JPH0630572B2 - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素Info
- Publication number
- JPH0630572B2 JPH0630572B2 JP60080293A JP8029385A JPH0630572B2 JP H0630572 B2 JPH0630572 B2 JP H0630572B2 JP 60080293 A JP60080293 A JP 60080293A JP 8029385 A JP8029385 A JP 8029385A JP H0630572 B2 JPH0630572 B2 JP H0630572B2
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- JP
- Japan
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- reaction
- mol
- phenylalanine
- enzyme
- dehydrogenase
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法に関する。
製造方法に関する。
本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59-198972に記載されている。しかしながら
この公開された明細書に記載されているＬ−フェニルア
ラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム（Brevib
acterium）属細菌により生産されたものであり、この明
細書にはスポロサルシナ（Sporosarcina）属細菌及びバ
シルス（Bacillus）属細菌が同様の酵素を生産すること
は全く示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量を有
し、分子量66,000±5,000のサブユニットから成る点、
及びフェニルピンビン酸のみならずｐ−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の基質
に対して高い特異性を有する点等において、本発明のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59-198972に記載されている。しかしながら
この公開された明細書に記載されているＬ−フェニルア
ラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム（Brevib
acterium）属細菌により生産されたものであり、この明
細書にはスポロサルシナ（Sporosarcina）属細菌及びバ
シルス（Bacillus）属細菌が同様の酵素を生産すること
は全く示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量を有
し、分子量66,000±5,000のサブユニットから成る点、
及びフェニルピンビン酸のみならずｐ−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の基質
に対して高い特異性を有する点等において、本発明のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
従って本発明は、今までＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、及び該酵素
の新規な製造方法、を提供しようとするものである。
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、及び該酵素
の新規な製造方法、を提供しようとするものである。
前記の目的は、次の性質： (1)１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において約2
90,000の分子量を有し、SDS−ポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法において約38,000〜39,000の分子量
を有するサブユニットを示す； (3)Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対する
特異性が非常に低い； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素；並びにこれらの細菌を培養し、この培養物から前
記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方
法； を提供することにより解決される。
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において約2
90,000の分子量を有し、SDS−ポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法において約38,000〜39,000の分子量
を有するサブユニットを示す； (3)Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対する
特異性が非常に低い； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素；並びにこれらの細菌を培養し、この培養物から前
記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方
法； を提供することにより解決される。
〔具体的な説明〕 (1)微生物 本発明において使用する微生物としてはスポロサルシナ
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。
スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。この種に属する
保存菌として例えばスポロサルシナ・ウレアエIFO1269
8、及びスポロサルシナ・ウレアエIFO12699(ATCC 6473)
を挙げることができ、また新菌株として本発明者等が分
離したスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04を挙げること
ができる。前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもと
にIFO又はATCCから自由に入手することができ、また新
菌株スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第8178号（FERM P-817
8）として寄託され、微工研条寄第1012号（FERM≠BP-10
12）としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。
シナ・ウレアエを挙げることができる。この種に属する
保存菌として例えばスポロサルシナ・ウレアエIFO1269
8、及びスポロサルシナ・ウレアエIFO12699(ATCC 6473)
を挙げることができ、また新菌株として本発明者等が分
離したスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04を挙げること
ができる。前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもと
にIFO又はATCCから自由に入手することができ、また新
菌株スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第8178号（FERM P-817
8）として寄託され、微工研条寄第1012号（FERM≠BP-10
12）としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。
バシルスに属する微生物としては、例えば本発明者等に
より分離された新菌株バシルスsp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、バシルスsp.SCRC-101A、及びバシルスs
p.SCRC-114Dを挙げることができる。これらの菌株の菌
学的性質は非常に近似しており、これらの代表株として
バシルスsp.SCRC-R79aが工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第８１７９号（FERM P−８１７９）とし
て寄託され、微工研条寄第1013号（FERM≠BP-1013）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。また
バシルスsp.SCRC-114Dが微工研条寄第1011号としてブタ
ペスト条約に基き国際寄託されている。
より分離された新菌株バシルスsp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、バシルスsp.SCRC-101A、及びバシルスs
p.SCRC-114Dを挙げることができる。これらの菌株の菌
学的性質は非常に近似しており、これらの代表株として
バシルスsp.SCRC-R79aが工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第８１７９号（FERM P−８１７９）とし
て寄託され、微工研条寄第1013号（FERM≠BP-1013）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。また
バシルスsp.SCRC-114Dが微工研条寄第1011号としてブタ
ペスト条約に基き国際寄託されている。
前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調製した。
示す組成の培地を調製した。
この培地を試験管（１８mm）に５mlずつ分注し、120
℃で１５分間滅菌した。この培地に各地より採取した土
壌サンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養した。
この培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさらに３
０℃で３日間振とう培養した。表の培地に２％の寒天を
加えた平板培地に、培養液の一部を白金耳を用いて画線
塗布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同
じ培地組成の斜面培地に釣菌した。
℃で１５分間滅菌した。この培地に各地より採取した土
壌サンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養した。
この培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさらに３
０℃で３日間振とう培養した。表の培地に２％の寒天を
加えた平板培地に、培養液の一部を白金耳を用いて画線
塗布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同
じ培地組成の斜面培地に釣菌した。
このようにして各地より採取した土壌サンプルから多数
