기 조효소액의 GOT 활성측정치 사이에는 상당한 상관관계가 인정되었다. 또, 표 2에 나타낸 효소의 GOT 비활성(×10-3단위/단백질 ㎎)은 조효소액중 단백질의 양을 바이오-래드 프로테인(Bio-rda protein)분석법에 의해 측정하여 평가한 값이다.
[실시예 3]
스트렙토미세스 히그로스코피커스(sterptomyces hygroscopicus) SF-1293주(FERM BP-130)를 전배양배지(preliminary culture medium)(가용성 전분 2.0%, 폴리펩톤 1.0%, 고기추출물 0.3%, 디포타슘 히드로겐 포스페이트 0.05%의 조성 : PH 7.0) 10㎖에 접종하였다. 이 균주를 28℃에서 24시간 진탕시켜 배양하여 얻어진 배양액을 종모(seed culture)로서 사용하였다. 이것은 2%의 접종량으로 하여 생산배지[글루코오스 7.0%, 박토소이톤(bactosoytou)4.4%, 포타슘 디히드로겐 포스페이트 0.327%, 디소듐 히드로겐 포스페이트 0.0852%, 도타이트 TES(dotites TES) 1.15%, 즉 N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산, 코발트클로리드 0.0001%, PH 6.0]에 접종하였다. 그 다음 28℃에서 그 SF-1293균주를 통기(通氣)교반하면서 배양하였다. 4일간 배양한다음 그 균체를 원심분리에 의해 모아 50mM 인산염 완충액(PH 6.0)으로 세척하였다.
그 다음이 그 균체를 초음파처리("Kubota Insonator" 장치사용 : 1.5A, 1분간)에 의해 파쇄하고 균체파쇄물을 원심분리하여 상징액으로서 조효소액을 얻었다. OMPB를 농도 100㎍/㎖로, 또 L-아스파라긴산을 농도 200㎍/㎖으로 되게하여 상기 조효소액에 첨가하였다. 아미노화반응(transamination reaction)의 대조기질로서 2-케토글루타르산(2-KG)을 사용하여 대조시험을 또 하였다.
30℃에서 2시간 그 효소반응을 행한다음, 100℃에서 3분간 가열하여 그 반응을 끝마쳤다. 얻어진 그 반응액을 묽은 황산으로 처리하여 PH 2로 조정한 다음 원심분리에 의해 상징액을 얻었다. 그 상징액중에 있는 L-AMPB와, 2OMPB-KG에서 생성한 글루타민산을 아미노산 분석기에 의해 정량하였다.
그 결과를 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00006
[실시예 4]
(1) 스트렙토미세스 히그로스코피커스(sterptomyces hygroscopicus) NP-50주(FERM P-7804 또는 FERM BP-1368)를 전배양배지(가용성전분 2.0%, 폴리펩톤 1.0%, 고기추출물 0.3%, 디포타슘 히드로겐 포스페이트 0.05%로 조성 : PH 7.0)10㎖에 접종하였다. 상기 NP-50균주를 28℃에서 24시간 진탕시켜 배양하였다. 이 배양액을 종모(seed culture)로서 사용하였다. 이것을 2%의 접종량으로 하여 생산배지[글루코오스 7.0%, 박토소이톤(bactosoyton)4.4%, 포타슘 디히드로겐 포스페이트 0.327%, 디소듐 히드로겐포스페이트 0.0852%, 도타이드 TES 1.15%, 코발트 클로리드 0.0001%로 조성 ; PH 6.0]에 접종하였다. 그 다음 그 NP-50균주를 28℃에서 통기하고 교반하면서 배양하였다.
