HU200342B

HU200342B - Enzymatic process for producing l-2-amino-4-/hydroxy-methyl-phosphinyl/-butiric acid

Info

Publication number: HU200342B
Application number: HU872606A
Authority: HU
Inventors: Satoshi Imai; Yachiyo Yoshizawa; Hiroshi Ogawa; Osamu Hara; Yoichi Kumada; Kozo Nagaoka; Atsuyuki Sato; Akira Okada; Nobuhiko Takane; Toshinori Saito; Takeshi Murakami; Shinji Miyado; Hiroyuki Anzai; Hidehi Takabe; Shunzo Fukatsu
Original assignee: Meiji Seika Kaisha
Priority date: 1986-06-09
Filing date: 1987-06-08
Publication date: 1990-05-28
Also published as: AU599985B2; CN87105130A; SU1731067A3; KR880000593A; EP0249188A2; IN165699B; ATE111530T1; ES2059324T3; AU7375087A; EP0249188B1; DK289687A; DE3750523T2; KR940005654B1; DE3750523D1; IL82786A0; DK289687D0; JP2589693B2; JPS6427485A; NZ220576A; EP0249188A3

Description

(57) KIVONAT

A találmány szerinti eljárásban (Π) képletű vegyület egy vagy több transzaminázzal vagy egy vagy több transzaminázt termelő mikroorganizmussal kezelnek egy vagy több amino-donor vegyület, például α-aminosavak jelenlétében.

A (I) képletű vegyület herbicid aktivitással rendelkezik.

CHj —P-CHj-C^-CH —COOH (I) OH NHj

CH-j— P-OH-CHj-C— COOH (II)

I S

OH 0

A leírás terjedelme: 15 oldal, 1 ábra

HU 200 342 B

-1HU 200342 Β

A találmány tárgya új eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfmil)-vajsav előállítására, amely ismert herbicid hatású anyag (lásd 56 210/86 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés vagy 4 165 654 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom).

Az (I) általános képletű L-2-amino-4-(hidroximetil-foszfinil)-vajsav (amelyet a továbbiakban LAMPB rövidítéssel jelölünk) ismert módon úgy állítható elő, hogy az SF-1293 jelű antibiotikus anyagot, éspedig az L-2-amino-4-(hidroxi-meitl-foszíinil)-butiril-L-alanil-L-alanint, amely magában foglalja a L-AMPB-t és herbicid aktivitással rendelkezik (bialafosz néven van forgalomban, lásd 639/76 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés és a 4 309 208 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom) hidrolizálják (lásd 85538/73 sz. először publikált japán szabadalmi bejelentés „Kokai). Az (I) általános képletű vegyület előállítható továbbá úgy is, hogy az SF-1293jelű anyagot mikrobiológiai enzimmel bontják lásd 31 890/74 sz. először publikált japán szabadalmi bejelentés, Kokai). Emellett ismeretesek továbbá olyan eljárások, ahol az AMPBt először kémiai szintetikus módszerrel racém elegy formájában állítják elő (lásd 91019/73 és 84 529Π9 sz. először publikált japán szabadalmi bejelentések), majd a racém AMPB-t mikrobiológiai enzimmel optikailag rezolválják, és így L-AMPB-t állítanak elő. Ismeretes továbbá egy olyan módszer, ahol L-AMPB-t termelő, Streptomyces nemzetségbe tartozó törzset tenyésztenek, és a fermentléből kinyerik a L-AMPB-t (lásd 47 485/82 sz. először publikált japán szabadalmi bejelentés, Kokai).

Alihoz, hogy egy herbicid hatású vegyületet, mint például az L-AMPB-t kereskedelmi herbicid készítményként hozzunk forgalomba, feltétlenül szükséges olyan kutatásokat végezni, amelyekkel az előállítási eljárást javítjuk és alkalmassá tesszük a nagyüzemi, alacsony költséggel történő gyártásra, továbbá olyan kutatásokra van szükség, amelyekkel az anyag biztonságosságát és herbicid hatásosságát fokozzuk Az említett kémiai szintetikus eljárásokkal előállított AMPB az L-AMPB és D-AMPB elegye. Maga a D-AMPB lényegében nem rendelkezik herbicid aktivitással. Ezenkívül a D-AMPB nem természetes anyag, így ha a talajba kerül, a talajbaktériumok lassan bontják el, így felhalmozódik és környezeti szennyezést okoz. Ha L-AMPB-t akarunk előállítani szinteitkus módszerrel, akkor először AMPB-t állítunk elő racém elegy formájában, és az L-AMPB-t és D-AMPB-t egymástól el kell választani. A szintetikus módszer tehát nehézkes, és az L-AMPB hozama alacsony. Ezzel szemben azokban az eljárásokban, amelyekben LAMPB előállítására mikroorganizmust vagy mikrobiológiai enzimet alkalmazunk, kizárólag L-AMPB képződik, amely természetben előforduló anyag. A természetben előforduló L-AMPB ideális herbicidnek tekinthető, amely nem okoz környezetszennyezést, mivel az L-AMPB-nek azt a részét, amely a herbicid hatás kifejtésében nem vesz részt és a talajban marad, a talabaktériumok könnyen elbontják és metabolizálják, így nem halmozódik fel a talajban.

Kidolgoztunk egy eljárást, amellyel L-AMPB nagy mennyiségben szelektív módon állítható elő.

fiíz. L-AMPB egy alfa-aminosav származéknak tekinthető. Ismeretes, hogya fehérjéket alkotó aaminosavak a megfelelő 2-oxo-savak transzaminálásával specifikus transzaminázok jelenlétében előállíthatok. Kísérleteket folytattunk az L-AMPBnek megfelelő 2-oxo-savak felkutatására. Meglepő módon úgy találtuk, hogyha 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsavat (amelyet a továbbiakban röviden OMPB-ként említünk) bizonyos transzaminázzal vagy ilyen transzaminázt termelni képes mikroorganizmussal kezelünk legalább egy amino-donor jelenlétében, az OMPB átalakítható L-AMPB-vé megfelelő kitermeléssel, elfogadható reakcióidőn belül.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás (I) általános képletű L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására. Az eljárást úgy végezzük, hogy egy (II) képletű 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2oxo-vajsavat egy vagy több amino-donor jelenlétében egy vagy több transzaminázzal, vagy egy vagy több, ilyen transzaminázokat termelni képes mikroorganizmussal kezelünk.

A találmány szerinti eljárást úgy hajtjuk végre, hogya transzaminázt vagy a transzaminázt termelni képes mikroorganizmust az OMPB-vel és az amino-donor vegyülettel vizes közegben reagáltatjuk, amely az OMPB-t és az amino-donor vegyületet oldott állapotban tartalmazza.

Előnyös, ha a találmány szerinti eljárásban az OMPB L-AMPB-vé történő átalakításakor a reakciöközeg pH-ját 7,5 vagy ennél magasabb értéken, előnyösen 8,0 és 9,0 közötti értéken tartjuk. A pH beállítását nátrium-hidroxiddal vagy alkalmas pufferrel végezzük Célszerűen a reakciókörülményeket olyan hőmérsékleten és pH-értéken tartjuk amely megfelel a transzamináz vagy a transzaminázt termelő mikroorganizmus optimális hőmérséklet és pH-értékének. Általában előnyös a reakciót szobahőmérséklet és 60 ®C, előnyösen 25 és 50 °C közötti hőmérsékleten vezetni.

A kiindulási anyagként alkalmazott OMPB ismert vegyület. Az OMPB előállítását és fizíkokémiai tulajdonságait például a92897/81 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés és a 4 399 287 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. A találmány szerinti eljárásban a reakcióközeg kezdeti OMPB-koncentrációját előnyösen 0,1 és 100 mg/ml értékre állítjuk be a reakció kezdetekor.

A találmány szerinti eljárásban mikroorganizmusként alkalmazhatunk actinomicetákat, baktériumokat, élesztőket és penészeket. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható actinomiceták például Streptomyces albus, Streptomyces griseus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces morookaensis, Streptoverticillium cinnamoneum, Nocardia mediterránéi, Nocardiopsis dassonvillei, Saccharopolyyspora hirsuta, Kitasatosporia phosalacinea, Micromonospora carbonaceae, Streptosporangium pseudovulgare stb.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható baktériumok például Bacillus substilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia, Serritia marcesces, Croynebacterium glutamicum stb.

-2HU 200342 Β

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható élesztők például Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Debaryomyces handsenii, Trigonopsis variábilis, Hansenula shcneggi stb.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható penészek például Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Mucor spinescens, Aureaobasidium pullulans, Chaetomium globosum, Penicillium funiculosum, Gliodadium vireus stb.