の菌株を分離した。次に、表の培地200mlを500ml容の三
角フラスコに分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株
をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう培養し、得ら
れた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕した。遠心後
得られた上清を0.1mMのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析した。この上清に含まれるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素活性を後記の方法により測定した。
の菌株を分離した。次に、表の培地200mlを500ml容の三
角フラスコに分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株
をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう培養し、得ら
れた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕した。遠心後
得られた上清を0.1mMのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析した。この上清に含まれるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素活性を後記の方法により測定した。
このようにして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を顕
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。
前記の新規な５菌株はそれぞれ次のような菌学的性質を
有する。
有する。
上記の菌学的性質に基づき、ヘバージィズ・マニュアル
・オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Be
rgey′s Manual of Determinative Bacteriology）第８
版、1974年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に
同定した。
・オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Be
rgey′s Manual of Determinative Bacteriology）第８
版、1974年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に
同定した。
(i)SCRC-R04株は、好気性で運動性及び胞子形成能を有
し、グラム陽性の２連〜４連の球菌であることからスポ
ロサルシナ属に属する。スポロサルシナ属には唯一の種
としてスポロサルシナ・ウレアエが知られており、前記
性質が文献記載のそれとほぼ一致するので、SCRC-R04株
はスポロサルシナ・ウレアエであると同定される。
し、グラム陽性の２連〜４連の球菌であることからスポ
ロサルシナ属に属する。スポロサルシナ属には唯一の種
としてスポロサルシナ・ウレアエが知られており、前記
性質が文献記載のそれとほぼ一致するので、SCRC-R04株
はスポロサルシナ・ウレアエであると同定される。
(ii)SCRC-R53b、SCRC-R79a、SCRC-101A、及びSCRC-114D
株はいずれもグラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カ
タラーゼの生成が認められることからバシルス属に属す
ることが明らかである。
株はいずれもグラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カ
タラーゼの生成が認められることからバシルス属に属す
ることが明らかである。
なお、菌株SCRC-R04、SCRC-R53b、SCRC-R79a、SCRC-101
A、及びSCRC-114Dの電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜
第５図に示す。
A、及びSCRC-114Dの電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜
第５図に示す。
以上、主として自然界から分離した菌株について詳細に
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産生
の高い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の
細胞中に存在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生
産に関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター
例えばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当
な宿主、例えばエッシェリッヒヤ・コリ（Eshcerichia
coli）や酵母のごとき異種宿主、又はバシルス属菌株も
しくはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転
換することにより、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素生産株を人為的に創成することもできる。
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産生
の高い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の
細胞中に存在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生
産に関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター
例えばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当
な宿主、例えばエッシェリッヒヤ・コリ（Eshcerichia
coli）や酵母のごとき異種宿主、又はバシルス属菌株も
しくはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転
換することにより、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素生産株を人為的に創成することもできる。
この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。また、凍結乾燥保存も常法に従って行う
ことができる。
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。また、凍結乾燥保存も常法に従って行う
ことができる。
(2)酵素の製造方法 前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当たっては前
記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ0.01〜10w/v％であり、好ましく
は0.1〜１w/v％である。
記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ0.01〜10w/v％であり、好ましく
は0.1〜１w/v％である。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培養を行うのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45℃
である。pHは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培養を行うのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45℃
である。pHは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。
次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩
析、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等
を行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレン
グリコール等の添加による結晶化等の公知の方法によっ
て均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、
本発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載
する。
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩
析、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等
を行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレン
グリコール等の添加による結晶化等の公知の方法によっ
て均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、
本発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載
する。
(3)力価の測定方法 本発明においては次の方法により力価を測定した。
酸化的脱アミノ化反応：グリシン−KCl−KOH緩衝液（pH
10.5）100μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン
10μmol、及び適当量のサンプルを１mlになるように混
合して反応せしめ、２５℃におけるNADHの増加を340nm
の吸光度の増加として計測し、１分間当り１マイクロモ
ルのNADHを増加せしめる酵素量を１単位とした。
10.5）100μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン
10μmol、及び適当量のサンプルを１mlになるように混
合して反応せしめ、２５℃におけるNADHの増加を340nm
の吸光度の増加として計測し、１分間当り１マイクロモ
ルのNADHを増加せしめる酵素量を１単位とした。
還元的アミノ化反応：各種緩衝液100μmol、NADH0.1μm
ol、NH4Cl200μmol、フェニルピルビン酸ナトリウム１
０μmol及び適当量のサイプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの減少を340nmの
吸光度の減少として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを減少せしめる酵素量を１単位とした。
ol、NH4Cl200μmol、フェニルピルビン酸ナトリウム１