(2) 위의 생산배지에서 3일간 배양한 스트렙토미세스 히그로스코피커스, NP-50주 배양액 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조정) 30㎖와, 시판되는 소듐 L-글루타메이트 수용액 40㎖(소듐 L-글루타메이트농도 ; 170㎎/㎖)와 1M 트리스(tris)-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크내에서 혼합시켰다. 이때, 그 혼합액중의 OMPB 농도는 약 26㎎/㎖로 되었다. 그 플라스크내에서 얻어진 혼합액을 37℃에서 약하게 진탕하면서 24시간 동안 그 효소반응을 시켰다. 그다음, 이와같이 하여 얻어진 반응액을 원심분리시켜 그 균체를 제거하였다. 그 결과 얻어진 L-AMPB를 함유한 상징액(100㎖)을 아미노산분석기로 분석하여 그 용액중의 L-AMPB의 생성량을 정량하였다. 따라서, L-AMPB 14㎎/㎖가 생산되었음을 확인하였다. 또, 아미노공여체로서 L-알라닌 또는 소듐 L-아스파르테이트(농도 170㎎/㎖로 첨가)를 사용하여 위와 동일한 실험을 실시하였다. L-알라닌을 사용할 경우 L-AMPB 2.8㎎/㎖가 생산되었고, 소듐 L-아스파르테이트를 사용할 경우에는 L-AMPB 1.5㎎/㎖이 생산되었음을 확인하였다.
(3) 위 처리항(2)에서 아미노기 공여체로서 소듐 L-글루타메이트를 사용할 때 반응액을 원심분리하여 얻어진 상징액(100㎖)을 수지 "DOWEX 50×2"(H+형) 400㎖의 양이온 수지컬럼에 처리시킨다음 묽은 암모니아수로 전개시켰다. L-AMPB를 함유한 그 용출액의 분액을 모아 농축시켰다. 그다음 그 농축액을 수지 "DOWEX 1×2"(CH3COO-형) 150㎖의 음이온 수지컬럼에서 크로마토그라피 처리를 하였다. 그리고, 그 수지컬럼을 물로 세척시킨다음 0.3N의 아세트산 수용액으로 용출(elute)시켰다. 그 L-AMPB를 함유한 용출액의 분액을 농축시켜 감압하에 건조하고 그다음 진공건조시켜 백색분말의 L-AMPB를 720㎎ 얻었다. 그 백색분말을 메타놀로 다시 결정화하였다. 얻어진 결정을 통상의 방법, 즉 원소분석, 비선광도, 융점, 적외선흡수 스펙트럼, 핵자기공명 스펙트럼, 및 질량분석법에 의해 분석하였다. 얻어진 L-AMPB의 결정은 L-AMPB의 표준품과 완전히 일치되었음을 확인하였다.
[실시예 5]
(1) 실시예 4의 처리공정항(1)에서 사용한 생산배지에 배양한 스트렙토미세스 히그로스코피커스 NP-50주(FERM P-7804; FERM BP-1368) 배양액 20㎖를 30㎖용 원심관에 넣어 10분간 3000rpm으로 원심분리하였다. 그리고 그 NP-50균주의 침전균체를 30㎖의 50mM 트리스-HCl 완충액(PH 8.5)에 현탁시켜 균체현탁액을 만들었다. 그 균체현탁액 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조정) 30㎖와, 시판용 소듐 L-글루타메이트 수용액(소듐 L-글루타메이트 농도 : 170㎎/㎖) 40㎖와, 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크에 넣어 혼합하였다. 이때 혼합한 용액중의 OMPB 농도는 약 25㎎/㎖로 되었다. 이것을 37℃에서 약하게 진탕하면서 24시간 효소반응을 시켰다. 그다음, 이와같이 해서 얻어진 반응액을 원심분리시켜 그 균체를 제거하였다.
그 결과 얻어진 L-AMPB를 함유한 상징액(100㎖)을 아미노산 분석기에 의해 분석시켜 그 용액중에서 L-AMPB의 양을 정량하였다.
L-AMPB 15㎎/㎖가 생산되었음을 확인하였다.
(2) 위 처리공정항(1)에서 얻어진 L-AMPB 함유상징액(100㎖)을 실시예 4 의 처리공정항(3)에서와 동일한 방법으로 하여 400㎖의 양이온 교환수지 "DOWEX 50W×2"(H+형)의 컬럼(column)상에서 크로마토그라피 처리를 한다음 묽은 암모니아수로 전개하였다.
그다음 실시예 4의 처리공정수(3)와 같이 L-AMPB 함유용출액 분액을 처리하여 백색분말로서 L-AMPB 750㎎을 얻었다.