A felsorolt aktinomiceták, baktériumok, penészek és élesztők ismert törzsgyűjteményekben letétbe helyezett és szabadon hozzáférhető mikroorganizmusok lehetnek.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható a szabadon hozzáférhető Streptomyces hygroscopicus SF-1293 jelű törzs (FERM BP-130 vagy ATCC 21705, lásd 639/76 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés vagy 3 832 394 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom), amely SF-1293 anyag termelő Streptomyces törzsként ismert, vagy ennek mutánstörzse, a Streptomyces hygroscopicus NP-50 jelű törzs (FERM p-7804 vagy FERM BP-1368, lásd 68 589/86 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés), valamint Streptomyces lividans 66 jelű törzs jelű törzs (FERM BP-737, lásd 175 889/84 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés vagy0196375 sz. európai szabadalmi bejelentés). Emellett bármely olyan mikroorganizmus is alkalmazható, amely transzamináz aktivitással rendelkező enzimet termel, amely képes az OMPB-t L-AMPB-vé átalakítani amino-donor jelenlétében. A streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzs mikrobiológiaijellemzőit a 639/76 számú japán szabadalmi publikáció és a 3 832 394 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. A Streptomyces hygroscopicus NP-50 jelű törzs (FERM BP-1368) mikrobiológiai jellemzői meg4 egyeznek az előbb említett SF-1293 jelű törzsével, de az NP-50 jelű törzs genetikai jellemzői annyiban térnek el a SF-1293 jelű törzsétől, hogy az NP-50 jelű törzs nem képes SF-1293jelű anyagot termelni (lásd 58 589/86 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés vagy a 0173327 számú európai szabadalmi bejelentés). A Streptomyces lividans 66 jelű törzs (FERM BP-737) mikrobiológiai jellemzői a 175 889/84 számú közzétett japán szabadalmi beje10 lentés ismerteti. Az említett mikroorganizmus törzsek közül azok, amelyek FERM P-számmal vannak jelölve a japán „Fermentation Resarch Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministryof International Trade and Industry (1-3,

Higashi 1-chome, Yatebe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japán), vannal letétbe helyezve, és azok a mikroorganizmusok, amelyek FERM BPszámmal vannak jelölve a japán törzsgyfijteményben a Budapest Egyezmény értelmében vannak le20 tétbe helyezve.

A Streptomyces hygroscopücus SF-1293 NP-50 és az 5. hygroscopicus SF-1293 törzsek mikrobiológiai tulajdonságai a következők.

I. Morfológiai tulajdonságok

Légmicéliumokat jelentős mértékben termel, spórákat bőségesen termel keményítő-agaron, zabliszt-agaron, élesztő-maláta-agaron és tirozin-agaron. A légmicéliumok egyszerűen elágaznak, de nem örvös formában. A légmicéliumok végénél zárt, szoros spirálok vagy nyílt, rövid spirálok képződnek. Sklerotium képződése nem figyelhető meg. Az elektromikroszkópos megfigyelések azt mutatják, hogy a spóra sima felületi szerkezetű. A spórák ellipszis vagy ovális formájúak, és 10 vagy több spóra összekapcsolódik. A spórák 0,6-0,8 x 0,8-1,1 mikrométer.

II. Ténvésztési tulajdonságok

Tenyészközeg	Növekedés	Légmicélium	Oldható pigment
Szacharóz-nit- rát-agar	Színtelentől gos barnáig, enyhén zöldes árnyalattal	vilá- től fehéres szürkéig	Kevés, fehérNincs
Glükóz-aszpa- ragm-agar	Krémszínűtől gyengén zöldig	Fehér, később enyhén zöldes barnába változó	Nincs
Glicerin-asz- paragin-agar	Krémszínűtől világos sárgáig	Kevés, fehér színű	Nincs
Keményítő- -agar	Jó növekedés, krémszínű enyhén zöldes árnyalattal, fokozatosan halvány barnára színeződik	Bőséges, szürkés barna, fokozatosan higroszkópossá válik	Nincs
Tirorin-agar	Jó növekefdés, sár- Bőséges, zöldes gás krémszínűtől barna, fokozatovilágos sárgás san higroszkó- barnáig possá válik	Nincs

-3HU 200342 Β

6

Tenyészközeg	Növekedés	Légmicélium ' ’ '	Oldható pigment
Tápagar	Gyenge növekedés, világos sárga	Kevés, fehér	Nincs
Élesztő-ma-	Jó növekedés,	Kevés, barnás
láta-agar	sárgás barna	szürke, fokozatosan higroszkópossá válik	Nincs
Zabliszt-agar	Jó növekedés,	Bőséges, szürkés
világos szürkés zöld	barna, fokozatosan higroszkópossá válik	Nincs
Élesztő-kemé	Jó növekedés,	Bőséges, barnás
nyítő-agar	sárgás barna	szürke, fokozatosan higroszkópossá válik	Nincs
Burgonya-	Fokozott növeke-	Nem figyelhető	Nincs
-szelet	dés, erősen redőzött, világos barna	meg

Inkubálás hőmérséklete minden tápközeg esetén 28 °C.

ΙΠ. Fiziológiai tulajdonságok

1. Tenyésztési hőmérséklettartomány: jó növekedés 20-40 ’C-on, élesztő-maláta ferde agaron. 30

2. Zselatin elfolyósítás: nem figyelhető meg 20 ’C-on 30 napig történő inkubálás alatt

3. Keményítő-hidrolízis: pozitív (erősen)

4. Sovány tej koagulálás: negatív 28 ’C-on és 37 ‘C-on 35

5. Sovány tej peptonizácíója: pozitív 28 és 37 ’C-on

6. Melaninszerű pigment képzés: negatív

IV. Szénforrások hasznosítása 40 (Pridham-Gottlieb agar tápközegen vizsgálva)

1. Hasznosítja: D-glükóz, D-fruktóz, D-mannit, szacharóz és raifíinóz

2. Kétséges: D-xilóz, L-arabinóz

3. Nem hasznosítja: inozit és ramnóz 45

A Streptomyces lividans 66 mikrobiológiai jellemzői a következők:

Morfológiai jellemzők: Spórák spirál alakú láncát képezi, az érett spórák lánca 10 vagy ennél több spórát tartalmaz, élesztő-maláta-agaron, zabliszt- 50 agaron, keményítő-szervetlen só-agaron és glicerin-aszparagin-agaron. A spórák felülete sima. A légmicéliumok színe élesztő-maláta-agaron, zabliszt-agaron, keményítő-szervetlen só-agaron és glicerin-aszparagin-agaron szürkétől vöröses színig 55 változik. Ezen tápközegeken a telepek hátoldala halvány-sötét szürkés bíbor vagy szürkés vöröses bíbor. Pepton-élesztő-agaron, tirozin-agaron vagy tripton-élesztó-agar folyékony közegen oldható pigment nem képződik. Élesztő-maláta-agaron, 60 zabliszt-agaron keményítő-szervetlen só-agaron és glicerin-aszparagin-agaron kék vagy ibolya színű pigmentet képez, és a pigment színe érzékenyen változik a tápközeg pH-jától függően.

Az S. lividans 66 a D-glükózt, L-arabinózt, D-xi- 65 lózt, i-inozitot, D-mannitot, D-fruktózt, ramnózt, szacharózt és a rafiinózt hasznosítja.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható bármely olyan enzim, azaz transzamináz, amely képes az OMPB-t L-AMPB-vé transzaminálni egy amino-donor jelenlétében.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatók például a kereskedelemben kapható glutaminsav-oxálecetsav-transzamináz (GOT; nemzetközi enzim osztályozási száma EC 2,6,1,1) és a kereskedelemben kapható glutaminsav-piroszőlősav-tTanszamináz (GPT; nemzetközi enzimosztályozása száma EC 2,6,1,2), valamint az olyan enzimek, amelyek az OMPB-t L-AMPB-vé képesek transzaminálni L-glutaminsav mint amino-donor jelenlétében. Ezek a transzaminázok alkalmazhatók önmagukban vagy kettő vagy több kombinációban. A transzaminázok egy előnyös kombinációja az a rendszer, amely tartalmaz egy olyan transzaminázt, amely képes a 2-kctoglutársavat glutaminsavvá átalakítani aszparaginsav mint amino-donor jelenlétében, azaz áz ilyen transzamináz szintén rendelkezik úgynevezett GOT-aktivitással, továbbá egy második enzimet, amely rendelkezik az OMPBt glutaminsav mint amino-donor jelenlétében LAMPB-vé átalakító transzamináz-aktivitással. így például alkalmazhatunk úgynevezett GOT-aktivitással rendelkező kereskedelemben kapható glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázt (nemzetközi enzimosztályozási szám EC 2,6,1,1) vagy olyan GOTaktivitással is rendelkező transzaminázt, amelyet GOT-aktivitással rendelkező mikroorganizmusból szokásos módon extraháltunk, így például a Streptomyces hygroszcopicus SF-1293jelű törzsből (lásd 47485/82 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés; FERM BP-130; ATCC 21705). Ezek a GOT-aktivitással is rendelkező transzaminázok szintén alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációban. Második transzaminázként amely amely az

-4HU 200342 Β

OMPB-t L-glutaminsav mint amino-donor jelenlétében L-AMPB-vé képes átalakítani, és amelyet az említett, GOT-aktivitással is rendelkező transzaminázokkal együtt alkalmazhatunk, lehet bármely olyan transzamináz, amely képes az OMPB-t L-glutaminsav jelenlétében L-AMPB-vé átalakítani.