０μmol及び適当量のサイプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの減少を340nmの
吸光度の減少として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを減少せしめる酵素量を１単位とした。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化反応の速度は、至
適pHにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて約
5.5倍速い。従って前記特開昭59-198972に記載されてい
るように還元的アミノ化反応速度を測定し、上記のよう
に力価を定義した場合、同量の酵素が約5.5倍の単位数
を示す。
適pHにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて約
5.5倍速い。従って前記特開昭59-198972に記載されてい
るように還元的アミノ化反応速度を測定し、上記のよう
に力価を定義した場合、同量の酵素が約5.5倍の単位数
を示す。
(4)酵素の性質 本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。
有する。
Ａ．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04により生産され
る酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
る酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋NAD+＋H2O フェニルピルビン酸＋NADH＋NH3＋Ｈ＋ (2)基質特異性：本酵素は第３表に示すようにＬ−フェ
ニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにし
か反応せず又は全く反応しない。
ニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにし
か反応せず又は全く反応しない。
上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結果
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システインおよびＤＬ−フェニルグ
リシンは基質とならない。
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システインおよびＤＬ−フェニルグ
リシンは基質とならない。
補酵素としてはNAD+が必要であり、NADP+はNAD+に対し
て約3.9％の活性を示すにすぎない。
て約3.9％の活性を示すにすぎない。
(3)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.5付近が至
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る（第６図）。
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る（第６図）。
(4)pH安定性：各pHの緩衝液（0.05Ｍ）中３０℃にて１
時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について
測定した場合、第７図に示す（処理前の活性を100％と
する）ごとくpH９付近において安定である。
時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について
測定した場合、第７図に示す（処理前の活性を100％と
する）ごとくpH９付近において安定である。
(5)至適温度：４０℃付近における活性が最大である
（第８図）。
（第８図）。
(6)温度安定性：0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）
中、各温度において１０分間処理した後の残存活性を酸
化的脱アミノ化反応について測定したところ、第９図に
示す（処理前の活性を100％とする）ごとく４２℃にお
いて活性の半分を失う。
中、各温度において１０分間処理した後の残存活性を酸
化的脱アミノ化反応について測定したところ、第９図に
示す（処理前の活性を100％とする）ごとく４２℃にお
いて活性の半分を失う。
(7)吸収スペクトル：278ｎｍに極大吸収、283ｎｍ付近
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１０図に示す。
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１０図に示す。
(8)金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イオ
ン、およびPCMB、Ｎ−エチルマレイミド、５，５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）等のＳＨ阻害剤によ
って活性が阻害される（第４表）。
ン、およびPCMB、Ｎ−エチルマレイミド、５，５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）等のＳＨ阻害剤によ
って活性が阻害される（第４表）。
金属イオンおよび阻害剤の濃度は特に記さない限り１ｍ
Ｍである。
Ｍである。
(9)等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動により
測定した場合5.3〜5.4である。
測定した場合5.3〜5.4である。
(10)分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSK 3000 S
W）により約290,000と算出される。
W）により約290,000と算出される。
(11)サブユニットの分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
(12)均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.5
％，pH8.4）により第１１図Ａに示す如く単一のバンド
を与える。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（10.0％，pH7.2）により第１１図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
％，pH8.4）により第１１図Ａに示す如く単一のバンド
を与える。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（10.0％，pH7.2）により第１１図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
(13)結晶形：第１２図に拡大して示すように板状であ
る。
る。
以上のごとく、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。
Ｂ．バシルスsp.SCRC-R79aにより生産される酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋NAD+＋H2O フェニルピルビン酸＋NADH＋NH3＋Ｈ＋ (2)基質特異性：本酵素は第５表に示すようにＬ−フェ
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めてわずかにしか反応せず、又は全く反応しない。
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めてわずかにしか反応せず、又は全く反応しない。
上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結果
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−アミノ−ｎ−
酪酸は基質とならない。
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−アミノ−ｎ−
酪酸は基質とならない。
なお、還元的アミノ化反応ではフェニルピルビン酸をＬ
−フェニルアラニンにする速度を100％とすると、ｐ−
ヒドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする相
対速度はpH9.0において176％である。
−フェニルアラニンにする速度を100％とすると、ｐ−
ヒドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする相
対速度はpH9.0において176％である。
Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化反応ではNADP
+はNAD+の2.9％の補酵素活性しか有さない。
+はNAD+の2.9％の補酵素活性しか有さない。
(3)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.6〜11.3付
近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.8
付近が至適である（第１３図）。
近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.8
付近が至適である（第１３図）。
(4)pH安定性：各pHの緩衝液（0.05M）中３０℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合、第１４図に示す（処理する前の活性を100
％とする）ごとく、pH４〜11.3の範囲で安定であり、特
にpH９〜11の範囲で安定であった。
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合、第１４図に示す（処理する前の活性を100
％とする）ごとく、pH４〜11.3の範囲で安定であり、特
にpH９〜11の範囲で安定であった。
(5)至適温度：５０℃付近における活性が最大である
（第１５図）。
（第１５図）。
(6)温度安定性：0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0；
第１６図Ａ）、及び0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液（p
H11.0；第１６図Ｂ）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測定
する場合、pH9.0においては57℃で活性が半減し、pH11.
0においては４８℃で活性が半減する。
第１６図Ａ）、及び0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液（p
H11.0；第１６図Ｂ）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測定
する場合、pH9.0においては57℃で活性が半減し、pH11.