[실시예 6]
(1) 실시예(4)의 처리공정항(1)에서 생산배지로 배양한 스트렙토미세스 히그로스코피커스 NP-50주(FERM P-780; FERM BP-1368) 배양액(20㎖)을 30㎖ 원심관에 넣어 10분, 3,000rpm으로 원심분리시켰다. 그 NP-50주의 침전된 균체를 30㎖의 50mM 트리스-HCl 완충액(PH 8.5)에 현탁하여 균체현탁액을 얻었다.
이 균체현탁액의 균체를 10분간 초음파 파쇄기(ultra-sonic disintegrator)로 파쇄시킨다음, 10,000rpm 10분간 원심분리하여 상징액으로 조효소액 20㎖을 얻었다.
(2) 상기 상징액(조효소액) 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조정) 30㎖와, 시판용 소듐 L-글루타메이트 수용액(소듐 L-글루타메이트 농도 : 170㎎/㎖) 40㎖와, 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크에 넣어 혼합하였다. 이때 상기 혼합액중의 OMPB 농도는 약 26㎎/㎖으로 되었다. 이 혼합액을 37℃에서 약하게 진탕하면서 24시간 그 효소반응을 시켰다.
그다음, 그 결과 얻어진 반응혼합액(100㎖)을 아미노산 분석기로 분석하여 상기 혼합액에 생성된 L-AMPB의 생성량을 정량하였다.
L-AMPB 16㎎/㎖의 생성이 확인되었다.
(3) 상기 처리공정항(2)의 효소반응에서 얻어진 반응혼합액(100㎖)을 실시예 4 의 처리공정항(3)에서와 같이 하여 400㎖의 양이온수지 "DOWEX×50W×2"(H+형)의 이온 교환수지컬럼상에서 크로마토그라피 처리를 하여 묽은 암모니아수로 전개하였다.
실시예 4 의 처리공정항(3)에서와 같이 L-AMPB 함유 용출액 분액을 처리하여 백색분말의 L-AMPB 740㎎을 얻었다.
[실시예 7]
(1) 스트렙토미세스 리비단스(sterptomyces lividans) 66주(FERM BP-737)를 실시예 4 의 처리공정항(1)에서 사용한 것과 같은 동일조성의 전배양배지 10㎖에 접종하였다. 이 균주를 24시간 28℃에서 진탕, 배양하였다. 그 얻어진 배양액을 종모로서 사용하였다.
이것을 실시예 4 의 처리공정항(1)에서 사용한 것과 동일한 조성의 생산배지에 2%의 접종양으로 하여 접종하였다. 그다음 28℃에서 통기, 교반하면서 배양하였다.
(2) 위와같은 생산배지에서 3일간 배양한 스트렙토미세스 리비단스(sterptomyces lividans) 66균주 배양액 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조성함) 30㎖와, 시판용 소듐 L-글루타메이트 수용액(소듐 L-글루타메이트 농도 : 170㎎/㎖) 40㎖와, 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크내에 넣어 혼합하였다. 그 혼합액중의 OMPB 농도는 약 26㎎/㎖로 되었다. 37℃의 이 혼합액을 그 플라스크내에서 약하게 진탕하면서 24시간 그 효소반응을 시켰다.
그다음, 그 반응혼합액을 원심분리시켜 균체를 제거하였다. 그 얻어진 L-AMPB 함유 상징액(100㎖)을 아미노산 분석기로 분석시켜 그 상징액중의 L-AMPB 생산량을 정량하였다.
L-AMPB 6㎎/㎖의 생산이 확인되었다.
[실시예 8]
(1) 스트렙토미세스 히그로스커피커스 SF-1293주(FERM BP-130, ATCC 21705)를 실시예 4 의 처리공정항(1)에서 사용한 것과 동일한 조성의 전배양배지 10㎖에 접종하였다.
상기 SF-1293 균주를 28℃에서 24시간 진탕, 교반을 하였다. 그 얻어진 배양액을 종모로서 사용하였다. 이것을 실시예 4 의 처리공정항(1)에서 사용한 것과 동일한 조성의 생산배지에서 2%의 접종량으로 하여 접종하였다.
그다음 그 SF-1293주를 통기, 교반하면서 28℃에서 배양하였다.