A találmány szerinti eljárásban amiao-donorként bármely ismert amino-donor alkalmazható, például azok, amelyeket a következő források ismertetnek: SEIKAGAKU JIKKEN KOZA, IX Mctaboiism of Amino-acids and Bio-amines, szerkesztő: The Japanese Biochemical Society, kiadó. Tokyo Kagaku Dozin Company Limited; Jorunal of Biological Chemistry, 242» 2486 (1972).

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható amino-donor vegyületek például az egyenes szénláncú alifás L-a-aminosavak, mist például L-glutaminsav, L-aszparaginsav, L-alanin, L-metionin, L-glutamin stb: elágazó szénláncú alifás L-aaminosavak, mint például L-leucin, L-izoleucin, Lvalin stb; bázikus aminosavak, mint például L-lizin, L-ornitin, L-hisztidin stb; valamint aromás aminosavak mint például L-fenilalanin, L-tirozin, L-triptofán stb. alkalmazható továbbá ezeknek az aminosavaknak az alkálifémsója, például nátrium- vagy káliumsója. Emellett a találmány szerinti eljárásban amino-donorként alkalmazhatók az említett L-aminosavaknak megfelelő megfelelő D-aminosavak. Az amino-donorok alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációban. Amino-donorként előnyösen glutaminsavat vagy sóját alkalmazunk aszparaginsawal vagy sójával kombinálva. Az aminodonor mólaránya a reakcióközegben jelenlevő OMPB mennyiségéhez viszonyítva általában 10:1 és 1:10 között vas a reakció kelletén.

Ha a találmány szerinti eljárásban amino-donorként glutaminsavat és/vagy aszparaginsavat alkalmazunk, akkor általában a kereskedelemben kapható glutaminsavat vagy aszparaginsavat alkalmazzuk. Általában ezek az aminosavak a D-izomer és L-izomer elegyének formájában lehetnek Előnyös azonban L-izomerjük. A glutaminsav és aszparaginsav sójaként alkálifém sójuk, különösen nátrium- vagy káliumsójuk alkalmazható.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint glutaminsavat (vagy sóját) és aszparaginsavat (vagy sóját) alkalmazunk kombinációban. Az egyes amino-donor vegyületek koncentrációját és az amino-donor vegyületek OMPB-hez viszonyított arányát az alábbiakban leüt módon határozzuk meg. Ha az amino-donor vegyületek nagyobb mennyiségben vannak jelen a reakcióközegben, mint az OMPB, akkor a reakció sebessége és az OMPB L-AMPB-vé történő átalakulásának aránya növekedhet. Az amino-donor vegyület és az OMPB megfelelő aránya azonban gazdasági szempontból határozható meg. Általában a glutaminsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az OMPB koncentrációjához viszonyítva előnyösen 0,2:1 és 3,0:1 határok között van. Másrészt az aszparaginsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az OMPB koncentrációjához viszonyítva előnyösen 0,2:1 és 3,0:1 határok között van. Másrészt az aszparaginsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az

OMPB koncentrációjához (vagy adagolandó mennyiségedhez) viszonyítva előnyösen 1,0:1 és 3,0:1 között van.

Ha a találmány szerinti eljárásban egy transzamináz termelő mikroorganizmust kívánunk reagáltatni a (Π) általános képletű OMPB-vel és az amino-donorral, az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a mikroorganizmust először olyan táptalajon tenyésztjük, amely a mikroorganizmus tenyésztéséhez szükséges tápanyagokat tartalmazza. Tápanyagforrásként bármely szokásos tápanyagforrást alkalmazhatunk, amely a mikroorganizmusok szokásos tenyészetében alkalmazható. Szénforrásként alkalmazhatunk például glükózt, keményítőt, glicerint, szacharózt, sűrű malátaszirupot, melaszt stb. Ezeket alkalmazhatjuk önmagukban vagy kombinációban. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szójabablisztet, búzacsírát, húskivonatot, peptont, szárított élesztőt, kukorica áztatólét, ammóniumszulfátot stb., önmagukban vagy kombinációban. A tápközeghez adagolhatunk egy vagy több szervetlen sót is, például kálcium-karbonátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, vagy foszfátot, ahogyan szükséges. A mikroorganizmusokat előnyösen folyékony tápközegben, különösen szubmerz tenyésztéssel tenyésztjük. A mikroorganizmusok tenyésztését aerob körülmények között végezhetjük. A tenyésztést előnyösen 25 és 40 ^eC közötti hőmérsékleten végezzük. A tenyésztést előnyösen 1-4 napig végezzük aktinomiceták esetén, baktériumok esetén 1-2 napig, élesztők esetén 1-2 napig és penészek esetén 1-4 napig.

A transzamináz termelő mikroorganizmusok tenyésztésével így kapott tenyészközeget önmagában alkalmazhatjuk. Kívánt esetben a mikroorganizmus sejteket elválaszthatjuk a tenyészközegtől és moshatjuk vízzel, vagy fiziológiás sóoldattal. A kapott, mosott, ép sejteket ezután vízben, fiziológiás sóoldatban vagy alkalmas vizes pufferolt oldatban szuszpenzáljuk a kívánt sejtkoncentráció eléréséhez. A tenyészközeghez vagy a mikroorganizmus sejteket tartalmazó vizes szuszpenzióhoz adagoljuk azután az OMPB-t (első szubsztrát) és az aminodonor vegyületeket (második szubsztrát az enzim számára), párhuzamosan vagy egymás után. A kapott folyadékelegyet ezután olyan körülmények között tartjuk, hogy a mikroorganizmus reagáljon az OMPB-vel, és az aminó-donorral és így az OMPBt L-AMPB-vé alakítsa át. A vizes reakcióközegben a sejtkoncentrációt, az OMPB és az amino-donor koncentrációját, valamint a reakcióhőmérsékletet és a pH-t olyan értéken tartjuk, hogy a mikroorganizmus megfelelő sebességgel alakítsa át az OMPB-t L-AMPB-vé. A reakcióidőt úgy választjuk meg, hogy megfelelő mennyiségű L-AMPB szaporodjon fel a reakcióközegben.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az OMPB-t és aminodonort a transzamináz vizes vagy púderes oldatához adagoljuk és oldjuk, majd lefolytatjuk az OMPB-enzimes reakcióját. A transzamináz OMPB és amino-donor megfelelő koncentrációját a reakciórendszerben, valamint a reakcióhőmérsékletet és pH-t olyan határok között választjuk meg, hogy az OMPB L-AMPB-vé történő átalaku5

-5HU 200342 Β lása megfelelő sebességgel menjen végbe.

Transzaminázként bármely, a kereskedelemben kapható transzamináz enzimkészítmény alkalmazható. Eljárhatunk úgy is, hogy egy olyan nyers enzimoldatot alkalmazunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy transzamináz termelő mikroorganizmusként aktinomicetát, baktériumot, penészt vagy élesztőt tenyésztünk, és a kapott tenyészlében a mikroorgavábbá a nyers enzimkészítmény vizes oldatát. Vizes nyers enzimoldatként alkalmazhatjuk a dezintegrált mikroorganizmus sejtek vizes extraktumát.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatjuk az enzim tisztított formájának vizes oldatát is.

Ismeretes, hogy egy enzim vagy mikroorganizmus működési hatékonysága fokozható úgy, hogy immobilizáljuk. A találmány szerinti eljárásban ilyen ismert módon immobilizált transzaminázok vagy transzaminázt termelő mikroorganizmusok alkalmazhatók, amennyiben ezek rendelkeznek azzal a képességgel, hogy OMPB-ból L-AMPB-t termelnek.