0においては４８℃で活性が半減する。
(7)吸収スペクトル：278ｎｍに極大吸収、283ｎｍ付近
に肩を有する。可視部に吸収は認められない。この様子
を第１７図に示す。
に肩を有する。可視部に吸収は認められない。この様子
を第１７図に示す。
(8)金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イオ
ンおよびPCMBによって活性が阻害される（第６表）。
ンおよびPCMBによって活性が阻害される（第６表）。
金属イオンおよび阻害剤の濃度は特に記さない限り１ｍ
Ｍである。
Ｍである。
(9)等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動により
測定した場合4.3〜4.4である。
測定した場合4.3〜4.4である。
(10)分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSK 3000 S
W）により約290,000と算出される。
W）により約290,000と算出される。
(11)サブユニットの分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
(12)均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.5
％，pH8.4）により第１８図Ａに示す如く単一のバンド
を与える。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（10.0％，pH7.2）により第１８図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
％，pH8.4）により第１８図Ａに示す如く単一のバンド
を与える。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（10.0％，pH7.2）により第１８図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
(5)Ｌ−フェニルアラニンの製造方法 本発明のＬ−フェニルアラニンの製造方法においては、
スポロサルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産
されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
ニルピルビン酸、NADH及びアンモニウムイオンを反応せ
しめることによりＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、
該フェニルアラニンを採取する。
スポロサルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産
されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
ニルピルビン酸、NADH及びアンモニウムイオンを反応せ
しめることによりＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、
該フェニルアラニンを採取する。
この方法において使用されるＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。例えば、この発
明によって精製された酵素を使用することできるのは無
論のこと、細胞を含有する培養液、培養生菌体、アセト
ン等によって脱水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、種
々の段階まで精製された部分精製酵素標品等の酵素含有
物を使用することができる。さらにこれらの酵素又は酵
素含有物を常法に従って固定化したものを使用すること
もできる。工業的な実施に当っては生菌体、固定化菌体
等を用いるのが有利である。反応液中のＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の量は基質であるフェニルピリビン酸
又はその塩の濃度等によって異なり特に限定されない
が、通常10〜10,000単位／とするのが便利である。
素酵素の使用形態は特に限定されない。例えば、この発
明によって精製された酵素を使用することできるのは無
論のこと、細胞を含有する培養液、培養生菌体、アセト
ン等によって脱水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、種
々の段階まで精製された部分精製酵素標品等の酵素含有
物を使用することができる。さらにこれらの酵素又は酵
素含有物を常法に従って固定化したものを使用すること
もできる。工業的な実施に当っては生菌体、固定化菌体
等を用いるのが有利である。反応液中のＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の量は基質であるフェニルピリビン酸
又はその塩の濃度等によって異なり特に限定されない
が、通常10〜10,000単位／とするのが便利である。
基質としてフェニルピリビン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピリビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜500ｇ／とするのが便利で
ある。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用する
ことができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩の
形で使用するのがpH調整の観点から好ましい。例えばフ
ェニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全には溶解
しないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が存在して
いても差しつかえない。また、フェニルピリビン酸アン
モニウム又はフェニルピルビン酸をアンモニアで中和し
たものを使用することもでき、この場合このアンモニウ
ム塩あフェニルピルビン酸の給源であると同時に後に記
載するアンモニウムイオンの給源としても機能する。フ
ェニルピリビン酸又はその塩はバッチ式反応においては
反応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行
と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加するこ
ともできる。
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピリビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜500ｇ／とするのが便利で
ある。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用する
ことができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩の
形で使用するのがpH調整の観点から好ましい。例えばフ
ェニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全には溶解
しないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が存在して
いても差しつかえない。また、フェニルピリビン酸アン
モニウム又はフェニルピルビン酸をアンモニアで中和し
たものを使用することもでき、この場合このアンモニウ
ム塩あフェニルピルビン酸の給源であると同時に後に記
載するアンモニウムイオンの給源としても機能する。フ
ェニルピリビン酸又はその塩はバッチ式反応においては
反応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行
と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加するこ
ともできる。
アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のpHを所定値に維持しな
がら反応の進行と共に連続的に導入することも可能であ
る。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを使
用する場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源として
も機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピルビ
ン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量は
一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル量
とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多く
することによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラニ
ン側に傾け、フェニルピリビン酸に対するＬ−フェニル
アラニンの収率を上昇せしめることができる。
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のpHを所定値に維持しな
がら反応の進行と共に連続的に導入することも可能であ
る。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを使
用する場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源として
も機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピルビ
ン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量は
一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル量
とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多く
することによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラニ
ン側に傾け、フェニルピリビン酸に対するＬ−フェニル
アラニンの収率を上昇せしめることができる。
NADHは、フェニルピルビン酸と等モルを加えてもよい
が、NADHは非常に高価であるから、工業的見地から、前
記の反応系のほかに、NADH再生系、すなわち前記反応に
より生成したNAD+をNADHに還元する系を共有させるのが
好ましい。このような系としてNAD+をNADHに変換する酵
素とその基質との組合わせ、例えば蟻酸脱水素酵素（EC
1.2.1.2）と蟻酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素（EC
1.4.1.2）とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素（EC
1.1.1.1）とエタノール、アルデヒド脱水素酵素（EC 1.
2.1.3）とアセトアルデヒド、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素（EC 1.1.1.49）とグルコース−６−リン酸
等を使用することができる。また、ヒドロゲナーゼ（EC
1.18.3.1）による分子状水素を電子供与体とするNAD+
のNADHへの還元反応や、電気化学的に還元されたメチル
ビオローゲンやジヒドロリポアミドのジアホラーゼ（EC
1.6.4.3）による酸化に伴うNAD+のNADHへの還元反応を
も使用することができる。蟻酸脱水素酵素と蟻酸を使用
する場合、NAD+が還元されてNADHとなると同時に蟻酸が
酸化されて二酸化炭素が生成し、これは反応系から容易
に除去され、反応が常に所望の方向に進行するため特に
好ましい。蟻酸脱水素酵素は市販されており容易に入手
することができる。又、例えばカンジダ・ボイディニ
（Candida boidinii）No.2201(AKU 4705)や、ハンゼヌ
ラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)(ATCC26012)
から公知の方法〔カトウら、アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー(Agri-cultural and
Biological Chemistry)38,111〜116(1974)〕により精
製して使用することもできる。NADH再生系の酵素濃度
は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素濃度等に依存して
異なり、一般に基質フェニルピルビン酸の還元的アミノ
化速度（従ってNAD+生成速度）に匹敵する速度でNAD+を
NADHに還元するために必要な量である。例えば、前記の
ように10〜10,000単位／のＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素を使用し、NADH再生系酵素として蟻酸脱水素酵素
を使用する場合、この酵素の使用量は10〜10,000単位／
程度とするのが好ましい。蟻酸脱水素酵素の基質とし
ては蟻酸の塩、例えば蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、
蟻酸アンモニウム等を使用するのが便利である。蟻酸塩
の使用量はフェニルピルビン酸又はその塩の量の１〜２
倍モル量とするのが好ましい。NADH再生系を用いる場合
は、NAD+又はNADHを通常の生理的濃度である0.1〜１０
ｍＭ加えればよい。
が、NADHは非常に高価であるから、工業的見地から、前
記の反応系のほかに、NADH再生系、すなわち前記反応に
より生成したNAD+をNADHに還元する系を共有させるのが
好ましい。このような系としてNAD+をNADHに変換する酵
素とその基質との組合わせ、例えば蟻酸脱水素酵素（EC
1.2.1.2）と蟻酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素（EC
1.4.1.2）とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素（EC
1.1.1.1）とエタノール、アルデヒド脱水素酵素（EC 1.