(2) 위와 같이 생산배지에서 3일간 배양한 스트렙토미세스 히그로스코피커스 SF-1293주 배양액 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조정) 30㎖와, 시판용 소듐 L-글루타-메이트 수용액(소듐 L-글루타메이트 농도 : 170㎎/㎖) 40㎖와 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크내에 넣어 혼합하였다. 그 얻어진 혼합액을 그 플라스크내에서 37℃로 약하게 진탕하면서 24시간 효소반응을 시켰다.
그다음, 그 얻어진 반응혼합액을 원심분리시켜 그 균체를 제거하였다. 그리고 얻어진 L-AMPB 함유 상징액(100㎖)을 아미노산 분석기로 분석하여 그 상징액중에 생산된 L-AMPB의 생산량을 정량하였다. L-AMPB 7㎎/㎖의 생산이 확인되었다.
3) 실시예 4 의 처리공정항(3)에서와 같은 동일한 방법으로 하여, 위 처리공정항(2)에서 얻어진 상징액(100㎖)을 400㎖의 양이온수지 "DOWEX 50W×2"(H+형)의 이온 교환수지컬럼상에서 크로마토그라피 방법으로 처리하고 그다음 묽은 암모니아수로 전개하였다.
실시예 4의 처리공정항(3)에서와 같은 동일한 방법으로 하여 L-AMPB 함유 용출액 분액을 처리하여 백색분말의 L-AMPB 350㎎을 얻었다.
[실시예 9]
시판용 빵효모(saccharomyces cerevisial ; 일본국 oriental yeast co.사 제품)의 습윤케이크(wet cake) 20g를 50mM 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 100㎖에 현탁하였다. 이 빵효모 균체 현탁액 20㎖와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 87㎎/㎖, 미리 PH 7.0으로 조정함) 30㎖와, 시판용 소듐 L-글루타메이트 수용액(소듐 L-글루타메이트 농도 : 170㎎/㎖) 40㎖와, 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 250㎖용 3각 플라스크에 넣어 혼합하였다. 그 결과 얻어진 혼합액을 37℃에서 24시간 진탕하면서 OMPB의 효소반응을 시켰다.
이와같이 하여 얻어진 반응혼합액을 원심분리시켜 그 균체를 제거하였다. 그리고 얻이진 L-AMPB 함유상징액(100㎖)을 아미노산 분석기로 분석하여 그 상징액중에 있는 L-AMPB의 생성량을 정량하였다. L-AMPB 6㎎/㎖의 생산이 확인되었다.
[실시예 10]
OMPB 400㎍/㎖와 L-글루타민산 600㎍/㎖를 가하여 용해시킨 500mM 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 중에 OMPB에 트랜스아미나제를 작용시켜 L-AMPB를 생산하였다. 이 트랜스아미나제로서 시판용 글루타민산-옥살로아세트산-트랜스아미나제(GOT)(Boehringer Mannheim Co., 제품)을 사용하였다. 이 GOT 농도는 40단위/㎖로 정하였다.
37℃, 24시간 상기 효소반응을 시킨다음 얻어진 반응액을 100℃에서 3분간 가열하여 반응을 끝마쳤다. 그 다음 이 반응액을 묽은 황산을 써서 PH 2로 조정하고 원심분리시켜 불용물(insoluble solids)을 제거하였다. 그리고 상징액을 얻었다. 그 상징액중의 L-AMPB의 생산량은 아미노산 분석기로 분석하였다. 그 아미노산 분석기는 아토사제(ATTO Corporation, 일본국) 제품 MLC-703형이고, 그 유지시간(retention time)은 12분으로 하였다. 그 상징액중에서 L-AMPB 100㎍/㎖의 생산이 확인되었다.
[실시예 11]
(1) 재배방법
각각의 종배양슬랜트(seed culture slants)에서 다음 표 4-10에 나타낸 미생물(균 1)을, 액체 배지(liquid culture medium)[글루코오스 0.5%, 효모 추출물 0.3%, 고기추출물(meet extract) 1.0%, 펩톤 1.0%, 소듐 클로티드 0.3%의 조성; PH 7.0] 10㎖씩 넣은 대형 시험관내에서 그 액체배지에 접종하였다. 방선균 배양의 경우에만 스테인레스 스틸제코일을 넣은 시험관을 사용하였다. 그리고 위에서 접종한 미생물 튜브세이커(tube shaker)에서 28℃, 24시간(또는 48시간) 각각 진탕하였다.