A találmány szerinti enzimatikus reakciót az OMPB L-AMPB-vé történő átalakítására transzamináz segítségével előnyösen 7,5 vagy ennél magasabb pH-értéknél, előnyösen 8,0 és 9,0 közötti pHértéknél hajtjuk végre. A reakciókörülményeket, azaz a hőmérsékletek és pH-értéket úgy választjuk meg, hogy az az enzimatikus reakcióban alkalmazott transzamináz optimális értékének feleljen meg.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint 4-(hidroxi-metil-foszfonil)-2-oxovajsavat azaz OMPB-t egy vagy több transzaminázzal vagy transzaminázt termelő mikroorganizmussal kezelünk L-glutaminsav vagy sója és L-aszparaginsav vagy sója mint amino-donor jelenlétében. Transzaminázként előnyösen olyan enzimrendszert alkalmazunk, amely egyrészt tartalmaz egy olyan enzimet, amely 2-keto-glutársavat L-aszparaginsavmint amino-donor jelenlétében glutaminsavvá alakító transzamináz aktivitással rendelkezik, azaz olyan enzimet, amelynek a transzamináz aktivitása az úgynevezett GOT-aktivitás kategóriájába esik, tartalmaz egy olyan második enzimet, amelynél OMPB-t L-glutaminsav mint amino-donor jelenlétében L-AMPB-vé alakítani képes transzamináz aktivitással rendelkezik. A találmány szerinti eljárásban előnyösen olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amely egy olyan enzimrendszert képes termelni, amely nem csak 2-keto-glutársavat L-aszparaginsav mint amino-donor jelenlétében glutaminsawá átalakító enzimaktivitással, azaz úgynevezett GOT-aktivitással rendelkezik, hanem OMPB-t L-glutaminsav mint amino-donor jelenlétében LAMPB-vé alakító transzamináz aktivitással is. Ilyen mikroorganizmus például a Streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzs (FERM BP-130 vagy ATCC 21705) vagy ennek mutáns törzse a Streptomyces hygroscopicus NP-50 jelű törzs (lásd például 58589/86 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés, FERM P-7804 vagy FERM BP-1368).

Fektételezhető, hogy a találmány szerinti eljárás fenti előnyös megvalósítási módjában az OMPB az aminocsoportot az egyik amino-donorként alkalmazott glutaminsavtól (vagy sójától) kapja az emlí6 tett'transzamináz rendszer vagy mikroorganizmus hatására, igy L-AMPB képződik, miközben a glutaminsavból 2-keto-glutársawá alakul, míg az aszparaginsav (vagy sója) mint a másik amino-donor aminocsoportját a képződött 2-keto-glutársavnak adja át az olyan transzamináz hatására, amely szintén rendelkezik GOT-aktivitással, ig/ a 2-keto-glutársav glutamiasawá regenerálható és az aszparagiinsav (vagy sója) oxálecetsawá, majd végól piroszőlősawá alakítható.

Ilyen módon a találmány szerinti eljárásban olyan reakcióelegyet kapunk, amely az L-AMPB-t mint terméket tartalmazza.

A találmány szerinti eljárást tehát előnyösen úgy hatjuk végre, hogy 4-(hidroxi-inetil-foszfmil)-2oxo-vajsavat legalább egy transzaminázzal kezelünk legalább egy amino-donor vegyület jelenlétében, előnyösen L-glutaminsav és L-aszparaginsav vagy ezek nátriumsója jelenlétében, vizes reakcióközegben, amelyben a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2oxo-vajsavat és az amino-donor vegyületeket, valamint a transzaminázt feloldottuk, alkálikus pH-nál, előnyösen 1(5-9,0 pH-értéknél és szobahőmérséklet és 60 ’C közötti hőmérsékleten. A találmány szerinti eljárást végrehajthatjuk úgy is, hogy a 4(hidroxi-metil-foszfmil)-2-oxo-vajsavat legalább egy olyan mikroorganizmussal kezeljük vagy reagáltatjuk, amely legalább egy transzaminázt képes termelni, legalább egy olyan mikroorganizmussal kezeljük vagy reagáltatjuk, amely legalább egy transzaminázt képes termelni, legalább egy amino-donor vegyület, előnyösen L-glutaminsav és L-aszparaginsav vagy ezek nátriumsója jelenlétében, vizes reakciókózegben, amelyben a 4-(hidroxi-metilfoszfmil)-2-oxo-vajsavat és az amino-donor vegyületeket feloldottuk és a mikrooranizmus sejteket szuszpendáltuk, 1(5 és 9,0 közötti pH-értéknél és szobahőmérséklet és 60 °C közötti hőmérsékleten. Ha az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy transzamináz termelő mikroorganizmust alkalmazunk, akkor eljárhatunk úgy, hoy a 4-(hidroxi-metil-foszfmil)-2oxo-vajsavat és az amino-donor vegyületeket a transzamináz termelő mikroorganizmus tenyészkózegéhez adagoljuk, amelyben az ép mikroorganizmus sejtek szuszpendált formában vannak jelen, majd a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsav, amino-donor vegyületek és a mikroorganizmus közötti kölcsönhatást hagyjuk lefolyni.

A találmány szerinti eljárást úgy is végrehajthatjuk, hogy a 4-(hidroxi-metil-foszfmil)-2-oxo-vajsavat a legalább egy transzaminázt termelni képes mikroorganizmus, transzaminázt tartalmazó extraktumával kezeljük legalább egy amino-donor vegyület, előnyösen L-glutaminsav és L-aszparaginsav vagy ezek nátriumsója jelenlétében, vizes reakcióközegben, amelyben a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsavat és az amino-donor vegyületeket, valamint a mikroorganizmus transzaminázt tartalmazó extraktumát feloldottuk, 7,5 és 9,0 közötti pH-értéknél és szobahőmérséklet és 60 °C közötti hőmérsékleten.

A találmány szerinti eljárást bármilyen módon hajtjuk is végre, a 4 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2oxo-vajsav kezdeti koncentrációját az enzimatikus reakció megkezdése előtt a vizes reakcióközegben

-6HU 200342 Β

0,1-100 mg/ml értékre állítjuk be. A 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsav és az amino-donor vegyületek kezdeti mólaránya a vizes reakcióközegben, mielőtt a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsav L-2-amino-4-(hÍrdoxi-metil-foszfinil)-vajsawá tör- 5 ténő átalakításának enzimatikus reakciója elkezdődik 1:10 és 10:1 közötti.

Ha a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxi-vajsav (azaz OMPB), amino-donor vegyületek és a transzaminázok vagy transzminázt termelő mikroorga- 10 nizmus sejtek közötti kölcsönhatást a találmány szerinti eljárás szerint folytatjuk te, egy olyan vizes reakcióközeget vagy reakcióelegyet kapunk, amely bizonyos mennyiségű L-2-amino-4-(hidröXÍ-metilfoszfinil)-vajsavat (azaz L-AMPB) terméket, bizo- 15 nyos mennyiségű maradék el nem reagált OMPB-t, transzaminázt vagy mikroorganizmus sejtet tartalmaz. Mielőtt az említett reakcióoldatból vagy reakcióelegyből az L-AMPB-t kinyerjük, előnyös ha a reakcióelegyet vagy reakcióoldatot lecentrifugál- 20 juk, ha ez mikroorganizmus sejteket tartalmaz, centrifugálással a mikroba sejteket dt^volftjuk a reakcióoldatból vagy reakcióelegyból, és így olyan felülúszó oldatot kapunk, amely az L-AMPB-t tartalmazza, de mikroba sejtektől mentes. 25

Az L-AMPB termék vizes oldatából történő kinyerését a következőkben ismertetjük. Az LAMPB vizes oldatából történő kinyerését és tisztítását ugyanúgy végezhetjük, mint az olyan ismert módszerekben, ahol az L-AMPB-t fermentációs 30 úton állítják elő, és a tenyészetből nyerik ki az L-AMPB-t és tisztítják. Az L-AMPB kinyerését és tisztítását részletesen például a 47485/82 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés ismerteti.

A találmány szerinti eljárással előállított L- 35 AMPB-t a reakcióoldatból például úgy nyerhetjük ki, és tisztíthatjuk, hogy az L-AMPB-t tartalmazó reakcióoldatot kationcserélő gyantát, például Dowex 50 W (Rohm and Haas Co. Ltd., USA gyártmány) tartalmazó oszlopon engedjük át, ahol a L- 40 AMPB adszorbeálódik a gyantán, majd az oszlopot vízzel vagy hígított vizes ammóniaoldattal eluáljuk.