2.1.3）とアセトアルデヒド、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素（EC 1.1.1.49）とグルコース−６−リン酸
等を使用することができる。また、ヒドロゲナーゼ（EC
1.18.3.1）による分子状水素を電子供与体とするNAD+
のNADHへの還元反応や、電気化学的に還元されたメチル
ビオローゲンやジヒドロリポアミドのジアホラーゼ（EC
1.6.4.3）による酸化に伴うNAD+のNADHへの還元反応を
も使用することができる。蟻酸脱水素酵素と蟻酸を使用
する場合、NAD+が還元されてNADHとなると同時に蟻酸が
酸化されて二酸化炭素が生成し、これは反応系から容易
に除去され、反応が常に所望の方向に進行するため特に
好ましい。蟻酸脱水素酵素は市販されており容易に入手
することができる。又、例えばカンジダ・ボイディニ
（Candida boidinii）No.2201(AKU 4705)や、ハンゼヌ
ラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)(ATCC26012)
から公知の方法〔カトウら、アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー(Agri-cultural and
Biological Chemistry)38,111〜116(1974)〕により精
製して使用することもできる。NADH再生系の酵素濃度
は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素濃度等に依存して
異なり、一般に基質フェニルピルビン酸の還元的アミノ
化速度（従ってNAD+生成速度）に匹敵する速度でNAD+を
NADHに還元するために必要な量である。例えば、前記の
ように10〜10,000単位／のＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素を使用し、NADH再生系酵素として蟻酸脱水素酵素
を使用する場合、この酵素の使用量は10〜10,000単位／
程度とするのが好ましい。蟻酸脱水素酵素の基質とし
ては蟻酸の塩、例えば蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、
蟻酸アンモニウム等を使用するのが便利である。蟻酸塩
の使用量はフェニルピルビン酸又はその塩の量の１〜２
倍モル量とするのが好ましい。NADH再生系を用いる場合
は、NAD+又はNADHを通常の生理的濃度である0.1〜１０
ｍＭ加えればよい。
反応媒体としては水、又は水性液、例えば水性緩衝液を
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−HC
l緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液等を使用することがで
きる。
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−HC
l緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液等を使用することがで
きる。
反応液のpHとしては、前記のNADH再生系を用いない場合
には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還元的ア
ミノ化に適するpHを用いることができ、例えばスポロサ
ルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはpH８〜１０、
好ましくはpH約９とし、バシルス属細菌由来の酵素を用
いる場合にはpH９〜１１、好ましくはpH約１０とする。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化系と共にNADH再生
系を用いる場合には、これら両者の反応が共に良好に進
行するpH範囲を選択する必要がある。このようなpHは、
例えば、スポロサルシナ属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来の蟻酸脱水
素酵素を用いる場合には通常はpH7.5〜9.5、好ましくは
pH8.0〜9.0である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来
の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常はpH８〜10、好
ましくはpH8.5〜9.5である。
には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還元的ア
ミノ化に適するpHを用いることができ、例えばスポロサ
ルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはpH８〜１０、
好ましくはpH約９とし、バシルス属細菌由来の酵素を用
いる場合にはpH９〜１１、好ましくはpH約１０とする。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化系と共にNADH再生
系を用いる場合には、これら両者の反応が共に良好に進
行するpH範囲を選択する必要がある。このようなpHは、
例えば、スポロサルシナ属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来の蟻酸脱水
素酵素を用いる場合には通常はpH7.5〜9.5、好ましくは
pH8.0〜9.0である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来
の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常はpH８〜10、好
ましくはpH8.5〜9.5である。
反応温度も、反応pHの場合と同様に考えることができる
が酵素のいずれの組合わせにおいても通常は20℃〜50
℃、好ましくは25℃〜40℃である。
が酵素のいずれの組合わせにおいても通常は20℃〜50
℃、好ましくは25℃〜40℃である。
反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基質濃度、
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。
反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。
生成したＬ−フェニルアラニンは任意の常法に従って精
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。
フェニルアラニンの定量は、例えばロイコノストック・
メセンテロイデス（Leuconostoc mesent eroides)ATCC
8042を用いるバイオアッセイにより行うことができる。
メセンテロイデス（Leuconostoc mesent eroides)ATCC
8042を用いるバイオアッセイにより行うことができる。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04からのＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl0.1％、及びMgSO4・7H2O0.0
2％を含有し、pH7.0に調整した培地３０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエSCRC
-R04（微工研菌寄第８１７８号）微工研条寄第1012号を
接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取し湿重量約380ｇの菌体を得
た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液（pH7.0）１に懸濁し、９ＫHzにおける超
音波処理を約１０時間行い菌体を破砕した。破砕菌体は
14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽
出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.1ｇ
となるように添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱
を14,000xg、20分間遠心分離し、得られた粗酵素液を0.