(2) 균체의 조제
그 배양을 한다음 얻어진 배양액 1㎖(균류의 경우 균류 배양액 0.2㎖)을 미크로테스트 튜브(Micro test tube)(Eppendorf co., Ltd사 제품)에 뽑아내어 3분간 12000rpm으로 원심분리시켜 얻어진 상징액을 버리고 나머지의 균체를 시료로 각각 채취하였다.
(3) 효소반응
위 미크로테스트 튜브 각각에 넣은(Pack) 균체 시료에 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.0) 20㎕와, OMPB 수용액(OMPB 농도 : 200㎎/㎖, PH 8.0) 20㎖와, 아래에 나타낸 아미노기 공여체 수용액(소듐 L-글루타메이트, 소듐 L-아스파트테이트 및 L-알라닌중 어느 하나를 포함하며, 각각 1 mol/㎖ 농도임) 40㎖와 물 120㎖를 첨가하여 얻어진 이 혼합액을 37℃, 24시간 방치하여 균체, OMPB와 아미노기 공여체 화합물 상호간에 반응시켰다. 반응후, 그 반응액을 3분간 12,000rpm으로 원심분리하였다.
그 다음 얻어진 상징액에 있는 L-AMPB의 함량을 아미노산 분석기로 분석하여 측정하였다. 그 결과를 다음 표 4-10에 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00007
[표 5]
Figure kpo00008
[표 6]
Figure kpo00009
[표 7]
Figure kpo00010
* 배양시간은 48시간으로 하였음.
[표 8]
Figure kpo00011
* 비아라포스 생산균
[표 9]
Figure kpo00012
[표 10]
Figure kpo00013
* 배양시간은 48시간으로 하였음
본 명세서에서, 특히 위 표 2 와, 표4, 표10에 나타낸 미생물중 ATCC 번호를 붙인 균종은 "American Type Culture Collection"(미국 워싱톤 D.C 소재)에 기탁되어 있는 것이며, JCM 번호를 붙인 균종은 이 화학연구소 미생물계통 보존시설(Japan Collection of Microorganism : 일본국 사이타마겐 와코시 소재)에 기탁되어 있는 것이고, IAM 번호를 붙인 균종은 일본국 토쿄대학 응용미생물 연구소에 기탁되어 있는 것이며, IFO 번호를 붙인 균종은 일본국 오사카시 소재의 발효연구소("Institute for Fermentation, Osaka")에 기탁되어 있는 것이다. 이들의 균종은 각각 상기 기탁소에서 분양, 입수할 수 있는 공지타입의 배양균주의 미생물(culture strains)이다.
[실시예 12]
(1) 스트렙토미세스 히그로스코피스 NP-50주(FERM P-7804 또는 FERM BP-1368)을 전배양배지(가용성 전분 2.0%, 폴리펩톤 1.0%, 고기추출물 0.3%, 디포타슘 히드로겐 포스페이트 0.05%로 조성; PH 7.0) 10㎖에 접종하였다. 상기 NP-50주를 28℃에서 24시간 진탕배양하였다.
그 결과 얻어진 배양액 종모(seed culture)로서 사용하였다. 이것을 2%의 접당량으로 하여 생산배지[글루코오스 87.0%, 밀씨눈(wheet germs) 3.9%, 가용성의 식물성 단백질(vegatative protein) 2.5%, 포타슘 디히드로겐 포스페이트 0.3%, 코발트클로리드 0.0001% 조성; PH 6.8]에 접종하였다.
또 28℃에서 동기하여 교반하면서 배양하였다.
(2) 위 생산배지에서 3일간 상기 NP-50주를 배양하여 그 NP-50주의 균체를 함유한 배양액 20㎖에, OMPB와, 아미노가 공여체로서 소듐 L-글루타메이트와 소듐 L-아스파르-테이트를 아아미노기 전이반응(transamination reaction)의 개시시점에서 다음 표11에 나타낸 농도로 되도록 한 양으로 첨가하였다.