Az L-AMPB-t tartalmazó eluátum frakciókat összegyűljük, csökkentett nyomáson bepároljuk, így száraz por formájában kapjuk L-AMPB-t. A találmány szerint járással előállított L-AMPB ugyanolyan fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint az autentikus L-AMPB-minta, amely például a 47845/82 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés szerint állítható elő. A találmány szerinti eljárással előállított L-AMPB továbbá ugyanolyan herbicid aktivitással rendelkezik, mint az ismert fermentációs úton előállított LAMPB.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

Az L-AMPB előállítását úgy végeztük, hogy különböző kereskedelemben kapható transzaminázokat OMPB-vel reagált at tünk, amelyet 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldatban(pH «6) oldottunk, amely az amino-donor vegyületet tartalmazta.

Transzamináz enzimként glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázt (GOT) (Brödinger Mannheim Co., Ltd. gyártmánya) alkalmaztunk, amino-donorként (amino-csoport-adó szubsztrátként) L-aszparaginsavag (Asp) és L-glutaminsavat (Glu) adtunk hozzá, és feloldottuk a reakcióközegben. Másrészt, ha glutaminsav-, piroszőlősav-transzaminázt (GPT) alkalmaztunk (Böringer Mannheim Co. gyártmánya), a reakcióelegyben amino-donorként L-alanint (Ala) oldottunk. Ha a referencia tesztben glutaminsav-dehidrogenázt (GLDH) alkalmaztunk, amino-donorként ammómum-Uoridot és NADH-t adagoltunk. Összehasonlítás céljából glutaminsav (Glu) termelését is megfigyeltük 2-ketoglutársavból (2-KG) (kontroll szubsztrátként) transzamináz segítségével.

Az enzimatikus reakciót 30 ^eC-on 50 percig folytattuk, majd a reakcióelegyet 3 percre 100 ’C-re melegítettük a reakció leállítása céljából. A reakcióelegy vagy reakcióoldat pH-ját ezután hígított vizes kénsavval 2 értékre állítottuk, és lecentrifugáltuk. A képződött és a felülúszó oldatban jelenlevő L-AMPB és glutaminsav mennyiségét aminosav elemzővel határoztuk meg. Az eredményeket az I. táblázatban foglaltuk össze.

I. táblázat
Alkalmazott enzim és mennyisége	Szubsztrát vegyület és mennyisége (ig/ml	Amino-donor vegyület és mennyisége pg/ml	Reakciótermék és termelt mennyisége g.g/ml
	OMPB 100	Asp	1000	L-AMPB	2,8
GOT
(10 egység/ml)	OMPB 100	Glu	1000	L-AMPB	3,7
	2-KG 100 (kontroll)	Asp	1000	Glu	109,3
GPT	OMPB 100	Ala	1000	L-AMPB	0,9
(4 egység/ml)
	2-KG 100	Ala	1000	Glu	92,7

-7HU 200342 Β

	13	14
Alkalmazott	Szubsztrát	Amino-donor *'	Reakciótermék
enzim és	vegyűlet és	vegyűlet és	és termelt
mennyisége	mennyisége	mennyisége	mennyisége
	jig/ml	jig/ml	Itg/ml
GLDH (60 egység/ml)	OMPB 100	NADL+NH4C1 1000	L-AMPB 1,9
	2-KG 100 (kontroll)	NADH+NH4CI 1000	Glu 109,3

Amint az I. táblázatból látható, az enzimatikus reakcióról az OMPB-ből L-AMPB képződött, bár az L-AMPB kitermelése jelentős νοίζ azonban nem olyan magas, mint a glutaminsav képződése a

2-keto-ghitársavból.

2. példa

AII. táblázatban megadott baktériumtörzsekkel 40 ml táptalajokat oltottunk be, amelyeket Difco tápközegből készítettünk, majd a tenyésztést 28 ’Con 6 óra hosszat végeztük. A kapott tenyészeteket oltótenyészetként használtuk és 2%-ban alkalmaztunk 40 ml ugyanolyan tenyészközeg beoltására, amelyet 28’C-on egy éjszakán át tenyésztettünk, és OMPB-t adagoltunk 100 pgíml koncentrációban minden tenyészethez. Ezután amino-donorként minden tenyészethez nátrium-L-aszparátot adagoltunk 100 |ig/ml koncentrációban. Az enzimati20 kus átalakulást 28 ‘C-on 24 óra hosszat hagytuk lefolyni, majd a reakcióközeg pH-ját 25 ’C-os kénsawal 2 értékre állítva leállítottuk a reakciót. A sejteket centrifugálással távolítottak el. A képződött L-AMPB mennyiségét a felülúszó oldatokban aminosav analizátorral határoztuk meg. A tesztek eredményét a II. táblázatban foglaltak össze.

Π. Táblázat
Vizsgált baktérium	Termel	Nyers enzimoldat (xl0'³egység/ml ) GOT aktivitása fikus GOT aktivitása	Enzim (xlO'³
törzs	L-AMPB mennyi- sége (M,g/ml)	egység/mg protein) spéci-
Bacillus subtilis (ATCC 6633)	2.4	22.0	46,7
Micrococcus luteus (ATCC 9341)	1.9	22.0	196.4
Staphylococcus Aureus 209 P (ATCC 6538)	26.6	17.5	1823
Escherichia coli (ATCC 10798)	0.8	3.8	5.4
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)	83	342.0	686.7
Serratia marcescens (ATCC 13880)	5.0	45.6	300.0

AII. táblázatból látható, hogy az AMPB jelentős kitermeléssel képződik OMPB-ből. 50

A fenti módon kapott tenyészetek részleteit ultrahang kezelésnek vetettük alá, így elroncsoltak a baktériumsejteket és sejtextraktumot kaptunk. A sejtextraktumokat lecentrifugáltuk, így nyers enzimoldatot kaptunk. A kapott nyers enzimoldatok 55 GOT-aktivitását szintén meghatároztak és a II. táblázatban feltűntettük. Amint a II. táblázatból látható, összefüggés figyelhető meg a termelt L-APMB mennyisége és a nyers enzimoldat GOT-aktivitási értéke között. Emellett a nyers enzimoldat fehéije 60 tartalmát is meghatároztak BioRad protein vizsgáló módszerrel, és az oldatban jelenlévő enzim specifikus GOT aktivitását számítottuk (x 10'³ egység) (preotein) és a Π. táblázatban feltüntettük.

3. példa

Streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzzsel (FERM BP-130) beoltottunk 10 ml előzetes tenyészközeget (összetétele 2,0% oldható keményítő, 1,0% polipepton, 0,3% húskivonat, 0,05% dikálium-hidrogén-foszfát, pH = 7,0). A törzset 28 ’Con 24 óra hosszat rázató tenyészetben tenyésztettük. A kapott tenyészetet oltótenyészetként 2% mennyiségben tenyésztő tápközeg beoltására használtuk (összetétele 7,0 glükóz, 4,4% bactosoyton (Difco Co., USA gyártmány), 0,327% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,052% dinátrium-hidrogénfoszfát, 1,15% dotiteTES, azazN-trisz(hidroxi-metil)-metil-2-amino-etánszulfonsav, 0,0001% kobalt-klorid, pH = 6,0) és a tenyésztést 28 ’C-on levegőztetés és keverés mellett végeztük. 4 nap múlva a mikróba sejteket centrifugálással elválasztot-8HU 200342 Β tűk, 50 mmól/literes foszfátpuffer-oldattal (pH = 6,0) mostuk. A sejteket ultrahang kezeléssel (KUKOBATAINSONATOR, 1,5 A, 1 perc) elroncsoltuk, majd lecentrifugáltuk, és így nyers enzimoldatot kaptunk

A nyers enzimoldathoz OMPB-t adtunk 100 gg/ml koncentrációban és L-aszparaginsavat 200 Hg/ml koncentrációban. Kontrolltesztt is folytattunk, amelyben 2-ketoglutársavat (2-KG) adagoltunk kontrollszubsztrátként a transzamináló reakcióhoz. Az enzimatikus reakciót 30 °C-on 2 óra hosszat hagytuk lefolyni, majd a reakcióoldatot 3 percig 100 ’C-ra melegítettük a reakció leállítása céljából. A kapott reakcióoldat pH-ját hígított kénsavval 2 értékre állítottuk, és a reakcióoldatot lecentrifugálva megkaptuk a felfllúszó oldatot. A felülúszó oldatban jelenlévő L- AMPB és a 2-KG-ből képződött glutainsav mennyiségét aminosav analizátorra határoztuk meg. A vizsgálatok eredményét a III. táblázat mutajta.