1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透析し
た。透析後の酵素液（1990ml）に固体硫酸アンモニウム
（412ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。
３０分間攪拌の後、14,000xgで20分間遠心して得られる
上清（2100ml）にさらに固体硫酸アンモニウム（416
ｇ）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。14,000
xgで20分間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で透析した。こ
の酵素液をあらかじめ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラム
に通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で溶
出した。
−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl0.1％、及びMgSO4・7H2O0.0
2％を含有し、pH7.0に調整した培地３０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエSCRC
-R04（微工研菌寄第８１７８号）微工研条寄第1012号を
接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取し湿重量約380ｇの菌体を得
た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液（pH7.0）１に懸濁し、９ＫHzにおける超
音波処理を約１０時間行い菌体を破砕した。破砕菌体は
14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽
出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.1ｇ
となるように添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱
を14,000xg、20分間遠心分離し、得られた粗酵素液を0.
1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透析し
た。透析後の酵素液（1990ml）に固体硫酸アンモニウム
（412ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。
３０分間攪拌の後、14,000xgで20分間遠心して得られる
上清（2100ml）にさらに固体硫酸アンモニウム（416
ｇ）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。14,000
xgで20分間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で透析した。こ
の酵素液をあらかじめ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラム
に通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で溶
出した。
活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍのリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.15Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。このようにして得られた酵素液を限外濾化により
濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行った。こ
うして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２図に示
す。なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精
製工程における比活性および回収率を示す。
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍのリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.15Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。このようにして得られた酵素液を限外濾化により
濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行った。こ
うして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２図に示
す。なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精
製工程における比活性および回収率を示す。
例２．（参考例）バシルスsp.SCRC-R79aからのＬ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl0.1％、及びMgSO4・7H2O0.0
2％を含有し、pH7.0に調製した培地１０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工研
菌寄第８１７９号）（微工研条寄第1013号）を接種し、
３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後１０の培
養液から遠心分離機で菌体を採取し湿重量約108ｇの菌
体を得た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.
1ｍＭEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含むリン酸緩衝液（pH7.0）約０．４に懸濁し、９ＫH
zにおける超音波処理を約６時間行ない菌体を破砕し
た。破砕菌体は14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得
た。この無細胞抽出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１
ｇ蛋白当り0.1ｇとなるように添加し、３０分間攪拌し
た。生成した沈澱を14,000xg、20分間遠心分離し、得ら
れた粗酵素液を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
に対して透析した。透析後の酵素液（400ml）に固体硫
酸アンモニウム（70.4ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウ
ム飽和とした。３０分攪拌の後、14,000xgで20分間遠心
して得られる、上清（430ml）にさらに固体硫酸アンモ
ニウム（85.6ｇ）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和と
した。14,000xgで20分間遠心して得られる、酵素活性を
有する沈澱を少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶
解し、さらに0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析した。この酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭのEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650
Ｍのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶出した。
ニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl0.1％、及びMgSO4・7H2O0.0
2％を含有し、pH7.0に調製した培地１０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工研
菌寄第８１７９号）（微工研条寄第1013号）を接種し、
３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後１０の培
養液から遠心分離機で菌体を採取し湿重量約108ｇの菌
体を得た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.
1ｍＭEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含むリン酸緩衝液（pH7.0）約０．４に懸濁し、９ＫH
zにおける超音波処理を約６時間行ない菌体を破砕し
た。破砕菌体は14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得
た。この無細胞抽出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１
ｇ蛋白当り0.1ｇとなるように添加し、３０分間攪拌し
た。生成した沈澱を14,000xg、20分間遠心分離し、得ら
れた粗酵素液を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
に対して透析した。透析後の酵素液（400ml）に固体硫
酸アンモニウム（70.4ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウ
ム飽和とした。３０分攪拌の後、14,000xgで20分間遠心
して得られる、上清（430ml）にさらに固体硫酸アンモ
ニウム（85.6ｇ）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和と
した。14,000xgで20分間遠心して得られる、酵素活性を
有する沈澱を少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶
解し、さらに0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析した。この酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭのEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEAE−トヨパール650
Ｍのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶出した。
活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を約
６０％の収率で約1800倍に精製した。この精製過程にお
ける比活性および回収率を第８表に示す。この酵素はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において均一であることが証明さ
れた。
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を約
６０％の収率で約1800倍に精製した。この精製過程にお
ける比活性および回収率を第８表に示す。この酵素はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において均一であることが証明さ
れた。
実施例３．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由来の粗
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの製造 フェニルピリビン酸ナトリウム５ｇ（22ｍmol）、蟻酸
アンモニウム３ｇ（49ｍmol）、NAD+0.21ｇ（0.29ｍmo
l）、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）１８ｍmol、粗Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素43.2単位（実施例１、第７表
の工程３の硫酸アンモニウム分画まで部分精製した粗酵
素画分に相当）および粗蟻酸脱水素酵素49.0単位（pH8.