또, 1M 트리스-HCl 완충액(PH 8.5) 10㎖를 가하여 PH 8.5로 고정하였다. 그다음 얻어진 혼합액의 액량을 100㎖로 하였다. 즉, 상기 배양액을 5배로 묽게 하였다. 그리고, 현탁되어 있는 균체를 함유하며 또 용해한 OMPB와 아미노기 공여체 화합물을 함유한 용액을 약하게 진탕하면서 37℃, 24시간 OMPB의 효소적 아미노화 반응을 시켰다. 그 반응후에 얻어진 반응액 100㎖를 가열처리[멸균 및 효소의 불환성화)하여 반응을 끝마쳤다.
반응액을 여과시켜 균체를 제거하고 얻어진 여액중의 L-AMPB의 함량을 아미노산분석기("MLC-703", ATTC 사제품 ; 보유시간 12분)로 분석하여 정량하였다.
그 결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
Figure kpo00014
표 11의 성적에서, 아미노기공여체로서 소듐 L-글루타메이트와 L-아스파르테이트 존재하에 OMPB의 효소적 아미노화반응을 실시할때, 소듐 L-글루타메이트와 소듐 L-아스파르테이트 어느한쪽의 존재하에 OMPB의 효소적 아미노화반응을 실시할때와 비교하여 OMPB에서 생산된 L-AMPB의 생산량(수율)이 현저하게 높아짐을 알 수 있다.
[실시예 13]
실시예 12와 동일하게 전배양조건에서 배양된 스트렙토미세스 히그로스코피커스 NP-50주 배양액을 종모로서 사용하였다.
3ℓ용 자퍼멘터(3ar fermeutor)중에서 실시예 12와 동일한 생산배지에 접종한 다음 28℃에서 3일 통기배양을 하였다.
얻어진 배양액의 2ℓ를 반응탱크에 옮긴다음 OMPB 300g을 그 배양액에 첨가하였다. 또, 소듐 L-글루타메이트(일본국 와코 순약제품) 310g과, 소듐 L-아스파르테이트(일본국 나카라이 화학제품) 290g을 또 상기 배양액에 첨가하여 용해하였다. 그다음 NaOH 수용액으로 PH 8.5로 그 얻어진 혼합액을 조성한다음, 물을 가해 10ℓ로 하였다.
즉, 그결과 얻어진 혼합액중 OMPB 농도는 그 반응 개시시점에서 30,000㎍/㎖이었다. 이 시점에서 소듐 L-글루타메이트와 소듐 L-아스파르테이트의 물농도는 각각 OMPB의 물농도(1/6몰)와 동일하게 되었다.
그다음 그 NP-50주의 균체, OMPB 및 아미노기공여체 화합물을 함유한 용액을 약하게 교반하면서 PH를 8.5로 조정하여 37℃에서 24시간 OMPB의 효소적인 아미노화반응을 하였다.
그 반응후, 얻어진 반응액을 50% 황산을 첨가시켜 OH 3.0으로 조정하였다.
그다음 여과조제(filter aid)를 가하여 그 반응액을 여과시켜 균체를 제거하고, 여액 9ℓ를 얻었다. 이때, 그 여액중의 L-AMPB의 용도를 실시예 12에서와 같이 분석, 정량하여 29,000㎍/㎖임을 확인하였다.
다음으로, 그 여액은 양이온 교환수지로서 "DOWEX 50W" (H+형)5ℓ의 컬럼을 관통하여 크로마토그라피처리를 하였다. 그리고 물로 전개하였다.
얻어진 L-AMPB 함유 용출액 분액을 또 음이온교환 수지로서 "DOWEX 1×2"(CH3COO-형)칼럼에서 크로마토그라피처리를 한다음 물로 세척하고 0.3N 아세트산 수용액으로 용출시켰다.
L-AMPB 함유 용출액분액을 농축하여 감압하 건조한 다음 진공건조시켜 백색분말로서 L-AMPB을 얻었다. 이 백색분말을 메타놀로 다시 결정화시켜 L-AMPB 결정 183g을 얻었다.
수율은 약 70%이었다.
얻어진 L-AMPB 결정을 통상의 방법, 즉 원소분석, 비선광도, 융점, 적외선 흡수스펙트럼, 핵자기 공명 스펙트럼 및 질량분석법으로 분석하였다.
그결과, 얻어진 L-AMPB는 그 표준품과 완전히 일치됨을 확인하였다.