III. táblázat

Szubsztrát	Termék is termelt mennyisége (μ/ml)
OMPB 2-KG (kontroll)	L-AMPB Glu	23 67,9
4. példa

1. Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzzsel (FERM P-7804 vagy FRM BP-1368) beoltottunk 10 ml előzetes tenyészközeget (összetétel 2,0% oldható keményítő, 1,0% polipepton, 03% húskivonat, 0,05% dikálium-hidrogén-fo6zfát, pH = 7,0). A törzset 28 ’C-on 24 óra hosszat rázató tenyészetben tenyésztettük. A kapott tenyészetet oltótenyészetként 2% mennyiségben tenyésztő tápközeg beoltására használtuk (összetétele 7,0% glükóz, 4,4% bactosoyton, (Difco, USA gyártmány), 0327% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,0852% dinátrium-hidrogén-foszfát, 1,15% dotite TES, (kémiai nerc Ntrisz(hidroxi-metil)-metil-2-amino-etánszulfonsa v), 0,0001% kobalt-klorid, pH = 6,0) és a tenyésztést 28 ’C-on levegőztetés és keverés mellett végeztük.

2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértük a fenti módon tenyésztett Streptomyces hygroscopicus (OMPB koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes kereskdelmi nátrium-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/literes trisz-hidroklorid puffer-odlatot (pH = 8,5). Az OMPB koncentrációja az oldatban körülbelül 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 37 ’C-o 24 óra hosszat enyhe rázás közben hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet lecentrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban aminosav analizátorral meghatároztuk a termelt L-AMPB mennyiségét, amelyet 14 mg/ml-nek találtunk.

Párhuzamos kísérletekben amino-donorként 170 mg/ml koncentrációban adagolva L-alaint vagy nátrium-L-aszpartátot alkalmaztunk. Úgy találtuk, hogy L-alanin alkalmazásakor 2,8 mg/ml L-AMPB, mfgnátrium-L-aszpartát alkalmazásakor 1,5 mg/ml

L-AMPBrtcépződött.

3. A 2. lépésben, nátrium-L-glutamát mint amino-donor alkalmazása mellett kapott reakcióelegy centrifugálásával előállított felülúszó oldat 100 miét felvittük egy400 ml-es oszlopra, amely töltetként Dovex 50 W x 2 (H⁺-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott (Rohm and Haas gyártmány), majd vizes ammóniával eluáltuk. AZ eluátum L-AMPBtartalmú frakcióit összegyűjtöttük és betöményítettük. A betöményített oldatot 150 ml-es anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáltuk, amely töltetként Dowex 1x2 (CH3COO'-forma) (Rohm and Haas gyártmány) tartalmazott. Az oszlopot vízzel mostuk, és 03 a vizes ecetsav-oldattal eluáltuk. Az eluátum L-AMPB tartalmú frakcióit csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, majd vákuumban szárítottuk, így 720 ml L-AMPB-t kaptuk fehér por formájában. A fehér port metanolból átkristályosítottuk. Az így kapott kristályokat szokásos módon elemeztük, azaz meghatároztuk az elemi összetételt, a fajlagos optikai forgatóképességet, olvadáspontot, IR-spektrumot, NMR-spektrumot és tömegsepktrumot. Megállapítottuk, hogy a kapott kristály azonos az autentikus L-AMPB mintákkal.

5. példa

1. - A 4. példa 1. lépése szerinti módon előállított Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzs (FERM P-7804, FERM BP 1368) tenyészetéből 20 ml-t egy 30 ml-es centrifugacsőbe helyeztünk és 10 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A leülepedett sejteket 30 ml 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid pufferben (pH = 83) szuszpendáltuk. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértük 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB-oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-es trisz-hidroklorid oldatot (pH = 83). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 ’C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felólászó oldatban meghatároztuk a LAMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 15 mg/ml L-AMPB keletkezett.

2. A kapott, L-AMPB-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3.’ lépése szerint kromatografáltuk egy 400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 50W x 2 (H⁺-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a

4. példa 3. lépése szerint kezeltük, így 750 mg LAMPB-t kaptunk fehér por formájában.

6. példa

1. A 4. példa 1. lépése szerinti módon előállított Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzs (FERM P-7804, FERM BP-1368) tenyészetéből 20 ml-t egy 30 ml-es centrifugacsőbe helyeztünk és 10 percig 3000 forulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A leülepedett sejteket 30 ml 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid pufferben (pH = 8,5) szuszpendáltuk. A kapott sejtszuszpenziót 10 percig ultrahanggal kezeltük, és a kapott szuszpenziót 10000 fordulat/perc

-9HU 200342 Β sebességgel 10 percig centrifugáltuk, így 20 ml nyers enzímoldatot kaptunk felülúszóként.

2. egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (Koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/1 trisz-hidroklorid oldatot (pH = 84)· A kapott oldat OMPBkoncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 ’C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az LAMPB-tartalmat aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 15 mg/ml L-AMPB keletkezett.

3. A kapott I^AMPN-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3. lépése szerint kromatogafáltukegy400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 50 W x 2 (H⁺-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a 4. példa

3. lépése szerint kezeltük, így 74 ml L-AMPB-t kaptunk fehér por formájában.

7. példa

1. Streptomyces lividans 66 törzzsel (FERM BP737 beoltottunk 10 ml, a 4. példa 1. lépése szerinti előzetes tápközeget. A tenyésztést rázógépen 24 óra hosszat 28 °C-on folytattuk. A kapott tenyészetet 2% koncentrációban oltótenyészetként alkalmaztuk a termelő tenyésztéshez, amelyet a 4. példa

1. lépése szerint, 28 ’C-on, levegőztetés és keverés mellett 3 napig folytattunk.

2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-es trisz-hidroklorid oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 °C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 6 mg/ml L-AMPB keletkezett.

8. példa

1. Streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzzsel (FERM BP-130, ATCC 21705) beoltottunk 10 ml, a 4. példa 1. léppése szerinti előzetes tápközeget. A tenyésztést rázógépen 24 óra hosszat 28 °C-on folytattuk. A kapott tenyészetet 2% koncentrációban oltótenyészetként alkalmaztuk a termelő tenyésztéshez, amelyet a 4. példa 1. lépése szerint, 28 °C-on levegőtetés és keverés mellett 3 napig folytattunk.

2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-es trisz-hidroklorid oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 ’C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel.

Úgy'táláltuk, hogy 7 mg/ml L-AMPB keletkezett.

3. A kapott L-AMPB-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3. lépése szerint kromatografáltuk egy 400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 500 x2 (H⁺-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a 4. példa 3. lépése szerint kezeltük, így 350 mg LAMPB-t kaptunk fehér por formájában.

9. példa

100 ml 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid-pufferben (pH = 84) szuszpendáltunk 20 g kereskedelmi sütőélesztőt (Saccharomyces cerevisae, Orientál YEAST Co., Japán gyártmány). Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskdelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 101 mól/l-es trisz-hidroklorid-oldatot (pH - 84). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 ’C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 6 mg/ml L-AMPB keletkezett.

10. példa

400 pg/ml OMPB-t és 600 |ig/ml L-glutaminsavat tartalmazó 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid-pufferben (pH = 84) feloldottunk 40 egység/ml kereskedelmi glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázt (GOT, Bohringer Mannheim Co. gyártmány). Az enzimtikus reakciót 24 óra hosszat 37 ’C-on hagytuk végbemenni, majd a reakcióoldatot 3 percig 100 ’C-ra melegítettük. Ezután a reakcióoldat pH-ját hígított kénsavval 2 értékre állítottuk, majd centrifugálással eltávolítottuk az oldhatatlan szilárd anyagot. A kapott felülúszó L-AMPB-tartalmát aminosav elemzővel határoztuk meg. Aminosav elemzőként az ATTO CORPORATION japán gyártmányú MLC-703 típust használtuk, amelyen a retenciós időt 12 percre állítottuk be. Azt találtuk, hogy a kapott felülúszó oldat L-AMPB-tartalma 100 pg/ml.

11. példa

1. Tenyésztés

A N-X. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokkal ferde tenyészetről 10 ml, nagy térfogatú tesztkémcsövekbe töltött folyékony tápközegeket oltottunk be, amelyeknek az összetétele 04% glükóz, 0/3% élesztőkivonat, 1,0% húskivonat, 1,0% pepton, 04% nátrium-klorid, pH = 7,0. Az aktinomiceták tenyésztéséhez egy-egy darab rozsdamentes acélrugót is helyeztünk a csövekbe. A tenyésztést rázatás közben 28 ’C-on 24 óra (vagy 48 óra) hosszat végeztük.