5），カンジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を含
む300mlの反応液を３０℃において２４時間反応させ
た。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロ
イコノストック・メセンテロイデスを用いる微生物定量
法により定量したところ1.91ｇ（11.6ｍmol，52.7％の
転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。この
反応液に２０％トリクロロ酢酸30mlを加え除蛋白後、陽
イオン交換樹脂アンバーライト（Amberlite）IR-120
（Ｈ＋）カラムに吸着させ、１Ｍアンモニア水で溶出さ
せた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後
陰イオン交換樹脂アンバーライト（Amberlite）IRA-400
（ＯＨ−）カラムに吸着させ、１Ｍ蟻酸で溶出させた。
Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を濃縮乾固した。小量
の温水に溶解し、エタノールを５０％となるように加
え、冷蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様の操作
により再結晶化し、0.458ｇの無色固体を得た。この標
品の元素分析値は以下のとおりであった。
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの製造 フェニルピリビン酸ナトリウム５ｇ（22ｍmol）、蟻酸
アンモニウム３ｇ（49ｍmol）、NAD+0.21ｇ（0.29ｍmo
l）、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）１８ｍmol、粗Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素43.2単位（実施例１、第７表
の工程３の硫酸アンモニウム分画まで部分精製した粗酵
素画分に相当）および粗蟻酸脱水素酵素49.0単位（pH8.
5），カンジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を含
む300mlの反応液を３０℃において２４時間反応させ
た。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロ
イコノストック・メセンテロイデスを用いる微生物定量
法により定量したところ1.91ｇ（11.6ｍmol，52.7％の
転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。この
反応液に２０％トリクロロ酢酸30mlを加え除蛋白後、陽
イオン交換樹脂アンバーライト（Amberlite）IR-120
（Ｈ＋）カラムに吸着させ、１Ｍアンモニア水で溶出さ
せた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後
陰イオン交換樹脂アンバーライト（Amberlite）IRA-400
（ＯＨ−）カラムに吸着させ、１Ｍ蟻酸で溶出させた。
Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を濃縮乾固した。小量
の温水に溶解し、エタノールを５０％となるように加
え、冷蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様の操作
により再結晶化し、0.458ｇの無色固体を得た。この標
品の元素分析値は以下のとおりであった。
融点：270℃で分解した。
比旋光度▲［α］20 D▼−35.5°（ｃ＝0.48,H2O）で光
学的に純粋なＬ体であった。マススペクトル、核磁気共
鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルによる分
析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニンであ
ることを示した。
学的に純粋なＬ体であった。マススペクトル、核磁気共
鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルによる分
析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニンであ
ることを示した。
実施例４．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由来の部
分精製酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの高濃度合成 フェニルピリビン酸ナトリウム3.57ｍmol、NAD+100μmo
l、NH4Cl５ｍmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）２７２
μmol、蟻酸ナトリウム7.84ｍmol、Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素３５単位（実施例１、第７表の工程４のDE
AE−トヨパールカラムを通過させた画分）および蟻酸脱
水素酵素10.2単位（（pH8.5），カンジダ・ボイディニN
o.2201より部分精製）を５ml中に含む反応液を３０℃で
２４時間保温した。微生物定量法により定量したとこ
ろ、580mg（3.53ｍmol，98.5％の転換率）のＬ−フェニ
ルアラニンが生成していた。
分精製酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの高濃度合成 フェニルピリビン酸ナトリウム3.57ｍmol、NAD+100μmo
l、NH4Cl５ｍmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）２７２
μmol、蟻酸ナトリウム7.84ｍmol、Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素３５単位（実施例１、第７表の工程４のDE
AE−トヨパールカラムを通過させた画分）および蟻酸脱
水素酵素10.2単位（（pH8.5），カンジダ・ボイディニN
o.2201より部分精製）を５ml中に含む反応液を３０℃で
２４時間保温した。微生物定量法により定量したとこ
ろ、580mg（3.53ｍmol，98.5％の転換率）のＬ−フェニ
ルアラニンが生成していた。
実施例５．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由来の粗
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム200μmol、NAD+20μmo
l、蟻酸ナトリウム200μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）６００μmol、蟻酸脱水素酵素11.9単位（（pH8.
5），カンジダ・ボイディニNo.2201の無細胞抽出液）お
よびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素13.2単位（SCRC-R
04株の培養菌体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜
60％飽和として沈澱した粗酵素画分；実施例１の第７表
の工程３に相当）を含む13.0mlの反応液を３０℃で15時
間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニ
ンの量を微生物定量法により測定したところ32.8mg(19
8.8μmol,98.4％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが
生成していた。
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム200μmol、NAD+20μmo
l、蟻酸ナトリウム200μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）６００μmol、蟻酸脱水素酵素11.9単位（（pH8.
5），カンジダ・ボイディニNo.2201の無細胞抽出液）お
よびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素13.2単位（SCRC-R
04株の培養菌体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜
60％飽和として沈澱した粗酵素画分；実施例１の第７表
の工程３に相当）を含む13.0mlの反応液を３０℃で15時
間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニ
ンの量を微生物定量法により測定したところ32.8mg(19
8.8μmol,98.4％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが
生成していた。
例６．（参考例）バシルスsp.SCRC-R79a由来の部分精製
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム800μmol、NAD+5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）260μmol、粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（pH8.5），お
よびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素0.25単位（SCRC-R
79aの無細胞抽出液よりプロタミン処理，硫安分画，DEA
E−トヨパール、およびヒドロキシアパタイトの各カラ
ムクロマグラフィーにより、約180倍に精製した酵素標
品）を含む5.0mlの反応液を３０℃で２４時間反応させ
た。微生物定量法により定量したところ64.4mg（390.0
μmol，97.5％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生
成していた。
酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム800μmol、NAD+5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）260μmol、粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（pH8.5），お
よびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素0.25単位（SCRC-R
79aの無細胞抽出液よりプロタミン処理，硫安分画，DEA
E−トヨパール、およびヒドロキシアパタイトの各カラ
ムクロマグラフィーにより、約180倍に精製した酵素標
品）を含む5.0mlの反応液を３０℃で２４時間反応させ
た。微生物定量法により定量したところ64.4mg（390.0
μmol，97.5％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生
成していた。
この反応液から、実施例３の方法に準じてＬ−フェニル
アラニンを得た。
アラニンを得た。
第１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04の電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第２図はバシルスsp.SCRC-R53bの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第３図はバシルスsp.SCRC-R79aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第４図はバシルスsp.SCRC-101Aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第５図はバシルスsp.SCRC-114Dの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第６図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係
を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応に
ついて、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を示
し； 第７図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラ
フであり； 第８図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との
関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ化反応に
ついての結果を示し； 第９図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグ
ラフであり； 第１０図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペク
トラムであり； 第１１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気
泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.