본 발명에 의해 OMPB에서 아미노기공여체의 존재하에서 트랜스 아미나제 생산능을 가진 미생물 또는 트랜스 아미나제의 작용에 의해 L-AMPB를 제조하면 적당한 반응시간에서 높은 수율의 염가로 다량으로 L-AMPB를 제조할 수 있다.

Claims (18)

  1. 다음식(II)의 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 하나 또는 그 이상의 아미노기공여체(aminodonors) 존재하에서 하나 또는 그 이상의 트랜스로, 또는 하나 또는 그 이상의 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 하나 또는 그 이상의 미생물로 처리함을 특징으로 한 다음식(I)의 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 사용된 미생물로 반성균임을 특징으로 한 상기 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 박테리아임을 특징으로 한 상기 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 효모임을 특징으로 한 상기 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 균류(fungus)임을 특징으로 한 상기 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 스트렙토미세스 (sterptomyces)속, 스트렙토버티실륨(Streptoverticillium)속, 노카르디아(Nocardia)속, 노카르디오프시스(Nocardiopsis)속, 삭카로폴리스포라(sacakaropolyspora)속, 키타사토스포리아(kitasatosporia)속, 미크로모노스포라(Micromonospora) 및 스트렙토스포란굼(Streptosporangium)속에서 선택한 방선균임을 특징으로 한 상기 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 바실러스(Bacillus)속, 미크로콕커스(Micrococcus)속, 스타필로콕커스(staphylococcus)속, 에쉐리히아(Escherichia)속, 슈도모나스(pseudomonas)속, 세라티아(serratia)속 및 코리네박테륨(corynebacterium)속에서 선택한 박테리아임을 특징으로 한 상기 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 사용된 미생물은 삭카로미세스(saccharomyces)속, 칸디다(candida)속, 크립토콕커스(cryptococcus)속, 데바리오미세스(Debaryomyces)속, 트리고노프시스(Trigonopsis)속 및 한세눌라(Hansenula)속에서 선택한 효모(yeast)임을 특징으로 한 상기 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 사용한 미생물은 아스페르길러스(Aspergillus)속, 무코르(Mucor)속, 아우레오바시튬(Aureobasidium)속, 카에토늄(chaetomium)속, 페니실륨(penicillium)속 및 글리오클라듐(gliocladium)속에서 선택한 균류(fungus)임을 특징으로 한 상기 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 사용한 트랜스아미나제는 글루타민산-옥살토아세트산-트랜스아미나제, 글루타민산-피루빅산-트랜스아미나제 및 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 아미노기공여체로서 글루타민산의 존재하에서 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산으로 전환시킬 수 있는 트랜스아미나제 중에서 어느 하나 또는 상기 트랜스아미나제중 하나 또는 그 이상의 조합임을 특징으로 한 상기 방법.
  11. 제 1 항 내지 제10항중 한 항에 있어서, 상기 사용된 아미노기공여체는 글루타민산 및 또는 아스파라긴산임을 특징으로 한 상기 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을, 온도 실온-60℃와 PH 7.5-9.0의 알칼리 상태에서 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산; 아미노기공여체 화합물 및 트랜스아미나제를 용해한 수용성 반응용매액 중에서 적어도 하나의 아미노기공여체 화합물의 존재하에 적어도 하나의 트랜스아미나제와 처리 또는 반응시킴을 특징으로 한 상기 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을, 온도 실온-60℃와, PH 7.5-9.0의 알칼리상태에서 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체 화합물을 용해시키고 상기 미생물의 균체(cells)를 현탁시킨 수용성 반응매질액 중에서 적어도 하나의 아미노기공여체 화합물의 존재하에 적어도 하나의 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 처리 또는 반응시킴을 특징으로 한 상기 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을, 온도 실온-60℃와, PH 7.5-9.0의 알칼리상태하에서 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산, 아미노기공여체 화합물 및 트랜스아미나제함유 상기 미생물 추출물을 용해한 수용성 반응매질액 중에 적어도 하나의 아미노기공여체 화합물의 존재하에서 적어도 하나의 트랜스아미나제를 생산할 수 있고 그 트랜스아미나제를 함유한 미생물 추출물과 처리시킴을 특징으로 한 상기 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 수용성 반응매질액 중에서 그 산의 처음농도 0.1-100㎎/㎖으로 용해시킴을 특징으로 한 상기 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체 화합물을, 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산을 L-2-아미노-4-(히드록시메틸포스피닐)-부티르산으로 전환시키기 전 초기에 수용성 반응매질액 중에서 몰비를 1:10-10:1의 범위에 있도록 함을 특징으로 한 상기 방법.