2. Sejtminták készítése

Tenyésztés után a kapott tenyészközegből egyegy ml-t (illetve gombák esetén 0,2 ml-j) mikrokémcsövekbe helyeztünk (Eppendorf C<(. gyártmány) és 12000 fordulat/perc sebességgel 3 percig centri1

-10HU 200342 Β fugáltuk. A felülúszót eldobtuk, és a maradék sejtet sejtmintaként félretettük.

3. Enámatíkus reakciók A mikrokémcsövekben kapott sejtmintákhoz hozzáadtunk 20 μΐ trisz-hidroklorid-puffer-oldatot (1 mól, pH « 8,0), 20 μΐ vizes OMPB-oldatot (koncentráció 200 mg/ml, pH = 8,0), 40 pJ vizes amino-donor-oldatot és 120 μΐ vizet (amino-donor20 ként 1 móVml nátrium-L-glutamátot, nátrium-Laszpartátot vagy L-alanint alkalmaztunk). A kapott elegyet 37 ”C-on 24 óra hosszat állni hagytuk. Ezután a reakcióelegyet 12000 fordulat/perc sebes5 séggel 3 percig centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban aminoeav elemzővel meghatároztuk az LAMPB-tartalmaL A vizsgálatok eredményét IV-X. táblázatban foglaltuk össze.

IV. Táblázat

	Termelt L-AMPB mennyisége (mg/ml)
Alkalmazott mikroorganizmus (baktérium)	Glu	Asp	Alá
Bacillus subtiiis (ATCC 6633)	3.0	1.9	2.2
Micrococcus luteus (ATCC 9341)	2.6	0.2	03
Staphylocooccus aureus 209P (ATCC 6538)	3.2	0.6	03
Esdierichia coli (ATCC 10798)	93	4.2	33
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)	83	33	3.8
Pseudomonas cepacia (ATCC 17759)	9.6	2.4	3.0
Serratia marcescens (ATCC 13880)	95	1.8	1.6
Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032)	25	03	0.4

V. Táblázat

Alkalmazott mikroorganizmus (élesztő)	Termelt L-AMPB mennyisége (mg/ml)
Glu	Asp	Alá
Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763)	0.9	03	0.2
Candida Albieans (IÁM 4888)	1.2	0.9	0.4
Candida albieans (IÁM 4829)	12.1	6.1	4.0
Cryptococcus neoformans (IÁM 4829)	12.1	6.1	4.0
Cryptococcus neoformans (IÁM 4772)	2.4	13	0.8
Debaryomyces hansenii (IÁM 4356)	2.7	13	0.7
Trigonopsis variábilis (IÁM 4443)	22	15	0.4
Hansenula schneggi (IÁM 4269)	1.6	0.8	03

VI. Táblázat

Alkalmazott mikrooganizmus (Actinomyceták)	Termelt L-AMPB mennyisége
(mg/ml)	Alá
Glu	Asp
Streptomyces albus (IFO 13014) (ATCC 3004)	7.4	1.0	03
Streptomyces griseus (IFO 12875) (ATCC 23345)	83	1.7	1.9
Streptoveridllium cinnamoneum (IFO 12852) (ATCC 11874)	10,6	6.0	2.2
Streptomyces morookaensis (IFO 13416) (ATCC 19166)	63	73	33
Nocardia mediterránéi (ATCC 21271)	8.1	2.6	1.6
Nocardiopsis dassonvillei (JCM 3237)	63	13	13
Saccharopolyspora hirsuta (JCM 3170) (ATCC 27875)	3.7	0.8	0.9

VII. Táblázat

Alkalmazott mikroorganizmus (Actinomyceták)

Streptomyces viridochromogenes (IFO13347) (ATCC14925) Streptomyces pilosus (IFO 12807) (ATCC 19797)

Termelt I^AMPB mennyisége (mg/ml)

Glu	Asp	Alá
95	1.6	1.1
1.4	0.1	0.1

-11HU 200342 Β

Micromonospora carbonaceae (NRRL 2972) (ATCC 27114) Streptosporangjum pseudovulgare (ATCC 27100) * Tenyésztési idő: 48 óra

6.1 1.4 1.6

3.0 0.8 1.7

Vili. táblázat

Alkalmazott mikroorganizmus (Aktinomiceták)

Streptomyces viridochromogenes (JCM 4977)*

Termelt L-AMPB mennyisége (mg/ml) Glu Asp Ala

8.8 5.6 3.6

Bialaphos-termelő antinomyceták

	IX. táblázat
		Termelt L-AMPB
		Mennyisége (mg/ml)
Alkalmazott mikroorganizmus
(gombák)		Glu	Asp	Ala
Aspergillus flavus (ATCC 9643)		05	03	03
Aspergillus terreus (IÁM QM82J)		03	0.2	0.1
Mucor spinescens (IÁM Mu3)		53	0.9	1.1
Aureobasidium pullulans (IÁM F24)		1.7	0.6	0.4
Chaetomium globosum (ATCC 6205)		03	0.1	0.2

X. Táblázat

Termelt L-AMPB

Mennyisége (mg/ml)

Alkalmazott mikroorganizmus

(penészek)	Glu	Asp	Ala
Penicillium funiculosum (ATCC 9644)	0.6	0.4	03
Gliocladium virens (ATCC 9645)	2.0	0.4	05

* Tenyésztési idő: 48 óra

AII. és IV-X. táblázatban felsorolt mikroorganizmus törzsek közül azokat, amelyek ATCC számmal vannak jelölve az American Type Culture Collection intézetnél, a JCM-számmal ellátottakat a 45 Japán Collection of Microorganism intézetnél, az IAM-számmal ellátottakat az Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo intézetnél, és az IFO-számmal ellátottakat az Institute fór Fermentation Osaka at Osaka, Japán intézetnél vannak 50 letétbe helyezve, és hozzáférhetők.

12. példa

Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzzsel (FERM P-7804 vagy FERM BP-1368) beoltottunk 55 ml előtenyésztett (összetétel 2,0% oldható keményítő, 1,0% polipepton, 0,3% húskivonat, 0,05% dikáiium-hidrogén-foszfát, pH = 7,0). A tenyésztést rázatás közben 28 ’C-on 24 óra hosszat végeztük. A kapott tenyészettel 2% koncentrációban be- 60 oltottuk a termelő tápközeget, amely 7,0% glükózt,

3,9% búzacsírát, 25% oldható vegetatív proteint,

0,3% kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,0001% kobalt-kloridot tartalmazott, pH = 6,8. A tenyésztést 28 ’C-on levegőztetés és keverés közben végeztük.

2. A fenti módon 3 napig tenyésztett tenyészet 20 ml-eihez hozzáadtunk OMPB-t és nátrium-glutamátot és nátrium-L-aszpartátot, amino-donorként olyan mennyiségben, hogy a transzaminálási reakció kezdetekor a 11. táblázatban megadott koncentrációt étjük el. 10 ml 1 mól/l-es tris-hidroklorid-puffer oldat (pH = 8,5) adagolásával a reakrióelegyek pH-ját 8,5-re állítottuk, és az elegyek térfogatát 100 ml-re egészítettük ki. így tehát az eredeti térfogatot 5-szörösére hígítottuk.

Az enzimatikus reakciót 37 °C-on enyhe rázás közben 24 óra hosszat hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet 100 ml-es részletekben hőkezeltük a reakció leállítása céljából. A reakcióelegyből szűréssel eltávolítottuk a sejteket, és az L-AMPB mennyiségét aminosav elemzővel határoztuk meg (MLC-703 típus, ATTO Corporation gyártmány, retenciós idő 12 perc). Az eredményeket a XI. táblázatban foglaltuk össze.

-12HU 200342 Β

24

XI. táblázat	- · ** L-AMPB végső koncentrációja a reakció befejezése után (pg/ml)
Teszt sz.	Kezdeti OMPB koncentráció (pg/ml)	Amino-donor kezdeti kon centráóója a reakció előtt ptg/ml)
Nátrium L-glutamát	Nátrium-L -aszpartát
1.	10000	10000	0	5930
2.	10000	20000	0	7170
3.	10000	0	10000	350
4.	10000	10000	10000	8500
5.	30000	30000	30000	28360
6.	10000	30000	0	8310
7.	10000	100000	0	9470
8.	50000	50000	0	24200
9.	50000	150000	0	35600
10	40000	40000	40000	32590
11.	40000	40000	40000	32840

Megjegyzés: a 9. tesztet 50 ’C-on, 9.0 pH-nál, a 11. tesztet 45 ’C-on, 8,5 pH-nál végeztük

Amint a XI. táblázatból látható, az L-AMPB termelése jelentősen emelkedett, amikor aminodonorként nátrium-L-glutamátot és nátrium-Laszpartátot együtt alkalmaztunk, ahhoz képest, amikor ezeket külön-külön alkalmaztuk.