5％ゲル，pH8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10.0％ゲル，pH7.2）を示し； 第１２図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッ
チであり； 第１３図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係を表わすグ
ラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応について、Ｂ
は還元的アミノ化反応についての結果を示し； 第１４図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラフであり； 第１５図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との関係を表わ
すグラフであって、酸化的脱アミノ化反応についての結
果を示し； 第１６図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであ
り、Ａは0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）中での結
果を示し、そしてＢは0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液
（pH11.0）中での結果を示し； 第１７図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の紫外線吸収スペクトラムであ
り；そして、 第１８図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気泳動図であっ
て、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.5％ゲル，pH
8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動（10.0％ゲル，pH7.2）の結果を示す。
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第２図はバシルスsp.SCRC-R53bの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第３図はバシルスsp.SCRC-R79aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第４図はバシルスsp.SCRC-101Aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第５図はバシルスsp.SCRC-114Dの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第６図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係
を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応に
ついて、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を示
し； 第７図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラ
フであり； 第８図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との
関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ化反応に
ついての結果を示し； 第９図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグ
ラフであり； 第１０図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペク
トラムであり； 第１１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気
泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.
5％ゲル，pH8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10.0％ゲル，pH7.2）を示し； 第１２図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッ
チであり； 第１３図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係を表わすグ
ラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応について、Ｂ
は還元的アミノ化反応についての結果を示し； 第１４図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラフであり； 第１５図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との関係を表わ
すグラフであって、酸化的脱アミノ化反応についての結
果を示し； 第１６図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであ
り、Ａは0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）中での結
果を示し、そしてＢは0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液
（pH11.0）中での結果を示し； 第１７図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の紫外線吸収スペクトラムであ
り；そして、 第１８図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気泳動図であっ
て、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.5％ゲル，pH
8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動（10.0％ゲル，pH7.2）の結果を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】次の性質： (1)作用：１モルのＬ−アミノ酸、１モルのNAD+及び１
モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルのNA
DH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、並
びにこの逆反応を触媒する； (2)分子量：高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法に
おいて約290,000の分子量を有し、 SDS−ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法にお
いて約38,000〜39,000の分子量を有するサブユニットを
示す； (3)基質特異性：下記の表に示すようにＬ−フェニルア
ラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにしか反応
せず又は全く反応しない： （上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結
果を示す）； (4)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.5付近が至
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る； (5)pH安定性：各pHの緩衝液（0.05Ｍ）中30℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合pH９付近において安定である；並びに (6)至適温度：40℃付近における活性が最大である； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素。 - 【請求項２】スポロサルシナ（Sporosarcina）属細菌に
より生産される特許請求の範囲第１項記載の酵素。 - 【請求項３】次の性質： (1)作用：１モルのＬ−アミノ酸、１モルのNAD+及び１
モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルのNA
DH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、並
びにこの逆反応を触媒する； (2)分子量：高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法に
おいて約290,000の分子量を有し、 SDS−ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法にお
いて約38,000〜39,000の分子量を有するサブユニットを
示す； (3)基質特異性：下記の表に示すようにＬ−フェニルア
ラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにしか反応
せず又は全く反応しない： （上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結
果を示す）； (4)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.5付近が至
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る； (5)pH安定性：各pHの緩衝液（0.05Ｍ）中30℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合pH９付近において安定である；並びに (6)至適温度：40℃付近における活性が最大である； を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるスポロサルシナ
（Sporosarcina）属細菌を培養し、この培養物から該酵
素を採取することを特徴とする方法。 - 【請求項４】前記細菌がスポロサルシナ・ウレアエ（Sp
orosarcina ureae）である特許請求の範囲第３項記載の
方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080293A JPH0630572B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-04-17 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 |
| US06/851,207 US4849345A (en) | 1985-04-17 | 1986-04-14 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| EP19920113785 EP0513872A1 (en) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| DE86302830T DE3688864T2 (de) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-Phenylalanindehydrogenase und deren Verwendung. |
| EP86302830A EP0206460B1 (en) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080293A JPH0630572B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-04-17 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60127118A Division JPH0630573B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-06-13 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61239887A JPS61239887A (ja) | 1986-10-25 |
| JPH0630572B2 true JPH0630572B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=13714221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60080293A Expired - Lifetime JPH0630572B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-04-17 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630572B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0630573B2 (ja) * | 1985-06-13 | 1994-04-27 | 財団法人相模中央化学研究所 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 |
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
-
1985
- 1985-04-17 JP JP60080293A patent/JPH0630572B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61239887A (ja) | 1986-10-25 |
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