  17. 제 1 항 또는 제13항에 있어서, 상기 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산과 아미노기공여체 화합물을 상기 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 미생물 배양액에 첨가하여 상기 미생물의 생균체(intact cells)를 현탁시킨 다음 4-(히드록시메틸포스피닐)-2-옥소-부티르산, 아미노기공여체 화합물 및 상기 미생물을 서로 작용시킴을 특징으로 한 상기 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 트랜스아미나제를 생산할 수 있는 사용 미생물은 스트렙토미세스 히그로스코피커스(streptomyces hygroscopicus) SF-1293 FERM BP-130 또는 ATCC 21705, 스트렙토미세스 히그로스코피커스(streptomyces hygroscopicus) NP-50 FERM BP-1368, 스트렙토미세스 리비단스(streptomyces lividans) 66 FERM BP-737, 스트렙토미세스 알버스(streptomyces albus) IFO 13014(ATCC 3004), 스트렙토미세스 그리세우스(streptomyces griseus) IFO 12875(ATCC 23345), 스트렙토버리실륨 신나모네움(streptovericillium cinnamoneum) IFO 12852(ATCC 11874), 스트렙토미세스 모로오카엔시스(streptomyces morookaensis) IFO 13416(ATCC 19166), 노카르디아 메디터라네이(Nocardia mediterranei) ATCC 21271, 노카르디오프시스 라스손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei) JCM 3237, 삭카로폴리스포라 히르수타(saccharopolyspora hirsuta) JCM 3170(ATCC 278757), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(streptomyces viridochromogenes) IFO 13347(ATCC 14925, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 JCM 4977, 스트렙토미세스 필로서스(streptomyces pilosus) IFO 12807(ATCC 19797), 미크로모노스포라 카르보나시애(Micromonospora carbonaceae) NRRL 2972(ATCC 27114), 스트렙토스포란굼 슈도불가레(streptosporangium pseudovulgare) ATCC 27100; 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633, 미크로콕커스 루테우스(Micrococcus luteus) ATCC 9341, 스타필로콕커스 아우레우스(staphylococcus aureus) 209p, ATCC 6538, 에쉐리히아콜리(Escherichia coil) ATCC 10798, 슈도모나스 애루기노사(pseudomonas aeruginosa) ATCC 10145, 슈도모나스 세파시아(pseudomonas cepacia) ATCC 17759, 세트라티아 마르세스센스(serratia marcescens) ATCC 13880, 코리네박테륨 글루타미컴(corynebacterium glutamicum) ATCC 13032; 삭카로미세스 세리비시애(saccharomyces cerevisiae) ATCC 9763, 칸디다 알비칸(candida albicans) IAM 4888, 칸디다 알비칸 IAM 4829, 크리프로콕커스 네오포르만스(cryptococcus neoformans) IAM 4772, 데바리오미세스 한세디이(Debaryomyces hansenii) IAM 4356, 트리고노프시스 배리아빌리스(Trigonopsis variabilis) IAM 4443, 한세눌라 쉬네기(Hansenula schneggi) IAM 4269; 아스퍼길러스 플라버스(Aspergillus blavus) ATCC 9643, 아스퍼길러스 터리우스(Aspergillus terreus) IAM QM 82 J, 무코 스피네스센스(Mucor spinescens) IAM MU 3, 아우레오바시듐 플루란스(Aureobasidium pullulans) IAM F 24, 캐토뮴 글로보섬(Chaetomium globosum) ATCC 6205, 페니실륨 푸니컬로섬(penicillium funiculosum) ATCC 9466와 글리오클라듐 비렌스(gliocladium virens) ATCC 9645에서 선택함을 특징으로 한 상기 방법.
KR1019870005835A 1986-06-09 1987-06-09 L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법 KR940005654B1 (ko)

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