13. példa

A 12. példa szerinti módon előállított Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzs tenyészetet oltótenyészetként alkalmaztuk, és a 12. példa szerinti termelő tápközeget tartalmazó 3 literes üvegermentort oltottuk be vele, a tenyésztést 28 ’C-on 3 napig folytattuk.

így kapott tenyészlét egy reaktorba vittünk át, amelyhez 300 g OMPB-t adagoltunk. A teayészközeghez hozzáadunk még 310 g nátrium-L-glutamátot (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., gyártmány) és 290 g nátrium-L-aszpartítot (Nakarai Chamicals, Ltd. gyártmány). A kapott elegy pH-ját vizes nátrium-hidroxiddal 8,5 értékre állítottuk, és az elegy térfogatát vízzel 10 literre egészítettük ki. így az OMPB koncentrációja 30 000 pg/ml a reakció kezdetén. A nátrium-L-glutamát és a nátriumL-aszpartát koncentrációja megegyezik az OMPB moláris koncentrációjával (1/6 mól). Az enzimatikus reakciót enyhe keverés közben 37 ^aC-on 24 óra hosszat folytattuk, miközben a pH-t 8,5 értéken tartottuk. A reakció befejezése után a reakcióelegy pH-ját 50%-os kénsavval 3,0 értékre állítottuk. Ezután a sejteket szűréssel eltávolítottuk, így 91 szűrletet kaptunk.

A szűrlet L-AMPB-tartalmát a 12. példa szerinti módon határoztuk meg, és 29 000 μ/ml értéknek találtuk. A szűrletet ezután egy 51-es Dowex 50 W (H⁺-forma) kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáltuk, vízzel eluálva. Az LAMPB-tartalmú frakciókat Dowex 1x2 (CflbCOO'-forma) anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáltuk, amelyet vízzel mostunk, majd 03 n vizes ecetsav oldattal eluáltunk.

Áz L-AMPB-tartalmú frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, majd vákuumban szárítottuk és (gy fehér por formájában kaptuk az LAMPB-t. A fehér port metanolból átkristályosítottuk, így 183 g L-AMPB-t kaptunk (kb. 70%).

A kapott L-AMPB-t szokásos módon elemeztük, azaz elemanalízist végeztünk, meghatároztuk az optikai forgatóképességet, olvadáspontot, IRspektrumot, NMR-spektrumot és tömegspektrumot. Úgy találtuk, hogy a kapott L-AMPB megfelel az autentikus L-AMPB mintáknak. Op - 214 ’C (bomlás és habzás közben); [α]ϋ = 17* (vízben).

Szabadalmi igénypontok

Claims

1. Eljárás (I) képletű 2-ammo-4-(hidroxi-metilfoszfinil)-vajsav előállítására, azzaljellemezve, hogy (Π) képletű 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsavat 6,0 és 9,0 közötti pH-nál, szobahőmérséklet és

40 60 ’C közötti hőmérsékleten amino-donorként alkalmazott L-glutaminsav vagy alkálifémsója, L-aszparaginsav vagy alkálifémsója, L-alanin vagy ammónium-klorid vagy ezek kombinációja jelenlétében glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázzal, gluinsav-dehidrogenázzal vagy ezek kombinációjával vagy egy vagy több, transzamináz termelésére képes mikroorganizmussal, éspedig Streptomyces, Streptoverticillium, Nocardia, Nocardiopsis, Saccharo50 polyspora, Micromonospora nemzetségbe tartozó actionyceta, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Escherichia, Pseudomonas, Serratia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktérium, Saccharomyces Candida, Cryptococcus, Deba55 ryomyces,Trigonopsis vagy Hansenula nemzetségbe tartozó élesztő, Aspergilus, Mucor, Aureobasidium, Chaetomium, Penicillium vagy Gliodadium nemzetségbe tartozó penésztörzzsel kezelünk, és a (II) képletű vegyületet és az amin-donort 1:10 és

60 10:1 közötti mólarányban alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987.06.08.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (FERM, BP-130) vagy

65 (ATCC 21705), Streptomyces hygroscopicus NP13

-13HU 200342 Β

50 (FERM BP-1368), Streptomyces lividans 66 (FERM BP-737, Streptomyces albus (IFO 13014) (ATCC 3004), Streptomyces griseus (IFO 12875) (ATCC 23345), Streptovericillimn cinnamoneum (IFO 12852) (ATCC 11874), Streptomyces morookaensis (IFO 13416) (ATCC 19166), Nocardia mediterránéi (ATCC 21271), Nocardiopsis dassonvillei (JCM 3237), Saccharopolyspora hirsuta (JCM 3170) (ATCC 27875), Streptomyces viridochromogenes (IFO 13347) (ATCC 14925), Streptomyces viridochromogenes (JCM 4977), Streptomyces pilosus (IFO 12807) (ATCC 19797), Micromonospora carbonaceae (NRRL 2972) (ATCC 27114), Streptosporangium pseudovulgare (ATCC 27100); Bacillus subtilis (ATCC 6633), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus 209P (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 10798), Pseudomonas aeruginosa 9ATCC 10145), Pseudomonas cepacia (ATCC 17759), Serratia marcescens (ATCC 13880), Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032); Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), Candida albicans (IÁM 4888), Candida albicans (IÁM 4829), Cryptococcus neoformans (IÁM 4772), Debaryomyces hansenii (IÁM 4356), Trigonopsis variábilis (IÁM 4443), Hansenula schneggi (IÁM 4269); Aspergillus flavus (ATCC 9643), Aspergillus terreus (IÁM QM82J), Mucor spinescens (IÁM Mu3), Aureobasidium pullulans (IÁM F24), Chaetomium globosum (ATCC 6205), Penicillium funiculosum (ATCC 9644) és Gliocladium virens (ATCC 9645) törzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987.06.08.)

3. Eljárás (I) képletű L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására, azzal jellemezve, hogy (II) képletű 4-(hidroxi-metil-foszfíniI)-2-oxovajsavat 6,0 és 9,0 közötti pH-nál, szobahőmérésklet és 60 ’C közötti hőmérsékleten amino-donorként alkalmazott L-aszparaginsav, L-glutaminsav, L-alanin vagy ammónium-klorid vagy ezek kombinációja jelenlétében glutaminsav-oxálecetsavtranszaminázzal, glutaminsav-piroszőlősav-transzaminázzal vagy glutaminsav-dehidrogenázzal vagy ezek kombinációj ával vagy egy vagy több, transzamináz termelésére képes mikroorganizmussal, éspedig Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (FERM BP-130), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus 209P (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 10798), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Serratia marcesces (ATCC 13880) törzzsel kezelünk, és a (II) képletű vegyület és az amino-donort 1:10 és 10:1 között mólarányban alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1986.06.09.)

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű vegyületet glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázzal L-aszparaginsav és L-glutaminsav kombinációja vagy L-glutaminsav, mint amino-donor jelenlétében vagy glutaminsav-piroszőlősav-transzaminázzal L-alanin, mint amino-donor jelenlétében vagy glutaminsavdehidogenázzal ammónium-klorid, mint aminodonor jelenlétében kezeljük. (Elsőbbsége: 1986.06.09.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás (I) képletű L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfiniI)-vajsav elóál14 lítáSáráj azzal jellemezve, hogy (II) képletű 4-(hidroxi-metÍl-foszfinÍl)-2-oxo-vajsavat 6,0 és 9,0 közötti pH-nál, szobahőmérséklet és 60 ’C közötti hőmérsékleten amino-donorként alkalmazott L-glutaminsav vagy alkálifém sója jelenlétében glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázzal, glutaminsav-piroszőlősav-transzaminázzal vagy glutaminsav-dehidrogenázzal vagy ezek kombinációjával vagy egy vagy több, transzamináz termelésére képes mikroorganizmussal, éspedig Streptomyces hygroscopicus SF1293 NP-50 (FERM BP-1368), Streptomyces lividans 66 (FERM BP-737), Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) törzzsel kezelünk. (Elsőbbsége: 1987.06.08.)

6. Eljárás (I) képletű L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására, azzal jellemezve, hogy (II) képletű 4-(hidroxi-metil-foszfmil)-2-oxo-